Digital droplet PCR-metode til kvantificering af AAV Transduktionseffektivitet i Murine Retina
Summary
Denne protokol præsenterer, hvordan man kvantificerer AAV transduktion effektivitet i musen nethinden ved hjælp af digital dråbe PCR (dd-PCR) sammen med lille skala AAV produktion, intravitreal injektion, retinal billeddannelse, og retinal genomisk DNA isolation.
Abstract
Mange retinale cellebiologi laboratorier nu rutinemæssigt bruge Adeno-associerede vira (AAVs) til genredigering og lovgivningsmæssige applikationer. Effektiviteten af AAV transduktion er normalt kritisk, hvilket påvirker de samlede eksperimentelle resultater. En af de vigtigste determinanter for transduktionseffektivitet er serotypen eller varianten af AAV-vektoren. I øjeblikket, forskellige kunstige AAV serotyper og varianter er tilgængelige med forskellige tilhørsforhold til at være vært celle overflade receptorer. For retinal genterapi resulterer dette i varierende grader af transduktionseffektivitet for forskellige retinale celletyper. Derudover kan injektionsruten og kvaliteten af AAV-produktionen også påvirke den retinale AAV-transduktionseffektivitet. Derfor er det vigtigt at sammenligne effektiviteten af forskellige varianter, batches og metoder. Den digitale dråbe PCR (dd-PCR) metode kvantificerer nukleinsyrer med høj præcision og tillader udførelse af absolut kvantificering af et givet mål uden nogen standard eller en reference. Ved hjælp af dd-PCR er det også muligt at vurdere transduktionseffektiviteten af AAVs ved absolut kvantificering af AAV-genomkopinumre i en injiceret nethinde. Her giver vi en enkel metode til at kvantificere transduktionshastigheden for AAVs i retinale celler ved hjælp af dd-PCR. Med mindre ændringer kan denne metode også danne grundlag for kvantificeringen af mitokondrie-DNA’et med kopinummeret samt vurdering af effektiviteten af baseredigering, kritisk for flere retinale sygdomme og genterapiapplikationer.
Introduction
Adeno associerede vira (AAVs) er nu almindeligt anvendt til en række retinale genterapi undersøgelser. AAVs giver en sikker og effektiv måde at genlevering med mindre immunogenicitet og færre genomintegrationer. AAV-indtræden i målcellen sker gennem endokytose, hvilket kræver binding af receptorer og co-receptorer på celleoverfladen1,2. Derfor afhænger transduktionseffektiviteten af AAVs for forskellige celletyper hovedsageligt af capsid og dens interaktioner med værtscellereceptorerne. AAVs har serotyper og hver serotype kan have forskellige cellulære / væv troper og transduktion effektivitetsgevinster. Der er også kunstige AAV serotyper og varianter genereret af kemisk modifikation af virus capsid, produktion af hybrid capsids, peptid indsættelse, capsid shuffling, rettet evolution, og rationel mutagenese3. Selv mindre ændringer i aminosyresekvens eller capsidstruktur kan have indflydelse på interaktioner med værtscellefaktorer og resultere i forskellige troper4. Ud over capsid varianter, andre faktorer som injektion rute og batch-til-batch variation af AAV produktion kan påvirke transduktion effektivitet AAVs i neuronal nethinden. Derfor er pålidelige metoder til sammenligning af transduktionshastigheder for forskellige varianter nødvendige.
De fleste af metoderne til bestemmelse af AAV transduktion effektivitet stole på reporter genekspression. Disse omfatter fluorescerende billeddannelse, immunohistochemistry, western blot, eller histokemisk analyse af reporter genprodukt5,6,7. På grund af AAVs størrelsesbegrænsning er det imidlertid ikke altid muligt at inkludere reportergener for at overvåge transduktionseffektiviteten. Brug af stærke initiativtagere som hybrid CMV forstærker / kylling beta-actin eller Woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatoriske element (WPRE) som en mRNA stabilisator sekvens yderligere komplicerer størrelsen problem8. Derfor vil det også være gavnligt at definere transduktionshastigheden for injicerede AAVs med en mere direkte metode.
Digital dråbe PCR (dd-PCR) er en kraftfuld teknik til at kvantificere mål-DNA fra små mængder prøver. dd-PCR-teknologi afhænger af indkapsling af mål-DNA- og PCR-reaktionsblandingen ved hjælp af oliedråber. Hver dd-PCR-reaktion indeholder tusindvis af dråber. Hver dråbe behandles og analyseres som en uafhængig PCR-reaktion9. Analyse af dråber gør det muligt at beregne det absolutte kopiantal af mål-DNA-molekyler i enhver prøve ved blot at bruge Poisson-algoritmen. Da transduktionseffektiviteten af AAVs er korreleret med kopinummeret af AAV-genomer i neuronal nethinden, brugte vi dd-PCR-metoden til at kvantificere AAV-genomer.
Her beskriver vi en dd-PCR-metode til beregning af transduktionseffektiviteten af AAV-vektorer fra retinal genomisk DNA6,10. For det første blev AAVs, der udtrykker tdTomato-reporter, genereret ved hjælp af protokollen i lille skala og titered af dd-PCR-metoden11. For det andet blev AAVs intravitreally injiceret i neuronal nethinden. For at demonstrere transduktionseffektiviteten kvantificerede vi først tdTomato-udtrykket ved hjælp af fluorescerende mikroskopi og ImageJ-software. Dette blev efterfulgt af isolering af genomisk DNA til kvantificering af AAV-genomer i injicerede nethinder ved hjælp af dd-PCR. Sammenligning af tdTomato-ekspressionsniveauer med de transduced AAV-genomer kvantificeret ved dd-PCR viste, at dd-PCR-metoden nøjagtigt kvantificerede AAV-vektorernes transduktionseffektivitet. Vores protokoller viste en detaljeret beskrivelse af en dd-PCR-baseret metode til at kvantificere AAV transduktionseffektivitet. I denne protokol viser vi også det absolutte antal AAV-genomer, der overføres efter intravitreale injektioner ved blot at bruge fortyndingsfaktoren efter genomisk DNA-isolering og dd-PCR-resultaterne. Samlet set giver denne protokol en kraftfuld metode, som ville være et alternativ til reporter udtryk til at kvantificere transduktion effektivitetsgevinster af AAV vektorer i nethinden.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol genererede vi to AAV-vektorer, der har forskellige capsidproteiner og titered dem derefter i overensstemmelse hermed. Et af de mest afgørende trin i denne protokol er at producere tilstrækkelige mængder AAVs , der vil give påviselige reporter udtryk efter transduktion12,13.
Titering af AAVs er også en vigtig faktor til at justere doser af AAV for intravitreal injektioner. Når disse vigtige kriterier er opfyldt…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Oezkan Keles, Josephine Jüttner og Prof. Botond Roska, Institut for Molekylær og Klinisk Oftalmologi Basel, Complex Virus Platform for deres hjælp og støtte til AAV produktion. Vi vil også gerne takke Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania for AAV8/BP2 stamme. Dyrearbejde udføres på Gebze Technical University dyreanlæg. For det takker vi Leyla Dikmetas og prof. Uygar Halis Tazebay for teknisk bistand og støtte til husdyrhold. Vi vil også gerne takke Dr. Fatma Ozdemir for hendes kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde er støttet af TUBITAK, tilskud numre 118C226 og 121N275, og Sabanci University Integration tilskud.
Materials
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA  LAÇ SANAY VE TCARET A. . |
N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER – LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim laç Sanayi ve Ticaret A.. |
S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
Referenzen
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).
