Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הזרקת תאי אוסטאוסרקומה אינטראטיביאלית להפקת אוסטאוסרקומה אורתוטופית ומודלים של עכבר גרורות ריאות

Published: October 28, 2021 doi: 10.3791/63072
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education
* These authors contributed equally

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקת תאי intratibia osteosarcoma כדי ליצור מודלים עכבר הנושאים אוסטאוסרקומה אורתוטופית ונגעים גרורות ריאתיות.

Abstract

Osteosarcoma הוא סרטן העצם העיקרי הנפוץ ביותר אצל ילדים ומתבגרים, עם ריאות כאתר גרורתי הנפוץ ביותר. שיעור ההישרדות של חמש שנים של חולי אוסטאוסרקומה עם גרורות ריאתיות הוא פחות מ -30%. לכן, השימוש של מודלים עכבר מחקה את התפתחות osteosarcoma בבני אדם הוא בעל משמעות רבה להבנת המנגנון הבסיסי של קרצינוגנזה osteosarcoma וגרורות ריאתי לפתח טיפוליים חדשניים. כאן, נהלים מפורטים מדווחים כדי ליצור את מודלים עכבר גרורות אוסטאוזרקומה ריאות העיקרי באמצעות הזרקת intratibia של תאי osteosarcoma. בשילוב עם bioluminescence או מערכת הדמיה חיה רנטגן, מודלים אלה עכבר חי מנוצלים כדי לפקח ולכמת את צמיחת osteosarcoma וגרורות. כדי להקים מודל זה, מטריצת קרום מרתף המכילה תאי osteosarcoma נטען במזרק מיקרו נפח והוזרק לתוך שוקה אחת של כל עכבר אתימי לאחר שהיה מורדם. העכברים הוקרבו כאשר האוסטאוסרקומה העיקרית הגיעה למגבלת הגודל בפרוטוקול שאושר על ידי IACUC. הרגליים הנושאות אוסטאוסרקומה והריאות עם נגעי גרורות הופרדו. מודלים אלה מאופיינים בתקופת דגירה קצרה, צמיחה מהירה, נגעים חמורים ורגישות בניטור התפתחות נגעים גרורתיים ראשוניים ובריאתיים. לכן, אלה הם מודלים אידיאליים לחקר הפונקציות והמנגנונים של גורמים ספציפיים אוסטאוסרקומה קרצינוגנזה וגרורות ריאתיות, מיקרו-סביבה של הגידול, והערכה של היעילות הטיפולית ב- vivo.

Introduction

אוסטאוסרקומה היא סרטן העצמות העיקרי הנפוץ ביותר בקרב ילדים ומתבגרים 1,2, אשר בעיקר חודר לרקמה שמסביב, ואפילו גרורות לריאות כאשר החולים מאובחנים. גרורות ריאתיות הן האתגר העיקרי לטיפול באוסטיוסרקומה, ושיעור ההישרדות של חמש שנים של חולי אוסטאוסרקומה עם גרורות ריאתיות נשאר נמוך כמו 20%-30%-30%3,4,5. עם זאת, שיעור ההישרדות של חמש שנים של אוסטאוסרקומה ראשונית הוגדל לכ -70% מאז שנות השבעים עקב כניסתו של כימותרפיה6. לכן, יש צורך דחוף כדי להבין את המנגנון הבסיסי של אוסטאוסרקומה קרצינוגנזה וגרורות ריאתיות לפתח טיפולים חדשניים. היישום של מודלים עכבר המחקים בצורה הטובה ביותר את התקדמות osteosarcoma בבני אדם הוא בעל משמעות רבה7.

מודלים בעלי חיים osteosarcoma נוצרים על ידי ספונטני, המושרה הנדסה גנטית, השתלה, וטכניקות אחרות. מודל האוסטאוסרקומה הספונטני משמש לעתים רחוקות בשל זמן היווצרות הגידול הארוך, שיעור התרחשות הגידול הלא עקבי, תחלואה נמוכה ויציבות ירודה 8,9. למרות מודל osteosarcoma המושרה נגיש יותר להשיג מאשר osteosarcoma ספונטני, היישום של מודל osteosarcoma המושרה מוגבל כי הגורם המעורר ישפיע על microenvironment, הפתוגנזה, ואת המאפיינים הפתולוגיים של osteosarcoma10. מודלים מהונדסים עוזרים להבין את הפתוגנזה של סרטן שכן הם יכולים לדמות טוב יותר את הסביבות הפיזיולוגיות והפתולוגיות האנושיות; עם זאת, מודלים בעלי חיים מהונדסים יש גם את המגבלות שלהם בשל הקושי, לטווח ארוך, ועלות גבוהה של שינוי מהונדס. יתר על כן, אפילו במודלים המקובלים ביותר של בעלי חיים מהונדסים שנוצרו על ידי p53 ושינוי גנים Rb, רק 13.6% מהסרקומה התרחשה בארבע עצמות הגפיים11,12.

השתלה היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לייצור מודלים גרורתיים גרורתיים ראשוניים ורחוקים בשנים האחרונות בשל התמרון הפשוט שלה, קצב היווצרות הגידול היציב והומוגניותטובה יותר 13. ההשתלה כוללת השתלה הטרוטופית והשתלות אורתוטופיות על פי אתרי ההשתלה. בהשתלה הטרוטופית של אוסטאוסרקומה, תאי האוסטאוסרקומה מוזרקים מחוץ לאתרי האוסטאוסרקומה העיקריים (עצם) של בעלי החיים, בדרך כלל מתחת לעור, תת עורית14. למרות ההשתלה ההטרוטופית היא פשוטה ללא צורך לבצע ניתוח בבעלי חיים, האתרים שבהם תאי osteosarcoma מוזרקים אינם מייצגים את המיקרו-סביבה של אוסטאוסרקומה אנושית בפועל. השתלה אורתוטופית אוסטאוסרקומה היא כאשר תאי האוסטאוסרקומה מוזרקים לעצמות של בעלי חיים, כגון שוקה15,16. בהשוואה לשתלים ההטרוטופיים, שתלי אוסטאוסרקומה אורתוטופיים מאופיינים בתקופת דגירה קצרה, צמיחה מהירה ואופי שוחק חזק; לכן, הם מודלים בעלי חיים אידיאליים עבור מחקרים הקשורים osteosarcoma17.

בעלי החיים הנפוצים ביותר הם עכברים, כלבים ודגי זברה18,19. המודל הספונטני של osteosarcoma משמש בדרך כלל בכלבים כי osteosarcoma הוא אחד הגידולים הנפוצים ביותר בכלבים. עם זאת, היישום של מודל זה מוגבל בגלל זמן היווצרות הגידול הארוך, שיעור הגידול הנמוך, הומוגניות ירודה ויציבות. דגי זברה משמשים לעתים קרובות לבניית מודלים מהונדסים או נוקאאוט גידול בגלל הרבייה המהירה שלהם20. אבל גנים של דגי זברה שונים מהגנים האנושיים, ולכן היישומים שלהם מוגבלים.

עבודה זו מתארת את ההליכים המפורטים, אמצעי זהירות, ותמונות מייצגות לייצור osteosarcoma העיקרי בשוקה עם גרורות ריאתי באמצעות הזרקת intratibia של תאי osteosarcoma בעכברים אתימיים. שיטה זו יושמה כדי ליצור את osteosarcoma העיקרי בשוקת העכבר להערכת יעילות טיפולית, אשר הראה רבייה גבוהה21,22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית. עכברי BALB/C אתיקמיים זכרים בני ארבעה שבועות התאקלמו במשך שבוע לפני הניתוח להזרקה אורתוטופית של תאי אוסטאוסרקומה. עכברים שוכנו בכלובי עכברים מאווררים בנפרד עם חמישה עכברים לכלוב במחזור אור / כהה של 12 שעות עם גישה לליביטום מודעה להזנת SPF ומים סטריליים.

1. הכנת תאים

  1. ביום של תא osteosarcoma (143B-לוציפראז) הזרקה, לשטוף 80%-90% תאים רציפים בתרבית צלחת תרבית תא 10 ס"מ פעמיים עם PBS (pH 7.4) ו trypsinize עם 1.5 מ"ל של 0.25% טריפסין במשך 3 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 6 מ"ל של 10% מדיה MEM המכילה סרום כדי להרוות את הטריפסין, ולאסוף את התאים בצינור צנטריפוגות של 15 מ"ל.
    הערה: קו תא 143B-לוציפראז מתקבל מקו תא 143B transfect עם וקטור pLV-לוציפראז23.
  2. שאפו 20 μL של השעיית תאים לתוך החדר של צלחת ספירת תאים ולחשב ריכוז תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי (ראה טבלת חומרים).
  3. צנטריפוגה התאים ב 800 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. לשאוף את supernatant עם פיפטה resuspened את גלולה התא במטריצת קרום מרתף 8.5 מ"ג / מ"ל (ראה טבלת חומרים) לריכוז סופי של 2 x 107 תאים / מ"ל.
  5. שמירה על התאים על קרח, להביא אותם לחדר הניתוח. יש להשתמש בתאים בתוך 2 שעות.
    הערה: כדי למנוע מינונים הזרקה לא מדויקים (לדוגמה, בשל החלל המת במזרקים), השעיית תא נוספת מוכנה (בדרך כלל פעמיים את הנפח הנדרש של השעיית התא). מטריצת ממברנת המרתף נשמרת על קרח כל הזמן מכיוון שיש לה מאפיין קרישה מעל טמפרטורת החדר24.

2. ניתוח להזרקה אורתוטופית של תאי האוסטאוסרקומה

הערה: כלי הניתוח מוצגים באיור 1.

  1. עכברים גודלו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן. כל ההליכים נעשו בארון אספטי עם כלים סטריליים.
  2. להרדים את העכברים על ידי חשיפתם 2% איזופלוריין ו 98% חמצן (קצב זרימת חמצן, 2 L / min).
  3. החל כמות קטנה של משחה עיניים על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
    הערה: בצע את ההליך כולו באזור מאוורר היטב. לפני הזרקת תאי אוסטאוסרקומה, ודא כי כל עכבר נמצא תחת הרדמה עמוקה על ידי צביטת בוהן; אם לעכבר עדיין יש תגובות, כגון עווית או אידיוט, המתן זמן רב עד שהתגובות לעיל ייעלמו.
  4. שמור כל עכבר בתנוחה סופית. החזק את הקרסול של העכבר באמצעות האגודל והאצבע המורה ולחטא את אתר ההזרקה של השוקה עם 70% ספוגית אתנול.
    הערה: כדי להחזיק בחוזקה את קרסול העכבר, הן את האגודל והן את קצות האצבעות הן בעלות חשיבות רבה עבור ההליכים הבאים.
  5. סובבו את מפרק הקרסול של כל עכבר כלפי חוץ כדי להזיז את השוקה והשוקית, וכופפו את מפרק הברך למצב מתאים עד שרמת השוקה הפרוקסימלית (החלק העליון של השוקה) נראית בבירור דרך העור (איור 2A).
  6. חבר את המחט למזרק 1 מ"ל וכוון את קצה המחט לכיוון אתר ההזרקה. ודא כי מחט המזרק מקבילה לציר הארוך של השוקה.
    1. באופן מלעורי להכניס את המחט דרך או בסמוך לרצועה פיקת הברך כפי שהוא עובר דרך העור / כמוסת המפרקים; th0en, לסובב את המזרק (1/2 עד 3/4-עיגול) כדי לקדוח חור דרך פלטפורמת השוקה לכיוון הקצה הדיסטלי של השוקה (חלל medullary) להזרקת תאי אוסטאוסרקומה עם מזרק מיקרו נפח (איור 2B, C).
      הערה: סיבוב סימולטני של השוקה יכול להיות מורגש בעת הקידוח אם קצה המחט מדויק. ודא את הצורך נע קדימה עם סיבוב המזרק במקום להידחף ישירות קדימה עד כמחצית המחט הוא בשוקה.
  7. בדוק אם מחט המזרק עשתה תנועה בולטת לתוך תעלת medullary כדי להבטיח קידוח מוצלח.
    הערה: בצע בדיקת רנטגן (ראה טבלת חומרים) כדי לאשר את המיקום הנכון של המחט ולאסוף את התמונות.
  8. טען את ההשעיה של תאי אוסטאוסרקומה 143B (משלב 1.5) למזרק מיקרו-נפח והחלף את מזרק 1 מ"ל בשוקה במזרק מיקרו-נפח טעון בתא 143B (איור 2D). להזריק לאט ~ 10 μL (להתעלם פתרון קיים מראש במחט) של השעיית תא 143B לתוך השוקה של כל עכבר אתימי (כ 2 x 105 תאים) מבלי להפעיל לחץ גבוה.
  9. לחץ על אתר ההזרקה עם ספוגית כותנה במשך 20-30 שניות כאשר מזרק מיקרו נפח מוסר.
  10. מחזירים כל עכבר לכלוב נקי ומפקחים מקרוב עד שהעכבר מתאושש לחלוטין מהרדמה (כ-10 דקות).
  11. נטר את הגידול ב-vivo באמצעות מערכת הדמיית רנטגן. מדוד את הקוטר הארוך יותר (א) ואת הקוטר הקצר (ב) של מסת הסרטן מדי שבוע עם קליפר לחישוב נפח הגידול (V): V = 1/2 x a x x b2.
    הערה: להרדים את העכברים על ידי חשיפתם 2% איזופלוריין ו 98% חמצן. העכברים היו מורדמים להדמיית רנטגן. הזרקת אינטרטיביה של לוציפראז או חלבון פלואורסצנטי המסומן כתאי אוסטאוסרקומה מאפשרת מעקב אחר נגעי אוסטאוסרקומה ראשוניים ומטאסטטיים.
    הערה: נקודות קצה הומאניות של העכברים עם אוסטאוסרקומה עקב גידול של גרורות הברך והריאות התבססו על הקריטריונים הבאים: (1) ציון מצב הגוף, (2) סף הרזיה של 20%, (3) קוטר מקסימלי ממוצע של גידולים של 2 ס"מ, או (4) התנהגות בעלי חיים מוגבלת מאוד.

3. בדיקה פתולוגית (איסוף דגימת אוסטאוסרקומה גרורתית ראשונית וריאותית לניתוח)

  1. שישה שבועות לאחר הזרקת תאי אוסטאוסרקומה, להקריב את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם לאחר חשיפתם עבור שאיפת CO2 .
  2. שמור את העכבר בתנוחה סופית ולמתוח את שתי הגפיים האחוריות.
  3. הפרד את כל הרגליים הנושאות אוסטאוסרקומה מאזור המפשעה.
    הערה: ודא שכל הרגליים מופרדות מאותו אתר אנטומי.
  4. הכן את הדגימה היסטולוגית של רגליים הנושאות אוסטאוסרקומה על ידי הסרת העור, השרירים והרגליים, ולאחר מכן תקן את הדגימה של כל עכבר בצינור 50 מ"ל עם פתרון פורמלין של 20 מ"ל (10%) למשך 24 שעות, ואחריו הסרה בפתרון 10% EDTA למשך 14 ימים עם שינוי חיץ מזדמן.
  5. הטמע את הדגימה בפרפין והכן מדורים לבדיקה היסטולוגית לאחר עבודה25 שפורסמה בעבר.
  6. להפריד בעדינות את הריאות ולשים אותם לתוך צינור 50 מ"ל מלא פתרון פורמלין 20 מ"ל (10%). לאחר 24 שעות, להעביר את הריאות של כל עכבר לתוך צינור 15 מ"ל עם 70% אתנול. הטמע את הריאות בפרפין עבור המטוקסילין ואאוזין (H&E) מכתים ומבחן אימונוהיסטוכימיה25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אוסטאוסרקומה אורתופית מוצלחת (ראשונית) ומודלים ריאתיים גרורתיים תלויים בהזרקה האורתוטופית המדויקת של תאי אוסטאוסרקומה. כאן, מודל אוסטאוסרקומה אורתוטופית (ראשונית) באמצעות הזרקת תאי אוסטאוסרקומה intratibial פותחה בהצלחה. איור 3A מציג עכבר מייצג הנושא אוסטאוסרקומה אורתוטופית (ראשונית), ואיור 3B מראה אוסטאוסרקומה אורתוטופית מבודדת (ראשונית) מייצגת. נפח הגידול נמדד פעם בשבוע בקליפר ומחושב כמתואר בשלב 2.11 (איור 3C). צמיחת אוסטאוסרקומה אורתופית (ראשונית) ב- vivo הייתה במעקב הן על ידי רנטגן והן על ידי הביולומינציה (כאשר התאים המוזרקים סומנו עם לוציפראז) מערכת הדמיה חיה. תמונות הרנטגן התקבלו מהשבוע הראשון עד השבוע השישי לאחר הזרקת תאי אוסטאוסרקומה 143B (איור 3D). יתר על כן, התמונה של צמיחת אוסטאוסרקומה אורתוטופית (ראשונית) ב- vivo הושגה לאחר שלוציפראז שכותרתו תאי 143B הוזרקו לשוקת העכבר (איור 3E).

גרורות הריאות הנגרמות על ידי ההזרקה התוך-סיבילית של תאי לוציפראז המסומנים כתאי אוסטאוסרקומה, אותרו בהצלחה ב-vivo על-ידי מערכת הדמיה חיה של ביו-לומינציה (איור 4A). המושבות גרורתיות ברקמות הריאה המבודדות הוצגו גם הן תחת הסטריומימיקרוסקופ (איור 4B). הנגעים גרורתיים אושרו עוד יותר על ידי כתמי H&E על רקמות ריאה משובצות פרפין (איור 4C).

Figure 1
איור 1: כלי ניתוח. (A) מזרק בקנה מידה של 1 מ"ל. (B) מזרק מיקרו-נפח. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ייצוג ניתוח ההזרקה התוך-שנתי. (A) אתר ההזרקה התוך-שנתי של עכבר אתימי. (ב) מזרק סטרילי של 1 מ"ל עם מחט מלווה הוכנס באופן מלעורי לתוך השוקה לקראת הקצה הדיסטלי דרך רמת השוקה הפרוקסימלית (החלק העליון של השוקה). (ג) מבט רוחבי על תהליך הקידוח. מחט המזרק הייתה מקבילה לציר השוקה הארוך (קו מוצק). (D) הזרקה תוך-תאית עם מזרק אוסטאוסרקומה טעון מיקרו-נפח. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הדמיה של צמיחת האוסטאוסרקומה בעכברים. (A) מודל אוסטאוסרקומה אורתוטופית מוצלחת של עכבר. (B) אוסטאוסרקומה אורתוטופית מבודדת. (C) נפח הגידול נמדד בקליפר ומחושב באמצעות הנוסחה הבאה: נפח הגידול = 0.5 x קוטר ארוך יותר x קוטר קצר x קוטר קצר. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (n = 8). (D) תמונות רנטגן התקבלו מאותו עכבר בזמן אחר (מ 1-6 שבועות). (E) תמונה שהושגה ביום ה- 28 לאחר לוציפראז שכותרתו 143B תאים הוזרקו לתוך שוקת העכבר. החצים האדומים הצביעו על עוצמת הזוהר של אוסטאוסרקומה אורתוטופית (ראשונית). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: גרורות ריאתיות של אוסטאוסרקומה. (A) תמונה שהושגה ביום ה- 28 לאחר לוציפראז שכותרתו 143B תאים הוזרקו לתוך השוקה של העכבר. החצים האדומים הצביעו על עוצמת הזוהר של גרורות הריאות. (B) הריאות המבודדות עם גרורות אוסטאוסרקומה. החצים האדומים ציינו את המושבות גרורתיות (x20). (C) כתמי H&E הראו נגעים גרורתיים ברקמות הריאה (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הזרקה אורתוטופית של תאי אוסטאוסרקומה היא מודל אידיאלי לחקר הפונקציה והמנגנון של גורמים ספציפיים ב- osteosarcoma carcinogenesis ופיתוח כדי להעריך את היעילות הטיפולית. כדי למנוע הבדלים בצמיחת הגידול, רוב תאי האוסטאוסרקומה הפעילים ב 80%-90% במפגש עם אותו מספר מוזרקים בקפידה לתוך השוקה של כל עכבר, וזמן טריפסיניזציה התא נשלט בקפדנות מבלי להשפיע על הכדאיות של התא. כמו גושי תאים להשפיע על ספירת תאים המובילים מספרי תאים לא מדויקים מוזרק לתוך השוקה של כל עכבר, ההשעיה התא צריך להיות מעורב כראוי למעלה ולמטה עם פיפטה כדי למנוע היווצרות של גושי תאים.

היבט קריטי נוסף שיש לקחת בחשבון הוא הפתרון resuspended עבור תאי osteosarcoma. התאים המוזרקים הם resuspended במטריצת קרום מרתף במקום PBS או מדיום תרבות. יתר על כן, ריכוז גבוה של מטריצת ממברנה במרתף מאתגר להיות pipetted ומשפיע על הנפח המדויק; לכן, ריכוז מתאים של מטריצת קרום המרתף נדרש26. כדי לקדוח חור דרך פלטפורמת השוקה להזרקת תאי osteosarcoma, הצורך נע קדימה עם סיבוב המזרק במקום להידחף ישירות קדימה עד כמחצית המחט היא בשוקה. במיוחד, עכברים חיסוניים מוחלים כדי להקים מודל אוסטאוסרקומה אורתוטופית באמצעות תאי אוסטאוסרקומה אנושיים27. בינתיים, הליך ההזרקה מבוצע בארון בטיחות ביולוגי באמצעות כלים כירורגיים סטריליים. מאחר שעכברים עלולים לחוות אי נוחות לאחר הרדמה וניתוח, יש לעקוב מקרוב אחר העכברים בשבוע הראשון שלאחר ההתפרצות.

הזרקת אינטרטיביה של תאי אוסטאוסרקומה המסומנים בחלבון פלואורסצנטי או לוציפראז מאפשרת מעקב אחר נגעים ראשוניים ומגרסטטיים באמצעות הדמיה אופטית28. אוסטאוסרקומה לעולם אינה מותרת מעבר למגבלת הגודל כמו בפרוטוקול שאושר על-ידי IACUC; בינתיים, כיבים עלולים להתרחש במסת גידול בגודל עצום, מה שעלול להוביל לניתוחים חיסוניים כושלים. למרות גידולי העצם העיקריים גרורות עצם דווחו לאחרונה להיות מושגת על ידי השתלה של שתל גידול מוצק לתוך העצם, ובעלי החיים פיתחו צמיחה לשחזור, כמו גם גרורות ריאות בסופו של דבר29; עם זאת, המחברים מושתלים ישירות שברי גידול טריים או קריופסורים לתוך השוקה הפרוקסימלית, אשר הראה את החיסרון של ניתוח פתוח גרם זיהום פוטנציאלי וכישלון של פיתוח תחריט הגידול. יתר על כן, נפח שברי הגידול המושתלים ללא בקרה קפדנית יביא להבדל משמעותי בנפח הגידול המיוצר, אשר קשה לעקוב אחר היישום, כגון הערכת היעילות הטיפולית ב vivo. כאן, טכניקה פשוטה לשחזור הוא דיווח כדי להקים את אוסטאוסרקומה הראשית intratibia עם מודלים מאוחרים יותר גרורות ריאות עכבר באמצעות הזרקת intratibia של תאי osteosarcoma. זה הראה את היתרונות של חיקוי הטוב ביותר של מאפייני ההתפתחות הקלינית של אוסטאוסרקומה בבני אדם; מספרים מדויקים של תאי אוסטאוסרקומה מוזרקים ישירות לשוקה באמצעות מזרק מיקרו-נפח המאפשר קצב היווצרות גידול זהה (100%) ונפח הגידול. השיטה מבטיחה הימנעות מהאפשרויות של זיהום או אפילו מוות באמצעות טכניקות ניתוח פתוחות ומאפשרת ניטור תוסס וכימות צמיחת אוסטאוסרקומה וגרורות באמצעות מערכת ההדמיה החיה bioluminescence לאחר שתאי האוסטאוסרקומה המוזרקים מסומנים בביולומינציה. זה מונע את תאי osteosarcoma מוזרק מלהגיע ישירות למחזור הדם והתיישבות בריאות כדי ליצור תסחיף ריאתי ו /או גרורות ריאתיות חיוביות כוזבות על ידי resuspending תאי osteosarcoma מוזרק בריכוז המתאים של מטריצת קרום המרתף מאז מטריצת קרום המרתף יש את המאפיין של קרישה מעל טמפרטורת החדר. קרישה מיידית תמיכה ולהגביל תאי osteosarcoma בתוך מטריצת קרום המרתף לאחר שהוזרק לתוך השוקה של העכבר.

ספרות אחרת דיווחה על הקמת מודל גרורות עצם על ידי חיסון תוך לבבי או חיסון תוך-סביבתי של תאי סרטן השד30; עם זאת, תאים המשמשים בספרות זו הם תאים סרטניים בשד, אשר יש מאפיינים ביולוגיים וקליניים שונים עם תאי osteosarcoma; יתר על כן, הן התוך לב והן החיסון התוך-סיבילי שנקבעו מודלים לסרטן בעצם נוצרים על ידי תאים סרטניים המתיישבים ישירות או מגיעים דרך זרם הדם ולא נגעים גרורתיים שנוצרו על ידי הפצת תאים סרטניים מהנגעים העיקריים בסרטן.

קיימות מספר מגבלות של הפרוטוקול הנוכחי. עכברים המשמשים בפרוטוקול זה הם עכברים עירומים פגומים במערכת החיסון הגנטית ללא תימוס המונע מהם לדחות באופן חיסוני תאים אנושיים ונמצאים בשימוש נרחב בניסויים פרה-קליניים, שאינם ישימים למחקר תפקודי חיסוני. יתר על כן, מצאנו כי לא כל קווי התאים osteosarcoma רלוונטיים באופן זהה במודלים אלה, ואת היכולות tumorigenesis של 143B, MNNG, MG-63, ו U-2 תאי מערכת ההפעלה גבוהים יותר מאשר תאי Saos-2.

לסיכום, מודלים גרורתיים גרורתיים ראשוניים וראתיים הנוכחיים שנוצרו על ידי הזרקת תאי אוסטאוסרקומה אורתוטופית הם כלים שימושיים לחקר המיקרו-סביבה של הגידול, יעילות הטיפולים בצמיחת אוסטאוסרקומה ו/או גרורות. בנוסף, על ידי הזרקת intratibia של תאי osteosarcoma מהונדסים גנטית במיוחד מיקוד גן, המודלים מועילים לחקור את oncogenes מפתח מדכאי גידולים בצמיחת osteosarcoma וגרורות ריאתי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ(1) תוכנית מו"פ המפתח הלאומית של סין (2018YFC1704300 ו-2020YFE0201600), (2) הקרן הלאומית למדעי הטבע (81973877 ו-82174408).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automatic cell counter Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd IC1000 Counting cells
Anesthesia machine Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd R500IP The Equipment of Anesthesia mice
BALB/c athymic mice Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. / animal
Basement Membrane Matrix Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd 356234, BD, Matrigel re-suspende cells
Bioluminescence imaging system Shanghai Baitai Technology Co., Ltd Vieworks tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase
Centrifuge tube (15 mL) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, Corning Centrifuge the cells
isoflurane Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd VETEASY Anesthesia mice
MEM media Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd LM-E1141 Cell culture medium
Micro-volume syringe Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd 0-50 μL Inject precise cells into the tibia
Phosphate-buffered saline Beyotime Biotechnology ST447 wash the human osteosarcoma cells
1ml syringes Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd 20200411 drilling
143B cell line ATCC CRL-8303 osteosarcoma cell line
Trypsin (0.25%) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 25200056, Gibco trypsin treatment of cells
Trypan blue Beyotime Biotechnology ST798 Staining cells to assess activity
vector (pLV-luciferase) Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd VL3613 Plasmid
Lipofectamine 2000 Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 11668027,Thermo fisher Plasmid transfection reagent
X-ray imaging system Brook (Beijing) Technology Co., Ltd FX PRO X-ray images were obtained to detect tumor growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
  2. Yang, C., et al. Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).
  3. Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).
  4. Zhang, B., et al. The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51 (2020).
  5. Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation. Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).
  6. Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases. Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).
  7. Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
  8. Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets. Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).
  9. Mason, N. J. Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).
  10. Cobb, L. M. Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man. British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).
  11. Walkley, C. R., et al. Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease. Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).
  12. Entz-Werlé, N., et al. Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease. Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).
  13. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
  14. Chang, J., et al. MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).
  15. Maloney, C., et al. Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model. Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
  16. Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
  17. Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected]. Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).
  18. Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).
  19. Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement. The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).
  20. Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. Zebrafish as a model for human osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).
  21. Hu, S., et al. Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation. International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).
  22. Chang, J., et al. Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 7605 (2017).
  23. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  24. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).
  25. Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).
  26. Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
  27. Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
  28. Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).
  29. Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone. Journal of Visualized Experiments. (163), e61313 (2020).
  30. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).

Tags

חקר הסרטן גיליון 176
הזרקת תאי אוסטאוסרקומה אינטראטיביאלית להפקת אוסטאוסרקומה אורתוטופית ומודלים של עכבר גרורות ריאות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, J., Zhao, F., Sun, X., Ma,… More

Chang, J., Zhao, F., Sun, X., Ma, X., Zhi, W., Yang, Y. Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models. J. Vis. Exp. (176), e63072, doi:10.3791/63072 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter