Summary
תקן הזהב בקרדיולוגיה לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים הוא קרדיומיוציטים. מאמר זה מתאר התאמות לטכניקה שאינה לנגנדורף לבידוד קרדיומיוציטים של עכברים.
Abstract
הצורך בשיטות ניתנות לשחזור אך פשוטות מבחינה טכנית המניבות קרדיומיוציטים באיכות גבוהה חיוני למחקר בביולוגיה של הלב. ניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים (למשל, התכווצות, אלקטרופיזיולוגיה, מחזור סידן וכו ') על קרדיומיוציטים הם תקן הזהב לביסוס מנגנונים של מחלות. העכבר הוא המין המועדף לניסויים פונקציונליים והטכניקה המתוארת היא במיוחד לבידוד קרדיומיוציטים של עכבר. שיטות קודמות הדורשות מכשיר לנגנדורף דורשות רמות גבוהות של אימון ודיוק עבור קנולציה אבי העורקים, לעתים קרובות לגרום איסכמיה. התחום עובר לשיטות בידוד נטולות לנגנדורף שהן פשוטות, ניתנות לשכפול ומניבות מיוציטים בני קיימא לרכישת נתונים פיזיולוגיים ולתרבית. שיטות אלה מפחיתות מאוד את זמן האיסכמיה בהשוואה לקנולציה של אבי העורקים וגורמות לקרדיומיוציטים המתקבלים באופן אמין. ההתאמה שלנו לשיטה נטולת לנגנדורף כוללת זילוח ראשוני עם תמיסת ניקוי קרה כקרח, שימוש בפלטפורמה מייצבת המבטיחה מחט יציבה במהלך הזילוח, ושלבי עיכול נוספים כדי להבטיח קרדיומיוציטים המתקבלים באופן אמין לשימוש במדידות תפקודיות ובתרבית. שיטה זו פשוטה ומהירה לביצוע ודורשת מיומנות טכנית מועטה.
Introduction
במשך עשרות שנים, רעיון חיוני בספרות הביולוגיה של הלב הוא מנגנון הפעולה המולקולרי. יש להקים מנגנון פעולה על מנת לפרסם מחקרים מהימנים. אסטרטגיה מבוססת היטב לקביעת מנגנון מולקולרי היא מחקרי קרדיומיוציטים מבודדים, הדורשים קרדיומיוציטים באיכות גבוהה להשגת נתונים אמינים. ניסויים תאיים ומולקולריים המבוצעים על קרדיומיוציטים לקביעת מנגנון פעולה הם תקן הזהב לחקר התכווצות1, אלקטרופיזיולוגיה2, סידן (Ca 2+) מחזור3, מיופילמנט Ca2+ רגישות4, שלד ציטו-שלד5, מטבוליזם6, השפעות הורמונים7, מולקולות איתות8, מחקרי תרופות9 וכו. העכבר הפך למין המועדף על רוב הניסויים בביולוגיה של הלב בשל קלות המניפולציה הגנטית, גודלו הקטן, תוחלת החיים הקצרה יחסית שלו, עלותו הנמוכה וכו '10. עם זאת, בידוד אמין של קרדיומיוציטים עכבר באיכות גבוהה אינו טריוויאלי עם הטכניקות הנוכחיות.
מעבדות מבודדות קרדיומיוציטים כבר כמעט 70 שנה11. כמעט כל הטכניקות לבידוד קרדיומיוציטים מסתמכות על עיכול הלב באמצעות אנזימים שונים (קולגנאז, פרוטאז, טריפסין וכו '). בתקופות המוקדמות (שנות ה-50 עד שנות ה-60) נעשה שימוש בשיטת הגוש, שכללה הוצאת הלב, חיתוך לחתיכות קטנות בהרבה ודגירת תמיסה עם קולגנאז/פרוטאז/טריפסין12. בשנות ה-70 יישמו המעבדות את שיטת "לנגנדורף"13, שבודדה קרדיומיוציטים באמצעות טכניקת בידוד מבוססת זילוח של העורקים הכליליים (זילוח מדרדר עם אנזים באמצעות מנגנון לנגנדורף); טכניקה זו נותרה השיטה השלטת לבידוד מיוציטים בתחום כיום, ~50 שנה מאוחר יותר14,15,16. העבודה האחרונה עברה לשימורי הלב in vivo כדי להגביל את זמן ההיפוקסיה ואת הנזק האיסכמי וכתוצאה מכך בידודי קרדיומיוציטים מעולים (יבולים טובים יותר ואיכות גבוהה יותר)17. לאחרונה, זה התפתח לביצוע in vivo, זילוח לב ללא לנגנדורף 18,19,20,21,22. פיתחנו את טכניקת בידוד קרדיומיוציטים ללא לנגנדורף המבוססת על טכניקת Ackers-Johnson et al.18 והתאמנו רכיבים שונים מטכניקות בידוד קודמות רבות. התאמות מפתח אלה כוללות הזרקה של חיץ ניקוי קר כקרח ושילוב של פלטפורמה תומכת כדי לייצב את המחט, המאפשר מניפולציה מופחתת של הלב. כמו כן מפורט בטכניקה זו בקרת טמפרטורה של חוצצים מוזרקים (37 מעלות צלזיוס), אשר הפחית את הזמן בין הזרקת in vivo לעיכול עקב פחות זילוח EDTA כפי שפורסם בעבר18. על ידי הפחתת מניפולציה של הלב ולכן מזעור גודל אתר לנקב, זילוח יסודי ומתמיד של העורקים הכליליים מתקבל. כמו כן, שיפרנו את הטכניקה עם עיכול בשיטת נתח משני, כמות ה-EDTA במאגר הניקוי המוזרק, ושינינו את רמת החומציות. הטכניקה המתוארת שלנו אמינה יותר, יעילה יותר, ואינה דורשת הכשרה/תרגול נרחב בהשוואה לשימוש במכשיר לנגנדורף (טבלה 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אוהיו בהתאם להנחיות NIH.
1. הכנת פתרון
הערה: ראה טבלה 2 עבור ריכוזי חיץ.
- טרום בידוד (עד שבועיים לפני בידוד מיוציטים)
- בסיס חיץ זילוח: הכינו 1 ליטר של בסיס חיץ זילוח (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES,גלוקוז ו-BDM) ב-1 ליטר של אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H2O. התאימו ל-pH7.4 לפני סינון סטרילי של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד.
- חיץ ניקוי: יש להכין 1 ליטר של חיץ ניקוי (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES,Glucose, EDTA ו-BDM) ב-1 ליטר של אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H2O. יש לכוונן ל-pH7.4 לפני סינון סטרילי של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד.
- 100 מ"מ תמיסת מלאי CaCl 2: שוקלים 1.11 גרם CaCl 2 ומתמוססים ל-100 מ"ל של אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H2 O. יש לאחסן בטמפרטורתהחדר עד ליום הבידוד.
- Liberase aliquots: להמיס 5 מ"ג של אנזימי עיכול ב 5 מ"ל של מים סטריליים, ללא RNase. להכין 0.8 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 ° C עד יום הבידוד.
- למינציה את הכלים: יש למרוח 100 μL של למינין עכבר 40 מיקרוגרם/מ"ל על צלחות פטרי סטריליות בעלות תחתית זכוכית של 30 מ"ל. אפשר לשבת במשך 30 דקות ולהסיר עודף למינין. מניחים את הלמינין על צלחת פטרי עם דגירה UV בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד ליום הבידוד (ניתן להשתמש בצלחות פטרי למינציה עד שבועיים).
- מדיית DMEM: בארון בטיחות ביולוגית, הוסף 2.5 מ"ל של FBS, 0.5 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין (50 U/mL-50 מיקרוגרם) ו-1 מ"ל של 500 mM BDM עד 46 מ"ל של DMEM. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד (ניתן להשתמש במדיה עד שבועיים).
- חומרי הדפסה M199: יש להכין 1 ליטר של חומרי הדפסה M199 (NaHCO3, HEPES, L-גלוטתיון, M199, BDM ו-BSA) ב-1 ליטר של חומר אחסון אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H2O. יש לכוונן ל-pH 7.4 לפני סינון סטרילי (מסנן 0.22 מיקרומטר). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד.
- 500 מ"מ מלאי BDM: יש להוסיף 0.5 גרם BDM ל-10 מ"ל של אולטרה-טהור 18.2 MΩ·cm H2O. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד ליום הבידוד.
- יצירת פלטפורמה מייצבת: בצק משחק עובש סביב בסיס המחט המוברגת לסטופקוק Luer. עובש לצלחת הפטרי שיכיל את הלב ויבטיח שהמחט תהיה בגובה המתאים להזרקת החדר (~5 מ"מ מעל תחתית המנה).
- יום הבידוד
- חיץ זילוח: ביום הבידוד, יש להוסיף 9.5 מ"ג של MgCl2 עד 100 מ"ל של בסיס חיץ זילוח. מניחים לערבב לחלוטין לפני הסרת 30 מ"ל של חיץ זילוח שהושלם ומניחים בבקבוק זכוכית נקי, רחב פה, 100 מ"ל עם מכסה מכסה בורג (חיץ עיכול).
הערה: ניתן לבצע תוספות אלה ביום הבידוד ללא התאמות pH נוספות מכיוון שהוספתן משנה את ה- pH באופן זניח.- הסר 12 מ"ל של מאגר זילוח והגדר בצד (מאגר עצירה). יוצקים את 58 מ"ל הנותרים של חיץ זילוח לתוך בקבוק זכוכית נקי, רחב פה, 100 מ"ל עם מכסה בורג. אחסנו את מאגר הזילוח הנותר בטמפרטורה של 37°C במהלך הבידוד.
- חיץ עיכול: הוסף 7.5 μL של 100 mM CaCl2 עד 30 מ"ל של חיץ זילוח לקבלת ריכוז סופי של 25 μM. מיד לפני הבידוד, הוסף 770 μL של Liberase למאגר העיכול לקבלת ריכוז סופי של 26 מיקרוגרם / מ"ל.
- מאגר עצירה: יש להמיס 240 מ"ג BSA ב-12 מ"ל של מאגר זילוח. יש לאחסן בטמפרטורה של 37°C במהלך הבידוד.
- חיץ ניקוי: מכינים מזרק 3 מ"ל של חיץ ניקוי ומנקים את המחט מבועות. יש לאחסן על קרח עד לבידוד.
- חיץ זילוח: ביום הבידוד, יש להוסיף 9.5 מ"ג של MgCl2 עד 100 מ"ל של בסיס חיץ זילוח. מניחים לערבב לחלוטין לפני הסרת 30 מ"ל של חיץ זילוח שהושלם ומניחים בבקבוק זכוכית נקי, רחב פה, 100 מ"ל עם מכסה מכסה בורג (חיץ עיכול).
2. הכנת סעפת
- נקה את הסעפת מבוקרת הטמפרטורה עם חיץ זילוח טרי, תוך הקפדה על כך שלא יישארו בועות. באמצעות מחבר נעילת Luer, להבריג במחט 27 G, ולנקות מבועות. סעפת מפונה חיונית לבידוד מוצלח.
3. הכנת בעלי חיים
- יש להזריק לעכבר תוך צפקית 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-20 מ"ג/ק"ג קסילזין לפי משקל גוף מיד לפני הבידוד. הליך זה השתמש בעכבר C57Bl/6 זכר בן 4 חודשים.
- במידת הצורך, הניחו את העכבר על כרית כירורגית מחוממת כדי לעודד טשטוש. אוהלו את זרועות העכבר, והדביקו את הגפיים ואת בסיס הזנב לחיתול מעבדה כחול. ודא כי החיה מורדמת לחלוטין על ידי נסיגה של רפלקס צביטת הבוהן. יש למרוח וילון סטרילי סביב אזור הניתוח.
4. הליך בידוד קרדיומיוציטים
- לחשוף את עצם החזה של העכבר, לרוחב לקו האמצע, לחתוך בסמיכות דרך הצלעות אל בית השחי. חתכו בעדינות את הסרעפת במלואה, והקפידו על חתכים רדודים כדי למנוע את הלב. מהדקים את עצם החזה עם hemostat ומקפלים את הצלעות לאחור כדי לחשוף את חלל בית החזה.
- בעדינות להסיר את קרום הלב מן הלב לחתוך במלואו דרך נבוב הווריד הנחות, מיד דיסטלי ללב. השתמש מזרק 3 מ"ל עם מחט 27 G כדי להזריק במהירות 3 מ"ל של חיץ ניקוי קר כקרח לחדר הימני של הלב במשך 1 דקות.
- החזיקו בעדינות את הלב באמצעות פינצטה והתרחקו מהגוף, חושפים כמה שיותר מאבי העורקים. באמצעות hemostat, להדק את אבי העורקים העולה, נזהר לא להדק את אטריה, ואת הבלו את הלב מן החזה.
- להעביר במהירות את הלב המהודק למכסה של צלחת פטרי פוליפרופילן עם כ 10 מ"ל של חיץ זילוח חם. הניחו את הלב המהודק לתוך הפלטפורמה התומכת והשתמשו במחט 27 G מיוצבת המחוברת לסעפת כדי להזריק 10 מ"ל של חיץ זילוח מבוקר טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לחדר השמאלי במשך 5 דקות.
- מעבירים את הלב המהודק ואת המצע התומך לצלחת פטרי עם כ-5 מ"ל של חיץ עיכול. החלפת מזרקי קלט עבור מזרק 50 מ"ל עם 25 מ"ל של חיץ העיכול.
- נקה את הסעפת של כל הבועות ואת חיץ הזילוח שנותר לפני ההזרקה. החלף בזהירות את המחט לאותו מיקום מחט בקודקוד החדר השמאלי.
- השתמש במשאבת זילוח כדי להזריק חיץ עיכול מבוקר טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לחדר השמאלי למשך 15 דקות באמצעות מזרק 50 מ"ל. שלוט בטמפרטורת התמיסה באמצעות מעיל מים שכויל בעבר להוצאת תמיסה של 37 מעלות צלזיוס בקצה המחט.
- מוציאים את החדרים מהאטריה ומעבירים לכוס של 10 מ"ל. מוסיפים 3 מ"ל של חיץ עיכול לכוס ובעזרת מספריים חדים חותכים את החדרים לחתיכות גדולות. מכסים את הכד ברדיד אלומיניום ומניחים באמבט מים רועד שחומם מראש ל-37°C למשך 5 דקות.
- השליכו את הסופרנטנט, תוך זהירות להימנע מהסרת גושי רקמה. להשהות מחדש את גושי הרקמה ב 3 מ"ל של חיץ העיכול triturate במשך כ 4 דקות או עד תערובת הומוגנית מושגת.
- סנן את התאים דרך מסננת תאי ניילון 70 מיקרומטר לתוך צינור פוליפרופילן 50 מ"ל.
- החזירו את התסנין לצינור פוליפרופילן עגול בנפח 14 מ"ל וצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-100 סל"ד. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-3 מ"ל של חיץ עצירה.
- הוסף 54 μL של 100 mM מלאי CaCl 2 לתאים המרחפים לקבלת ריכוז CaCl2 סופי של 1.8 mM. שלב זה יכול להתבצע גם בהדרגה כדי להגדיל את תפוקת התא.
- אפשרו לתאים חיים להתיישב על ידי כוח הכבידה במשך 10 דקות לפני שתסירו את הסופרנאטנט המכיל תאים מתים. השהה מחדש את הגלולה בתמיסת אחסון (פתרון זילוח עם 200 מיקרומטר CaCl2). תאים אלה יכולים לשמש כיום לניסויים פונקציונליים (כלומר, הדמיה/התכווצות סידן, מהדק טלאי וכו'), תרבית וכו'.
הערה: התאים עשויים גם להיות מושהים מחדש בתמיסות תלויות מעבדה או ניסוי.
5. תרבית תאים
- ספור את התאים באמצעות המוציטומטר או לפי ספירת תצוגות שדה באמצעות החלקת כיסוי מרושתת. מכיוון שמיוציטים גדולים מאוד, ספירה באמצעות המוציטומטר אינה תמיד מדויקת. זה משמש כדי לקבל מושג על כמה תאים בקירוב התקבלו מהבידוד.
- לדלל את התאים ל~ 25,000 תאים / מ"ל עם מדיה DMEM. הוסף 1 מ"ל של תמיסת תאים לכל באר.
- יש לדגור ב-37°C, 95% O 2, 5% CO2 למשך שעתיים.
- שאפו בעדינות מדיית DMEM מכל באר והוסיפו 2 מ"ל של מדיה M199.
- יש לדגור ב-37°C, 95% O 2, 5% CO2 למשך עד 24 שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ישנם מספר אלמנטים שיש לבחון בעת קביעת הצלחת הבידוד. ראשית, הקרדיומיוציטים חייבים להיות בצורת מוט ללא כתמים בממברנה, כמו התאים שבודדו באיור 1. בידוד טיפוסי יניב ~80% מהמיוציטים בצורת מוט. אם הבידוד מניב משהו פחות מ 50% תאים בצורת מוט, אז זה נחשב בידוד לא מוצלח קרדיומיוציטים אינם בשימוש. לבסוף, cardiomyocytes צריך להיות שקט. מיוציטים המתכווצים באופן ספונטני מפגינים אי סבילות ל- Ca2+ וייצרו נתונים לא אמינים. מכל הבידודים המבוצעים בטכניקה הנ"ל, כמעט כל הבידודים נחשבים מוצלחים. קרדיומיוציטים בתרבית נחשבים מוצלחים אם הם בצורת מוט ללא כתמים בקרום או קצוות מעוגלים עם שיעורי הישרדות גבוהים (איור 2).
טבלה 1. טבלה של הבדלים בולטים בין השיטה שלנו, שיטות לנגנדורף, ושיטות ללא לנגנדורף שפורסמו בעבר לבידוד קרדיומיוציטים של עכברים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: ריכוזי מדיות חיץ. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
איור 1. (A) קרדיומיוציטים עכבריים C57Bl/6 בני 4 חודשים שצולמו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. תשואה: ~80%; הגדלה פי 20. (B) תמונת שדה בהיר של קרדיומיוציטים עכבר C57Bl/6 בן 4 חודשים. קרדיומיוציטים הם שקטים, ומציגים צורת מוט ללא כתמים קרומיים. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. (A) קרדיומיוציטים עכבריים C57Bl/6 בני 4 חודשים שגודלו בתרבית במשך 24 שעות במדיה M199. כדאיות: ~80%; הגדלה פי 20. (B) מיוציטים שגודלו בתרבית במשך 24 שעות. ב 24 שעות, cardiomyocytes להציג בצורת מוט ללא blebs הממברנה. (C) % עקומת הישרדות עבור קרדיומיוציטים בתרבית במשך 24 שעות בשיטה המתוארת. סרגל קנה המידה הוא 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היתרון העיקרי של טכניקת בידוד קרדיומיוציטים ללא לנגנדורף שלנו הוא שהיא מגבילה את זמן ההיפוקסיה והאיסכמי בכך שאינה דורשת קנולציה למכשיר לנגנדורף. לחילופין, בדומה לטכניקות לנגנדורף הקלאסיות שלוקח מספר דקות להסיר, לנקות ולתלות את הלב, מה שגורם לעיתים קרובות לנזק איסכמי למיוציטים, השיטה שלנו כוללת ניקוי דם in vivo באמצעות תמיסת ניקוי קר כקרח. חיץ הניקוי הקר כקרח מכיל חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA), תצבית קטיונים דו-ערכיים באופן בלתי הפיך כדי להסיר סידן ביעילות, מה שהופך אותו לנוגד קרישה מצוין, ולכן מפסיק את ההתכווצות23. השימוש בתמיסות קרות כקרח מעכב את ההתכווצות על ידי האטת חילופי היונים וקצב חילוף החומרים בתאים, ומונע נזק הנגרם על ידי איסכמיה24. על ידי הסרת הצורך בקנולציה של אבי העורקים, טכניקות נטולות לנגנדורף מייצרות מיוציטים חזקים וכתוצאה מכך הכנה אמינה יותר להניב נתונים אמינים, מה שלא תמיד קורה בשיטות הבידוד של לנגנדורף.
זוהי וריאציה של טכניקת בידוד ללא לנגנדורף18 שפורסמה בעבר עם התאמות כפי שמודגש בטבלה 1. והכי חשוב, טכניקה זו מציגה פלטפורמה מייצבת המגבילה את מספר הפעמים שיש להסיר את המחט ולהחליף אותה מהלב. כל תנועה מיותרת המוחדרת למחט בזמן החדרתה לחדר מרחיבה את אתר הניקוב. אתר ניקוב רחב יותר גורם לזרימה חזרה החוצה מהחדר מאתר הניקוב, לירידה בלחץ בלב ולירידה בזרימה אל הכליליים. בעיה זו נפתרת באמצעות הפלטפורמה המייצבת. על ידי הגבלת תנועת המחט ומספר הפעמים שהמחט מוסרת ומוחלפת (אחת לעומת שלוש פעמים כפי שתואר קודם לכן18), אנו שומרים על זרימה עקבית ללב הכלילי ומשיגים עיכול באופן עקבי. התאמה מרכזית נוספת הייתה הוספת מעיל מבוקר טמפרטורה לשמירה על תמיסות אנזימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם הכניסה ללב (אמבט טמפרטורה כויל כך שייפלט ב -37 מעלות צלזיוס מהמחט). אנזים העיכול המשמש הוא בעל פעילות תגובה אופטימלית ב 37 מעלות צלזיוס, ותוספת של בקרת טמפרטורה מגבירה את פעילות האנזים, ובכך מפחיתה את זמן העיכול. לליבראז יש גם שונות מינימלית בין הרבה להרבה ויש לו יכולת רבייה גבוהה יותר בהשוואה לאנזימים אחרים. התאמה נוספת של טכניקות קודמות היא כמות מופחתת של תמיסת סליקה מוזרקת. הפחתת כמות חיץ הניקוי הנכנס ללב ומתן אפשרות ליותר דם להתנקות על ידי חיץ זילוח מפחיתה את השבתת אנזים העיכול על ידי EDTA. סיבה נוספת לכך שהשיטה שלנו משיגה באופן עקבי בידודי מיוציטים מוצלחים היא על ידי שימוש ב- BDM. BDM הוא מעכב מיוזין המונע את מנגנון מכת הכוח של הסרקומר, ובכך מעכב את ההתכווצות ומגביל את פציעת החמצון במהלך העיכול. על ידי הגבלת ההתכווצות, אנו מונעים מחזור סידן וייצור מיני חמצן תגובתי הטבוע בהתכווצות מיוציטים בתרבית. מכיוון שמצע התרבית מכיל סידן, ייתכן שהמיוציטים עלולים להתכווץ ולהקטין את היבול לאחר התרבית. אנו בוחרים לתרבית את המיוציטים ב- BDM כדי למנוע התכווצות ולהגדיל את התשואה25,26. BDM תמיד ניתן לשטוף מתוך מיוציטים למדידות פונקציונליות לאחר תרבית בהצלחה רבה. לחלופין, ניתן לבצע את כל השלבים של הליך זה ללא תוספת של BDM, אך בידודים עשויים שלא להיחשב כ"מוצלחים" על מיוציטים מבודדים ללא BDM.
מלבד זמן איסכמי, ישנם גורמים רבים אחרים שיקבעו אם בידוד ייצור מיוציטים חזקים. מכיוון שישנם תנאים שונים במעבדות השונות, ייתכן שהאנשים המבצעים את הבידוד יצטרכו לשנות את כמות האנזים ו / או הסידן, את זמן הזילוח ו / או מהירות המשאבה, ואת מהירות אמבט המים המתנדנדים ו / או זמן. פרמטרים אלה יהיו תלויים במודל העכבר בו נעשה שימוש, כגון בריא או חולה, הזדקנות וכו '.
בעוד טכניקה זו אינה דורשת את המיומנות הכירורגית הדרושה לטכניקות מבוססות לנגנדורף, ישנם עדיין צעדים קריטיים כדי להפוך את הטכניקה למוצלחת. הבעיה הנפוצה ביותר שמניבה מיוציטים עניים בטכניקה זו נובעת מבועות הנכנסות למערכת הזילוח וחוסמות את הגישה של רקמת שריר הלב למאגר הזילוח. הפתרון לבעיה זו הוא תרגול זהיר למניעת בועות (באמצעות טכניקת פינוי מזרקים נכונה, טכניקת פינוי מחטים נכונה, גיהוק סעפת הבועות בעת החלפת מזרקים וכו'), כמו גם נקודות יציאה מרובות ממערכת הזילוח במקרה של תקיעות בועה בסעפת. ללא בועות, מניסיוננו, אנו מתקרבים ל-100% בידודי מיוציטים מוצלחים (המוגדרים מעל 50% מיוציטים בצורת מוט; הממוצע הוא ~80%).
בעוד שהשיטה פשטה על ידי הסרת המיומנות הכירורגית הנדרשת לשיטת לנגנדורף, שיטה מותאמת זו נוסתה רק בעכברים. יתרון נוסף של השיטה נטולת לנגנדורף הוא שניתן להשתמש בה עבור מודלים רבים של מורין (כלומר, מיילוד ועד זקנה), כפי שתואר קודם לכן19. למרבה הצער, יונקים גדולים יותר (למשל, כלבים, חזירים וכו ') לא יתאימו לטכניקה זו בגלל גודל ליבם. זה יהיה בלתי אפשרי לחורר את הלב עם פתרון מספיק כדי לרכוש מיוציטים אמינים.
ההתאמה שלנו לשיטה נטולת לנגנדורף היא שיטה אמינה לבידוד מוצלח של קרדיומיוציטים של עכברים. בהשוואה לשיטת לנגנדורף, גישה חלופית זו דורשת מיומנות טכנית מועטה כדי להשיג קרדיומיוציטים באופן עקבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) ו- T32 HL134616 (Sturgill and Salyer).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cc Bd Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Low-Form Beaker | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polypropylene cap glass media storage bottle | DWK Life Sciences | UX-34523-00 | |
| 14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Syringe | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD Syringe without Needle | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| 95% O2 5% CO2 | |||
| AIMS Space Gel Heating Pad | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles | Becton Dickinson | 305109 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3803 | Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98% |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C7902 | >99% |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | Suitable for cell culture, >99.5% |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| FBS | R&D Systems (Bio-techne) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Labeling Tape | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Syringe Pump | kdScientific | 788100 | |
| L-glutathione | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberase TH Research Grade | Sigma | 5401135001 | High thermolysin concentration |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnesium Chloride | Invitrogen | AM9530G | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | |
| Pen/Strep | Fisher Sci | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P5405 | >99% |
| Precision Digital Reciprocating Water Bath | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Suitable for cell culture |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | >99% |
| Sterile Cell Strainer 70 µm | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| VWR Absorbent Underpads | Fisher Sci | NC9481815 |
References
- Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).
- Ziolo, M. T., et al. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).
- Traynham, C. J., et al. Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling. PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).
- Nixon, B. R., et al. Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).
- Swager, S. A., et al. Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1. Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).
- Pinckard, K. M., et al. A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function. Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).
- Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).
- Harris, J. E., et al. Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring. Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).
- Roof, S. R., et al. CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat. Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).
- Milani-Nejad, N. J. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Harary, I., Farley, B. In vitro studies of single isolated beating heart cells. Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).
- Kono, T. Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues. Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).
- Baker, J. B. An improved apparatus for mammalian heart perfusion. The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).
- Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
- Zhang, Z., et al. An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).
- Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).
- Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart. AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).
- Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice. Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).
- Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice. Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).
- Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers. Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).
- Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart. Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).
- Thum, J. B. Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).
