Summary
Pungere la testa basale della pianta di pepe nero è un metodo breve e che fa risparmiare tempo per danneggiarla. Qui, abbiamo fornito passaggi dettagliati con un video per infettare le piante di pepe nero.
Abstract
Piper nigrum L. (pepe nero) è una tipica vite legnosa che è una coltura di spezie economicamente importante in tutto il mondo. La produzione di pepe nero è significativamente influenzata dalla malattia del marciume radicale causata da Phytophthora capsici, che ha seriamente influenzato lo sviluppo del settore come problema del "punto di strozzatura". Tuttavia, il meccanismo genetico molecolare di resistenza nel pepe nero non è chiaro, portando a lenti progressi nello sviluppo di nuove varietà di pepe nero. Un'inoculazione efficace e un preciso sistema di campionamento per Phytophthora capsici sulle piante di pepe nero è essenziale per studiare questa interazione pianta-patogeno. Lo scopo principale di questo studio è quello di dimostrare una metodologia dettagliata in cui la testa basale di pepe nero viene inoculata con Phytophthora capsici, fornendo anche un riferimento per l'inoculazione di piante legnose di vite. La testa basale della pianta di pepe nero è stata punzonata per danneggiarla e i pellet miceliali coprivano i tre fori per trattenere l'umidità in modo che l'agente patogeno potesse infettare bene la pianta. Questo metodo fornisce un modo migliore per risolvere l'instabilità causata dai metodi di inoculazione tradizionali, tra cui l'inzuppamento del terreno o l'immersione delle radici. Fornisce anche un mezzo promettente per studiare la modalità d'azione tra le piante e altri patogeni vegetali trasmessi dal suolo nell'allevamento di precisione agricolo.
Introduction
Il pepe nero (Piper nigrum L.) è un rampicante legnoso e una delle più importanti colture di spezie. È conosciuto come il "Re delle spezie"1 ed è coltivato in oltre 40 paesi e regioni in Asia, Africa e America Latina. Il marciume radicale di Phytophthora è la malattia più devastante del pepe nero ed è causata dall'oomicete Phytophthora capsici. Questo agente patogeno infetta anche cucurbitacee, melanzane, peperoncini e pomodori 2,3. Con il pepe nero, un intero raccolto a volte può essere decimato da questa malattia. L'espansione delle aree di piantagione di pepe è limitata a causa dell'indisponibilità di varietà resistenti, che ha ostacolato in modo significativo lo sviluppo dell'industria cinese del pepe nero. Un'inoculazione efficace e un preciso sistema di campionamento per Phytophthora capsici sulle piante di pepe nero sono essenziali per studiare questa interazione pianta-patogeno.
L'identificazione e lo screening della resistenza nelle risorse del germoplasma è il requisito fondamentale per la ricerca della patogenicità dell'agente patogeno e l'allevamento e l'utilizzo di varietà resistenti. Un approccio ampiamente utilizzato consiste nell'utilizzare una varietà di metodi di identificazione basati su specie vegetali e gruppi patogeni. Gli attuali metodi di identificazione includono l'identificazione della popolazione, l'identificazione individuale, l'identificazione degli organi, l'identificazione dei tessuti, l'identificazione cellulare, l'identificazione biochimica e l'identificazione molecolare, che sono stati sviluppati negli ultimi anni 4,5. C'è stato successo in questi settori, ma ci sono anche molti problemi. Indipendentemente dal metodo scelto, i requisiti di base per l'identificazione della resistenza delle piante sono coerenti, inclusi obiettivi chiari, risultati affidabili e metodi semplici, rapidi e facili da standardizzare. Questo principio deve essere seguito anche nell'identificazione della resistenza al pepe nero.
In condizioni di campo naturale, l'identificazione della resistenza alle malattie può essere influenzata da molti fattori ambientali. Pertanto, è stato proposto di utilizzare in laboratorio foglie staccate e radici irrigate per identificare la resistenza alle malattie. Le foglie giovani di piante sane sono state inoculate in vitro in laboratorio e l'area delle foglie malate è stata misurata inoculando l'agente patogeno al fine di identificare la resistenza alle malattie delle piante6. Tuttavia, l'inoculazione fogliare in vitro può essere utilizzata solo per l'identificazione generale della resistenza e non per studi di interazione molecolare. Nonostante ciò, lo stato di resistenza alle malattie si presenta spesso nell'inoculazione della radice irrigata, causando incertezza nello studio di follow-up dell'allevamento molecolare per la resistenza alle malattie. Pertanto, i metodi di rilevamento interni rapidi e semplici sono essenziali. Questo studio mira a fornire un metodo per l'identificazione della resistenza in laboratorio.
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Protocol
1. Preparazione di piante da taglio del pepe nero per l'infezione
- Prendi un taglio a cinque nodi, lungo circa 40 cm con un diametro di 0,5 cm, da un ramo ortotropico sano e vigorosamente crescente di pepe nero usando un coltello da potatura disinfettato o secateurs. Potare i tre nodi inferiori dei rami plagiotropici, con i due nodi superiori rimasti con circa 10 foglie intatte.
- Preparare il substrato di radicazione contenente terreno e letame animale (sterco di mucca o sterco di pecora) con un rapporto di 1:1. Autoclave del substrato di radicazione a 121 °C per 20 min.
- Inserire le talee nel substrato di radicazione con un angolo di circa 50°, con il terzo nodo che tocca solo la superficie del substrato e la gemma ascellare su questo nodo sopra il substrato.
NOTA: La borsa qui utilizzata ha le seguenti dimensioni: altezza di 40-60 cm, diametro di 25-30 cm. - Versare 10-20 L di acqua sulle radici della pianta. Posizionare le talee in una serra con ombra al 90% a una temperatura di 25-30 ° C per il radicamento e la crescita.
2. Propagazione di Phytophthora capsici (P. capsici)
NOTA: Una scorta di coltura di Phytophthora capsici è mantenuta nel laboratorio di protezione delle piante del Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences7.
- Spennellare e pulire i tuberi di patata sotto l'acqua corrente del rubinetto e quindi tagliare 200 g di patate a cubetti di 1 cm3. Mettere alcuni dei cubetti in un becher contenente 800 ml di acqua a doppio distillato (ddH2O) e far bollire per 20 minuti.
- Filtrare il brodo attraverso una doppia garza utilizzando la filtrazione a gravità. Preparare l'agar destrosio di patate (PDA) aggiungendo 20 g di destrosio e 15 g di agar al filtrato e completando il volume fino a 1 L con ddH2O. Autoclave la miscela a 121 °C per 20 min8.
- Versare 20 ml di PDA sterilizzato in forma liquida in una capsula di Petri rotonda di 9 cm di diametro all'interno di una cappa laminare a flusso d'aria. Lasciare le piastre PDA con i coperchi aperti all'interno della cappa a flusso d'aria laminare durante la notte come mezzo per prevenire la condensa.
- Utilizzare un ciclo di inoculazione per raccogliere i miceli dal brodo di Phytophthora capsici all'interno di una provetta. Posizionare l'inoculo con il lato miceliale a contatto con il PDA in una capsula di Petri.
3. Infezione del pepe nero
- Incubazione
- Identificare un'area a 5 cm sopra la superficie del substrato e vicino alle radici sul gambo per l'inoculazione.
- Estrarre un disco di micelio di 0,5 cm di diametro sul bordo crescente della coltura di Phytophthora capsici su PDA in una capsula di Petri utilizzando una piralide di stopper.
- Danneggiare lo stelo con un ago per siringa e praticare tre fori in un modello triangolare nell'area di inoculazione selezionata. Coprire ogni foro con un disco miceliale. Posizionare i fori l'uno vicino all'altro per garantire che l'area ferita sia completamente coperta con i dischi miceliali.
- Coprire i dischi miceliali con tamponi di cotone inumiditi sterilizzati come mezzo per prevenire l'essiccazione. Legare il tampone sullo stelo con una striscia di polietilene per mantenere la posizione dei dischi inoculanti.
NOTA: A 8 ore dall'inoculazione, i fori inoculati sono diventati neri e la lesione si è estesa con il passare del tempo. Le foglie sono diventate gialle e sono cadute, e la pianta inoculata è morta 7-10 giorni dopo l'inoculazione. Nessuna lesione sviluppata negli impianti di controllo. La maggior parte dei geni si è espressa in modo diverso dopo l'inoculazione con Phytophthora capsici rispetto al gruppo di controllo. L'analisi istopatologica dei tessuti infetti ha dimostrato che Phytophthora capsici ha colonizzato nello xilema.
- Campionare i materiali vegetali di interesse e conservarli a -80 °C in azoto liquido per l'uso in studi successivi.
NOTA: azoto liquido, sacchetti di plastica, pennarelli, cesoie e altri materiali sono stati preparati prima degli esperimenti. - Dopo che i materiali vegetali specifici sono stati campionati per l'uso, autoclave tutti i materiali vegetali rimanenti, la coltura e il terreno di coltura di Phytophthora capsici rimanenti e tutti gli strumenti e gli articoli da laboratorio utilizzati in questo lavoro di inoculazione.
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Representative Results
La Figura 1 mostra i sintomi delle foglie di pepe nero dopo l'inoculazione di P. capsici . La Figura 2 mostra i sintomi degli steli di pepe nero dopo l'inoculazione di P. capsici . L'agente patogeno ha infettato il pepe nero sul gambo basale; sintomi tra cui ingiallimento delle foglie, avvizzimento che appare, imbrunimento dello xilema e oscuramento dei vasi che appaiono gradualmente. La Figura 3 mostra la maggior parte dei geni espressi in modo diverso dopo l'inoculazione con Phytophthora capsici rispetto al gruppo di controllo. La Figura 4 ha dimostrato Phytophthora capsici colonizzata nello xilema mediante l'analisi istopatologica dei tessuti infetti.
Figura 1: I sintomi delle foglie di pepe nero a seguito dell'inoculazione di P. capsici 7. CK: gruppo di controllo; Inoculato: dopo inoculazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il sintomo dei gambi di pepe nero dopo l'inoculazione di P. capsici 7. Inoculato: dopo inoculazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Profili di espressione dettagliati dei geni nelle radici del pepe nero. Le barre di errore nelle figure denotano l'errore standard dei livelli di espressione da tre repliche biologiche. CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24 e 48 sull'asse x si riferiscono a 8, 12, 24 e 48 h sul controllo e 8, 12, 24 e 48 h, rispettivamente, dopo l'inoculazione con P. capsici. L'asse y rappresenta il livello di espressione relativo rispetto all'ubiquitina. Ogni colonna rappresenta il valore medio più SD (deviazione standard) da tre repliche biologiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi istopatologica dei tessuti infetti. Il confronto tra la colorazione O blu toluidina da sola (colonna di sinistra) e la doppia colorazione blu cotone e safraninA O (colonna destra) (20X). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, la testa basale è stata punzonata per danneggiare e fornire un efficace sistema di inoculazione nella pianta del pepe nero. I pellet miceliali hanno quindi coperto i tre fori per trattenere l'umidità e consentire all'agente patogeno di infettare bene la pianta. Dopo l'inoculazione, le foglie sono diventate gialle e sono cadute e le piante inoculate sono morte. Nessuna lesione sviluppata negli impianti di controllo. La maggior parte dei geni si è espressa in modo diverso dopo l'inoculazione con Phytophthora capsici rispetto al gruppo di controllo. Le malattie fungine sono responsabili di disturbi strutturali e fisiologici in un numero significativo di colture, portando a una diminuzione della produttività e perdite economiche per i loro produttori. Studi strutturali che impiegano tecniche istologiche sulle modalità di penetrazione e colonizzazione dei tessuti vegetali da parte dei funghi forniscono un'indicazione dettagliata delle interazioni tra l'agente patogeno e il tessuto vegetale. Questi studi hanno rivelato aspetti importanti per aiutare a comprendere il monociclo delle malattie. L'analisi istopatologica dei tessuti infetti ha dimostrato che Phytophthora capsici è colonizzata nello xilema. Questo metodo fornisce un mezzo migliore per risolvere l'instabilità causata dai metodi di inoculazione tradizionali, tra cui l'inzuppamento del terreno o l'immersione delle radici. Un'efficace inoculazione e un preciso sistema di campionamento per Phytophthora capsici sulle piante di pepe nero sono essenziali per studiare questa interazione pianta-patogeno. Fornisce anche un mezzo promettente per studiare la modalità d'azione tra le piante e altri patogeni vegetali trasmessi dal suolo nell'allevamento di precisione agricolo.
Allo stesso tempo, questo protocollo rappresenta un modo più efficiente di fornire riferimento per l'incubazione della vite legnosa. In studi precedenti, i patogeni sono stati inoculati mediante immersione radicale con sospensioni di spore coltivate in terreno V89. Ci vogliono 7 giorni perché la sospensione di spore sia pronta, mentre l'uso del PDA per la coltura di Phytophthora capsici richiede solo 5 giorni. La piastra PDA è stata sigillata utilizzando nastro chirurgico permeabile come mezzo per evitare la contaminazione da altri batteri e funghi. Le colture sono state mantenute a temperatura ambiente. Il metodo utilizzato in questo studio può far risparmiare più tempo ed essere eseguito più rapidamente. Il pepe nero è una vite legnosa con molti zuccheri e fenoli10, e le zoospore prodotte da Phytophthora capsici si verificano generalmente nei terreni, rendendo difficile infettare le viti di pepe nero e causare instabilità infettiva nella radice11. Questo protocollo fornisce risultati migliori, consentendo una forte interazione tra le piante di vite e gli agenti patogeni trasmessi dal suolo. Il rilevamento del processo dinamico tra piante e agenti patogeni è visibile e conveniente.
Il metodo di irrigazione della radice è veloce e fa risparmiare tempo, ma un problema rimane irrisolto per il pepe nero. Phytophthora capsici è un patogeno trasmesso dal suolo che generalmente infetta le radici delle piante attraverso sporangi e zoospore12. In natura, gli sporangi sono in grado di diffondersi attraverso la pioggia e l'irrigazione. Una volta che le zoospore si attaccano alla superficie della pianta, i tubi germinali possono svilupparsi rapidamente e penetrare nel tessuto vegetale, il che si traduce in infezione13,14. Ciò può causare incertezza sul fatto che la scelta delle ife come fonte di infezione sarà simile alla sospensione di spore. Il metodo utilizzato in questo studio inizia con la puntura di spillo della testa basale della pianta di pepe nero per danneggiarla. L'area danneggiata viene quindi coperta con Phytophthora capsici e l'umidità viene trattenuta, assicurando che l'agente patogeno possa infettare bene la pianta. Questo metodo è migliore per risolvere l'instabilità causata dai metodi di inoculazione tradizionali, tra cui l'inzuppamento del terreno o l'immersione delle radici. È anche un metodo promettente per studiare la modalità d'azione tra le piante e altri patogeni vegetali trasmessi dal suolo nell'allevamento di precisione agricolo.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal National Key R&D Program of China (2020YFD1001200), dal China Agriculture Research System (CARS-11), dal fondo di ricerca specifico di The Innovation Platform for Academicians of Hainan Province (YSPTZX202154), dalla Natural Science Foundation of Hainan Province of China (321RC652) e dalla Natural Science Foundation of China (No. 31601626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
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