Photodegradierbare Hydrogel-Grenzflächen für Bakterienscreening, -selektion und -isolierung

Summary

Die Verwendung von photoabbaubaren Hydrogelen zur Isolierung von Bakterienzellen unter Verwendung eines hochauflösenden Lichtmusterwerkzeugs wird berichtet. Wesentliche experimentelle Verfahren, Ergebnisse und Vorteile des Verfahrens werden überprüft. Die Methode ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Isolierung von Zielbakterien mit seltenen oder einzigartigen Funktionen aus heterogenen Gemeinschaften oder Populationen.

Abstract

Biologen haben lange versucht, die Beziehung zwischen Phänotyp und Genotyp zu verstehen. Um diesen Zusammenhang besser zu verstehen, ist es entscheidend, praktische Technologien zu entwickeln, die mikroskopisches Zellscreening mit zellisolierter Hochreparation für die nachgelagerte genetische Analyse koppeln. Hier wird die Verwendung von photoabbaubaren Poly(ethylenglykol)hydrogelen zum Screening und zur Isolierung von Bakterien mit einzigartigen Wachstumsphänotypen aus heterogenen Zellpopulationen beschrieben. Die Methode beruht auf der Verkapselung oder dem Einfangen von Zellen mit dem Hydrogel, gefolgt von Kultur, mikroskopischem Screening, dann Verwendung eines hochauflösenden Lichtstrukturierungswerkzeugs zur raumzeitlichen Kontrolle des Hydrogelabbaus und Freisetzung ausgewählter Zellen in eine Lösung zur Rückgewinnung. Die Anwendung verschiedener Lichtmuster ermöglicht die Kontrolle über die Morphologie der extrahierten Zelle, und Muster wie Ringe oder Kreuze können verwendet werden, um Zellen mit minimaler direkter UV-Lichtexposition abzurufen, um DNA-Schäden an den Isolaten zu mildern. Darüber hinaus liefert das Lichtstrukturierungswerkzeug eine einstellbare Lichtdosis, um verschiedene Abbau- und Zellfreisetzungsraten zu erreichen. Es ermöglicht eine Degradation mit hoher Auflösung und ermöglicht den Zellabruf mit räumlicher Präzision im Mikrometerbereich. Hier wird die Verwendung dieses Materials zum Screening und Abrufen von Bakterien sowohl aus Bulk-Hydrogelen als auch aus mikrofabrizierten Lab-on-a-Chip-Geräten demonstriert. Die Methode ist kostengünstig, einfach und kann für häufige und aufkommende Anwendungen in der Mikrobiologie verwendet werden, einschließlich der Isolierung von Bakterienstämmen mit seltenen Wachstumsprofilen aus Mutantenbibliotheken und der Isolierung von Bakterienkonsortien mit emergenten Phänotypen für genomische Charakterisierungen.

Introduction

Die Isolierung von Zellen mit einzigartigem Verhalten aus einer komplexen und heterogenen Umgebung ist grundlegend für die Gewinnung genetischer Informationen in der Biologie¹. In der Mikrobiologie wird die Selektion und Isolierung seltener oder einzigartiger Mikroben nach Beobachtung in vielen Anwendungen wichtig, die eine Verbindung zwischen genomischen Informationen und beobachtbaren phänotypischen Informationen erfordern. Zu diesen Anwendungen gehören die Auswahl phänotypisch seltener Stämme aus Mutantenbibliotheken², die Auswahl von Keystone-Mikroorganismen aus komplexen mikrobiellen Gemeinschaften^3,4und die Auswahl phänotypisch seltener, aber wichtiger Bakterien aus isogenen Populationen. Die Isolierung lebensfähiger, aber nicht kulturierbarer Zellen (VBNC) aus einer Bakterienpopulation ist ein wichtiges Beispiel für letztere, bei der Zellen mit dem VBNC-Phänotyp häufig in Bakterienpopulationen im Verhältnis 1:10² bis 1:10^{5 5} versteckt sind^5,6. Aufgrund der weit verbreiteten Schwierigkeiten bei der Bakterienisolierung bleibt über viele phänotypisch seltene Mikroorganismen vieles unbekannt. Diese Einschränkungen unterstreichen die Notwendigkeit von Zellisolationstechniken, um zuerst die Zielzelle(n) aus einer Mischung zu identifizieren und sie dann für die nachgeschaltete molekulare Analyse abzurufen und zu isolieren⁷.

Einige der am häufigsten etablierten Methoden der Zellisolierung umfassen durchflusszytometrie und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)^8,immunmagnetische Trennung^9,10und Mikrofluidik¹¹. Während diese Isolationsmethoden einen hohen Wert haben, haben sie auch Nachteile, die ihre Verwendung einschränken. Zum Beispiel kann FACS eine routinemäßige mikrobielle Isolierung auf Einzelzellebene für die nachfolgende genomische Analyse³ bieten, ist aber oft durch seine Verfügbarkeit und Kosten sowie durch nachgelagerte^{Kontaminationsprobleme begrenzt 11}. Mikrofluidische Ansätze wie die mikrofluidische Durchflusszytometrie haben viel Aufmerksamkeit erregt, was im Vergleich zur herkömmlichen Durchflusszytometrie eine signifikante Reduzierung des erforderlichen Probenvolumens ermöglicht¹². Die Trennung und das Abrufen einzelner oder kleiner Zellsammlungen aus mikrofluidischen Geräten ist jedoch oft ein herausforderndes Problem, das typischerweise eine komplexere Einrichtung und ein komplexeres Gerätedesign erfordert¹³. Viele mikrofluidische Ansätze charakterisieren Zellen genetisch, bevor sie in eine Vorrichtung¹⁴eingegeben und beobachtet werden, wodurch die Anzahl der einzigartigen Spezies, die bei der Durchführung eines funktionellen Screenings beobachtet werden, begrenzt wird. Angesichts dieser Einschränkungen ist eine weitere Innovation sowohl von Methoden als auch von Materialien, die für das Screening und die Isolierung von Zellen praktikabel sind, für den breiten Einsatz in vielen Labors erforderlich.

Dieser Beitrag stellt einen neuen, materialbasierten Ansatz für das Screening und die Isolierung von Bakterien vor. Die Methode verwendet photoabbaubare Hydrogele für die Zellverkapselung, Kultur, mikroskopische Beobachtung und On-Demand-Freisetzung und -Wiederherstellung von Zielbakterien mit einzigartigen Phänotypen. Hydrogele sind so konzipiert, dass sie eine Maschenweite von 10 nm enthalten, wobei jede Vernetzung o-Nitrobenzylgruppen¹⁵enthält. Das Material verkapselt oder fängt Zellen zur Beobachtung ein und ermöglicht gleichzeitig die Diffusion von Nährstoffen und Abfallprodukten zu und von Zellen für die Kultur. Die Exposition des Materials gegenüber einer gemusterten 365 nm UV-Lichtquelle durch ein aufrechtes Mikroskop ermöglicht den lokalen Abbau des Hydrogels durch Photokleave der o-Nitrobenzylgruppen^{16, 17}. Der Abbau löst die selektive Freisetzung von Zellen zur Erholung für die nachgelagerte Analyse aus, einschließlich genomischer und möglicherweise proteomischer und transkriptomischer Analysen. Der Versuchsaufbau und das Protokoll sind relativ einfach, kostengünstig und in mikrobiologische Labore translational. Es erfordert nur die Zellverkapselung durch Hydrogelbildung, die Beobachtung von gefangenen Zellen mit einem aufrechten Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskop und die Beleuchtung von Zellen von Interesse mit einer strukturierten UV-Lichtquelle zum Abrufen.

Ein wesentlicher Vorteil dieses materialbasierten Screening-Ansatzes ist seine Anpassungsfähigkeit an verschiedene Screening-Formate. In seinem einfachsten Format kann das Material zum Screening verwendet werden, indem eine heterogene Zellsammlung in Bulk-Hydrogelen eingekapselt wird. Zellen werden dann für den gewünschten Phänotyp beobachtet und einzelne Zellen von Interesse werden zur genomischen Charakterisierung entfernt. In aufwendigeren Formaten kann das Material auch in Lab-on-a-Chip-Geräte integriert werden, um eine präzise Zellfreigabe und -entnahme aus den gewünschten Bereichen des Geräts zu ermöglichen. Beide Formate werden hier beschrieben, und beide haben kürzlich neuartige mikrobielle Screening- und Selektionsanwendungen^{ermöglicht 17,18,19}. Die Methode wird hier mit Modell-Gram-negativen Organismen (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) und einem Modell-Gram-positiven Organismus (Bacillus subtilis) demonstriert und wurde leicht auf eine Vielzahl anderer Bakterien ausgedehnt.

Protocol

1. Bakterienstämme und Kulturprotokolle

1. Streifenkolonien von Bakterien auf Agarplatten, ergänzt mit geeigneten Wachstumsmedien. In diesem Bericht wird B. subtilis (Stamm 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) auf ATGN (0,079 M_KH2PO₄, 0,015 M_(NH4)_2SO4, 0,6 mM MgSO₄·7H₂O, 0,06 mM CaCl₂·2H₂O, 0,0071 mM MnSO₄· _H2O, 0,125 M FeSO_4· 7H₂O, 28 mM Glucose, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L Agar) Agarplatten ergänzt mit 100 μg/ml Spectinomycin und E. coli (Stamm 25922, ATCC) auf ATGN Agarplatten ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin.
   HINWEIS: Frühere Berichte über hydrogelverkapselung und -freisetzung mit diesen Materialien aus Fattahi et al.¹⁹ verwendeten stattdessen A. tumefaciens C58-Zellen
2. Wählen Sie die gewünschten Kolonien aus ATGN-Agarplatten und beginnen Sie mit den Kulturen über Nacht. Für die hier verwendeten Stämme E. coli und B. subtilis wird 24 h bei 37 °C beim Schütteln bei 215 U/min in ATGN Flüssigmedium kultiviert. Lagern Sie die Zellkulturen in 50% Glycerin bei -80 °C bis zur späteren Verwendung.
3. Entnehmen Sie Kolonien beider Stämme aus Glycerinvorräten unter Verwendung steriler Impfschleifen und inkubieren Sie in ATGN-flüssigen Medien für 24 h bei 37 °C und 215 U / min.

2. Vorbereitung des für die Hydrogelbildung benötigten Materials

1. Photoabbaubare PEG-o-NB-Diacrylat-Synthese
   ANMERKUNG: Die hauseigene Synthese des PEG- o-NB-Diakrylats wurde gut beschrieben und zuvor berichtet^16,17. Da die Synthese Routine ist, kann sie alternativ aus einer chemischen Syntheseanlage ausgelagert werden.
2. Vernetzungspuffer
   1. Nehmen Sie die Rezeptur des ausgewählten Mediums für den Bakterienstamm und bereiten Sie Medien mit 2x Nährstoffen vor. Phosphat, z.B._NaH2PO4,in das Medium auf eine Endkonzentration von 100 mM geben. Stellen Sie dann den pH-Wert mit 5 M NaOH (aq) auf 8 ein.
   2. Sterilisieren Sie die Pufferlösung und lagern Sie sie bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung.
      HINWEIS: Lassen Sie alle im Medium vorhandenen Übergangsmetalle weg, da diese Metalle die Oxidation der Thiole zu Disulfiden katalysieren.
3. PEG-o-NB-Diacrylat-Lösung
   1. Für jedes mg des aliquoten PEG- o-NB-Diacrylatpulvers (3.400 Da Molekulargewicht) werden 3,08 μL Reinstwasser zugegeben, um eine Konzentration von 49 mM PEG-o-NB-diacrylat(98 mM Acrylatkonzentration) zu erreichen.
   2. Die Lösung vortreiben, bis sie gut vermischt ist, und diese Lösung bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C lagern.
4. 4-Arm-PEG-Thiol-Lösung
   1. Für die 4-Arm-PEG-Thiol-Zubereitung (10.000 Da Molekulargewicht) werden 4 μL Reinstwasser pro mg Pulver zugegeben, um eine Konzentration von 20 mM (80 mM Thiolkonzentration) zu erreichen.
   2. Wirbeln Sie diese Lösung vor, bis sie gut gemischt ist, und lagern Sie diese Lösung bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung.

3. Herstellung von perfluoralkylierten (nicht reaktiven) Deckgläsern

1. Legen Sie bis zu 5 Glasobjektträger (25 mm x 75 mm x 1 mm) in einen Polypropylen-Dia-Mailer. Beschallen Sie die Objektträger mit einer 2% igen (w/v) Reinigungsmittellösung (Materialtabelle) für 20 min.
2. Spülen Sie die Objektträger dreimal mit Reinstwasser ab und beschallen Sie die Objektträger 20 Minuten lang in Wasser. Trocknen Sie die Rutschen mit einem Strom von_N2.
3. Plasmareinigung (siehe Materialtabelle)auf beiden Seiten der Glasobjektträger gemäß protokoll in Abschnitt 4.1 für 2 min.
4. Legen Sie die plasmagereinigten Objektträger wieder in den Objektträgerversender und füllen Sie den Behälter mit einer 0,5% (v / v) -Lösung von Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H, 2H, -perfluoroctyl) silan in Toluol. Lassen Sie diese Glasobjektträger für 3 h bei Raumtemperatur (RT) funktionalisieren.
5. Nachdem die Dias funktionalisiert sind, spülen Sie die Dias im Slide Mailer ab, zuerst mit Toluol und dann mit Ethanol (dreimal mit jedem Lösungsmittel). Als nächstes trocknen Sie jede funktionalisierte Rutsche mit einem Strom von_{N 2}.

4. Herstellung von Thiol-funktionalisierten (Basis-) Deckgläsern

1. Reinigung der Glasdeckgläser mit einem Plasmareiniger
   1. Legen Sie 18 mm x 18 mm Deckgläser in eine Petrischale. Stellen Sie dann die Petrischale in eine Plasmareinigerkammer und schalten Sie die Leistung des Plasmareinigers ein.
   2. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, um die Luft in der Kammer zu reinigen, bis das Manometer 400 mTorr anzeigt.
   3. Öffnen Sie das Dosierventil, um Luft in die Kammer zu lassen, bis das Manometer einen konstanten Druck (800-1000 mTorr) erreicht. Wählen Sie dann RF mit dem Modus "Hi" und belichten Sie die Deckgläser für 3 Minuten.
   4. Schalten Sie nach 3 Minuten den HF-Modus und die Vakuumpumpe aus.
   5. Nehmen Sie die Petrischale aus der Kammer, drehen Sie die Deckgläser um und legen Sie sie zurück in die Kammer, um die andere Seite des Glasdeckglases mit Plasma freizulegen.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.2-4.1.4, um die unbehandelte Seite des Glasdeckglases plasmazureinen.
   7. Entfernen Sie nach Abschluss des Vorgangs die Petrischale aus der Kammer und schalten Sie den Plasmareiniger und die Vakuumpumpe aus.
2. Reinigung und Hydroxylierung der Deckgläser mit Piranha-Lösung
   HINWEIS: Standard-Piranha-Reinigungsprotokolle können verwendet werden, um Glasrutschen zu reinigen und zu hydroxylieren. Piranha-Lösung ist ein 30:70 (v/v) Gemisch aus_H2O2 und_H2SO4. Alternative Methoden zur Reinigung von Glasdeckgläsern können ebenfalls verwendet werden.
   VORSICHT: Piranha-Lösung ist stark korrosiv und explosiv mit organischen Lösungsmitteln und sollte mit äußerster Vorsicht gehandhabt werden. Es sollten geeignete Sicherheits- und Eindämmungsmaßnahmen ergriffen werden, z. B. die Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, chemikalienbeständige Schürze, Schutzbrille, Gesichtsschild, säurebeständige Butylhandschuhe). Alle Glaswaren und Arbeitsflächen, die mit Piranha-Lösung in Berührung kommen, sollten vor der Verwendung sauber, trocken und frei von organischen Rückständen sein. Piranha-Lösung sollte niemals in einem teilweise geschlossenen oder geschlossenen Behälter gelagert werden.
   1. Legen Sie eine saubere 100 mm x 50 mm Glasschale auf einen Magnetrührer mit einstellbarer Rührgeschwindigkeit unter einem Abzug und geben Sie 14 ml H₂SO₄ in die Schüssel.
   2. Legen Sie einen kleinen, teflonbeschichteten Magnetrührstab mit einer teflonbeschichteten Pinzette vorsichtig in die Schale. Drehen Sie dann den Rührer langsam, um ein Spritzen der Säure zu vermeiden.
   3. Als nächstes vorsichtig 6 ml_H2O2in die Schale geben und die Lösung gut mischen lassen.
   4. Schalten Sie den Rührer aus und nehmen Sie dann den Rührstab mit der Pinzette aus der Schüssel. Als nächstes legen Sie die Deckgläser vorsichtig mit der Pinzette in die Schale und stellen sie die Temperatur auf 60–80 °C ein.
   5. Nach 30 Minuten die Deckgläser vorsichtig mit der Pinzette entfernen und zweimal in entionisiertes Wasser (DI) tauchen, um die restliche Piranha-Lösung abzuwaschen.
   6. Nach dem Abspülen mit Wasser die Deckgläser bis zur weiteren Verwendung in DI-Wasser bei RT aufbewahren.
   7. Schalten Sie die Kochplatte aus und lassen Sie die Piranha-Lösung abkühlen.
   8. Um die Piranha-Lösung zu entsorgen, legen Sie die 100 mm x 50 mm große Glasschale mit der abgekühlten Piranha-Lösung vorsichtig in ein größeres, leeres Glasbecherglas mit einem Volumen von mindestens 1,5 l. Dann fügen Sie 1 L Wasser zum Verdünnen hinzu und fügen Sie Natriumbicarbonatpulver hinzu, um es zu neutralisieren. Beachten Sie, dass Natriumbicarbonat Blubbern und Wärmeentwicklung verursacht und sehr langsam hinzugefügt werden sollte, da sonst das Blubbern zu einem Spritzen der Säure führen kann. Wenn die weitere Zugabe von Natriumbicarbonat kein Blubbern verursacht, überprüfen Sie den pH-Wert mit pH-Papier, um sicherzustellen, dass es neutralisiert wurde. Sobald die Lösung neutralisiert und abgekühlt ist, kann sie in die Spüle gegossen werden.
3. Thiol-Funktionalisierung der Deckgläser
   1. Eine 5% ige (v/v) Lösung von 269 mM (3-Mercaptopropyl) Trimethoxysilan (MPTS) Lösung in trockenem Toluol herstellen.
   2. Geben Sie 10 ml der Lösung in einzelne konische 50 ml Zentrifugenröhrchen und legen Sie einen gereinigten Deckglas in jedes Röhrchen und tauchen Sie ihn in die Lösung ein.
      HINWEIS: Ein Deckglas pro 50 ml Röhrchen wird verwendet, um die Thiolierung beider Seiten des Substrats zu gewährleisten, ohne durch andere Substrate gestört zu werden.
   3. Nach 4 h jeden Deckglas (vier Wäschen pro Deckglas) mit Toluol, einem 1:1 (v/v) Ethanol: Toluol-Gemisch und Ethanol waschen.
      HINWEIS: Dies geschieht, indem jeder Deckglas nacheinander in konische Zentrifugenröhrchen getaucht wird, die die genannten Lösungen enthalten.
   4. Nach dem Spülen des Substrats tauchen Sie es in Ethanol ein und lagern Sie es bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung.
      HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der Deckgläser kann diese Methode aufgrund der Behandlung von Deckgläsern nacheinander mühsam werden. Für mehrere Deckgläser können Columbia-Gläser verwendet werden, die auf mehrere Deckgläser gleichzeitig passen.

5. Herstellung von Silizium-Microwell-Arrays

1. Parylen-Beschichtung: Verwenden Sie das in früheren Forschungsartikeln^20,21 beschriebene^{Standardprotokoll,}um Siliziumwafer mit Parylen zu beschichten.
2. Mikrofabrikation: Befolgen Sie das von Barua et al.¹⁸ beschriebene Protokoll, um das Mikrotiterplattenarray zu entwerfen und herzustellen (Ergänzende Abbildung 1).
   ANMERKUNG: Die von Timm et al.¹⁷ beschriebenen photolithographischen Standardtechniken wurden zur Herstellung von Mikrotiterplattenarrays auf Parylen-beschichteten Siliziumwafern angewendet.

6. Hydrogelbildung

1. Hydrogelbildung in großen Mengen auf Glasdeckgläsern
   1. Hydrogel-Vorläuferlösung: 12,5 μL des Vernetzungspuffers in ein 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben,gefolgt von 5,6 μL PEG- o-NB-Diacrylatlösung. Schließlich werden 6,9 μL 4-Arm-PEG-Thiol-Lösung zu der Mischung gegeben.
      HINWEIS: Die Zugabe des 4-Arm-PEG-Thiols zum Gemisch löst die Vernetzungsreaktion aus. Daher sollte die Hydrogel-Vorläuferlösung unmittelbar nach dem Mischen verwendet werden.
   2. Für die Zellverkapselung in der Hydrogelvorläuferlösung führen Sie die Schritte 6.1.3-6.1.9 aus.
   3. Für die Zellverkapselung ist vor Schritt 6.1.1 der Vernetzungspuffer mit der gewünschten Zelldichte zu impfen. Wie bereits berichtet¹⁹, wurde beobachtet, dass eine Zelldichte von 7,26 × 10⁷ KBE/ml im Vernetzungspuffer mit einer Dichte von ~ 90 Zellen/mm2 korreliert, die über das Hydrogel verkapselt sind.
   4. Legen Sie den thiolierten Bodendeckslip auf eine saubere Petrischale. Platzieren Sie zwei Abstandshalter (siehe Materialtabelle)auf den beiden gegenüberliegenden Seiten des Deckglases.
      HINWEIS: Die Thiolfunktionalisierung der Deckgläser ist für die kovalente Befestigung des Hydrogels an der Deckglasoberfläche notwendig. Dies geschieht durch die Reaktion von Thiolgruppen auf der Oberfläche und den in der Hydrogelvorläuferlösung vorhandenen Acrylatgruppen.
   5. Befestigen Sie die Abstandshalter auf dem Bodendeckglas, indem Sie die Abstandshalter an die Petrischale kleben.
   6. Das gewünschte Volumen der Vorläuferlösung wird auf einen nicht reaktiven, perfluoralkylierten Glasobjektträger pipettiert.
   7. Legen Sie den perfluoralkylierten Glasobjektträger auf den Bodendeckstein (Abbildung 1C). Warten Sie bei RT 25 Minuten, bis die Hydrogelbildung abgeschlossen ist.
   8. Nach der Gelierung den perfluoralkylierten Glasobjektträger vorsichtig entfernen. Das Hydrogel bleibt am Bodendeckglas befestigt.
      HINWEIS: Verwenden Sie für 18 mm x 8 mm Deckgläser, um eine 12,7 μm dicke Membran zu erhalten, ~ 7 μL der Vorläuferlösung (Abbildung 1A, B). Die Verwendung größerer Mengen an Vorläuferlösung kann zu Hydrogel unter dem Bodendeckglas führen. Dies kann dazu führen, dass der Basisdecker an der Petrischale klebt und bei einem Entfernungsversuch zerbricht. Auch Hydrogelrückstände unter dem Deckglas sind für die Mikroskopie problematisch. Eine schonende Entfernung des nicht reaktiven perfluoralkylierten Glasobjektträgers ist erforderlich, da eine schnelle Entfernung das Hydrogel beschädigen kann.
   9. Legen Sie das Substrat in eine 60 mm x 15 mm große Petrischale in spezifizierte Nährmedien. Hier wurden ATGN-Medien, ergänzt mit 100 μg/ml Spectinomycin für B. subtilis oder 100 μg/ml Ampicillin für E.coli bei 37 °C, für 24 h Kulturzeiten verwendet.

Abbildung 1: Hydrogelbildung auf thiolierten Glasdeckgläsern. (A) Abstandhalter mit einer Dicke von 12,7 μm werden auf zwei gegenüberliegenden Seiten eines Basisdeckglases platziert, das reaktive Thiolgruppen enthält. (B) Die Hydrogelvorläuferlösung wird über einen nicht reaktiven, fluorierten Glasobjektträger pipettiert. (C) Der nicht reaktive Glasobjektträger wird zur Bildung von 12,7 μm dickem Hydrogel auf die Abstandhalter gelegt. (D) Der nicht reaktive Glasobjektträger wird vorsichtig entfernt, so dass das Hydrogel am Bodendeckglas befestigt bleibt. (E) Das hergestellte Hydrogel kann in Medien zur Kultur inkubiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

7. Hydrogelbildung über Microwell-Arrays

1. Bakterienaussaat in Microwell-Arrays
   HINWEIS: 700 μL von 0,1 OD₆₀₀ Zellsuspensionen wurden über die Microwell-Array-Substrate gesät, und die Parylen-Lift-Off-Methode wurde angewendet, um Zellen aus dem Hintergrund unter Verwendung des von Timm et al. beschriebenen Protokolls zuentfernen. ²².
2. Die Hydrogel-Vorläuferlösung wird durch Zugabe von 5,6 μL des PEG-o-NB-Diacrylats mit 12,5 μL pH8 phosphatgepufferter Kochsalzlösung ATGN und Mischen mit 6,9 μL der vierarmigen PEG-Thiollösung hergestellt.
3. 12,5 μL der Vorläuferlösung werden auf einem nicht reaktiven, perfluoralkylierten Glasobjektträger pipettiert und zwei 38 μm Stahlabstandhalter (siehe Materialtabelle)auf zwei gegenüberliegende Seiten des mit Zellen beimpften Microwell-Array-Substrats platziert.
4. Invertieren Sie den perfluoralkylierten Glasobjektträger mit dem Vorläuferlösungströpfchen und legen Sie den Tröpfchen in die Mitte des Mikrotitergutsubstrats. Dann für 25 min bei RT für hydrogelbildung inkubieren.
5. Entfernen Sie den Glasobjektträger vorsichtig vom Mikrotiterplattensubstrat. Die Hydrogelmembran sollte am Mikrotiterplattensubstrat befestigt bleiben. Fahren Sie mit Schritt 6.1.9 fort.

8. Materialaufbereitung für die Zellextraktion

1. PDMS Halter Vorbereitung
   1. Kleben Sie einen Stapel von zehn 18 x 18 mm Deckgläsern zusammen und kleben Sie diesen Stapel Deckgläser auf den Boden einer Petrischale.
   2. Um PDMS-Halter herzustellen, mischen Sie PDMS-Vorläufer und Härter im Verhältnis 10: 1 in einem Kunststoffbecher, entgasen Sie die Mischung in einem Vakuum-Exsikkator und gießen Sie die Mischung dann in die Petrischale.
   3. PDMS 90 min bei 80 °C aushärten. Schneiden Sie dann um den abgeklebten Block herum, um den PDMS-Halter zu entfernen, und legen Sie den PDMS-Halter auf einen Glasobjektträger, um die Handhabung der Mikroskopie zu erleichtern.
2. Mikrospritzen- und Schlauchvorbereitung
   1. Schneiden Sie 20 cm PTFE-Schlauch (0,05 in ID) und befestigen Sie ein Ende des Schlauchs an einer 100 μL Mikroliterspritze.
      HINWEIS: Vermeiden Sie bei der Extraktion die Verwendung von Pipetten, da das Ziehen der freigesetzten Zellen über eine Pipettenspitze die Hydrogeloberfläche beschädigen und zu einer Kontamination führen kann.

9. Hydrogelabbau mit dem gemusterten Beleuchtungswerkzeug

HINWEIS: Die folgenden in diesem Abschnitt beschriebenen Schritte sind sowohl für Bulk-Hydrogele als auch für Microwell-Arrays identisch, mit Ausnahme der in den Schritten 9.6.4-9.6.6 und 9.6.7-9.6.10 beschriebenen Lichtbelichtungsmuster.

1. Schalten Sie das Mikroskop ein (siehe Materialtabelle). Schalten Sie dann das Gemusterte Beleuchtungswerkzeug ein (siehe Materialtabelle).
2. Schalten Sie das analoge und digitale Steuermodul der 365-nm-LED-Lichtquelle ein. Schalten Sie als Nächstes das LED-Lichtquellen-Steuermodul ein.
3. Öffnen Sie die Mikroskopsoftware und die Software für das Werkzeug für die strukturierte Beleuchtung. Wenn das Hardwarekonfigurationsfenster geöffnet wird, wählen Sie die Schaltfläche Laden.
   HINWEIS: Hier werden drei Geräte geladen. (Kamera eines Drittanbieters, ein Steuermodul und das Gemusterte Beleuchtungstool)
4. Drücken Sie die Starttaste. Das Fenster der Lichtmustersoftware wird nun geöffnet. Wählen Sie die erste Option, die Schaltfläche Gerätesteuerung, in der linken Seitenleiste des Fensters aus.
5. Kalibrieren Sie das Werkzeug für die gemusterte Beleuchtung.
   HINWEIS: Die Kalibrierung muss mit demselben Mikroskopobjektiv und Filter durchgeführt werden, die für die Lichtbelichtung verwendet werden.
   1. Stellen Sie das Mikroskopobjektiv auf 10-fache Vergrößerung.
      HINWEIS: Diese Vergrößerung ermöglicht einen ausreichenden Arbeitsabstand zwischen der Mikroskoplinse und der Probenoberfläche. Es ermöglicht auch die Überwachung und Aufzeichnung des Abrufprozesses in Echtzeit über das Bildfenster.
   2. Stellen Sie die Mikroskoplinse und den Filter auf die einstellungen ein, die für die Lichtbelichtung verwendet werden, und platzieren Sie den Kalibrierspiegel unter dem Mikroskop.
   3. Drücken Sie im Fenster Gerätesteuerung auf die Registerkarte LED-Steuerung. Schalten Sie LED #1 ein und stellen Sie die Lichtintensität auf die gewünschte Zahl ein. In Standard-Extraktionsexperimenten wird diese auf 60% festgelegt.
   4. Drücken Sie im Fenster Gerätesteuerung auf die Registerkarte mit dem Produktnamen des gemusterten Beleuchtungswerkzeugs. Drücken Sie dann die Schaltfläche Raster anzeigen.
      HINWEIS: Ein Rastermuster wird auf den Kalibrierspiegel projiziert.
   5. Passen Sie den Mikroskopfokus und die Kamerabelichtung an, um eine hohe Bildqualität des Rasters zu erhalten, und drehen Sie die Kamera, um die Gitterlinien bei Bedarf parallel zum Kamerafensterrahmen auszurichten.
   6. Wählen Sie die Schaltfläche Kalibrierungsassistent unter der Registerkarte mit dem Produktnamen des gemusterten Beleuchtungswerkzeugs und folgen Sie den Anweisungen der Software in diesem Fenster.
      HINWEIS: Ein Fenster zum Einrichten der Kamera eines Drittanbieters wird geöffnet.
   7. Ein Fenster zur Auswahl des Kalibrierungstyps wird geöffnet. Wählen Sie Automatische Kalibrierung und drücken Sie Weiter.
   8. Wenn das Fenster Vorkalibrierungsanpassung geöffnet wird, folgen Sie den Anweisungen der Software und drücken Sie die Taste Weiter.
   9. Wenn das Fenster Mapping-Informationen geöffnet wird, speichern Sie diese Kalibrierung entsprechend im gewünschten Ordner. Dies geschieht durch Eingabe des Datums, des Mikroskopnamens, der Objektivlinse und des Filters.
   10. Klicken Sie nach der Kalibrierung auf die Schaltfläche Arbeitsbereichsdefinition unter der Registerkarte mit dem Produktnamen des gemusterten Beleuchtungswerkzeugs, um bei Bedarf den Arbeitsbereich des gemusterten Beleuchtungswerkzeugs zu definieren.
6. Sequenzentwurfsabschnitt für die Mustervorbereitung.
   1. Drücken Sie die Taste Sequence Design in der linken Seitenleiste des Softwarefensters. Drücken Sie dann die Schaltfläche Profilsequenz-Editor.
   2. Wenn das Fenster Profilsequenz-Editor geöffnet wird, wählen Sie in der Profilliste die Option Neues Profil aus.
      HINWEIS: Jetzt wird ein Pattern Editor-Fenster geöffnet.
   3. Bereiten Sie das gewünschte Muster für die Lichtbelichtung vor, indem Sie verschiedene Musterformen und -größen auswählen, oder zeichnen Sie das Muster bei Bedarf manuell.
   4. Für kreisförmige und gebrochene Kreuzmuster für das Bulk-Hydrogel führen Sie die Schritte 9.6.5- 9.6.6 aus.
   5. Definieren Sie für Kreismuster einen Kreis mit einem Durchmesser von 30 μm über einer Zielbakterienkolonie, um die gesamte Kolonie abzudecken. Wählen Sie die Formfüllfarbe weiß.
   6. Wählen Sie für gebrochene Kreuzmuster die Rechteckform aus dem Musterzeichnungsfenster mit Abmessungen von 3 μm x 8 μm. Platzieren Sie vier Rechtecke mit dieser Dimension an den Rändern der Zielkolonie, während die Hälfte der Muster eine Überlagerung mit der Kolonie hat.
   7. Für Kreis- und Ringmuster für die Mikrotiterplatten-Arrays führen Sie die Schritte 9.6.8-9.6.10 aus.
   8. Zeichnen Sie für Kreismuster einen Kreis mit einem Durchmesser von 10 μm um den Bohrlochumfang. Wählen Sie die Formfüllfarbe weiß.
   9. Zeichnen Sie für das Ringmuster einen Kreis mit einem Durchmesser von 20 μm, legen Sie ihn über den Brunnen und wählen Sie die Formfüllfarbe Weiß.
   10. Zeichnen Sie ein weiteres Kreismuster mit einem Durchmesser von 10 μm mit der Füllformfarbe Schwarz und legen Sie es um den Umfang des Brunnens.
7. Bearbeiten Sie das Muster und ändern Sie die Formen basierend auf der gewünschten Extraktionsmethode. Stellen Sie sicher, dass das gewünschte Muster im Arbeitsbereich des gemusterten Beleuchtungswerkzeugs vorhanden ist.
8. Legen Sie die Probe in einen PDMS-Halter und pipettieren Sie das definierte Medium auf der Probe, um eine Austrocknung der Probe zu verhindern und eine Trägerlösung für freigesetzte Zellen bereitzustellen.
9. Ersetzen Sie diese dann durch den Kalibrierungsspiegel.
10. Passen Sie den Mikroskopfokus an, um ein scharfes Bild der Kolonien im Hydrogel zu erhalten. Inspizieren Sie die Kolonien, um eine Kolonie von Interesse zu identifizieren.
11. Entwerfen Sie hier die Lichtmuster, während die Kameraansicht die Kolonien in der Probe zeigt, um verschiedene Muster für die Zellextraktion zu testen.
12. Speichern Sie das definierte Muster. Nachdem Sie das definierte Muster gespeichert haben, wählen Sie den Abschnitt Sitzungssteuerung aus.
13. Fügen Sie in diesem Abschnitt auf der Registerkarte mit dem Produktnamen des gemusterten Beleuchtungswerkzeugs die gespeicherte Sequenz hinzu.
14. Nachdem Sie die Sequenz hinzugefügt haben, wählen Sie die Option, um das anzuzeigende Muster zu simulieren und an die gewünschte Belichtungsposition anzupassen.
    HINWEIS: Die Probenposition kann hier angepasst werden, um sicherzustellen, dass das Muster genau auf den Zielbereich projiziert wird.
15. Stellen Sie als Nächstes die Lichtintensität auf 60% und die Belichtungszeit auf 40 s unter der LED-Steuerregisterkarte ein und starten Sie den Belichtungsprozess.
16. Überwachen Sie den Hydrogelabbau in Echtzeit und im Hellfeldmodus, um die Zellfreisetzung sicherzustellen.
    HINWEIS: Verhindern Sie Bewegungen zur Probe während der Lichteinwirkung, da dies zu einer Verschlechterung unerwünschter Bereiche des Hydrogels führen kann, was zu einer Kreuzkontamination führt.

10. Zellabruf

HINWEIS: Das Zellentnahmeverfahren ist sowohl für Bulk-Hydrogele als auch für Microwell-Arrays identisch.

1. Nach 365 nm Lichtexposition und Zellfreisetzung sammeln Sie die Zellen mit einer Mikroliterspritze und einem mikrofluidischen Schlauch (Abbildung 2).
   HINWEIS: Der Zellabruf muss unmittelbar nach der Musterbelichtung erfolgen. Dies ermöglicht eine lokalisierte Zellwiederherstellung, bevor sich die freigesetzten Zellen vom bestrahlten Bereich entfernen.
2. Stellen Sie das Mikroskop von Hellfeld auf FITC- oder TRITC-Filter um, um den belichteten Bereich der Probe mit bloßem Auge sichtbar zu machen.
3. Sobald sich der exponierte Bereich befindet, legen Sie das Ende des Schlauches auf die bestrahlte Stelle. Wechseln Sie dann den Mikroskopfilter zurück in hellfeld, um den Zellabruf in Echtzeit zu überwachen.
4. Verwenden Sie die Spritze, die am anderen Ende des Schlauches befestigt ist, um die freigesetzten Zellen vorsichtig zurückzuziehen. Entnahme von 200 μL der Lösung und Einsetzen der Lösung in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen zur DNA-Analyse oder Beschichtung.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Extraktionsmethode zum Sammeln von Zellen, die aus dem Hydrogel freigesetzt werden. Hier wird unmittelbar nach 365 nm UV-Exposition, Hydrogelabbau und Zellfreisetzung das Mikroskop verwendet, um die Hydrogelprobe mit Licht eines TRITC-Filters zu beleuchten, was zu einem hellgrünen Fleck führt, der den Bereich bedeckt, in dem die Zellfreisetzung stattfand. Dies unterstützt den Benutzer bei der Identifizierung des räumlichen Ortes für die Probensammlung. Nach der Visualisierung dieses Bereichs wird der an einer Mikroliterspritze befestigte Sammelschlauch an dieser Stelle platziert und die Probe wird entnommen. Die Hellfeldmikroskopie mit 10-facher Vergrößerung wird verwendet, um das Ende der Schlauch- und Hydrogeloberfläche in Echtzeit für eine präzise Zellsammlung zu überwachen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

11. Genomische DNA-Aufreinigung und DNA-Qualitätsmessung

1. Verwenden Sie das DNA-Reinigungskit (siehe Materialtabelle),um DNA aus Bakterienisolaten zu extrahieren.
   1. Befolgen Sie die im DNA-Reinigungskit-Handbuch²³ beschriebene Herstellerspezifikation bis zum letzten Schritt (Schritt 7), der eine Elution mit Buffer AE erfordert.
   2. Befolgen Sie für den Elutionsschritt die Spezifikation des Herstellers, mit dem Unterschied, 100 μL Buffer AE anstelle von 200 μL zu verwenden.
   3. Elution einmal wiederholen, wie in Schritt 11.1.2 beschrieben. Dieser Schritt führt zu einer erhöhten DNA-Gesamtausbeute.
2. Messen Sie die DNA-Qualität mit einem UV-Vis-Spektralphotometer (siehe Materialtabelle).
   1. Schalten Sie das Spektralphotometer ein. Wählen Sie nach der Geräteinitialisierung auf der Startseite die Option dsDNA auf dem Bildschirm aus.
   2. Als nächstes heben Sie den Sockelarm an und reinigen die Sockelposition mit DI-Wasser und fusselfreien Tüchern.
   3. 2 μL einer Blindlösung, hier AE-Puffer, auf die Sockelposition pipettieren und den Sockelarm vorsichtig nach unten bringen und blank auf dem Bildschirm auswählen.
   4. Als nächstes heben Sie den Sockel an und reinigen Sie die Sockelposition mit DI-Wasser, um Restmaterial von der vorherigen Messung zu entfernen.
   5. Legen Sie die Probe (2 μL) auf die Sockelposition, bringen Sie den Sockelarm nach unten und wählen Sie die Taste Messen auf dem Bildschirm.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 11.2.4 und 11.2.5 für alle Beispiele.
   7. Sobald die Messung abgeschlossen ist, wählen Sie "Experimente beenden" auf dem Bildschirm. Legen Sie das Flash-Laufwerk in das Gerät ein und drücken Sie auf dem Bildschirm auf "Daten exportieren".

12. Bestimmung der Zelllebensfähigkeit aus Hydrogel- und Mikrotiterplattenextrakten

1. Verdünnen Sie die Bakteriensuspensionen mit einem Verdünnungsfaktor von^{10 bis 5} unter Verwendung einer 96-Well-Platte.
2. 10 μL der verdünnten Bakteriensuspension pipettieren und für jede Bakteriensuspension dreimal auf ATGN-Platten punktieren.
3. Kippen Sie die Platten, um die Zellen auf Agaroberflächen zu verteilen. Trocknen Sie die ATGN-Platten, die die Bakteriensuspensionen enthalten, an der Luft.
4. Die Platten bei 37 °C für 48 h inkubieren. Zählen und notieren Sie die Zahlen der Colony Formation Units (CFUs). Zählen Sie alle drei Aufstriche von Bakteriensuspensionen auf jeder Platte.
   HINWEIS: Führen Sie die Schritte 12.1-12.4 in einer biologischen Sicherheitswerkbank aus, um eine Kontamination der Platte zu vermeiden.

Results

Um die Fähigkeit von UV-Licht zu untersuchen, einen kontrollierten Hydrogelabbau für die Zellfreisetzung auszulösen, wurden Hydrogele zunächst über thiolierte Deckgläser verkapselt, ohne dass Bakterien vorhanden waren. Jedes Hydrogel wurde drei replizierten Kreismustern des Lichts bei unterschiedlichen Intensitäten und Belichtungszeiten ausgesetzt. Der prozentuale Gelabbau wurde nach UV-Lichtexposition bei jeder Lichtintensität berechnet, und die Expositionszeit wurde dann quantifiziert, indem hängende Thiolgruppen mit einem Fluorescein-5-maelimid-Farbstoff für die Fluoreszenzbildgebung^19,24, Ein repräsentatives Beispiel dafür, wie diese beiden Parameter den Hydrogelabbau beeinflussen, ist in Abbildung 3 dargestellt. Wie offensichtlich, bietet das gemusterte Licht, das vom Musterbeleuchtungswerkzeug bereitgestellt wird, eine räumlich-zeitliche Kontrolle des Hydrogelabbaus mit einer Auflösung, die die Freisetzung nur einer kleinen Anzahl von Zellen ermöglichen kann.

Abbildung 3: Kontrolle des Hydrogelabbaus. Die UV-Lichtdosis und die daraus resultierende Hydrogelabbaurate sind über das gemusterte Beleuchtungswerkzeug abstimmbar. (Einschub) Für den strukturierten Hydrogelabbau wurden zwei verschiedene Lichtintensitäten gewählt. Nach 365 nm UV-Lichtexposition wurden Hydrogele mit Fluorescein-5-Maleimid für die Fluoreszenzbildgebung markiert. Nachdruck (angepasst) mit Genehmigung von Fattahi et al.¹⁹ Copyright 2020 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Für die Zellextraktion wurden verschiedene Lichtmuster verwendet, um die Zellfreisetzung zu untersuchen (Abbildung 4). Hier wurden Agrobacterium-Bakterienzellen in Bulk-Hydrogele über thiolierten Glasdeckgläsern eingekapselt und dann zu mikroskaligen Kolonien kultiviert. Hydrogele wurden dann in der Hellfeldmikroskopie inspiziert, und gezielte Mikrokolonien wurden verschiedenen UV-Lichtmustern ausgesetzt. Es wurde beobachtet, dass unterschiedliche Expositionsmuster die Morphologie der freigesetzten Zellen beeinflussten. Dies ist potenziell vorteilhaft für verschiedene Anwendungen. Zum Beispiel führt die Freilegung eines Ringmusters um die Zielkolonie zur Freisetzung der gesamten Kolonie, die immer noch in einem schützenden PEG-Hydrogel und ohne direkte UV-Lichtexposition eingekapselt ist (Abbildung 4A), was Zellen konservieren und eine einfache nachgeschaltete Reinigung ermöglichen kann. Im Gegensatz dazu können Zellen durch die Teilweise- oder gesamte Exposition der Kolonie gegenüber UV-Licht entweder als aggregierte Zellcluster (Abbildung 4B) oder als freie, einzelne Zellen (Abbildung 4C) extrahiert werden.

Abbildung 4: Kontrolle über die Morphologie der extrahierten Zellen. (A) Verwendung eines Ringmusters zur Freisetzung der gesamten Zellkolonie, geschützt in einer PEG-Matrix. (B) Verwendung eines gebrochenen Kreuzmusters für die Zellfreisetzung in Aggregaten. (C) Verwendung eines Kreuzmusters zur Freisetzung einzelner Zellen. Nachdruck (angepasst) mit Genehmigung von Fattahi et al.¹⁹ Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Entscheidend für das Verkapselungsprotokoll ist sowohl die Zellsaatdichte als auch die Dicke des Hydrogels, da beide Parameter die Anzahl der im Hydrogel zur Beobachtung enthaltenen Zellen beeinflussen können. Zur Demonstration wurden A. tumefaciens-Zellproben in Hydrogele zweier unterschiedlicher Dicke mit dünnen Abstandshaltern (12,7 μm) oder dicken Abstandshaltern (40 μm) verkapselt und nach den etablierten Protokollen abgebildet. Dünnere Hydrogele führten zu einer Mikrokoloniedichte von 90 Kolonien/mm2 im gesamten Hydrogel, wobei eine minimale Kolonieüberlappung beobachtet wurde (Abbildung 5A). Im Gegensatz dazu führten Hydrogeldicken von mehr als 12,7 μm zur Bildung überlappender Kolonien in vertikaler Richtung (Abbildung 5B), was zur Extraktion mehrerer Kolonien führen kann. Überlappende Kolonien können während der Extraktion aufgrund der zweidimensionalen Natur des Lichtmusters zu einer Kreuzkontamination führen. Beispielsweise kann eine Top-Kolonie anvisiert werden, während eine darunter liegende Kolonie ebenfalls mit ihr extrahiert wird (Abbildung 5C). Daher wird die Verwendung von 12,7 μm Abstandhaltern für die Hydrogelpräparation empfohlen.

Abbildung 5: Die Hydrogeldicke beeinflusst die Extraktionsreinheit. (A) Durch die Verwendung von Abstandshaltern mit einer Dicke von 12,7 μm für die Hydrogelbildung werden Kolonien innerhalb einer 10-fachen Fokusebene gebildet. (B) Überlagerungen von Kolonien können bei 10-facher Vergrößerung beobachtet werden, wenn Abstandhalter mit größeren Dicken als 12,7 μm verwendet werden. (C)Kreuzkontamination kann mit einer Überlagerung von Kolonien während der Zellfreisetzung auftreten: (i) ein Ringmuster wird verwendet, um eine Zielzellkolonie freizusetzen, (ii) die Zielzellkolonie löst sich vom Hydrogel und (iii) eine zweite, darunter liegende Kolonie wird während der Lichtexposition unter der Zielkolonie beobachtet. Diese Kolonie wird ebenfalls entfernt, was zu einer Kreuzkontamination führt. Nachdruck (angepasst) mit Genehmigung von Fattahi et al.¹⁹ Copyright 2020 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Angesichts der möglichen Schädigung von Bakterien mit UV-Licht wurde die Wirkung verschiedener UV-Licht-Mikromuster auf die Zelllebensfähigkeit anhand von Modell, Gram-positiven Bakterien (B. subtilis) und Modell, Gram-negativen Bakterien (E. coli) weiter untersucht. Jedes wurde in Bulk-Hydrogelen eingekapselt und nach Standardprotokollen in mikroskalige Kolonien kultiviert, um ihre Kompatibilität mit dem Hydrogel zu überprüfen. Gezielte Mikrokolonien äquivalenter Größe (26 ± 1 μm Durchmesser) wurden dann einer konstanten Lichtdosis (168 mJ/mm²⁾ausgesetzt, entweder in Form von Kreismustern, die ganze Mikrokolonien UV-Licht aussetzen, oder Kreuzmustern, die nur Hydrogelkanten abbauen, um die Lichtexposition der Zellen zu minimieren. Die Zellen wurden dann geborgen und plattiert, um die aus jeder Kolonie gewonnene KBE / ml zu quantifizieren. Es wurde kein signifikanter Unterschied im Zellwiederherstellungsniveau gefunden (Abbildung 6A). Um die Reinheit der extrahierten Zellen weiter zu untersuchen, wurde DNA aus E. coli-Proben extrahiert und mit einem UV-Vis-Spektralphotometer analysiert. Für beide Muster liegen die DNA-Qualitätsniveaus in einem A₂₆₀/ A_280-Bereich zwischen 1,8 und 2,0 (Abbildung 6B), der im idealen Bereich für die genomische Sequenzierung^{25 liegt.} Dies zeigt, dass die UV-Muster, die für die Freisetzung unter den beschriebenen Bedingungen verwendet werden, nur minimale Auswirkungen auf die Quantität lebensfähiger Zellen haben, die aus den Bulk-Hydrogelen gewonnen werden, oder auf die genomische DNA-Qualität nach der Extraktion.

Abbildung 6: Einfluss unterschiedlicher Lichtexpositionsmuster auf die Zelllebensfähigkeit und DNA-Qualität von Bakterien, die aus Bulk-Hydrogelen freigesetzt werden. (A) Zellwiederherstellungswerte für E. coli und B. subtilis nach Extraktion unter Verwendung von Kreuzmustern und Kreismustern. Für dieses Experiment wurde eine Extraktion aus kugelförmigen Kolonien mit dem gleichen Durchmesser (26 μm ± 1 μm) durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Anzahl der freigesetzten Zellen aus jeder Kolonie gleichwertig war. Die extrahierten Lösungen wurden dann plattiert, um die aus jedem Muster gewonnene KBE/ ml zu berechnen. Die statistische Analyse zeigte keinen signifikanten Unterschied in der KBE/ml, die aus Kreuz- und Kreismustern sowohl für E. coli als auch für B. subtilis erhalten wurde (P-Wert > 0,05, n= 6 für beide Stämme). (B) Spektralphotometrische Quantifizierung der DNA-Qualität für isolierte E. coli-Zellen unter Verwendung von Kreuz- und Kreismustern. Hier zeigte die statistische Analyse keinen signifikanten Unterschied in der DNA-Qualität für die verwendeten Muster (P-Wert > 0,05, n = 6) (C) Hellfeldbilder von Kolonien mit gleichen Durchmessern, die Kreuz- und Kreismustern ausgesetzt waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Microwell-Arrays bieten eine alternative Lab-on-a-Chip-Screening-Schnittstelle, die im Vergleich zu Bulk-Hydrogelen kontrolliertere Screening-Funktionen bietet. Zum Beispiel ermöglichen Microwell-Arrays die Aussaat von Bakterien in diskrete Kulturstellen, an denen die Anzahl der Zellen im Inokulum kontrolliert werden kann. Geometrische Merkmale von Mikrobohrungen wie Bohrlochtiefe und -durchmesser werden ebenfalls durch Standard-Mikrofabrikationsmethoden gesteuert. Mit diesen Vorteilen waren Mikrobohrungen nützlich für die Untersuchung des Bakterienwachstums unter räumlichem Einschluss²⁶und zuletzt für die Entdeckung symbiotischer und antagonistischer Interaktionen zwischen verschiedenen Bakterienarten, wenn sie zusammen auf der Mikroskala¹⁸eingeschlossen sind. Die zelluläre Extraktion aus Vertiefungen für die genomische Analyse wie die 16S-Amplikonsequenzierung ist für diese Anwendungen von entscheidender Bedeutung. Mit dem gleichen Hydrogel-Material kann UV-Licht über einem Brunnen belichtet werden, der Zellen von Interesse enthält, entweder als Kreis- oderRingmuster. Letzteres sorgt für den Hydrogelabbau nur am Mikrotiterraumumfang, um eine direkte Bestrahlung der Zellen zu verhindern. Um dies zu demonstrieren, wurden A. tumefaciens-Zellen, die mCherry exprimieren, in Vertiefungen ausgesät, das Hydrogel wurde dann an das Mikrotiterchen-Array gebunden. Zellen wurden kultiviert und dann entweder mit Kreis- oder Ringmustern bestrahlt. Die Membran wurde dann mit Fluorescein-5-Maleimid-Farbstoff angefärbt. Zweifarbige Fluoreszenzbilder zeigten, dass sowohl die Membran als auch die Zellen innerhalb der Vertiefungen für beide Bestrahlungsmuster entfernt werden¹⁷. Im Gegensatz zum Bulk-Hydrogel-Format wurde die Zellextraktion hier nur in Form von Zellclustern^{beobachtet 18}.

Abbildung 7: Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder, die den Einfluss von Lichtmustern auf die Zellisolation von Mikrotiterplattenarrays zeigen. (A) Mikrotiterwerke mit Durchmessern von 40 μm, die Bakterien (rot) nach aussaat und kultiviert enthalten. (B) Lichtbelichtung mit Kreis- und Ringmustern (blau). (C) Verminderte rote Fluoreszenz zeigt, dass Zellen aus bestrahlten Vertiefungen extrahiert werden. (D) Zweifarbiges Fluoreszenzbild von Membranen und Bakterien nach Bestrahlung, das die Entfernung sowohl des Hydrogels (grün) als auch der Bakterien (rot) aus den Zielbohrlöchern anzeigt. (E) Z-Stack, zweifarbiges Fluoreszenzbild von Zieltöpfen. Die rote Linie in (D) bezeichnet die in (E) abgebildete xz-Ebene und die grüne Linie in (E) die in (D) abgebildete xy-Ebene . Proben in Bildern (C-E) wurden gewaschen, um freigesetzte Zellen zu entfernen, dann fixiert und abgebildet. Maßstabsleiste = 40 μm. Nachdruck (angepasst) mit Genehmigung von van der Vlies et al.¹⁷. Copyright 2019 American Chemical Soceity. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um die Lebensfähigkeit von Bakterienzellen und die DNA-Qualität nach der Extraktion in diesem Format zu quantifizieren, wurden B. subtilis- und E. coli-Zellen ausgesät, kultiviert und dann aus Mikrotiterplatten-Arrays unter Verwendung von Kreis- und Ringmustern freigesetzt(Abbildung 8A, B). Freigesetzte Zellen wurden dann auf ATGN-Agarplatten plattiert und die DNA-Qualität der extrahierten Zellen wurde quantifiziert. Um sicherzustellen, dass bei jeder Extraktion eine konsistente Anzahl von Zellen vorhanden war, wurden Mikrobohrungen mit ähnlichen fluoreszierenden Intensitäten (~ 6000 A.E.) und damit eine ähnliche Anzahl von Zellen zur Freisetzung anvisiert. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen, die unter Verwendung eines Kreismusters extrahiert wurden, unterschied sich nicht signifikant von der Anzahl der lebensfähigen Zellen, die unter Verwendung eines Ringmusters für beide Bakterien extrahiert wurden (Abbildung 8C). Auch die DNA-Qualitätsniveaus unterschieden sich nicht signifikant zwischen den Kreis- und Ringmustern für beide Bakterien (Abbildung 8D). Ähnlich wie bei Befunden in Bulk-Hydrogelen hatte die Anwendung von UV-Licht in der hier angegebenen Intensität und Dauer einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Lebensfähigkeit und DNA-Qualität von Zellen, die aus den Mikrotiterplatten-Arrays extrahiert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass lebensfähige Bakterienzellen selektiv und mit minimalem Schaden aus Mikrotitertöpfen für die nachgeschaltete Analyse entnommen werden können.

Abbildung 8:Einfluss verschiedener Lichtexpositionsmuster auf die Zelllebensfähigkeit und DNA-Qualität von Bakterien, die aus Mikrotiterplatten-Arrays freigesetzt werden. (A,B) Sowohl für E. coli als auch für B. subtiliswurden Kreismuster und Ringmuster für die Zellextraktion aus 10 μm Mikrotiterlöchern verwendet. Kreismuster mit einem Durchmesser von 10 μm und Ringmuster mit einem Innendurchmesser von 10 μm und einem Außendurchmesser von 20 μm wurden in diesem Experiment zur Zellextraktion verwendet. Mikrotiterwerke mit den gleichen Durchmessern wurden verwendet, um sicherzustellen, dass die Anzahl der freigesetzten Zellen aus jedem Mikrobohrloch gleich war. (C) Die extrahierten Lösungen wurden dann plattiert, um die aus jedem Expositionsmuster gewonnene KBE/ml zu berechnen. Die statistische Analyse zeigte keinen signifikanten Unterschied in der KBE/ml aus Kreis- und Ringmuster sowohl für E. coli als auch für B. subtilis (P-Wert > 0,05, n = 6 für beide Stämme). (D) Die Spektrophotometrie wurde verwendet, um die DNA-Qualität von E. coli- und B. subtilis-Zellen anhand von Kreis- und Ringmustern zu messen. Hier zeigte die statistische Analyse keinen signifikanten Unterschied in der DNA-Qualität für die verwendeten Muster (P-Wert > 0,05, n = 6 für beide Stämme). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Design und Herstellung von Microwell-Arrays. (A) Standard-Mikrofabrikationstechniken wurden angewendet, um Mikrowellen-Arrays auf Siliziumwafern herzustellen. (B) Jedes Substrat bestand aus 7 x 7 Arrays von Vertiefungen mit einem Durchmesser von 10 μm mit einer Tiefe von 20 μm und einem Pitch von 30 μm. (C) Jedes Array bestand aus 225 Mikrobohrungen. Diese Zahl wurde von Barua et al.¹⁸modifiziert. Urheberrecht 2021 Frontiers Media. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Dieses Manuskript demonstriert die Verwendung von photodegradierbaren Hydrogelen für das Screening und die Isolierung von Bakterien. Das Material und der Ansatz ermöglichen eine Hochdurchsatzkultur, die Kontrolle über Wachstumsmedien und Wachstumsbedingungen sowie eine saubere und präzise Zellextraktion auf einfache und kostengünstige Weise. Die Extraktion erfordert nur ein Fluoreszenzmikroskop in Verbindung mit dem gemusterten Beleuchtungswerkzeug und kann sequentiell durchgeführt werden, um mehrere Zellziele zu isolieren. Jede Extraktion dauert 5-10 Minuten, und bis zu 30 Zielkolonien wurden aus einem einzigen Hydrogel entfernt. Ein wesentlicher Vorteil des Ansatzes ist seine Anpassungsfähigkeit an eine Vielzahl unterschiedlicher Assay-Formate, wie hier mit dem Screening von Bulk-Hydrogelen und Microwell-Arrays demonstriert wird. Der Trennprozess in beiden Formaten wurde erfolgreich eingesetzt, um Bakterien zu isolieren, die ein einzigartiges Wachstumsverhalten für die nachgeschaltete Genotypisierung nach Kultur und mikroskopischer Beobachtung aufweisen, eine kritische Fähigkeit zur Verbindung des Zellgenostyps mit dem Phänotyp. Bis heute umfassten genomische Charakterisierungen von Bakterien, die aus diesen Grenzflächen extrahiert wurden, die 16S-Amplikon-Sequenzierung, um Multi-Spezies-Sammlungen von Bakterien aus Umweltmikrobiomen zu identifizieren, die emergentes Wachstumsverhalten erzeugen¹⁸, und für die Sequenzierung des gesamten Genoms, um genetische Mutationen erfolgreich zu identifizieren, die seltene Wachstumsprofile in Zellen verursachen, die in Mutantenbibliotheken vorhanden sind¹⁹.

Die Verwendung von Bulk-Hydrogelen für das Screening und die Isolierung von Zellen ist das einfachste und einfachste Format. Photoabbaubare Bulk-Hydrogele bilden sich schnell (25 min), nachdem die Vorläufer über transparente Glasabdeckungen gemischt wurden, um Zellen in einer 3D-Zellkulturmatrix zu verkapseln, die mit einem standardaufgebauten oder inversen Fluoreszenzmikroskop abgebildet wird. Daher hat die Methode das Potenzial, in gängige mikrobiologische Labors translational zu sein, die nicht über Mikrofabrikationsressourcen oder Fachwissen verfügen. Ein Nachteil dieses Formats ist, dass die Zellen im gesamten dreidimensionalen Hydrogel zufällig orientiert sind. Daher können Zellen bei der Bildgebung mit höheren Vergrößerungszielen aus der Fokusebene heraus erscheinen und die Extraktion kann schwierig sein, wenn Zellkolonien zu nahe beieinander ausgerichtet sind oder wenn es eine vertikale Überlagerung von Kolonien gibt. Die Abscheidung eines dünnen Hydrogels (<13 μm) wie beschrieben ist entscheidend, um diesen Nachteil zu mildern. Die Belichtung in gebrochenen Kreuzlichtmustern (Abbildung 4B) ist hier vorzuziehen, da dieses Muster zu Zellen führt, die frei von Hydrogel sind, die nur minimal UV-Licht ausgesetzt sind und durch Beschichtung leicht wiederhergestellt werden können.

Im Gegensatz dazu bietet das Microwell-Array-Format eine besser kontrollierte Schnittstelle, da Bakterienzellen in diskrete Mikrotöpfe unterteilt sind, die als kleine Kultur- oder Co-Kulturstellen dienen^17,18,26. Mikrotiterplattenabmessung, Steigung und Dichte werden mit photolithographischen Standardtechniken präzise hergestellt. Im Vergleich zu Bulk-Hydrogelen können Bakterien aus Microwell-Arrays mit einem höheren Spezifitätsgrad und einer geringeren Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination extrahiert werden, da die Zellen nur an vordefinierten Stellen vorhanden sind und nicht zufällig im gesamten Hydrogel verteilt sind. Die Konzentration und die Verhältnisse der Bakterienzellen in der Aussaatlösung können auch variiert werden, um die Menge und Zusammensetzung des Mikrotrinnenokulums durch einen Aussaatprozess zu kontrollieren, der in früheren Berichten²⁶charakterisiert wurde, was dem Benutzer Flexibilität bei der experimentellen Gestaltung des Bildschirms verleiht. Der Hauptnachteil des Screenings mit dem Microwell-Array-Format ist die zusätzliche Zeit und das Fachwissen, die für die Mikrofabrikation erforderlich sind. Die Herstellung von Mikrobohrungen wurde auf ~ $ 10 pro Array geschätzt, einschließlich Materialkosten und Reinraumkosten. Darüber hinaus werden Microwells-Arrays traditionell aus Silizium hergestellt, was zu Bildgebungsschwierigkeiten führen kann, da die Substrate nicht transparent sind. Darüber hinaus kann eine hohe Lichtstreuung von der Siliziumoberfläche die Bildgebung innerhalb der Mikroträume einschränken und die Musterauflösung während der Hydrogelbelichtung mit UV-Licht aus dem gemusterten Beleuchtungswerkzeug verringern (siehe Abbildung 8A,B). Ähnliche Mikrobohrungen wurden auf transparenten Quarzsubstraten hergestellt, um diese Art von Einschränkungen zu beheben²⁷; diese Herstellung ist jedoch wesentlich schwieriger. Die Exposition gegenüber Ringmustern, die den Umfang des Brunnens beleuchten, ist hier vorzuziehen, um freie Zellen aus den Vertiefungen freizusetzen und gleichzeitig die UV-Exposition zu minimieren.

Das häufigste Problem, das in beiden Formaten auftritt, ist die Ablösung des Hydrogels vom darunter liegenden Substrat während der Kultur aufgrund der Hydrogelquellung. Wenn dies ein Problem für Bulk-Hydrogele ist, sollte das Vorhandensein, die Dichte und die Gleichmäßigkeit von Thiolgruppen in der chemischen (MTPS) Anheftungsschicht über die Oberfläche des Basisglas-Deckglases mit einer geeigneten Oberflächencharakterisierungstechnik (XPS, ATR-FTIR, AFM usw.) überprüft werden. Geringe Dichten von Oberflächenthioolgruppen aufgrund einer ineffizienten Oberflächenfunktionalisierung können zu einer schwachen Wechselwirkung zwischen dem Substrat und dem Hydrogel führen. Wenn eine geringe Oberflächenthiolierung auftritt, sollte die Stabilität der MTPS-Lösung überprüft werden. Bei der Erstreinigung des Glasobjektträgers sollte darauf geachtet werden, dass vor der MTPS-Behandlung eine saubere Oberfläche gewährleistet ist, und es sollte darauf geachtet werden, dass während der MTPS-Oberflächenreaktion wasserfreies Toluol verwendet wird (Protokollabschnitt 4). Bei Microwell-Arrays werden Oberflächen nicht thioliert, und Hydrogele heften sich stattdessen durch die teilweise Füllung der Vertiefungen mit dem Hydrogel an, das das Hydrogel am Siliziumsubstrat¹⁷verankert. Wenn die Hydrogelablösung in diesem System ein Problem darstellt, können mehr Mikrobohrungen oder andere mikroskalige Merkmale in das Array geätzt werden, um das Hydrogel weiter auf dem Substrat zu verankern, um eine stärkere Anhaftung zu fördern.

Eine Einschränkung der Technik in beiden Formaten ist die begrenzte Stabilität der Hydrogele in Gegenwart von Bakterien. Es wurde festgestellt, dass einige Bakterien, wie A. tumefaciens, das Hydrogel im Laufe von 5-7 Tagen¹⁷,¹⁹abbauen^können,was die Experimentzeit begrenzt. Aktuelle Untersuchungen der Mechanismen des bakteriellen Abbaus sind im Gange; Es wird angenommen, dass die aus den Diacrylatmonomeren vorhandenen Estergruppen einer bakterienvermittelten Hydrolyse und/oder einem enzymatischen Abbau unterliegen, wie in anderen Systemen^{festgestellt 17}. Die Entwicklung stabilerer Hydrogel-Chemikalien verlängert die Zeit, in der Bakterien im Hydrogel verbleiben können, und dehnt den Screen auf Mikroorganismen mit langsameren Wachstumsraten aus. Eine zweite Einschränkung besteht darin, dass bei beiden Formaten die Zellrückgewinnung und -extraktion in einer offenen Umgebung erfolgt, was zu relativ hohen Extraktionsvolumina (30-100 μL) führt, die anfällig für Kontaminationen von außen sein können. Daher muss darauf geachtet werden, dass genügend Zellen aus den Zielkolonien vorhanden sind und gleichzeitig das Extraktionslösungsvolumen minimiert wird. Um genügend Zellen für die Plattierung und Wiederherstellung oder für die Extraktion von DNA-Material zu erhalten, wurde beobachtet, dass in Bulk-Hydrogelen Zellen lange genug kultiviert werden müssen, um Koloniedurchmesser von mindestens 10 μm zu erreichen. Um das erforderliche Volumen für die Zellextraktion zu senken, wurde beobachtet, dass die Verwendung einer Mikroliterspritze und eines Schlauches (Abbildung 2) effizienter war als das Pipettieren. Der Schlauch ermöglichte es, die Isolate genauer vom Freisetzungspunkt zu ziehen, was weniger Lösungsvolumen erforderte und die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination verringerte.

Zukünftige Arbeiten beinhalten das Verständnis der Wirkung der mechanischen Eigenschaften von Hydrogel auf das Zellwachstum, da die mechanischen Eigenschaften dieser Hydrogele durch die Auswahl geeigneter PEG-basierter Monomervorläufer mit verschiedenen Molekulargewichten gut kontrolliert werden²⁸, und mechanische Wechselwirkungen spielen wahrscheinlich eine wichtige Rolle im Bakterienverhalten²⁹. Da die Hydrogelmaterialien problemlos in eine Vielzahl unterschiedlicher Systeme und Geräte eingebunden werden können, konzentriert sich die Weiterentwicklung auch auf die Integration dieses Materials in mikrofluidische Systeme. Dies würde die Extraktionslösung zu Femtoliter- bis Picoliter-Volumina im Vergleich zu herkömmlichen 30-100 μL-Volumina reduzieren, die derzeit im offenen Sammlungsformat benötigt werden. Kleinere Lösungsvolumina würden die potenzielle Kontamination erheblich reduzieren und den Ansatz in Richtung Einzelzellisolierung und -charakterisierung vorantreiben.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilan	Sigma-Aldrich	175617-25G	> 95%
Alconox Waschmittelpulver	Alconox	1104
Ammoniumsulfat	Fisher Chemical	A702-500	Certified ACS Granulat
Autoklav SK300C	Yamato Scientific	18016
Bacillus subtilis 1A1135	Bacillus Genetic Stock Center	1A1135
Hellfeld-Standmikroskop	Olympus Corporation	BX51
Calciumchlorid, wasserfrei	Fisher Chemical	C614-500	Für Exsikkatoren Pellets, 4-20 Mesh
Zentrifuge 5702	Eppendorf	5702
Zitronensäuremonohydrat	Sigma-Aldrich	C1909-500G	ACS Reagenz, > 99,0%
D-Glukose ( Dextrose)	VWR Amresco Life Science	0188-1KG
Dneasy Blut & Tissue Kit	Qiagen	69504	DNA-Aufreinigungskit
DOWSIL 184 Silikonelastomer-Basis	Dow Silicones Corporation		Lagertemperatur: -30-60 ° C
DOWSIL 184 Silikonelastomer-Härter	Dow Silicones Corporation		Lagertemperatur: < 32 C
EPOCH2 Mikrotiterplatten-Spektralphotometer	BioTek Instruments	EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
Ethanol, wasserfrei	Fisher Chemical	459844
Fisherbrand Mikroskop-Deckglas	Fisher Scientific	12540A
Fisherfinest Premium Objektträger glatt	Fisher Scientific	12-544-4
Wasserstoffperoxid-Lösung	Sigma-Aldrich	216763-500ML	Enthält Inhibitor, 30 Gew.-% in H2O
Incu-Shaker Mini	Benchmark	E5-0014-01
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
Magnesiumsulfat, 7-Hydrat	Macron Fine Chemicals	6066-04	Avantor Performance Materials, Inc.
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	ACS Reagenz, > 99,8%
NanoDrop One Spektralphotometer	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
Stickstoff, komprimiert	Matheson	UN1066
Sauerstoff Plasmareiniger	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Pentaerythritol Tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylen (4 Arm-PEG)	NOF America Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	Zwischen 15 & Grad lagern; C– 30°; C
Polydimethylsiloxan (PDMS) Slygard 184	Dow Corning	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
Premium Objektträger	Fisher Scientific	12-544-4	25 x 75 x 1 mm
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Natriumchlorid	Sigma Life Science	S5886-500G	Bioreagenz, geeignet für Zellkulturen
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra, > 98%, Pellets (wasserfrei)
Natriumphosphat monobasisches Dihydrat	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra, für die Molekularbiologie, > 99,0% (T)
Edelstahl-Dickenmessgerät	Präzisionsmarkenprodukte	77739
Schwefelsäure	Sigma-Aldrich	320501-2,5 l
Toluol, wasserfrei, 99,8 %	Sigma-Aldrich	244511-1 l	wasserfrei, > 99,8 %
Trichlor (1H,1H,2H, Perfluoroctyl) Silan (TPS), 97 %	Sigma-Aldrich	448931-10G
Tryptische Sojabrühe	Sigma-Aldrich	22092-500G	Für die Mikrobiologie
Super Nuova Digital Heizplattenrührer	Thermo Scientific	S131825
Ultraschall-Ultraschallgerät	Fischer Scientific	FS-110H