Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल इंट्राटिबिया ओस्टियोसारकोमा सेल इंजेक्शन का वर्णन करता है ताकि ऑर्थोटोपिक ओस्टियोसारकोमा और फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस घावों वाले माउस मॉडल उत्पन्न किए जा सकें।
Abstract
Osteosarcoma बच्चों और किशोरों में सबसे आम प्राथमिक हड्डी का कैंसर है, जिसमें फेफड़े सबसे आम मेटास्टैटिक साइट के रूप में हैं। फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस के साथ osteosarcoma रोगियों की पांच साल की जीवित रहने की दर 30% से कम है। इसलिए, मनुष्यों में ऑस्टियोसारकोमा विकास की नकल करने वाले माउस मॉडल का उपयोग उपन्यास चिकित्सीय विकसित करने के लिए ऑस्टियोसारकोमा कार्सिनोजेनेसिस और फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस के मौलिक तंत्र को समझने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। यहां, ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं के इंट्राटिबिया इंजेक्शन के माध्यम से प्राथमिक ओस्टियोसारकोमा और फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं की सूचना दी गई है। बायोल्यूमिनेसेंस या एक्स-रे लाइव इमेजिंग सिस्टम के साथ संयुक्त, इन जीवित माउस मॉडल का उपयोग ऑस्टियोसारकोमा विकास और मेटास्टेसिस की निगरानी और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। इस मॉडल को स्थापित करने के लिए, ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं वाले एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को एक माइक्रो-वॉल्यूम सिरिंज में लोड किया गया था और एनेस्थेटिक होने के बाद प्रत्येक एथाइमिक माउस के एक टिबिया में इंजेक्ट किया गया था। चूहों की बलि तब दी गई जब प्राथमिक ओस्टियोसारकोमा आईएसीयूसी-अनुमोदित प्रोटोकॉल में आकार सीमा तक पहुंच गया। ऑस्टियोसारकोमा वाले पैर और मेटास्टेसिस घावों वाले फेफड़ों को अलग कर दिया गया था। इन मॉडलों को एक छोटी इनक्यूबेशन अवधि, तेजी से विकास, गंभीर घावों और प्राथमिक और फुफ्फुसीय मेटास्टैटिक घावों के विकास की निगरानी में संवेदनशीलता की विशेषता है। इसलिए, ये ओस्टियोसारकोमा कार्सिनोजेनेसिस और फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में विशिष्ट कारकों के कार्यों और तंत्र की खोज करने और विवो में चिकित्सीय प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए आदर्श मॉडल हैं।
Introduction
Osteosarcoma बच्चों और किशोरों में सबसे आम प्राथमिक हड्डी का कैंसरहै 1,2, जो मुख्य रूप से आसपास के ऊतकों में घुसपैठ करता है, और यहां तक कि रोगियों का निदान होने पर फेफड़ों में मेटास्टेसाइज़ भी करता है। फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस ओस्टियोसारकोमा थेरेपी के लिए मुख्य चुनौती है, और फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस के साथ ओस्टियोसारकोमा रोगियों की पांच साल की जीवित रहने की दर 20% -30% 3,4,5 के रूप में कम बनी हुई है। हालांकि, कीमोथेरेपी 6 की शुरुआत के कारण 1970 के दशक के बाद से प्राथमिक ओस्टियोसारकोमा की पांच साल की जीवित रहने की दर को लगभग 70% तक बढ़ा दिया गयाहै। इसलिए, उपन्यास उपचार विकसित करने के लिए ऑस्टियोसारकोमा कार्सिनोजेनेसिस और फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस के मौलिक तंत्र को समझने के लिए तत्काल आवश्यकता है। माउस मॉडल का आवेदन जो मनुष्यों में ऑस्टियोसारकोमा प्रगति की सबसे अच्छी तरह से नकल करता है,7 का बहुत महत्व है।
Osteosarcoma पशु मॉडल सहज, प्रेरित आनुवंशिक इंजीनियरिंग, प्रत्यारोपण, और अन्य तकनीकों द्वारा उत्पन्न होते हैं। सहज osteosarcoma मॉडल शायद ही कभी लंबे ट्यूमर गठन समय, असंगत ट्यूमर घटना दर, कम रुग्णता, और खराब स्थिरता 8,9 के कारण उपयोग किया जाता है। यद्यपि प्रेरित ऑस्टियोसारकोमा मॉडल सहज ओस्टियोसारकोमा की तुलना में प्राप्त करने के लिए अधिक सुलभ है, प्रेरित ऑस्टियोसारकोमा मॉडल का आवेदन सीमित है क्योंकि उत्प्रेरण कारक माइक्रोएन्वायरमेंट, रोगजनन और ओस्टियोसारकोमा10 की रोग संबंधी विशेषताओं को प्रभावित करेगा। ट्रांसजेनिक मॉडल कैंसर के रोगजनन को समझने में मदद कर रहे हैं क्योंकि वे मानव शारीरिक और रोग संबंधी वातावरण को बेहतर ढंग से अनुकरण कर सकते हैं; हालांकि, ट्रांसजेनिक पशु मॉडल में भी कठिनाई, दीर्घकालिक और ट्रांसजेनिक संशोधन की उच्च लागत के कारण उनकी सीमाएं हैं। इसके अलावा, यहां तक कि पी 53 और आरबी जीन संशोधन द्वारा उत्पन्न सबसे व्यापक रूप से स्वीकृत ट्रांसजेनिक पशु मॉडल में, सार्कोमा का केवल 13.6% चार अंग हड्डियों11,12 में हुआ।
प्रत्यारोपण हाल के वर्षों में अपने सरल पैंतरेबाज़ी, स्थिर ट्यूमर गठन दर और बेहतर समरूपता13 के कारण सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले प्राथमिक और दूर के मेटास्टैटिक कैंसर मॉडल-उत्पादक तरीकों में से एक है। प्रत्यारोपण में प्रत्यारोपण स्थलों के अनुसार हेटरोटोपिक प्रत्यारोपण और ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण शामिल हैं। Osteosarcoma heterotopic प्रत्यारोपण में, osteosarcoma कोशिकाओं को जानवरों के प्राथमिक osteosarcoma साइटों (हड्डी) के बाहर इंजेक्ट किया जाता है, आमतौर पर त्वचा के नीचे, चमड़े के नीचे14। यद्यपि हेटरोटोपिक प्रत्यारोपण जानवरों में सर्जरी करने की आवश्यकता के बिना सीधा है, जिन साइटों पर ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाता है, वे वास्तविक मानव ऑस्टियोसारकोमा माइक्रोएन्वायरमेंट का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। ऑस्टियोसारकोमा ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण तब होता है जब ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं को जानवरों की हड्डियों में इंजेक्ट किया जाता है, जैसे कि टिबिया15,16। हेटरोटोपिक ग्राफ्ट की तुलना में, ऑर्थोटोपिक ओस्टियोसारकोमा ग्राफ्ट को एक छोटी इनक्यूबेशन अवधि, तेजी से विकास और मजबूत इरोसिव प्रकृति की विशेषता है; इसलिए, वे osteosarcoma से संबंधित अध्ययन17 के लिए आदर्श पशु मॉडल हैं।
सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले जानवर चूहे, कुत्ते और ज़ेबराफ़िश18,19 हैं। ऑस्टियोसारकोमा के सहज मॉडल का उपयोग आमतौर पर कैनाइन में किया जाता है क्योंकि ओस्टियोसारकोमा कैनाइन में सबसे आम ट्यूमर में से एक है। हालांकि, इस मॉडल का आवेदन लंबे समय तक ट्यूमर गठन समय, कम होने की दर, खराब समरूपता और स्थिरता के कारण सीमित है। ज़ेबराफ़िश का उपयोग अक्सर ट्रांसजेनिक या नॉकआउट ट्यूमर मॉडल के निर्माण के लिए किया जाता है क्योंकि उनके तेजी से प्रजनन20। लेकिन ज़ेब्राफ़िश जीन मानव जीन से अलग हैं, इसलिए उनके अनुप्रयोग सीमित हैं।
यह काम एथाइमिक चूहों में ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं के इंट्राटिबिया इंजेक्शन के माध्यम से फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस के साथ टिबिया में प्राथमिक ओस्टियोसारकोमा के उत्पादन के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं, सावधानियों और प्रतिनिधि छवियों का वर्णन करता है। इस विधि को चिकित्सीय प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए माउस टिबिया में प्राथमिक ओस्टियोसारकोमा बनाने के लिए लागू किया गया था, जिसने एक उच्च पुनरुत्पादन21,22 दिखाया था।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों को पारंपरिक चीनी चिकित्सा के शंघाई विश्वविद्यालय की पशु कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। चार सप्ताह के पुरुष BALB / c एथाइमिक चूहों को ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के लिए सर्जरी से पहले एक सप्ताह के लिए acclimated किया गया था। चूहों को व्यक्तिगत रूप से हवादार चूहों के पिंजरों में रखा गया था, जिसमें 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र में प्रति पिंजरे में पांच चूहों के साथ एसपीएफ फ़ीड और बाँझ पानी के लिए विज्ञापन लिबिटम पहुंच के साथ रखा गया था।
1. कोशिकाओं की तैयारी
- ऑस्टियोसारकोमा सेल (143B-Luciferase) इंजेक्शन के दिन, पीबीएस (पीएच 7.4) के साथ दो बार 10 सेमी सेल कल्चर डिश में सुसंस्कृत 80% -90% confluent कोशिकाओं को धोएं और 3 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन के 1.5 मिलीलीटर के साथ ट्रिप्सिनाइज़ करें। फिर, ट्रिप्सिन को बुझाने के लिए 10% सीरम युक्त एमईएम मीडिया के 6 एमएल जोड़ें, और 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
नोट: 143B-Luciferase सेल लाइन pLV-luciferase वेक्टर23 के साथ 143B सेल लाइन transfect से प्राप्त किया जाता है। - सेल गिनती प्लेट के कक्ष में सेल निलंबन के एस्पिरेट 20 μL और एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता की गणना ( सामग्री की तालिका देखें)।
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
- एक पिपेट के साथ supernatant aspirate और एक 8.5 मिलीग्राम / एमएल तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में सेल गोली resuspend ( सामग्री की तालिका देखें) 2 x 107 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए।
- कोशिकाओं को बर्फ पर रखते हुए, उन्हें सर्जरी रूम में लाएं। कोशिकाओं का उपयोग 2 घंटे के भीतर किया जाना है।
नोट: गलत इंजेक्शन खुराक से बचने के लिए (उदाहरण के लिए, सिरिंज में मृत स्थान के कारण), एक अतिरिक्त सेल निलंबन तैयार किया जाता है (आमतौर पर सेल निलंबन की आवश्यक मात्रा का दो गुना)। तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को हर समय बर्फ पर रखा जाता है क्योंकि इसमें कमरे के तापमान24 से ऊपर जमावट गुण होता है।
2. osteosarcoma कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के लिए सर्जरी
नोट: सर्जरी उपकरण चित्र 1 में दिखाए गए हैं।
- चूहों को विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त स्थितियों में उठाया गया था। सभी प्रक्रियाओं को बाँझ उपकरणों के साथ एक एसेप्टिक कैबिनेट में किया गया था।
- चूहों को 2% आइसोफ्लुरेन और 98% ऑक्सीजन (ऑक्सीजन प्रवाह दर, 2 एल / मिनट) के संपर्क में लाकर एनेस्थेटिक करें।
- संज्ञाहरण के तहत रहते हुए सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र मरहम की एक छोटी मात्रा लागू करें।
नोट:: एक अच्छी तरह से हवादार क्षेत्र में पूरी प्रक्रिया निष्पादित करें। ऑस्टियोसारकोमा सेल इंजेक्शन से पहले, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक माउस एक पैर की अंगुली चुटकी द्वारा गहरी संज्ञाहरण के तहत है; यदि माउस में अभी भी प्रतिक्रियाएं हैं, जैसे कि चिकोटी या झटका, तो लंबे समय तक प्रतीक्षा करें जब तक कि उपरोक्त प्रतिक्रियाएं गायब न हो जाएं। - प्रत्येक माउस को एक सुपाइन स्थिति में रखें। अंगूठे और तर्जनी का उपयोग करके माउस के टखने को पकड़ो और 70% इथेनॉल स्वाब के साथ टिबिया के इंजेक्शन साइट को कीटाणुरहित करें।
नोट: माउस टखने को कसकर पकड़ने के लिए, अंगूठे और अनुक्रमणिका उंगलियों दोनों बाद की प्रक्रियाओं के लिए बहुत महत्व के हैं। - टिबिया और फाइबुला को स्थानांतरित करने के लिए प्रत्येक माउस के टखने के जोड़ को बाहर की ओर घुमाएं, और घुटने के जोड़ को एक उपयुक्त स्थिति में मोड़ें जब तक कि समीपस्थ टिबिया पठार (टिबिया का शीर्ष) त्वचा के माध्यम से स्पष्ट रूप से दिखाई न दे (चित्रा 2 ए)।
- सुई को 1 एमएल सिरिंज से जोड़ें और इंजेक्शन साइट की ओर सुई की नोक को इंगित करें। सुनिश्चित करें कि सिरिंज सुई टिबिया की लंबी धुरी के समानांतर है।
- Percutaneously के माध्यम से या पटेलर स्नायुबंधन के बगल में सुई डालें के रूप में यह त्वचा / संयुक्त कैप्सूल के माध्यम से चला जाता है; th0en, सिरिंज (1/2 से 3/4-सर्कल) घुमाने के लिए टिबिया मंच के माध्यम से एक छेद ड्रिल करने के लिए टिबिया (मज्जा गुहा) के डिस्टल छोर की ओर एक माइक्रो-वॉल्यूम सिरिंज (चित्रा 2 बी, सी) के साथ ओस्टियोसारकोमा सेल इंजेक्शन के लिए।
नोट: सुई की नोक सटीक होने पर ड्रिलिंग करते समय टिबिया का एक साथ रोटेशन महसूस किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि नीडलिंग सिरिंज रोटेशन के साथ आगे बढ़ता है, बजाय सीधे आगे बढ़ने के बजाय जब तक कि सुई का लगभग आधा हिस्सा टिबिया में न हो।
- Percutaneously के माध्यम से या पटेलर स्नायुबंधन के बगल में सुई डालें के रूप में यह त्वचा / संयुक्त कैप्सूल के माध्यम से चला जाता है; th0en, सिरिंज (1/2 से 3/4-सर्कल) घुमाने के लिए टिबिया मंच के माध्यम से एक छेद ड्रिल करने के लिए टिबिया (मज्जा गुहा) के डिस्टल छोर की ओर एक माइक्रो-वॉल्यूम सिरिंज (चित्रा 2 बी, सी) के साथ ओस्टियोसारकोमा सेल इंजेक्शन के लिए।
- जांचें कि क्या सिरिंज सुई ने सफल ड्रिलिंग सुनिश्चित करने के लिए मज्जा नहर में एक प्रमुख आंदोलन किया है।
नोट: सुई की उचित स्थिति की पुष्टि करने और छवियों को इकट्ठा करने के लिए एक एक्स-रे परीक्षा ( सामग्री की तालिका देखें) करें। - लोड 143B osteosarcoma सेल निलंबन (चरण 1.5 से) एक माइक्रो-वॉल्यूम सिरिंज में और 143B सेल-लोडेड माइक्रो-वॉल्यूम सिरिंज (चित्रा 2 डी) के साथ टिबिया में 1 एमएल सिरिंज को प्रतिस्थापित करें। धीरे-धीरे उच्च दबाव लागू किए बिना प्रत्येक एथाइमिक माउस के टिबिया (लगभग 2 x 105 कोशिकाओं) में 143 बी सेल निलंबन के ~ 10 μL (सुई में पहले से मौजूद समाधान को अनदेखा करें) इंजेक्ट करें।
- माइक्रो-वॉल्यूम सिरिंज को हटा दिए जाने पर 20-30 सेकंड के लिए कपास झाड़ू के साथ इंजेक्शन साइट दबाएं।
- प्रत्येक माउस को एक साफ पिंजरे में वापस रखें और बारीकी से निगरानी करें जब तक कि माउस पूरी तरह से संज्ञाहरण (लगभग 10 मिनट) से ठीक न हो जाए।
- एक एक्स-रे इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके विवो में ट्यूमर के विकास की निगरानी करें। ट्यूमर की मात्रा (V) गणना के लिए कैलिपर के साथ हर हफ्ते कैंसर द्रव्यमान के लंबे व्यास (a) और छोटे व्यास (b) को मापें: V = 1/2 x a x b2।
नोट: चूहों को 2% आइसोफ्लुरेन और 98% ऑक्सीजन के संपर्क में लाकर एनेस्थेटिक करें। चूहों को एक्स-रे इमेजिंग के लिए एनेस्थेटिक किया गया था। लूसिफेरस या फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं का इंट्राटिबिया इंजेक्शन प्राथमिक और मेटास्टैटिक ओस्टियोसारकोमा घावों की ट्रैकिंग को सक्षम बनाता है।
नोट: घुटने और फेफड़ों के मेटास्टेसिस के ट्यूमर के विकास के कारण ओस्टियोसारकोमा के साथ चूहों के मानवीय समापन बिंदु निम्नलिखित मानदंडों पर आधारित थे: (1) शरीर की स्थिति स्कोर, (2) 20% की वजन घटाने की सीमा, (3) 2 सेमी के ट्यूमर का औसत अधिकतम व्यास, या (4) गंभीर रूप से सीमित पशु व्यवहार।
3. पैथोलॉजिकल परीक्षा (विश्लेषण के लिए प्राथमिक और फुफ्फुसीय मेटास्टैटिक ओस्टियोसारकोमा नमूना एकत्र करना)
- ओस्टियोसारकोमा सेल इंजेक्शन के छह सप्ताह बाद, सीओ2 इनहेलेशन के लिए उन्हें उजागर करने के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों की बलि दें।
- माउस को एक सुपाइन स्थिति में रखें और दोनों हिंद अंगों को फैलाएं।
- वंक्षण क्षेत्र से ओस्टियोसारकोमा वाले पूरे पैरों को अलग करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि सभी पैर एक ही शारीरिक साइट से अलग हैं। - त्वचा, मांसपेशियों और पैरों को हटाकर ओस्टियोसारकोमा वाले पैरों के हिस्टोलॉजिकल नमूने को तैयार करें, और फिर 24 घंटे के लिए 20 एमएल फॉर्मेलिन समाधान (10%) के साथ 50 एमएल ट्यूब में प्रत्येक माउस के नमूने को ठीक करें, इसके बाद कभी-कभी बफर परिवर्तन के साथ 14 दिनों के लिए 10% ईडीटीए समाधान में डीकैल्सीफिकेशन किया जाए।
- पैराफिन में नमूने को एम्बेड करें और पहले से प्रकाशित काम25 के बाद हिस्टोलॉजिकल परीक्षा के लिए अनुभाग तैयार करें।
- धीरे से फेफड़ों को अलग करें और उन्हें 20 एमएल फॉर्मेलिन समाधान (10%) से भरे 50 एमएल ट्यूब में डालें। 24 घंटे के बाद, प्रत्येक माउस के फेफड़ों को 70% इथेनॉल के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। हेमेटोक्सिलिन और इओसिन (एच एंड ई) धुंधला और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री परख25 के लिए पैराफिन में फेफड़ों को एम्बेड करें।
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Representative Results
सफल ऑर्थोटोपिक (प्राथमिक) ओस्टियोसारकोमा और मेटास्टैटिक पल्मोनरी मॉडल ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं के सटीक ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन पर निर्भर करते हैं। यहां, इंट्राटिबियल ओस्टियोसारकोमा सेल इंजेक्शन के माध्यम से एक ऑर्थोटोपिक (प्राथमिक) ओस्टियोसारकोमा मॉडल सफलतापूर्वक विकसित किया गया था। चित्रा 3A ऑर्थोटोपिक (प्राथमिक) ऑस्टियोसारकोमा वाले एक प्रतिनिधि माउस को दिखाता है, और चित्रा 3 बी एक प्रतिनिधि पृथक ऑर्थोटोपिक (प्राथमिक) ओस्टियोसारकोमा दिखाता है। ट्यूमर की मात्रा को सप्ताह में एक बार कैलिपर के साथ मापा गया था और चरण 2.11 (चित्रा 3 सी) में वर्णित के रूप में गणना की गई थी। विवो में ऑर्थोटोपिक (प्राथमिक) ओस्टियोसारकोमा विकास को एक्स-रे और बायोल्यूमिनेसेंस दोनों द्वारा ट्रैक किया गया था (जब इंजेक्ट की गई कोशिकाओं को लूसिफेरस के साथ लेबल किया गया था) लाइव इमेजिंग सिस्टम। एक्स-रे छवियों को 143 बी ओस्टियोसारकोमा सेल इंजेक्शन (चित्रा 3 डी) के बाद पहले सप्ताह से छठे सप्ताह तक प्राप्त किया गया था। इसके अलावा, विवो में ऑर्थोटोपिक (प्राथमिक) ओस्टियोसारकोमा वृद्धि की छवि को ल्यूसिफेरस लेबल 143 बी कोशिकाओं को माउस टिबिया (चित्रा 3 ई) में इंजेक्ट किए जाने के बाद प्राप्त किया गया था।
लुसिफेरस लेबल वाले ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं के इंट्राटिबियल इंजेक्शन के कारण फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस को बायोल्यूमिनेसेंस लाइव इमेजिंग सिस्टम (चित्रा 4 ए) द्वारा विवो में सफलतापूर्वक ट्रैक किया गया था। अलग-थलग फेफड़ों के ऊतकों में मेटास्टैटिक उपनिवेशों को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (चित्रा 4 बी) के तहत भी कल्पना की गई थी। मेटास्टैटिक घावों को पैराफिन-एम्बेडेड फेफड़ों के ऊतकों (चित्रा 4 सी) पर एच एंड ई धुंधला होने से आगे की पुष्टि की गई थी।
चित्रा 1: सर्जरी उपकरण(ए) 1 एमएल स्केल सिरिंज। (बी) माइक्रो-वॉल्यूम सिरिंज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: इंट्राटिबियल इंजेक्शन सर्जरी का प्रतिनिधित्व। (ए) एक एथाइमिक माउस का इंट्राटिबियल इंजेक्शन साइट। (बी) एक साथ सुई के साथ एक बाँझ 1 एमएल सिरिंज को समीपस्थ टिबिया पठार (टिबिया के शीर्ष) के माध्यम से डिस्टल छोर की ओर टिबिया में पर्कुटेनियस रूप से डाला गया था। (c) ड्रिलिंग प्रक्रिया का एक पार्श्व दृश्य। सिरिंज सुई लंबी टिबिया अक्ष (ठोस रेखा) के समानांतर थी। (डी) ऑस्टियोसारकोमा सेल लोडेड माइक्रो-वॉल्यूम सिरिंज के साथ इंट्राटिबियल इंजेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: चूहों में osteosarcoma वृद्धि का विज़ुअलाइज़ेशन. (A) सफल माउस ऑर्थोटोपिक osteosarcoma मॉडल. (बी) पृथक ऑर्थोटोपिक ऑस्टियोसारकोमा। (सी) ट्यूमर की मात्रा को कैलिपर के साथ मापा गया था और निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके गणना की गई थी: ट्यूमर की मात्रा = 0.5 x लंबे व्यास x छोटे व्यास x छोटे व्यास। त्रुटि सलाखों का अर्थ मानक विचलन (n = 8) है। (डी) एक्स-रे छवियों को एक अलग समय (1-6 सप्ताह से) पर एक ही माउस से प्राप्त किया गया था। (ई) लूसिफेरस लेबल 143 बी कोशिकाओं के बाद 28वें दिन प्राप्त छवि को माउस टिबिया में इंजेक्ट किया गया था। लाल तीर ऑर्थोटोपिक (प्राथमिक) osteosarcoma की luminescence तीव्रता का संकेत दिया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: osteosarcoma के फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस। (ए) लूसिफेरस लेबल के बाद 28वें दिन प्राप्त छवि 143 बी कोशिकाओं को माउस टिबिया में इंजेक्ट किया गया था। लाल तीरों ने फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस की ल्यूमिनेसेंस तीव्रता का संकेत दिया। (बी) ओस्टियोसारकोमा मेटास्टेसिस के साथ अलग फेफड़े। लाल तीर मेटास्टैटिक उपनिवेशों (x20) का संकेत देते हैं। (सी) एच एंड ई धुंधला फेफड़ों के ऊतकों में मेटास्टैटिक घावों को दिखाया गया (स्केल बार = 200 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
Osteosarcoma कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन osteosarcoma कार्सिनोजेनेसिस और चिकित्सीय प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए विकास में विशिष्ट कारकों के कार्य और तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है। ट्यूमर के विकास में अंतर से बचने के लिए, एक ही संख्या के साथ 80% -90% confluent पर अधिकांश सक्रिय osteosarcoma कोशिकाओं को प्रत्येक माउस के टिबिया में सावधानीपूर्वक इंजेक्ट किया जाता है, और सेल ट्रिप्सिनाइजेशन समय को सेल व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना सख्ती से नियंत्रित किया जाता है। चूंकि सेल clumps सेल गिनती को प्रभावित करते हैं जिससे प्रत्येक माउस के टिबिया में गलत सेल नंबर इंजेक्ट किए जाते हैं, सेल निलंबन को सेल clumps के गठन से बचने के लिए एक पिपेट के साथ उचित रूप से ऊपर और नीचे मिश्रित करने की आवश्यकता होती है।
एक और महत्वपूर्ण पहलू जिसे ध्यान में रखा जाना चाहिए, वह है ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं के लिए पुन: निलंबित समाधान। इंजेक्ट की गई कोशिकाओं को पीबीएस या संस्कृति माध्यम के बजाय एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में फिर से निलंबित किया जाता है। इसके अलावा, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की एक उच्च एकाग्रता pipetted किया जा करने के लिए चुनौतीपूर्ण है और सटीक मात्रा को प्रभावित करता है; इस प्रकार, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की एक उपयुक्त एकाग्रता की आवश्यकता है26. ओस्टियोसारकोमा सेल इंजेक्शन के लिए टिबिया प्लेटफॉर्म के माध्यम से एक छेद ड्रिल करने के लिए, नीडलिंग सिरिंज रोटेशन के साथ आगे बढ़ता है, बजाय सीधे आगे बढ़ने के बजाय जब तक कि सुई का लगभग आधा हिस्सा टिबिया में न हो। अधिक विशेष रूप से, immunodeficient चूहों को मानव osteosarcoma कोशिकाओं27 का उपयोग कर एक orthotopic osteosarcoma मॉडल स्थापित करने के लिए लागू कर रहे हैं। इस बीच, इंजेक्शन प्रक्रिया बाँझ सर्जिकल उपकरणों का उपयोग करके जैविक सुरक्षा कैबिनेट में की जाती है। चूंकि चूहों को संज्ञाहरण और सर्जरी के बाद बेचैनी का अनुभव हो सकता है, इसलिए चूहों को पहले सप्ताह के बाद की सर्जरी पर बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए।
फ्लोरोसेंट प्रोटीन या लूसिफेरस के साथ लेबल किए गए ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं के इंट्राटिबिया इंजेक्शन ऑप्टिकल इमेजिंग28 का उपयोग करके प्राथमिक और मेटास्टैटिक घावों की ट्रैकिंग को सक्षम बनाता है। Osteosarcoma को कभी भी आकार सीमा से परे अनुमति नहीं दी जाती है जैसा कि IACUC-अनुमोदित प्रोटोकॉल में है; इस बीच, अल्सरेशन भारी आकार के ट्यूमर द्रव्यमान में हो सकता है, जिससे असफल इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण हो सकता है। हालांकि प्राथमिक हड्डी ट्यूमर और हड्डी मेटास्टेसिस को हाल ही में हड्डी में ठोस ट्यूमर ग्राफ्ट के आरोपण द्वारा प्राप्त करने की सूचना दी गई है, और जानवरों ने पुनरुत्पादक विकास विकसित किया, साथ ही साथ फेफड़ों के मेटास्टेसिस अंततः29; हालांकि, लेखकों ने सीधे समीपस्थ टिबिया में ताजा या क्रायोप्रिजर्व्ड ट्यूमर के टुकड़ों को प्रत्यारोपित किया, जिसने दिखाया कि खुली सर्जरी के नुकसान से संभावित संक्रमण और ट्यूमर एनग्राफ्टमेंट विकसित करने में विफलता हुई। इसके अलावा, सख्त नियंत्रण के बिना प्रत्यारोपित ट्यूमर के टुकड़ों की मात्रा के परिणामस्वरूप उत्पादित ट्यूमर की मात्रा में महत्वपूर्ण अंतर होगा, जो निम्नलिखित आवेदन में मुश्किल है, जैसे कि विवो में चिकित्सीय प्रभावकारिता का मूल्यांकन करना। यहां, एक सरल और पुन: प्रस्तुत करने योग्य तकनीक को ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं के इंट्राटिबिया इंजेक्शन के माध्यम से बाद में फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस माउस मॉडल के साथ इंट्राटिबिया प्राथमिक ओस्टियोसारकोमा स्थापित करने के लिए सूचित किया गया है। इसने मनुष्यों में ओस्टियोसारकोमा की नैदानिक विकास विशेषताओं की सबसे अच्छी नकल करने के लाभों को दिखाया; Osteosarcoma कोशिकाओं की सटीक संख्या सीधे टिबिया में इंजेक्ट किया जा रहा है माइक्रो-वॉल्यूम सिरिंज का उपयोग करके समान ट्यूमर गठन दर (100%) और ट्यूमर की मात्रा की अनुमति देता है। यह विधि खुली सर्जरी तकनीकों का उपयोग करके संक्रमण या यहां तक कि मृत्यु की संभावनाओं से बचने और इंजेक्ट किए गए ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं को बायोल्यूमिनेसेंस के साथ लेबल किए जाने के बाद बायोल्यूमिनेसेंस लाइव इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके ओस्टियोसारकोमा विकास और मेटास्टेसिस की जीवंत निगरानी और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देती है। यह इंजेक्ट किए गए ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं को सीधे रक्तप्रवाह तक पहुंचने और फेफड़ों में उपनिवेशीकरण करने से रोकता है ताकि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की उचित एकाग्रता में इंजेक्ट किए गए ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं को फिर से निलंबित करके फुफ्फुसीय अन्त: शल्यता और / या झूठी-सकारात्मक फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस बनाई जा सके क्योंकि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में कमरे के तापमान से ऊपर जमावट की संपत्ति होती है। माउस टिबिया में इंजेक्ट किए जाने के बाद तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के भीतर ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं का तत्काल जमावट समर्थन और प्रतिबंधित करता है।
एक अन्य साहित्य ने स्तन कैंसर कोशिकाओं के इंट्राकार्डियक इनोक्यूलेशन या इंट्राटिबियल इनोक्यूलेशन द्वारा हड्डी मेटास्टेसिस मॉडल की स्थापना की सूचना दीहै 30; हालांकि, इस साहित्य में उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं स्तन कैंसर कोशिकाएं हैं, जिनमें ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं के साथ विभिन्न जैविक और नैदानिक विशेषताएं हैं; इसके अलावा, हड्डी में इंट्राकार्डियक और इंट्राटिबियल इनोक्यूलेशन स्थापित कैंसर मॉडल दोनों का गठन कैंसर सेल को सीधे उपनिवेशित करने या प्राथमिक कैंसर घावों से कैंसर सेल प्रसार द्वारा गठित मेटास्टेसिस घावों के बजाय रक्तप्रवाह के माध्यम से पहुंचने से होता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल की कई सीमाएं हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले चूहे आनुवंशिक प्रतिरक्षा प्रणाली दोष थाइमस के बिना नग्न चूहे हैं जो उन्हें मानव कोशिकाओं को इम्यूनोलॉजिकल रूप से अस्वीकार करने से रोकते हैं और व्यापक रूप से प्रीक्लिनिकल परीक्षणों में उपयोग किए जाते हैं, जो प्रतिरक्षा कार्यात्मक अनुसंधान के लिए लागू नहीं होते हैं। इसके अलावा, हमने पाया कि इन मॉडलों में सभी ओस्टियोसारकोमा सेल लाइनें समान रूप से प्रासंगिक नहीं हैं, और 143 बी, एमएनएनजी, एमजी -63 और यू -2 ओएस कोशिकाओं की क्षमताएं साओस -2 कोशिकाओं की तुलना में अधिक हैं।
अंत में, ऑर्थोटोपिक ओस्टियोसारकोमा सेल इंजेक्शन द्वारा उत्पन्न वर्तमान प्राथमिक और फुफ्फुसीय मेटास्टेटिक ओस्टियोसारकोमा मॉडल ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट, ओस्टियोसारकोमा विकास और / या मेटास्टेसिस पर चिकित्सीय की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए आसान उपकरण हैं। इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से संशोधित ओस्टियोसारकोमा कोशिकाओं के इंट्राटिबिया इंजेक्शन द्वारा विशेष रूप से एक जीन को लक्षित करते हुए, मॉडल ओस्टियोसारकोमा विकास और फुफ्फुसीय मेटास्टेसिस में प्रमुख ऑन्कोजीन और ट्यूमर दबाने वालों का पता लगाने में सहायक होते हैं।
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Disclosures
लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को (1) चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2018YFC1704300 और 2020YFE0201600), (2) नेशनल नेचर साइंस फाउंडेशन (81973877 और 82174408) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
References
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