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माउस कार्डियोमायोसाइट्स को लगातार अलग करने के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/63056
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University

Summary

सेलुलर और आणविक कार्यात्मक प्रयोगों के लिए कार्डियोलॉजी में स्वर्ण मानक कार्डियोमायोसाइट्स हैं। यह लेख माउस कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए गैर-लैंगनडॉर्फ तकनीक के अनुकूलन का वर्णन करता है।

Abstract

कार्डियक जीव विज्ञान में अनुसंधान के लिए उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स उत्पन्न करने वाले प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लेकिन तकनीकी रूप से सरल तरीकों की आवश्यकता आवश्यक है। कार्डियोमायोसाइट्स पर सेलुलर और आणविक कार्यात्मक प्रयोग (जैसे, संकुचन, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, कैल्शियम साइकिलिंग, आदि) रोग के तंत्र (ओं) की स्थापना के लिए स्वर्ण मानक हैं। माउस कार्यात्मक प्रयोगों के लिए पसंद की प्रजाति है और वर्णित तकनीक विशेष रूप से माउस कार्डियोमायोसाइट्स के अलगाव के लिए है। लैंगनडॉर्फ तंत्र की आवश्यकता वाले पिछले तरीकों को महाधमनी प्रवेशनी के लिए उच्च स्तर के प्रशिक्षण और परिशुद्धता की आवश्यकता होती है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर इस्केमिया होता है। यह क्षेत्र लैंगनडॉर्फ-मुक्त अलगाव विधियों की ओर बढ़ रहा है जो सरल हैं, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं, और शारीरिक डेटा अधिग्रहण और संस्कृति के लिए व्यवहार्य मायोसाइट्स उत्पन्न करते हैं। ये विधियां महाधमनी प्रवेशनी की तुलना में इस्केमिया के समय को बहुत कम कर देती हैं और इसके परिणामस्वरूप मज़बूती से प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स होते हैं। लैंगनडॉर्फ-मुक्त विधि के हमारे अनुकूलन में बर्फ-ठंडा समाशोधन समाधान के साथ एक प्रारंभिक छिड़काव शामिल है, एक स्थिर मंच का उपयोग जो छिड़काव के दौरान एक स्थिर सुई सुनिश्चित करता है, और कार्यात्मक माप और संस्कृति में उपयोग के लिए विश्वसनीय रूप से प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त पाचन कदम। यह विधि सरल और प्रदर्शन करने के लिए त्वरित है और इसके लिए थोड़ा तकनीकी कौशल की आवश्यकता होती है।

Introduction

दशकों से, कार्डियक जीवविज्ञान साहित्य में एक आवश्यक विचार कार्रवाई का आणविक तंत्र है। विश्वसनीय अध्ययन प्रकाशित करने के लिए कार्रवाई का तंत्र स्थापित किया जाना चाहिए। आणविक तंत्र को निर्धारित करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित रणनीति पृथक कार्डियोमायोसाइट्स अध्ययन है, जिसे भरोसेमंद डेटा प्राप्त करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले कार्डियोमायोसाइट्स की आवश्यकता होती है। कार्रवाई के तंत्र को निर्धारित करने के लिए कार्डियोमायोसाइट्स पर किए गए सेलुलर और आणविक प्रयोग संकुचनकी जांच के लिए स्वर्ण मानक हैं 1, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी2, कैल्शियम (सीए2 +) साइकिल चलाना3, मायोफिलामेंट सीए2 + संवेदनशीलता4, साइटोस्केलेटन5, चयापचय6, हार्मोन7 के प्रभाव, सिग्नलिंग अणु8, दवा अध्ययन9 आदि। माउस आनुवंशिक हेरफेर, इसके छोटे आकार, इसके अपेक्षाकृत कम जीवनकाल, कम लागत आदि की आसानी के कारण अधिकांश कार्डियक जीव विज्ञान प्रयोगों के लिए पसंद की प्रजाति बन गयाहै। हालांकि, उच्च गुणवत्ता वाले माउस कार्डियोमायोसाइट्स का विश्वसनीय अलगाव वर्तमान तकनीकों के साथ तुच्छ नहीं है।

प्रयोगशालाएं लगभग 70 वर्षों से कार्डियोमायोसाइट्स को अलग कर रहीहैं। कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए लगभग सभी तकनीकें विभिन्न एंजाइमों (कोलेजनेज, प्रोटीज, ट्रिप्सिन, आदि) के माध्यम से हृदय के पाचन पर निर्भर करती हैं। शुरुआती अवधि (1950-1960 के दशक) में, चंक विधि का उपयोग किया गया था, जिसमें हृदय को हटाना, बहुत छोटे टुकड़ों में काटना और कोलेजनेज / प्रोटीज / ट्रिप्सिन12 के साथ समाधान में इनक्यूबेट करना शामिल था। 1970 के दशक में प्रयोगशालाओं ने "लैंगेंडॉर्फ" विधि13 को लागू किया, जिसने कोरोनरी धमनी छिड़काव-आधारित अलगाव तकनीक (लैंगेंडोर्फ तंत्र के माध्यम से एंजाइम के साथ प्रतिगामी छिड़काव) का उपयोग करके कार्डियोमायोसाइट्स को अलग किया; यह तकनीक आज भी क्षेत्र में मायोसाइट अलगाव की प्रमुख विधि बनी हुई है, ~ 50 साल बाद 14,15,16। हाल के काम ने हाइपोक्सिया समय और इस्केमिक क्षति को सीमित करने के लिए विवो में दिल को पतला करने के लिए स्थानांतरित कर दिया है जिसके परिणामस्वरूप बेहतर कार्डियोमायोसाइट अलगाव (बेहतर पैदावार और उच्च गुणवत्ता) 17 है। हाल ही में, यह विवो, लैंगनडॉर्फ-मुक्त हृदय छिड़काव 18,19,20,21,22 में प्रदर्शन में विकसित हुआ है। हमने एकर्स-जॉनसन एट अल.18 तकनीक के आधार पर लैंगेंडॉर्फ-मुक्त कार्डियोमायोसाइट्स अलगाव तकनीक विकसित की है और कई पिछली अलगाव तकनीकों से विभिन्न घटकों को अनुकूलित किया है। इन प्रमुख अनुकूलनों में एक बर्फ-ठंडा समाशोधन बफर का इंजेक्शन और सुई को स्थिर करने के लिए एक सहायक मंच का समावेश शामिल है, जिससे हृदय के हेरफेर में कमी आई है। इस तकनीक में इंजेक्शन बफर (37 डिग्री सेल्सियस) का तापमान नियंत्रण भी विस्तृत है, जिसने पहले प्रकाशित 18 के रूप में कम ईडीटीए छिड़काव के कारण विवो इंजेक्शन और पाचन के बीच के समय को कमकर दिया। हृदय के हेरफेर को कम करके और इसलिए पंचर साइट के आकार को कम करके, कोरोनरी धमनियों का संपूर्ण और निरंतर छिड़काव प्राप्त किया जाता है। हमने तकनीक को द्वितीयक खंड विधि पाचन के साथ भी परिष्कृत किया, इंजेक्शन क्लियरिंग बफर में ईडीटीए की मात्रा, और पीएच को बदल दिया। हमारी वर्णित तकनीक अधिक विश्वसनीय, अधिक कुशल है, और लैंगेंडॉर्फ तंत्र (तालिका 1) का उपयोग करने की तुलना में व्यापक प्रशिक्षण / अभ्यास की आवश्यकता नहीं है।

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Protocol

इस अध्ययन में की गई सभी प्रक्रियाओं को एनआईएच दिशानिर्देशों के अनुसार ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. समाधान तैयार करना

नोट: कृपया बफर सांद्रता के लिए तालिका 2 देखें।

  1. पूर्व-अलगाव (मायोसाइट अलगाव से 2 सप्ताह पहले तक)
    1. छिड़काव बफर बेस: अल्ट्राप्योर 18.2 एम.सेमीएच2ओ के 1 एल में छिड़काव बफर बेस (एनएसीएल, केसीएल, एनएएच 2 पीओ4, एचईपीईएस, ग्लूकोज और बीडीएम) का 1 एल तैयार करें। अलगाव के दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. क्लियरिंग बफर: अल्ट्राप्योर 18.2 एम.सेमी एच2ओ के 1 एल में क्लियरिंग बफर (एनएसीएल, केसीएल, एनएएच2पीओ4, एचईपीईएस, ग्लूकोज, ईडीटीए और बीडीएम) का 1 एल तैयार करें। अलगाव के दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. 100 mM CaCl2 स्टॉक समाधान: CaCl2 के 1.11 ग्राम वजन करें और अलगाव के दिन तक कमरे के तापमान पर अल्ट्राप्योर 18.2 M.cm H2O के 100 एमएल में घुल जाएं।
    4. लिबेरेज एलिकोट्स: 5 एमएल बाँझ, आरएनएस-मुक्त पानी में 5 मिलीग्राम पाचन एंजाइमों को भंग करें। 0.8 एमएल एलिकोट तैयार करें और अलगाव के दिन तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. व्यंजनों को लैमिनेट करें: बाँझ, ग्लास-बॉटम 30 एमएल पेट्री व्यंजनों पर 40 μg / mL माउस लैमिनिन के 100 μL लागू करें। 30 मिनट के लिए बैठने दें और अतिरिक्त लैमिनिन हटा दें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर यूवी इनक्यूबेशन के साथ पेट्री डिश पर लैमिनिन सेट करें। अलगाव के दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (लैमिनेटेड पेट्री व्यंजन 2 सप्ताह तक उपयोग किया जा सकता है)।
    6. डीएमईएम मीडिया: एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, 2.5 एमएल एफबीएस, 0.5 एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 यू / एमएल -50 μg), और 500 mM BDM का 1 mL DMEM के 46 एमएल जोड़ें। अलगाव के दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (मीडिया का उपयोग 2 सप्ताह तक किया जा सकता है)।
    7. M199 मीडिया: M199 मीडिया (NaHCO3, HEPES, L-Glutathione, M199, BDM, और BSA) के 1 L को अल्ट्राप्योर 18.2 M.cm H 2 O में तैयार करें। बाँझ निस्पंदन (0.22μm फ़िल्टर) से पहले pH 7.4 में समायोजित करें। अलगाव के दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    8. 500 mM BDM स्टॉक: आइसोलेशन के दिन तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 एमएल अल्ट्राप्योर 18.2 M.cm H2O स्टोर में 0.5 ग्राम BDM जोड़ें।
    9. स्थिर मंच निर्माण: लुएर स्टॉपकॉक में फंसी सुई के आधार के चारों ओर मोल्ड प्लेफो। पेट्री डिश में मोल्ड करें जिसमें दिल होगा और यह सुनिश्चित करेगा कि सुई वेंट्रिकल इंजेक्शन (डिश के तल से ~ 5 मिमी ऊपर) के लिए उचित ऊंचाई पर है।
  2. अलगाव का दिन
    1. छिड़काव बफर: अलगाव के दिन, छिड़काव बफर बेस के 100 एमएल में 9.5 मिलीग्राम एमजीसीएल2 जोड़ें। 30 एमएल पूर्ण छिड़काव बफर को हटाने से पहले पूरी तरह से मिश्रण करने की अनुमति दें और स्क्रू कैप ढक्कन (पाचन बफर) के साथ एक साफ, चौड़े मुंह, 100 एमएल ग्लास बोतल में रखें।
      नोट: ये परिवर्धन अतिरिक्त पीएच समायोजन के बिना अलगाव के दिन किए जा सकते हैं क्योंकि उनके अतिरिक्त पीएच को नकारात्मक रूप से बदल देता है।
      1. छिड़काव बफर के 12 एमएल को हटा दें और साइड (स्टॉप बफर) पर सेट करें। शेष 58 एमएल छिड़काव बफर को स्क्रू कैप ढक्कन के साथ एक और साफ, चौड़े मुंह, 100 एमएल ग्लास बोतल में डालें। शेष छिड़काव बफर को पूरे अलगाव में 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. पाचन बफर:25 μM की अंतिम सांद्रता के लिए छिड़काव बफर के 100 mM CaCl 2 से 30 mL का 7.5 μL जोड़ें। अलगाव से तुरंत पहले, 26 μg / mL की अंतिम सांद्रता के लिए पाचन बफर में लिबेरेज का 770 μL जोड़ें।
    3. स्टॉप बफर: छिड़काव बफर के 12 एमएल में 240 मिलीग्राम बीएसए को भंग करें। पूरे अलगाव के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. क्लियरिंग बफर: क्लियरिंग बफर का 3 एमएल सिरिंज तैयार करें और बुलबुले की सुई साफ करें। अलगाव तक बर्फ पर स्टोर करें।

2. कई गुना तैयारी

  1. ताजा तैयार छिड़काव बफर के साथ तापमान-नियंत्रित कई गुना साफ करें, यह सुनिश्चित करने के लिए सावधान रहें कि कोई बुलबुले न रहें। एक लुएर लॉक कनेक्टर का उपयोग करना, 27 जी सुई में स्क्रू, और बुलबुले से साफ। एक सफल अलगाव के लिए कई गुना साफ करना आवश्यक है।

3. पशु तैयारी

  1. अलगाव से तुरंत पहले माउस को 100 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 20 मिलीग्राम / किग्रा ज़ाइलाज़िन के साथ इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें। इस प्रक्रिया में एक पुरुष, 4 महीने के C57Bl /6 माउस का उपयोग किया गया था।
  2. यदि आवश्यक हो, तो बेहोश करने की क्रिया को प्रोत्साहित करने के लिए माउस को गर्म सर्जिकल पैड पर रखें। माउस की बाहों को तम्बू करें, और पूंछ के अंगों और आधार को नीले लैब डायपर में टेप करें। सुनिश्चित करें कि पैर की अंगुली-चुटकी रिफ्लेक्स की वापसी से जानवर पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है। सर्जिकल क्षेत्र के चारों ओर एक बाँझ ड्रेप लागू करें।

4. कार्डियोमायोसाइट्स अलगाव प्रक्रिया

  1. माउस के उरोस्थि को उजागर करें और, मध्य रेखा के पार्श्व में, पसलियों के माध्यम से और एक्सिला को समीपस्थ रूप से काटें। धीरे से डायाफ्राम के माध्यम से पूरी तरह से काट लें, जिससे दिल से बचने के लिए उथले कट सुनिश्चित हों। हेमोस्टैट के साथ उरोस्थि को दबाएं और वक्ष गुहा को उजागर करने के लिए पसलियों को पीछे की ओर मोड़ें।
  2. धीरे से पेरिकार्डियम को दिल से हटा दें और हीन वेना कावा के माध्यम से पूरी तरह से काट लें, जो तुरंत दिल से दूर हो। 1 मिनट में दिल के दाहिने वेंट्रिकल में 3 एमएल बर्फ-ठंडा क्लियरिंग बफर को जल्दी से इंजेक्ट करने के लिए 27 ग्राम सुई के साथ 3 एमएल सिरिंज का उपयोग करें।
  3. धीरे से चिमटी का उपयोग करके दिल को पकड़ें और शरीर से दूर खींचें, जितना संभव हो उतना महाधमनी को उजागर करें। हेमोस्टैट का उपयोग करके, आरोही महाधमनी को दबाएं, सावधानी बरतें कि एट्रिया को दबाएं नहीं, और छाती से दिल को बाहर निकालें।
  4. लगभग 10 एमएल गर्म छिड़काव बफर के साथ एक पॉलीप्रोपाइलीन पेट्री डिश के ढक्कन में क्लैंप किए गए दिल को जल्दी से स्थानांतरित करें। क्लैंप किए गए दिल को सहायक मंच में रखें और 5 मिनट में बाएं वेंट्रिकल में 10 एमएल तापमान-नियंत्रित 37 डिग्री सेल्सियस छिड़काव बफर इंजेक्ट करने के लिए कई गुना से जुड़ी एक स्थिर 27 जी सुई का उपयोग करें।
  5. क्लैंप किए गए दिल और सहायक मंच को लगभग 5 एमएल पाचन बफर के साथ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। 25 एमएल पाचन बफर के साथ 50 एमएल सिरिंज के लिए इनपुट सिरिंज का आदान-प्रदान करें।
  6. इंजेक्शन से पहले किसी भी बुलबुले और शेष छिड़काव बफर के कई गुना साफ करें। सावधानी से सुई को बाएं वेंट्रिकुलर एपेक्स में एक ही सुई की स्थिति में बदलें।
  7. 50 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 15 मिनट के लिए बाएं वेंट्रिकल में तापमान-नियंत्रित 37 डिग्री सेल्सियस पाचन बफर इंजेक्ट करने के लिए छिड़काव पंप का उपयोग करें। सुई के अंत में 37 डिग्री सेल्सियस समाधान निकालने के लिए पहले कैलिब्रेट किए गए पानी की जैकेट के साथ घोल के तापमान को नियंत्रित करें।
  8. एट्रिया से वेंट्रिकल्स को हटा दें और 10 एमएल बीकर में स्थानांतरित करें। बीकर में 3 एमएल पाचन बफर जोड़ें और तेज कैंची का उपयोग करके, वेंट्रिकल्स को बड़े टुकड़ों में काट लें। बीकर को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किए गए पानी के स्नान में रखें।
  9. ऊतक के किसी भी टुकड़े को हटाने से बचने के लिए सावधानी बरतते हुए, सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। ऊतक के टुकड़ों को 3 एमएल पाचन बफर में पुन: निलंबित करें और लगभग 4 मिनट के लिए या जब तक एक समरूप मिश्रण प्राप्त नहीं हो जाता।
  10. कोशिकाओं को 70 μm नायलॉन सेल स्ट्रेनर के माध्यम से 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में फ़िल्टर करें।
  11. फिल्ट्रेट को 14 एमएल राउंड-बॉटम पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में वापस करें और 100 आरपीएम पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और गोली को 3 एमएल स्टॉप बफर में फिर से निलंबित करें।
  12. 1.8 mM की अंतिम CaCl2 एकाग्रता के लिए पुन: निलंबित कोशिकाओं में 100 mM CaCl2 स्टॉक का 54 μL जोड़ें। सेल उपज बढ़ाने के लिए इस चरण को चरणबद्ध रूप से भी किया जा सकता है।
  13. मृत कोशिकाओं वाले सतह पर तैरने वाले को हटाने से पहले जीवित कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा बसने की अनुमति दें। भंडारण समाधान में गोली को पुन: निलंबित करें (200 μM CaCl2 के साथ छिड़काव समाधान)। इन कोशिकाओं का उपयोग अब कार्यात्मक प्रयोगों (यानी, कैल्शियम इमेजिंग / संकुचन, पैच क्लैंप, आदि), संस्कृति आदि के लिए किया जा सकता है।
    नोट: कोशिकाओं को प्रयोगशाला- या प्रयोग-निर्भर समाधानों में भी पुन: निलंबित किया जा सकता है।

5. सेल संस्कृति

  1. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके या ग्रिडेड कवर स्लिप का उपयोग करके फील्ड व्यू काउंट द्वारा कोशिकाओं की गणना करें। चूंकि मायोसाइट्स बहुत बड़े होते हैं, इसलिए हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके गिनती हमेशा सटीक नहीं होती है। इसका उपयोग यह पता लगाने के लिए किया जाता है कि अलगाव से लगभग कितनी कोशिकाएं प्राप्त की गई थीं।
  2. डीएमईएम मीडिया के साथ कोशिकाओं को ~ 25,000 कोशिकाओं / एमएल तक पतला करें। प्रत्येक कुएं में 1 एमएल सेल समाधान जोड़ें।
  3. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 95% ओ2, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
  4. धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं से डीएमईएम मीडिया को एस्पिरेट करें और एम 199 मीडिया के 2 एमएल जोड़ें।
  5. 24 घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस, 95% ओ2, 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।

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Representative Results

अलगाव की सफलता का निर्धारण करते समय जांच करने के लिए कुछ तत्व हैं। सबसे पहले, कार्डियोमायोसाइट्स को रॉड के आकार का होना चाहिए, जिसमें कोई झिल्ली ब्लीब्स नहीं होना चाहिए, जैसे कि चित्रा 1 में अलग की गई कोशिकाएं। एक विशिष्ट अलगाव रॉड के आकार के मायोसाइट्स का ~ 80% उत्पन्न करेगा। यदि अलगाव 50% रॉड के आकार की कोशिकाओं से कम कुछ भी पैदा करता है, तो इसे एक असफल अलगाव माना जाता है और कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग नहीं किया जाता है। अंत में, कार्डियोमायोसाइट्स को क्विसेंट होना चाहिए। अनायास संकुचन मायोसाइट्स सीए 2 + असहिष्णुता का प्रदर्शन करते हैं और अविश्वसनीय डेटा का उत्पादन करेंगे। उपरोक्त तकनीक का उपयोग करके किए गए सभी अलगावों में से, लगभग सभी अलगाव को सफल माना जाता है। सुसंस्कृत कार्डियोमायोसाइट्स को सफल माना जाता है यदि वे रॉड के आकार के होते हैं, जिसमें कोई झिल्ली ब्लीब या उच्च जीवित रहने की दर वाले गोल किनारे होते हैं (चित्रा 2)।

तालिका 1. हमारी विधि, लैंगेंडॉर्फ विधियों और माउस कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के पहले प्रकाशित लैंगनडॉर्फ-मुक्त तरीकों के बीच उल्लेखनीय अंतर की एक तालिका। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: बफर मीडिया सांद्रता। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 1
चित्र 1. (ए) उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 4 महीने के सी 57 बीएल / 6 माउस कार्डियोमायोसाइट्स को चित्रित किया गया। उपज: ~ 80%; 20x आवर्धन। (बी) 4 महीने के सी 57 बीएल / 6 माउस कार्डियोमायोसाइट की उज्ज्वल क्षेत्र छवि। कार्डियोमायोसाइट्स क्विसेंट होते हैं, जो बिना किसी झिल्ली के रॉड-आकार का प्रदर्शन करते हैं। स्केल पट्टी 100 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2. (ए) 4 महीने के सी 57 बीएल / 6 माउस कार्डियोमायोसाइट्स को एम 199 मीडिया में 24 घंटे के लिए संवर्धित किया गया। व्यवहार्यता: ~ 80%; 20x आवर्धन। (बी) मायोसाइट्स 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत। 24 घंटे में, कार्डियोमायोसाइट्स बिना किसी झिल्ली के रॉड-आकार का प्रदर्शन करते हैं। (सी) कार्डियोमायोसाइट्स के लिए % उत्तरजीविता वक्र वर्णित विधि का उपयोग करके 24 घंटे के लिए संवर्धित किया गया। स्केल पट्टी 100 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हमारे लैंगनडॉर्फ-मुक्त कार्डियोमायोसाइट्स अलगाव तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह लैंगेंडॉर्फ तंत्र में प्रवेशनी की आवश्यकता नहीं करके हाइपोक्सिया और इस्केमिक समय को सीमित करता है। वैकल्पिक रूप से शास्त्रीय लैंगनडॉर्फ तकनीकों के लिए जो हृदय को हटाने, साफ करने और लटकाने में कई मिनट लगते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर मायोसाइट को इस्केमिक क्षति होती है, हमारी विधि में बर्फ-ठंडा समाशोधन समाधान के माध्यम से रक्त की विवो सफाई शामिल है। बर्फ-ठंडा समाशोधन बफर में एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) होता है, अपरिवर्तनीय रूप से कैल्शियम को कुशलतापूर्वक हटाने के लिए द्विसंयोजक पिंजरों को अलग करता है, जिससे यह एक उत्कृष्ट एंटीकोआगुलेंट बन जाता है, और इसलिए संकुचन23 को रोकता है। बर्फ के ठंडे समाधानों का उपयोग आयन विनिमय और सेलुलर चयापचय दर को धीमा करके संकुचन को रोकता है, इस्किमिया24 के कारण होने वाले नुकसान को रोकता है। महाधमनी प्रवेशनी की आवश्यकता को दूर करके, लैंगेंडॉर्फ-मुक्त तकनीकें मजबूत मायोसाइट्स का उत्पादन करती हैं जिसके परिणामस्वरूप भरोसेमंद डेटा प्राप्त करने के लिए अधिक विश्वसनीय तैयारी होती है, जो हमेशा अलगाव के लैंगेंडॉर्फ तरीकों के लिए मामला नहीं होता है।

यह तालिका1 में हाइलाइट किए गए अनुकूलन के साथ पहले प्रकाशित लैंगनडॉर्फ-मुक्त अलगाव तकनीक 18 की भिन्नता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, यह तकनीक एक स्थिर मंच का परिचय देती है जो सुई को हटाने और हृदय से प्रतिस्थापित करने की संख्या को सीमित करती है। वेंट्रिकल में डालते समय सुई में पेश किया गया कोई भी अनावश्यक आंदोलन पंचर साइट को चौड़ा करता है। एक व्यापक पंचर साइट के परिणामस्वरूप पंचर साइट से वेंट्रिकल से बैकफ्लो होता है, हृदय में दबाव कम हो जाता है, और कोरोना के प्रवाह में कमी आती है। स्थिर करने वाले प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके यह समस्या ठीक की जाती है। सुई की गति को सीमित करके और सुई को हटाने और प्रतिस्थापित करने की संख्या (पहले वर्णित18 के रूप में तीन बार की तुलना में), हम कोरोनरी में लगातार प्रवाह बनाए रखते हैं और लगातार पाचन प्राप्त करते हैं। एक अन्य महत्वपूर्ण अनुकूलन दिल में प्रवेश करने पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम समाधान बनाए रखने के लिए एक तापमान-नियंत्रित जैकेट को जोड़ना था (सुई से 37 डिग्री सेल्सियस पर बाहर निकलने के लिए तापमान स्नान को कैलिब्रेट किया गया था)। उपयोग किए गए पाचन एंजाइम में 37 डिग्री सेल्सियस पर इष्टतम प्रतिक्रिया गतिविधि होती है, और तापमान नियंत्रण के अलावा एंजाइम गतिविधि बढ़ जाती है, इसलिए पाचन समय कम हो जाता है। लिबेरेज में न्यूनतम लॉट-टू-लॉट परिवर्तनशीलता भी होती है और अन्य एंजाइमों की तुलना में उच्च प्रजनन क्षमता होती है। पिछली तकनीकों का एक और अनुकूलन इंजेक्शन समाशोधन समाधान की कम मात्रा है। हृदय में प्रवेश करने के लिए क्लियरिंग बफर की मात्रा को कम करना और छिड़काव बफर द्वारा अधिक रक्त को साफ करने की अनुमति देना ईडीटीए द्वारा पाचन एंजाइम की निष्क्रियता को कम करता है। एक और कारण है कि हमारी विधि लगातार सफल मायोसाइट अलगाव प्राप्त करती है, बीडीएम के उपयोग से है। बीडीएम एक मायोसिन अवरोधक है जो सार्कोमेरे के पावर स्ट्रोक तंत्र को रोकता है, जिससे संकुचन को रोका जाता है और पाचन के दौरान पुन: ऑक्सीकरण की चोट को सीमित किया जाता है। संकुचन को सीमित करके, हम संस्कृति में मायोसाइट्स के अनुबंध में कैल्शियम साइकिलिंग और अंतर्निहित प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन को रोकते हैं। चूंकि संस्कृति मीडिया में कैल्शियम होता है, इसलिए यह संभव है कि मायोसाइट्स संस्कृति के बाद बाद की उपज को अनुबंधित और कम कर सकते हैं। हम संकुचन को रोकने और उपज25,26 बढ़ाने के लिए बीडीएम में मायोसाइट्स को कल्चर करने का चुनाव करते हैं। बीडीएम को हमेशा बड़ी सफलता के साथ संस्कृति के बाद कार्यात्मक माप के लिए मायोसाइट्स से धोया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इस प्रक्रिया के सभी चरणों को बीडीएम के अतिरिक्त के बिना किया जा सकता है, लेकिन बीडीएम-मुक्त पृथक मायोसाइट्स पर अलगाव को "सफल" नहीं माना जा सकता है।

इस्केमिक समय के अलावा, कई अन्य कारक हैं जो यह निर्धारित करेंगे कि क्या अलगाव मजबूत मायोसाइट्स का उत्पादन करेगा। चूंकि अलग-अलग प्रयोगशालाओं में अलग-अलग स्थितियां हैं, इसलिए अलगाव करने वाले व्यक्तियों को एंजाइम और / या कैल्शियम की मात्रा, छिड़काव समय और / या पंप गति, और रॉकिंग वॉटर बाथ गति और / या समय को संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है। ये पैरामीटर उपयोग किए गए माउस मॉडल पर निर्भर होंगे, जैसे कि स्वस्थ या रोगग्रस्त, उम्र बढ़ने, आदि।

हालांकि इस तकनीक को लैंगनडॉर्फ आधारित तकनीकों के लिए आवश्यक सर्जिकल कौशल की आवश्यकता नहीं है, फिर भी तकनीक को सफल बनाने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। इस तकनीक के साथ खराब मायोसाइट्स पैदा करने वाला सबसे आम मुद्दा छिड़काव प्रणाली में प्रवेश करने वाले बुलबुले के कारण होता है और मायोकार्डियल ऊतक को छिड़काव बफर तक पहुंच से अवरुद्ध करता है। इस समस्या का समाधान बुलबुले से बचने के लिए सावधानीपूर्वक अभ्यास है (उचित सिरिंज निकासी तकनीक, उचित सुई निकासी तकनीक के माध्यम से , सिरिंज बदलते समय बुलबुले के कई गुना डकार, आदि), साथ ही साथ छिड़काव प्रणाली से कई निकास बिंदु। बुलबुले के बिना, हमारे अनुभव में, हम लगभग 100% सफल मायोसाइट अलगाव प्राप्त करते हैं (50% रॉड के आकार के मायोसाइट्स से ऊपर के रूप में परिभाषित; औसत ~ 80% है)।

जबकि लैंगेंडॉर्फ विधि के लिए आवश्यक सर्जिकल कौशल को हटाकर विधि को सरल बनाया गया है, इस अनुकूलित विधि को केवल चूहों में आजमाया गया है। लैंगनडॉर्फ-मुक्त विधि का एक और लाभ यह है कि इसका उपयोग कई मुराइन मॉडल (यानी, नवजात शिशु से सेनेसेंस तक) के लिए किया जा सकता है, जैसा कि पहले वर्णित19 है। दुर्भाग्य से, बड़े स्तनधारी (जैसे, कुत्ते, सूअर, आदि) अपने दिल के आकार के कारण इस तकनीक के लिए उपयुक्त नहीं होंगे। विश्वसनीय मायोसाइट्स प्राप्त करने के लिए पर्याप्त समाधान के साथ दिल को दूषित करना असंभव होगा।

लैंगेंडॉर्फ-मुक्त विधि का हमारा अनुकूलन माउस कार्डियोमायोसाइट्स के सफल अलगाव के लिए एक भरोसेमंद तरीका है। लैंगेंडॉर्फ विधि की तुलना में, इस वैकल्पिक दृष्टिकोण को कार्डियोमायोसाइट्स को लगातार प्राप्त करने के लिए बहुत कम तकनीकी कौशल की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट्स आर01 एचएल114940 (बिसियाडेकी), आर01 एजी060542 (जिओलो), और टी32 एचएल134616 (स्टरगिल और सालियर) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cc Bd Luer-Lok Syringe Fisher Sci 14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker Cole-Palmer UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle DWK Life Sciences UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap Fisher Sci 14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime Sigma B0753 >98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe Fisher Sci 14-823-435
35 mm glass bottom dishes MatTek Corporation P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle Fisher Sci 13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes Cole-Palmer EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad Fisher Sci 14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles Becton Dickinson 305109
Bovine Serum Albumin Sigma A3803 Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate Sigma C7902 >99%
D-(+)-Glucose Sigma G7021 Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM Fisher Sci 11965092
EDTA Fisher Sci AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish Corning 353003
FBS R&D Systems (Bio-techne) S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators Fisher Sci 13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps World Precision Instruments 15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set Fisher Sci 02-671-11
HEPES Sigma H4034 >99.5%
Labeling Tape Fisher Sci 15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump kdScientific 788100
L-glutathione Fisher Sci ICN19467980
Liberase TH Research Grade Sigma 5401135001 High thermolysin concentration
M199 Fisher Sci MT10060CV
Magnesium Chloride Invitrogen AM9530G
Mouse Laminin Corning 354232
Pen/Strep Fisher Sci
Potassium Chloride Sigma P5405 >99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath ThermoFisher Scientific TSCIR19
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 Suitable for cell culture
Sodium Chloride Sigma S5886 >99%
Sodium phosphate monobasic Sigma S5011 >99%
Sterile Cell Strainer 70 µm Fisher Sci 22-363-548
Student Fine Scissors Fine Science Tools 91460-11
VWR Absorbent Underpads Fisher Sci NC9481815

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References

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चिकित्सा अंक 189
माउस कार्डियोमायोसाइट्स को लगातार अलग करने के लिए एक सरल और प्रभावी तरीका
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Sturgill, S. L., Salyer, L. G., Biesiadecki, B. J., Ziolo, M. T. A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (189), e63056, doi:10.3791/63056 (2022).

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