Summary
검은 후추 식물의 기저 머리를 핀찌르는 것은 그것을 손상시키는 간단하고 시간을 절약 할 수있는 방법입니다. 여기에서는 검은 후추 식물을 감염시키기위한 비디오와 함께 자세한 단계를 제공했습니다.
Abstract
파이퍼 니그럼 L. (후추)는 전 세계적으로 경제적으로 중요한 향신료 작물 인 전형적인 우디 포도 나무입니다. 검은 후추 생산은 Phytophthora capsici로 인한 뿌리 썩음병에 의해 크게 영향을받으며, 이는 "초크 포인트"문제로 산업 발전에 심각한 영향을 미쳤습니다. 그러나 검은 후추에 대한 내성의 분자 유전 적 메커니즘이 불분명하여 새로운 후추 품종의 개발이 느리게 진행됩니다. 검은 후추 식물에 대한 Phytophthora capsici 에 대한 효과적인 접종 및 정확한 샘플링 시스템은이 식물 - 병원균 상호 작용을 연구하는 데 필수적입니다. 이 연구의 주요 목적은 검은 후추의 기저 머리에 Phytophthora capsici를 접종하는 상세한 방법론을 입증하는 동시에 우디 포도 나무 식물의 접종에 대한 참고 문헌을 제공하는 것입니다. 검은 후추 식물의 기저 머리는 그것을 손상시키기 위해 핀찔 렸고, 균사 알갱이는 병원균이 식물을 잘 감염시킬 수 있도록 수분을 유지하기 위해 세 개의 구멍을 덮었습니다. 이 방법은 토양 습류 또는 뿌리 침지를 포함한 전통적인 접종 방법으로 인한 불안정성을 해결하는 더 나은 방법을 제공합니다. 또한 농업 정밀 육종에서 식물과 다른 토양 매개 식물 병원균 사이의 작용 방식을 연구하기위한 유망한 수단을 제공합니다.
Introduction
검은 후추 (Piper nigrum L.)는 우디 등반가이자 가장 중요한 향신료 작물 중 하나입니다. 그것은 "향신료의 왕"1으로 알려져 있으며 아시아, 아프리카 및 라틴 아메리카 전역의 40 개 이상의 국가와 지역에서 재배됩니다. Phytophthora 뿌리 썩음은 검은 후추의 가장 파괴적인 질병이며, oomycete Phytophthora capsici에 의해 발생합니다. 이 병원균은 또한 큐커빗, 가지, 칠리 고추 및 토마토 2,3을 감염시킵니다. 검은 후추를 사용하면 전체 작물이 때때로이 질병에 의해 파괴 될 수 있습니다. 후추 재배 지역의 확장은 내성 품종의 이용 불가능으로 인해 제한되며, 이는 중국 후추 산업의 발전을 크게 방해했습니다. 검은 후추 식물에 대한 Phytophthora capsici에 대한 효과적인 접종과 정확한 샘플링 시스템은이 식물 - 병원균 상호 작용을 연구하는 데 필수적입니다.
생식 형질 자원에서 내성의 확인 및 스크리닝은 병원균의 병원성과 내성 품종의 번식 및 활용을 연구하기위한 기본 요구 사항입니다. 널리 사용되는 접근법은 식물 종 및 병원균 그룹에 기초한 다양한 식별 방법을 사용하는 것이다. 현재의 식별 방법에는 집단 식별, 개인 식별, 장기 식별, 조직 식별, 세포 식별, 생화학 적 식별 및 분자 식별이 포함되며 최근 몇 년 동안 개발 된 4,5. 이 분야에서 성공했지만 많은 문제가 있습니다. 어떤 방법을 선택하든 명확한 목표, 신뢰할 수있는 결과 및 간단하고 신속하며 표준화하기 쉬운 방법을 포함하여 식물 저항 식별의 기본 요구 사항은 일관됩니다. 이 원칙은 또한 후추 저항의 식별에 따라야합니다.
자연 현장 조건에서 질병 저항성의 확인은 많은 환경 요인에 의해 영향을받을 수 있습니다. 따라서 분리 된 잎과 관개 된 뿌리를 실험실에서 사용하여 질병 저항성을 확인하는 것이 제안되었습니다. 건강한 식물로부터의 어린 잎을 실험실 에서 시험관 내에서 접종하고, 병든 잎 면적을 식물6의 질병 저항성을 확인하기 위해 병원균을 접종하여 측정하였다. 그러나, 시험관내 잎 접종은 분자 상호작용 연구를 위한 것이 아니라 일반적인 내성 확인을 위해서만 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 질병 내성 상태는 관개 된 뿌리 접종에 종종 나타나며, 질병 저항성에 대한 분자 육종에 대한 후속 연구에서 불확실성을 야기합니다. 따라서 빠르고 간단한 실내 감지 방법이 필수적입니다. 이 연구는 실험실에서 저항 식별 방법을 제공하는 것을 목표로합니다.
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Protocol
1. 감염에 대한 후추 절단 식물의 준비
- 소독 된 가지치기 칼 또는 secateurs를 사용하여 건강하고 활발하게 자라는 검은 후추의 직교 성 가지에서 직경 0.5cm의 약 40cm 길이의 5 노드 절단을 가져 가십시오. 플라지오트로픽 브랜치의 아래쪽 세 노드를 자릅니다, 위쪽 두 노드는 약 10개의 잎을 그대로 남겨 둡니다.
- 토양과 동물 분뇨 (소 배설물 또는 양 배설물)가 들어있는 뿌리 기질을 1:1의 비율로 준비하십시오. 응원 기판을 121°C에서 20분 동안 오토클레이브한다.
- 절단을 약 50°의 각도로 응원 기판에 삽입하고, 세 번째 노드는 기판 표면과 기판 위의 이 노드의 겨드랑이 새싹을 터치합니다.
참고 : 여기에 사용 된 가방의 크기는 높이 40-60cm, 직경 25-30cm입니다. - 식물의 뿌리 위에 10-20 L의 물을 붓는다. 뿌리와 성장을 위해 25-30 ° C의 온도에서 90 % 그늘이있는 온실에 절단을 놓습니다.
2. Phytophthora capsici (P. capsici)의 전파
참고 : Phytophthora capsici 문화의 재고는 향신료 및 음료 연구소, 중국 열대 농업 과학 아카데미7의 식물 보호 실험실에서 유지됩니다.
- 흐르는 수돗물로 감자 괴경을 닦고 닦은 다음 감자 200g을 1cm3의 큐브로 자릅니다. 큐브 중 일부를 이중 증류수 (ddH2O) 800 mL가 들어있는 비이커에 넣고20분 동안 끓입니다.
- 중력 여과를 사용하여 이중 거즈를 통해 국물을 여과하십시오. 상기 여액에 덱스트로스 20 g 및 한천 15 g을 첨가하고, 혼합물을 ddH2O.로 부피 1 L까지 토핑하여 감자 덱스트로스 한천 (PDA)을 준비하고, 혼합물을 121°C에서 20분 동안 오토클레이브8.
- 액체 형태의 멸균된 PDA 20 mL를 층상 공기 흐름 후드 내부의 직경 9 cm 둥근 페트리 접시에 붓는다. 결로를 방지하기 위한 수단으로 하룻밤 사이에 층류 후드 내부에 뚜껑이 열려 있는 PDA 플레이트를 그대로 두십시오.
- 접종 루프를 사용하여 시험관 내부의 Phytophthora capsici 스톡에서 균사체를 채취하십시오. PDA와 접촉하는 균사체 측과 함께 접종물을 페트리 접시에 놓습니다.
3. 후추의 감염
- 잠복
- 접종을 위해 기질 표면에서 5cm 위, 줄기의 뿌리 근처에있는 영역을 확인하십시오.
- 마개 보어를 사용하여 페트리 접시에서 PDA 상의 피토프토호라 캡시치 배양물의 성장 가장자리에서 직경 0.5 cm의 균사체의 디스크를 코어 아웃한다.
- 주사기 바늘을 사용하여 줄기를 손상시키고 선택한 접종 영역에서 삼각형 패턴으로 세 개의 구멍을 만듭니다. 균사 디스크로 각 구멍을 덮으십시오. 상처 입은 부위가 균사 디스크로 완전히 덮여 있는지 확인하기 위해 구멍을 서로 가깝게 배치하십시오.
- 균사 디스크를 건조를 방지하기위한 수단으로 멸균 된 축축한 면봉으로 덮으십시오. 패드를 폴리에틸렌 스트립으로 줄기에 묶어 접종 디스크의 위치를 유지하십시오.
참고 : 접종 후 8 시간에, 접종 된 구멍은 검은 색으로 변하고 시간이 지남에 따라 병변이 연장되었습니다. 잎은 노랗게 변하고 떨어졌으며 접종 된 식물은 접종 후 7-10 일 후에 사망했습니다. 대조 식물에서 병변이 발생하지 않았습니다. 대부분의 유전자는 대조군과 비교하여 Phytophthora capsici 로 접종 한 후 다르게 발현되었습니다. 감염된 조직의 조직병리학적 분석은 피토프토라 고추 시 치가 자일렘에서 콜로니화되었음을 입증하였다.
- 관심있는 식물 재료를 샘플링하고 후속 연구에 사용하기 위해 액체 질소 중 -80°C에서 보관하십시오.
참고: 액체 질소, 비닐 봉지, 마커 펜, 가지 가위 및 기타 재료는 실험 전에 준비되었습니다. - 특정 식물 재료가 사용을 위해 샘플링 된 후, 나머지 모든 식물 재료, 남은 Phytophthora capsici 배양 및 배양 배지 및이 접종 작업에 사용 된 모든 도구 및 실험실을 오토클레이브합니다.
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Representative Results
도 1은 P. capsici 접종 후 후추 잎의 증상을 나타낸다. 도 2는 P. capsici 접종 후 후추 줄기의 증상을 나타낸다. 병원체는 기저 줄기에서 검은 후추를 감염시켰다; 잎 황변, 시들음 나타남, 자일렘 갈변 및 혈관 흑색과 같은 증상이 점차 나타납니다. 도 3은 피토프토호라 캅시치를 대조군과 비교하여 접종한 후 다르게 발현되는 대부분의 유전자를 보여준다. 도 4 는 감염된 조직의 조직병리학적 분석에 의해 자일렘에서 콜로니화된 피토프토라 캡시치를 입증하였다.
그림 1: P. capsici 접종 후 후추잎의 증상7. CK : 대조군; 접종 : 예방 접종 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: P. capsici 접종 후 후추 줄기의 증상7. 접종 : 예방 접종 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 후추 뿌리에서 유전자의 상세한 발현 프로필. 도면의 에러 막대는 세 가지 생물학적 복제로부터의 발현 수준의 표준 오차를 나타낸다. x축 상의 CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24, 및 48은 P. capsici로 접종한 후 대조군에서 각각 8, 12, 24, 및 48 h를 참조한다. y축은 유비퀴틴과 비교한 상대적 발현 수준을 나타낸다. 각 열은 세 개의 생물학적 반복실험으로부터의 평균값과 SD(표준 편차)를 더한 값을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 감염된 조직의 조직병리학적 분석. 톨루이딘 블루 O 염색 단독(왼쪽 컬럼)과 코튼 블루 및 사프라닌 O 이중 염색(오른쪽 컬럼)(20X)의 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서, 기저 머리는 손상에 핀찔링하고 검은 후추 식물에 효과적인 접종 시스템을 제공했다. 균사 펠릿은 수분을 유지하고 병원균이 식물을 잘 감염시킬 수 있도록 세 개의 구멍을 덮었습니다. 접종 후, 잎은 노랗게 변하고 떨어졌고 접종 된 식물은 죽었습니다. 대조 식물에서 병변이 발생하지 않았습니다. 대부분의 유전자는 대조군과 비교하여 Phytophthora capsici 로 접종 한 후 다르게 발현되었습니다. 곰팡이 질병은 상당수의 작물에서 구조적 및 생리적 장애를 유발하여 생산자의 생산성 저하와 경제적 손실을 초래합니다. 곰팡이에 의한 식물 조직의 침투 및 식민지화 방식에 대한 조직학적 기술을 이용한 구조 연구는 병원균과 식물 조직 간의 상호작용에 대한 상세한 지표를 제공한다. 이 연구는 질병의 단주기를 이해하는 데 도움이되는 중요한 측면을 밝혀 냈습니다. 감염된 조직의 조직병리학적 분석은 자일렘에서 콜로니화된 피토프토호라 캡시치를 입증하였다. 이 방법은 토양 침지 또는 뿌리 침지를 포함한 전통적인 접종 방법으로 인한 불안정성을 해결하기위한 더 나은 수단을 제공합니다. 검은 후추 식물에 대한 Phytophthora capsici 에 대한 효과적인 접종과 정확한 샘플링 시스템은이 식물 - 병원균 상호 작용을 연구하는 데 필수적입니다. 또한 농업 정밀 육종에서 식물과 다른 토양 매개 식물 병원균 사이의 작용 방식을 연구하기위한 유망한 수단을 제공합니다.
동시에,이 프로토콜은 우디 포도 나무의 배양에 대한 참조를 제공하는보다 효율적인 방법을 나타냅니다. 이전 연구에서, 병원균은 V8 배지9에서 배양된 포자 현탁액으로 뿌리 침지함으로써 접종되었다. 포자 현탁액이 준비되기까지 7 일이 걸리는 반면, Phytophthora capsici 를 배양하기 위해 PDA를 사용하는 데는 5 일 밖에 걸리지 않습니다. PDA 플레이트를 다른 박테리아 및 진균으로부터의 오염을 피하기 위한 수단으로서 투과성 수술 테이프를 사용하여 밀봉하였다. 배양물을 실온에서 유지하였다. 이 연구에 사용 된 방법은 더 많은 시간을 절약하고 더 빠르게 수행 할 수 있습니다. 검은 후추는 많은 당류와 페놀10을 가진 우디 포도 나무이며, Phytophthora capsici 에 의해 생성 된 동물원 포자는 일반적으로 토양에서 발생하므로 검은 후추 덩굴을 감염시키고 뿌리11에 감염 불안정을 일으키기가 어렵습니다. 이 프로토콜은 포도 나무 식물과 토양 매개 병원균 간의 강력한 상호 작용을 가능하게하여 더 나은 결과를 제공합니다. 식물과 병원균 사이의 역동적 인 과정의 탐지는 눈에 띄고 편리합니다.
관개 뿌리 방법은 빠르고 시간을 절약 할 수 있지만 검은 후추에 대해서는 해결되지 않은 채로 남아 있습니다. Phytophthora capsici는 일반적으로 sporangia 및 zoospores12를 통해 식물 뿌리를 감염시키는 토양 매개 병원체입니다. 자연에서 sporangia는 비와 관개를 통해 퍼질 수 있습니다. 일단 동물원 포자가 식물 표면에 부착되면, 생식관은 신속하게 발달하여 식물 조직에 침투하여 감염13,14을 초래할 수 있습니다. 이것은 감염원으로 균사를 선택하는 것이 포자 정지와 유사 할 것이라는 불확실성을 유발할 수 있습니다. 이 연구에 사용 된 방법은 검은 후추 식물의 기저 머리를 꼬집어 손상시키는 것으로 시작됩니다. 손상된 부위는 Phytophthora capsici로 덮여 수분이 유지되어 병원균이 식물을 잘 감염시킬 수 있습니다. 이 방법은 토양 침설 또는 뿌리 침지를 포함한 전통적인 접종 방법으로 인한 불안정성을 해결하는 데 더 좋습니다. 또한 농업 정밀 육종에서 식물과 다른 토양 매개 식물 병원균 간의 작용 방식을 연구하는 유망한 방법입니다.
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Acknowledgments
이 작업은 중국의 국가 핵심 R & D 프로그램 (2020YFD1001200), 중국 농업 연구 시스템 (CARS-11), 하이난 성 학자를위한 혁신 플랫폼 (YSPTZX202154), 중국 하이난 성 자연 과학 재단 (321RC652) 및 중국 자연 과학 재단 (제 31601626 호)의 재정 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
- Gordo, S. M., et al. High-throughput sequencing of black pepper root transcriptome. BMC Plant Biology. 12 (1), (2012).
- Leonian, L. H. Stem and fruit blight of Peppers caused by Phytophthora capsici sp. Nov. Phytopathology. 12 (9), 401-408 (1922).
- Ding, X., et al. Priming maize resistance by its neighbors: Activating 1,4-benzoxazine-3-ones synthesis and defense gene expression to alleviate leaf disease. Frontiers in Plant Science. 6, 830 (2015).
- Fonseca, C. E. L., Vianda, D. R., Hansen, J. L., Pell, A. N. Associations among forage quality traits, vigor, and disease resistance in alfalfa. Crop Science. 39 (5), 1271-1276 (1999).
- Altier, N. A., Thies, J. A. Identification of resistance to Pythium seedling disease in Alfalfa using a culture plate method. Plant Disease. 79 (4), 341-345 (1995).
- Pratt, R. G., Rowe, D. E. Evaluation of simplified leaf inoculation procedures for identification of quantitative resistance to Sclerotinia trifoliorum in Alfalfa seedling. Plant Disease. 82 (10), 1161-1164 (1998).
- Hao, C., et al. De novo transcriptome sequencing of black pepper (Piper nigrum L.) and an analysis of genes involved in phenylpropanoid metabolism in response to Phytophthora capsici. BMC Genomics. 17 (1), 1-14 (2016).
- Dong, C., et al. Field inoculation and classification of maize ear rot caused by Fusarium verticillioides. Bio-protocol. 8 (23), 3099 (2018).
- English, J. T., Laday, M., Bakonyi, J., Schoelz, J. E., Érsek, T. Phenotypic and molecular characterization of species hybrids derived from induced fusion of zoospores of Phytophthora capsica and Phytophthora nicotianae. Mycological Research. 103 (8), 1003-1008 (1999).
- Chatterjee, S., et al. Antioxidant activity of some phenolic constituents from green pepper (Piper nigrum L.) and fresh nutmeg mace (Myristica fragrans). Food Chemistry. 101 (2), 515-523 (2007).
- Pfender, W. F. Production of sporangia and release of zoospores by Phytophthora megasperma in soil. Phytopathology. 67 (5), 657-663 (1977).
- Nagila, A., Schutte, B. J., Sanogo, S., Idowu, O. J. Chile pepper sensitivity to mustard seed meal applied after crop emergence. HortScience. 56 (2), 1-7 (2021).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsica. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Hardham, A., Gubler, F. Polarity of attachment of zoospores of a root pathogen and pre-alignment of the emerging germ tube. Cell Biology International Reports. 14 (11), 947-956 (1990).
