Summary
O padrão-ouro em cardiologia para experimentos funcionais celulares e moleculares são os cardiomiócitos. Este artigo descreve adaptações à técnica não-Langendorff para isolar cardiomiócitos de camundongos.
Abstract
A necessidade de métodos reprodutíveis, porém tecnicamente simples, que produzam cardiomiócitos de alta qualidade é essencial para a pesquisa em biologia cardíaca. Experimentos funcionais celulares e moleculares (por exemplo, contração, eletrofisiologia, ciclagem de cálcio, etc.) em cardiomiócitos são o padrão-ouro para estabelecer mecanismo(s) de doença. O camundongo é a espécie de escolha para experimentos funcionais e a técnica descrita é específica para o isolamento de cardiomiócitos de camundongos. Métodos anteriores que requerem um aparelho de Langendorff requerem altos níveis de treinamento e precisão para a canulação aórtica, muitas vezes resultando em isquemia. O campo está mudando para métodos de isolamento livres de Langendorff que são simples, são reprodutíveis e produzem miócitos viáveis para aquisição de dados fisiológicos e cultura. Esses métodos diminuem muito o tempo de isquemia em relação à canulação aórtica e resultam em cardiomiócitos obtidos de forma confiável. Nossa adaptação ao método livre de Langendorff inclui uma perfusão inicial com solução de limpeza gelada, uso de uma plataforma estabilizadora que garante uma agulha estável durante a perfusão e etapas adicionais de digestão para garantir cardiomiócitos obtidos de forma confiável para uso em medidas funcionais e cultura. Este método é simples e rápido de executar e requer pouca habilidade técnica.
Introduction
Há décadas, uma ideia essencial na literatura de biologia cardíaca é o mecanismo molecular de ação. O mecanismo de ação deve ser estabelecido para a publicação de estudos confiáveis. Uma estratégia bem estabelecida para determinar o mecanismo molecular são os estudos isolados de cardiomiócitos, que requerem cardiomiócitos de alta qualidade para a obtenção de dados confiáveis. Experimentos celulares e moleculares realizados em cardiomiócitos para determinar o mecanismo de ação são o padrão-ouro para investigar contração1, eletrofisiologia2, ciclagem de cálcio (Ca2+)3, miofilamento Ca2+ sensibilidade4, citoesqueleto5, metabolismo6, efeitos de hormônios7, moléculas sinalizadoras8, estudos de fármacos9 etc. O camundongo tornou-se a espécie de escolha para a maioria dos experimentos de biologia cardíaca devido à facilidade de manipulação genética, seu pequeno tamanho, sua vida útil relativamente curta, baixo custo, etc10. No entanto, o isolamento confiável de cardiomiócitos de camundongos de alta qualidade não é trivial com as técnicas atuais.
Os laboratórios vêm isolando cardiomiócitos há quase 70 anos11. Praticamente todas as técnicas para isolar cardiomiócitos dependem da digestão do coração através de várias enzimas (colagenase, protease, tripsina, etc.). Nos primeiros períodos (décadas de 1950-1960), foi empregado o método chunk, que envolvia a remoção do coração, o corte em pedaços bem menores e a incubação em solução com colagenase/protease/tripsina12. Na década de 1970, os laboratórios implementaram o método de "Langendorff"melhorado13, que isolava cardiomiócitos usando uma técnica de isolamento baseada na perfusão coronariana (perfusão retrógrada com enzima via aparelho de Langendorff); Esta técnica continua sendo o método dominante de isolamento de miócitos no campo hoje, ~50 anos depois14,15,16. Trabalhos recentes passaram a cularizar o coração in vivo para limitar o tempo de hipóxia e o dano isquêmico, resultando em isolamentos superiores de cardiomiócitos (melhor rendimento e maior qualidade)17. Recentemente, este evoluiu para a realização in vivo de perfusões cardíacas livres de Langendorff 18,19,20,21,22. Evoluímos a técnica de isolamento de cardiomiócitos sem Langendorff baseada na técnica de Ackers-Johnson et al.18 e adaptamos vários componentes das várias técnicas de isolamento anteriores. Essas principais adaptações incluem a injeção de um tampão de limpeza gelado e a incorporação de uma plataforma de suporte para estabilizar a agulha, permitindo a diminuição da manipulação do coração. Também é detalhado nessa técnica o controle da temperatura dos tampões injetados (37 °C), que diminuiu o tempo entre a injeção in vivo e a digestão devido à menor perfusão com EDTA, como publicado anteriormente18. Diminuindo a manipulação do coração e, portanto, minimizando o tamanho do local de punção, obtém-se perfusão completa e constante das artérias coronárias. Também refinamos a técnica com um método secundário de digestão, a quantidade de EDTA no tampão de limpeza injetado e mudamos o pH. Nossa técnica descrita é mais confiável, mais eficiente e não requer treinamento/prática extensiva em comparação com o uso do aparelho de Langendorff (Tabela 1).
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Protocol
Todos os procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Ohio State University, de acordo com as diretrizes do NIH.
1. Preparação da solução
NOTA: Consulte o quadro 2 para as concentrações de tampão.
- Pré-isolamento (até 2 semanas antes do isolamento do miócito)
- Base tampão de perfusão: Preparar 1 L de base tampão de perfusão (NaCl, KCl, NaH 2PO 4, HEPES, Glicose e BDM) em 1 L de ultrapuro 18,2 MΩ·cm H2O. Ajustar para pH7,4 antes da filtração estéril de 0,22 μm. Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento.
- Tampão de limpeza: Prepare 1 L de tampão de limpeza (NaCl, KCl, NaH 2PO 4, HEPES, Glicose, EDTA e BDM) em 1 L de ultrapuro 18,2 MΩ·cm H2O. Ajuste para pH7,4 antes da filtração estéril de 0,22 μm. Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento.
- Solução-mãe de CaCl 2 100 mM: Pesar 1,11 g de CaCl 2 e dissolver em 100 mL de solução ultrapura de 18,2 MΩ·cm H2 O. Conservar à temperatura ambienteaté ao dia do isolamento.
- Alíquotas de liberase: Dissolver 5 mg de enzimas digestivas em 5 mL de água estéril e livre de RNase. Preparar alíquotas de 0,8 ml e conservar a -20 °C até ao dia do isolamento.
- Laminar os pratos: Aplicar 100 μL de laminina de rato a 40 μg/mL de laminação de Petri de 30 mL estéreis. Deixe descansar por 30 min e remova o excesso de laminina. Coloque a laminina em uma placa de Petri com incubação UV à temperatura ambiente por 30 min. Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento (podem ser utilizadas placas de Petri laminadas até 2 semanas).
- Meio DMEM: Em uma cabine de biossegurança, adicionar 2,5 mL de FBS, 0,5 mL de Penicilina-Estreptomicina (50 U/mL-50 μg) e 1 mL de BDM 500 mM a 46 mL de DMEM. Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento (os meios podem ser utilizados até 2 semanas).
- Meio M199: Preparar 1 L de meio M199 (NaHCO3, HEPES, L-glutationa, M199, BDM e BSA) em 1 L de ultrapuro 18,2 MΩ·cm H2O. Ajustar para pH 7,4 antes da filtração estéril (filtro de 0,22 μm). Conservar a 4 °C até ao dia do isolamento.
- Estoque de BDM 500 mM: Adicionar 0,5 g de BDM a 10 mL de ultrapuro 18,2 MΩ·cm H2O. Conservar a 4 °C até o dia do isolamento.
- Criação de plataforma estabilizadora: Molde a massa em torno da base da agulha rosqueada na torneira Luer. Molde para a placa de Petri que irá conter o coração e garantir que a agulha está na altura adequada para a injeção ventricular (~5 mm acima do fundo do prato).
- O dia do isolamento
- Tampão de perfusão: No dia do isolamento, adicionar 9,5 mg de MgCl2 a 100 mL de tampão base de perfusão. Deixe misturar completamente antes de remover 30 mL de tampão de perfusão completo e coloque em um frasco de vidro limpo e de boca larga de 100 mL com uma tampa de tampa de rosca (tampão de digestão).
NOTA: Estas adições podem ser feitas no dia do isolamento sem ajustes adicionais de pH, pois sua adição altera insignificantemente o pH.- Retirar 12 mL de tampão de perfusão e ajustar para o lado (stop buffer). Despeje os 58 mL restantes de tampão de perfusão em outro frasco de vidro limpo, de boca larga e 100 mL com tampa de rosca. Conservar o tampão de perfusão restante a 37 °C durante todo o isolamento.
- Tampão de digestão: Adicionar 7,5 μL de CaCl100 mM 2 a 30 mL de tampão de perfusão para uma concentração final de 25 μM. Imediatamente antes do isolamento, adicionar 770 μL de Liberase ao tampão de digestão para uma concentração final de 26 μg/mL.
- Tampão de parada: Dissolver 240 mg de BSA em 12 mL de tampão de perfusão. Conservar a 37 °C durante todo o isolamento.
- Tampão de limpeza: Prepare uma seringa de 3 mL de tampão de limpeza e limpe a agulha de bolhas. Conservar no gelo até ao isolamento.
- Tampão de perfusão: No dia do isolamento, adicionar 9,5 mg de MgCl2 a 100 mL de tampão base de perfusão. Deixe misturar completamente antes de remover 30 mL de tampão de perfusão completo e coloque em um frasco de vidro limpo e de boca larga de 100 mL com uma tampa de tampa de rosca (tampão de digestão).
2. Preparação do coletor
- Limpe o coletor com temperatura controlada com tampão de perfusão recém-preparado, tomando cuidado para garantir que não restem bolhas. Usando um conector Luer lock, rosqueie em uma agulha de 27 G e livre de bolhas. Uma variedade limpa é essencial para um isolamento bem-sucedido.
3. Preparo dos animais
- Injetar o rato por via intraperitoneal com 100 mg/kg de quetamina e 20 mg/kg de xilazina em peso corporal imediatamente antes do isolamento. Este procedimento foi utilizado em um camundongo C57Bl/6 macho, com 4 meses de idade.
- Se necessário, coloque o mouse em uma almofada cirúrgica aquecida para incentivar a sedação. Tenda os braços do rato, e tape os membros e base da cauda para uma fralda de laboratório azul. Certifique-se de que o animal esteja totalmente anestesiado pela retirada do reflexo de pinça dos dedos. Aplique um pano estéril ao redor da área cirúrgica.
4. Procedimento de isolamento de cardiomiócitos
- Expor o esterno do camundongo e, lateralmente à linha média, cortar proximalmente através das costelas e da axila. Corte suavemente totalmente o diafragma, garantindo cortes rasos para evitar o coração. Aperte o esterno com um hemostático e dobre as costelas para trás para expor a cavidade torácica.
- Remover suavemente o pericárdio do coração e cortar totalmente através da veia cava inferior, imediatamente distal ao coração. Use uma seringa de 3 mL com uma agulha de 27 G para injetar rapidamente 3 mL de tampão de limpeza gelado no ventrículo direito do coração durante 1 minuto.
- Segure suavemente o coração usando uma pinça e afaste-se do corpo, expondo o máximo possível da aorta. Usando um hemostático, pinça a aorta ascendente, tomando cuidado para não apertar os átrios, e extirpe o coração do tórax.
- Transfira rapidamente o coração pinçado para a tampa de uma placa de Petri de polipropileno com aproximadamente 10 mL de tampão de perfusão quente. Coloque o coração pinçado na plataforma de suporte e use uma agulha estabilizada de 27 G conectada ao coletor para injetar 10 mL de tampão de perfusão de 37 °C com temperatura controlada no ventrículo esquerdo durante 5 minutos.
- Transfira o coração pinçado e a plataforma de suporte para uma placa de Petri com aproximadamente 5 mL de tampão de digestão. Troque as seringas de entrada por uma seringa de 50 mL com 25 mL de tampão de digestão.
- Limpe o coletor de quaisquer bolhas e o tampão de perfusão restante antes da injeção. Substitua cuidadosamente a agulha na mesma posição da agulha no ápice do ventrículo esquerdo.
- Use uma bomba de perfusão para injetar tampão de digestão de 37 °C com temperatura controlada no ventrículo esquerdo por 15 minutos usando uma seringa de 50 mL. Controlar a temperatura da solução com uma camisa de água previamente calibrada para ejetar a solução de 37 °C na extremidade da agulha.
- Retire os ventrículos dos átrios e transfira para um copo de 10 mL. Adicione 3 mL de tampão de digestão ao copo e, usando uma tesoura afiada, corte os ventrículos em pedaços grandes. Cubra o copo com papel alumínio e coloque em banho-maria pré-aquecido a 37 °C por 5 min.
- Descarte o sobrenadante, tomando cuidado para evitar a retirada de pedaços de tecido. Ressuspender os pedaços de tecido em 3 mL de tampão de digestão e triturar por aproximadamente 4 min ou até que uma mistura homogênea seja alcançada.
- Filtrar as células através de um filtro de células de nylon de 70 μm para um tubo de polipropileno de 50 mL.
- Retorne o filtrado a um tubo de polipropileno de fundo redondo de 14 mL e centrifuja por 1 min a 100 rpm. Eliminar o sobrenadante e voltar a suspender o pellet em 3 ml de tampão stop.
- Adicionar 54 μL de CaCl 2 100 mM às células ressuspensas para uma concentração final de CaCl2 de 1,8 mM. Esta etapa também pode ser realizada passo a passo para aumentar o rendimento celular.
- Deixe as células vivas se acomodarem por gravidade por 10 minutos antes de remover o sobrenadante que contém células mortas. Ressuspender o pellet em solução de armazenamento (solução de perfusão com 200 μM de CaCl2). Essas células agora podem ser usadas para experimentos funcionais (por exemplo, imagem/contração de cálcio, patch clamp, etc.), cultura, etc.
NOTA: As células também podem ser ressuspensas em soluções dependentes de laboratório ou experimento.
5. Cultura celular
- Conte as células usando um hemocitômetro ou por uma contagem de visão de campo usando uma folha de cobertura quadriculada. Como os miócitos são muito grandes, a contagem por hemocitômetro nem sempre é precisa. Isso é usado para se ter uma ideia de aproximadamente quantas células foram obtidas a partir do isolamento.
- Diluir as células para ~25.000 células/mL com meio DMEM. Adicionar 1 ml de solução celular a cada poço.
- Incubar a 37 °C, 95% O 2, 5% CO 2 durante2 h.
- Aspirar suavemente o meio DMEM de cada poço e adicionar 2 mL do meio M199.
- Incubar a 37 °C, 95% O 2, 5% CO2 por até 24 h.
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Representative Results
Há alguns elementos a serem examinados ao determinar o sucesso de um isolamento. Primeiro, os cardiomiócitos devem ser em forma de bastonete, sem bolhas de membrana, como as células isoladas na Figura 1. Um isolamento típico produzirá ~80% dos miócitos em forma de bastonete. Se o isolamento produzir algo menos do que 50% de células em forma de bastonete, então é considerado um isolamento malsucedido e cardiomiócitos não são usados. Por fim, os cardiomiócitos devem ser quiescentes. Miócitos em contração espontânea demonstram intolerância ao Ca2+ e produzirão dados não confiáveis. De todos os isolamentos realizados com a técnica acima, quase todos são considerados bem-sucedidos. Os cardiomiócitos cultivados são considerados bem-sucedidos se forem em forma de bastonete, sem bolhas de membrana ou bordas arredondadas com altas taxas de sobrevida (Figura 2).
Tabela 1. Uma tabela de diferenças notáveis entre nosso método, métodos de Langendorff, e métodos livres de Langendorff publicados anteriormente para isolar cardiomiócitos de camundongos. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Concentrações dos meios tampão. Clique aqui para baixar esta tabela.
Gráfico 1. (A) Cardiomiócitos de camundongos C57Bl/6 com 4 meses de idade obtidos por microscopia de campo claro. Rendimento: ~80%; Ampliação de 20x. (B) Imagem de campo brilhante de um cardiomiócito de camundongo C57Bl/6 com 4 meses de idade. Os cardiomiócitos são quiescentes, exibindo bastonetes sem bolhas de membrana. A barra de escala é de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Gráfico 2. (A) Os cardiomiócitos de camundongos C57Bl/6 com 4 meses de idade foram cultivados por 24 h em meio M199. Viabilidade: ~80%; Ampliação de 20x. (B) Miócitos cultivados por 24 h. Às 24 h, os cardiomiócitos exibem bastonetes sem bolhas de membrana. (C) Curva de sobrevida % para cardiomiócitos cultivados por 24 h pelo método descrito. A barra de escala é de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A principal vantagem de nossa técnica de isolamento de cardiomiócitos sem Langendorff é que ela limita a hipóxia e o tempo de isquemia por não necessitar de canulação para um aparelho de Langendorff. Alternativamente às técnicas clássicas de Langendorff que levam vários minutos para remover, limpar e pendurar o coração, muitas vezes resultando em dano isquêmico ao miócito, nosso método inclui uma limpeza in vivo do sangue por meio de uma solução de limpeza gelada. O tampão de limpeza gelada contém ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), quelata irreversivelmente cátions divalentes para remover eficientemente o cálcio, tornando-o um excelente anticoagulante e, portanto, interrompe a contração23. O uso de soluções geladas inibe a contração por retardar a troca iônica e a taxa metabólica celular, prevenindo danos causados pela isquemia24. Ao eliminar a necessidade de canulação aórtica, as técnicas livres de Langendorff produzem miócitos robustos, resultando em um preparo mais confiável para fornecer dados confiáveis, o que nem sempre é o caso dos métodos de isolamento de Langendorff.
Trata-se de uma variação de uma técnica de isolamento livre de Langendorffpublicada anteriormente18, com adaptações destacadas na Tabela 1. Mais importante, esta técnica introduz uma plataforma estabilizadora que limita o número de vezes que a agulha deve ser removida e substituída do coração. Qualquer movimento desnecessário introduzido na agulha enquanto inserido no ventrículo alarga o local da punção. Um local de punção mais amplo resulta em refluxo para fora do ventrículo do local da punção, diminuição da pressão no coração e diminuição do fluxo para as coronárias. Esse problema é corrigido usando a plataforma de estabilização. Ao limitar o movimento da agulha e o número de vezes que a agulha é removida e substituída (uma em comparação com três vezes como descrito anteriormente18), mantemos um fluxo consistente para as coronárias e alcançamos consistentemente a digestão. Outra adaptação fundamental foi a adição de uma camisa com temperatura controlada para manter as soluções enzimáticas a 37 °C ao entrar no coração (o banho de temperatura foi calibrado para ejetar a 37 °C da agulha). A enzima de digestão utilizada tem ótima atividade de reação a 37 °C, e a adição de controle de temperatura aumenta a atividade enzimática, diminuindo assim o tempo de digestão. A liberase também tem mínima variabilidade lote a lote e tem maior reprodutibilidade em comparação com outras enzimas. Outra adaptação das técnicas anteriores é a diminuição da quantidade de solução de limpeza injetada. Diminuir a quantidade de tampão de limpeza para entrar no coração e permitir que mais sangue seja limpo pelo tampão de perfusão diminui a inativação da enzima de digestão pelo EDTA. Outra razão pela qual nosso método consistentemente alcança isolamentos bem-sucedidos de miócitos é pelo uso de BDM. O BDM é um inibidor da miosina que impede o mecanismo de power stroke do sarcômero, inibindo a contração e limitando a lesão de reoxigenação durante a digestão. Ao limitar a contração, evitamos a ciclagem do cálcio e a produção inerente de espécies reativas de oxigênio na contração de miócitos em cultura. Como o meio de cultura contém cálcio, é possível que os miócitos possam se contrair e diminuir o rendimento subsequente após a cultura. Optamos pela cultura dos miócitos em DMB para prevenir contração e aumentar orendimento25,26. O BDM sempre pode ser lavado dos miócitos para medidas funcionais após a cultura com grande sucesso. Alternativamente, todas as etapas desse procedimento podem ser realizadas sem a adição de BDM, mas os isolamentos não podem ser considerados como "bem-sucedidos" em miócitos isolados livres de BDM.
Além do tempo isquêmico, existem muitos outros fatores que determinarão se um isolamento produzirá miócitos robustos. Como existem diferentes condições nos laboratórios individuais, as pessoas que realizam o isolamento podem precisar modificar a quantidade de enzima e/ou cálcio, o tempo de perfusão e/ou velocidade da bomba e a velocidade e/ou tempo do banho de água de balanço. Esses parâmetros dependerão do modelo de camundongo utilizado, como saudável ou doente, envelhecimento, etc.
Embora essa técnica não exija a habilidade cirúrgica necessária para as técnicas baseadas em Langendorff, ainda existem etapas críticas para que a técnica seja bem-sucedida. O problema mais comum que produz miócitos pobres com esta técnica é devido às bolhas que entram no sistema de perfusão e bloqueiam o tecido miocárdico de acesso ao tampão de perfusão. A solução para este problema é a prática cuidadosa para evitar bolhas (através da técnica adequada de limpeza da seringa, técnica adequada de remoção da agulha, arrotar o coletor de bolhas ao trocar seringas, etc.), bem como múltiplos pontos de saída do sistema de perfusão no caso de uma bolha estar alojada no coletor. Sem bolhas, em nossa experiência, obtemos quase 100% de sucesso em isolamentos de miócitos (definidos como acima de 50% de miócitos em forma de bastonete; a média é de ~80%).
Embora o método tenha sido simplificado pela remoção da habilidade cirúrgica necessária para o método de Langendorff, este método adaptado só foi tentado em camundongos. Outra vantagem do método livre de Langendorff é que ele pode ser usado para muitos modelos murinos (ou seja, do neonato à senescência), como descrito anteriormente19. Infelizmente, mamíferos maiores (por exemplo, cães, porcos, etc.) não serão adequados para esta técnica devido ao tamanho de seus corações. Seria impossível perfundir o coração com solução suficiente para adquirir miócitos confiáveis.
Nossa adaptação do método livre de Langendorff é um método confiável para o sucesso do isolamento de cardiomiócitos de camundongos. Comparada ao método de Langendorff, essa abordagem alternativa requer pouca habilidade técnica para obter cardiomiócitos de forma consistente.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) e T32 HL134616 (Sturgill e Salyer).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
References
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