Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Live imaging van de mitochondriale glutathion redoxtoestand in primaire neuronen met behulp van een ratiometrische indicator

Published: October 20, 2021 doi: 10.3791/63073
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Medical Cell Biology, Institute for Anatomy and Cell Biology, Heidelberg University, 2Department of Neurogenetics, Max-Planck-Institute for Experimental Medicine

Summary

Dit artikel beschrijft een protocol om verschillen in basale redoxtoestand en redoxresponsen op acute verstoringen in primaire hippocampus- en corticale neuronen te bepalen met behulp van confocale levende microscopie. Het protocol kan met minimale aanpassingen worden toegepast op andere celtypen en microscopen.

Abstract

Mitochondriale redox homeostase is belangrijk voor neuronale levensvatbaarheid en functie. Hoewel mitochondriën verschillende redoxsystemen bevatten, wordt de zeer overvloedige thiol-disulfide redoxbuffer glutathion beschouwd als een centrale speler in de antioxidantafweer. Daarom levert het meten van het mitochondriale glutathion redoxpotentiaal nuttige informatie op over mitochondriale redoxstatus en oxidatieve stress. Glutaredoxine1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) is een genetisch gecodeerde, op groen fluorescerend eiwit (GFP) gebaseerde ratiometrische indicator van de glutathion redoxpotentiaal die twee redoxtoestandsgevoelige excitatiepieken heeft bij 400 nm en 490 nm met een enkele emissiepiek bij 510 nm. Dit artikel beschrijft hoe confocale levende microscopie van mitochondria-gerichte Grx1-roGFP2 in primaire hippocampale en corticale neuronen kan worden uitgevoerd. Het beschrijft hoe steady-state mitochondriaal glutathion redoxpotentieel kan worden beoordeeld (bijvoorbeeld om ziektetoestanden of langetermijnbehandelingen te vergelijken) en hoe redoxveranderingen bij acute behandelingen kunnen worden gemeten (met behulp van het excitotoxische medicijn N-methyl-D-aspartaat (NMDA) als voorbeeld). Daarnaast presenteert het artikel co-imaging van Grx1-roGFP2 en de mitochondriale membraanpotentiaalindicator, tetramethylrhodamine, ethylester (TMRE), om aan te tonen hoe Grx1-roGPF2 kan worden gemultiplext met aanvullende indicatoren voor multiparametrische analyses. Dit protocol biedt een gedetailleerde beschrijving van hoe (i) confocale laserscanmicroscoopinstellingen kunnen worden geoptimaliseerd, (ii) geneesmiddelen voor stimulatie kunnen worden toegepast gevolgd door sensorkalibratie met diamide en dithiothreitol, en (iii) gegevens kunnen worden geanalyseerd met ImageJ / FIJI.

Introduction

Verschillende belangrijke mitochondriale enzymen en signaalmoleculen zijn onderhevig aan thiol redox regulatie1. Bovendien zijn mitochondriën een belangrijke cellulaire bron van reactieve zuurstofsoorten en zijn ze selectief kwetsbaar voor oxidatieve schade2. Dienovereenkomstig heeft het mitochondriale redoxpotentiaal direct invloed op bio-energetica, celsignalering, mitochondriale functie en uiteindelijk de levensvatbaarheid van cellen3,4. De mitochondriale matrix bevat grote hoeveelheden (1-15 mM) van de thiol-disulfide redoxbuffer glutathion (GSH) om de redoxhomeostase te behouden en de antioxidantafweer te versterken5,6. GSH kan covalent worden gehecht aan doeleiwitten (S-glutathionylatie) om hun redoxstatus en -activiteit te beheersen en wordt gebruikt door een reeks ontgiftende enzymen die geoxideerde eiwitten verminderen. Daarom is de mitochondriale glutathion redoxpotentiaal een zeer informatieve parameter bij het bestuderen van mitochondriale functie en pathofysiologie.

roGFP2 is een variant van GFP die redoxgevoelig is gemaakt door de toevoeging van twee aan het oppervlak blootgestelde cysteines die een kunstmatig dithiol-disulfidepaar vormen7,8. Het heeft een enkele emissiepiek bij ~ 510 nm en twee excitatiepieken bij ~ 400 nm en 490 nm. Belangrijk is dat de relatieve amplitudes van de twee excitatiepieken afhankelijk zijn van de redoxtoestand van roGFP2 (figuur 1), waardoor dit eiwit een ratiometrische sensor is. In de Grx1-roGFP2-sensor is humaan glutaredoxine-1 (Grx1) gefuseerd met het N-eindpunt van roGFP29,10. Covalente hechting van het Grx1-enzym aan roGFP2 biedt twee belangrijke verbeteringen van de sensor: het maakt de sensorrespons specifiek voor het GSH / GSSG glutathion redoxpaar (figuur 1) en het versnelt de evenwichtsbalans tussen GSSG en roGFP2 met een factor van ten minste 100.0009. Daarom maakt Grx1-roGFP2 specifieke en dynamische beeldvorming van het cellulaire glutathion redoxpotentiaal mogelijk.

Grx1-roGFP2-beeldvorming kan worden uitgevoerd op een breed scala aan microscopen, waaronder widefield fluorescentiemicroscopen, confocale microscopen voor draaiende schijven en confocale microscopen voor laserscanning. Expressie van de sensor in primaire neuronen kan worden bereikt door verschillende methoden, waaronder lipofectie11, DNA / calciumfosfaatcoprecipitatie12, virusgemedieerde genoverdracht of gebruik van transgene dieren als celbron (figuur 2). Pseudotypeerde recombinante adeno-geassocieerde virussen (rAAV) met een 1:1 verhouding van AAV1 en AAV2 capsid eiwitten 13,14 werden gebruikt voor de experimenten in dit artikel. Met deze vector wordt de maximale sensorexpressie meestal 4-5 dagen na infectie bereikt en blijft deze gedurende ten minste twee weken stabiel. We hebben Grx1-roGFP2 met succes gebruikt in primaire hippocampus- en corticale neuronen van muizen en ratten.

In dit artikel wordt rAAV-gemedieerde expressie van mitochondria-gerichte Grx1-roGFP2 in primaire hippocampale en corticale neuronen van ratten gebruikt om de basale mitochondriale glutathion redoxtoestand en de acute verstoring ervan te beoordelen. Er is een protocol voor confocale live beeldvorming met gedetailleerde instructies voor het optimaliseren van (i) het optimaliseren van confocale microscoopinstellingen voor laserscannen, (ii) het uitvoeren van een live beeldvormingsexperiment en (iii) het analyseren van gegevens met FIJI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierproeven voldeden aan nationale en institutionele richtlijnen, waaronder richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement van de Raad, en hadden volledige ethische goedkeuring van het ministerie van Binnenlandse Zaken (Bureau voor Dierenwelzijn van de Universiteit van Heidelberg en Regierungspraesidium Karlsruhe, vergunningen T14/21 en T13/21). Primaire hippocampus- en corticale neuronen werden bereid uit pasgeboren muizen- of rattenjongen volgens standaardprocedures en werden gedurende 12-14 dagen gehandhaafd zoals eerder beschreven13.

1. Bereiding van oplossingen

  1. Stockoplossingen voor beeldvormingsbuffer
    1. Bereid elke stamoplossing volgens tabel 1 en bewaar ze bij 4 °C. Voor langdurige opslag (>3 maanden) bewaart u aliquots bij -20 °C.
Bestanddeel MW Concentratie (M) Bedrag (g) Volume (ml)
NaCl 58.44 5 14.61 50
Kcl 74.55 3 1.12 5
MgCl2· 6h2o 203.3 1.9 2 5
CaCl2·2H2O 147.01 1 1.47 10
Glycine 75.07 0.1 0.375 50
Sacharose 342.3 1.5 25.67 50
Natriumpyruvaat 110.04 0.1 0.55 50
Hepes 238.3 1 11.9 50
Glucose 180.15 2.5 45 100

Tabel 1: Stockoplossingen voor beeldvormingsbuffer.

  1. Voorraadoplossingen van geneesmiddelen en kleurstoffen
    1. Los diamide (DA; gebruikt voor kalibratie van maximale 405:488-verhouding) op in water om een stamoplossing van 0,5 M te verkrijgen (bijv. 1 g in 11,615 ml water). Aliquot en bewaren bij -20 °C.
    2. Los dithiothreitol (DTT; gebruikt voor kalibratie van minimaal 405:488 verhouding) op in water om een 1 M stamoplossing te verkrijgen (bijv. 5 g in 32,425 ml water). Aliquot en bewaren bij -20 °C gedurende maximaal 3 maanden.
    3. Los N-methyl-D-aspartaat (NMDA; gebruikt om excitotoxiciteit en mitochondriale oxidatie te induceren) op in water om een voorraadoplossing van 10 mM te verkrijgen (bijv. 25 mg in 16,991 ml water). Bewaar de aliquots bij -20 °C. Voor langdurige opslag (>6 maanden) bewaart u de aliquots op -80 °C.
    4. Tetramethylrhodamine ethylesterperchloraat (TMRE; een indicator met kleine moleculen van het mitochondriale membraanpotentiaal)
      1. Los TMRE poeder op in methanol om een voorraad van 20 mM te verkrijgen (bijv. 25 mg in 2,427 ml methanol).
      2. Verdun de 20 mM-voorraad 1:1.000 in methanol om een voorraad van 20 μM te verkrijgen.
      3. Vul de 20 mM en 20 μM voorraadoplossingen, sluit af met parafilm en bewaar beschermd tegen licht bij -20 °C.
        OPMERKING: Beide voorraadoplossingen zijn meerdere jaren stabiel. Gebruik de 1.000x stockoplossing (20 μM) voor experimenten.
  2. Beeldbuffer
    1. Bereid 100 ml beeldbuffer voor door alle componenten uit tabel 2 toe te voegen aan 80 ml steriel water in een maatcilinder. Breng het volume op 100 ml met steriel water. Meng door de meetcilinder voorzichtig te schudden totdat de oplossing homogeen lijkt.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een osmometer te gebruiken om de osmolariteit van de buffer te controleren. Het moet zo dicht mogelijk bij het groeimedium van de cellen zijn. Hier is dit 315 mOsmol / L. Verhoog of verlaag de sucroseconcentratie indien nodig om de osmolariteit van de beeldvormingsbuffer en het groeimedium te evenaren.
    2. Stel de pH in op 7,4. Maak aliquots en bewaar ze maximaal twee weken op 4 °C. Bewaar de aliquots voor langdurige opslag op -20 °C. Laat de beeldbuffer voor gebruik op kamertemperatuur komen.
Bestanddeel Voorraadoplossing (M) Eindconcentratie (mM) Volume (ml)
NaCl 5 114 2.3
Kcl 3 5.29 0.176
MgCl2 1.9 1 0.053
CaCl2 1 2 0.2
Glycine 0.1 0.005 0.005
Sacharose 1.5 52 3.5
Natriumpyruvaat 0.1 0.5 0.5
Hepes 1 10 1
Glucose 2.5 5 0.2

Tabel 2: Samenstelling van de beeldvormingsbuffer. De aangegeven volumes worden gebruikt voor de bereiding van 100 ml beeldbuffer.

  1. Oplossingen voor stimulatie en kalibratie
    OPMERKING: Bereid altijd verse stimulatieoplossingen voor door voorraadoplossingen van geïndiceerde geneesmiddelen vlak voor het experiment aan de beeldvormingsbuffer toe te voegen. Oplossingen voor stimulatie en kalibratie zullen tijdens een experiment achtereenvolgens aan de beeldvormingskamer worden toegevoegd (zie rubrieken 3-5). Afhankelijk van het type experiment zijn verschillende oplossingen nodig om dezelfde eindconcentratie te bereiken in het respectieve eindvolume in de beeldvormingskamer.
    1. Bereid 3x NMDA-oplossing (90 μM; eindconcentratie in de kamer: 30 μM) door 63 μL van een NMDA-voorraad van 10 mM toe te voegen aan 6,937 ml beeldbuffer. Voeg 500 μL van de resulterende oplossing toe aan de kamer (eindvolume: 1,5 ml).
    2. Bereid 2x DA-oplossing voor stap 3 en 4 (1 mM; eindconcentratie in de kamer: 0,5 mM) door 14 μL van een 0,5 M DA-voorraad toe te voegen aan 6,986 ml beeldbuffer. Voeg 1 ml toe aan de kamer (eindvolume: 2 ml).
    3. Bereid 4x DA-oplossing voor stap 5 (2 mM; eindconcentratie in de kamer: 0,5 mM) door 28 μL van een 0,5 M DA-voorraad toe te voegen aan 6,972 ml beeldbuffer. Voeg 500 μL toe aan de kamer (eindvolume: 2 ml).
    4. Bereid 1x DTT-oplossing (5 mM; eindconcentratie in de kamer: 5 mM) door 45 μL 1 M DTT-voorraad toe te voegen aan 8955 μL beeldbuffer. Voeg 1 ml van deze oplossing toe aan de kamer na het aanzuigen van de beeldvormingsbuffer (eindvolume: 1 ml).

2. Laden van cellen met TMRE

OPMERKING: In dit protocol wordt TMRE gebruikt in niet-dempingsmodus15 bij een eindconcentratie van 20 nM. Over het algemeen moet de laagst mogelijke concentratie TMRE worden gebruikt die nog steeds voldoende signaalintensiteit biedt op de microscoop van keuze. Door ongelijke verdamping kan het volume van medium in verschillende putten verschillen in primaire culturen op lange termijn. Om een consistente TMRE-concentratie in alle putten te garanderen, moet u TMRE niet rechtstreeks aan de putten toevoegen. Vervang in plaats daarvan het medium in elke put door dezelfde hoeveelheid TMRE-bevattend medium. Het onderstaande protocol is ontworpen voor primaire neuronen in 24-well platen met ~ 1 ml medium per put.

  1. Werk in een weefselkweek laminaire stroomkap, verzamel 500 μL medium uit elke put in een enkele conische buis.
  2. Voeg per put 0,5 μL van 20 μM TMRE-voorraad toe aan de conische buis (bijv. 12 μL voor 24 putten).
  3. Zuig het resterende medium voorzichtig op uit de eerste put en vervang het door 500 μL TMRE-bevattend medium. Ga verder, goed-bij-goed, met de resterende putten.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de cellen niet uitdrogen en dat u de cellen niet verstoort.
  4. Breng de cellen terug naar de incubator en wacht minstens 60 minuten op kleurstofevenwicht.
    OPMERKING: De laadtijd kan worden verlengd tot enkele uren zonder nadelige effecten.
  5. Om consistente TMRE-concentraties en evenwichtsoefeningen tijdens het beeldvormingsexperiment te garanderen, moet u een eindconcentratie van 20 nM TMRE opnemen in de beeldvormingsbuffer en alle stimulatieoplossingen.

3. Optimalisatie van het scannen van confocale microscoopinstellingen

OPMERKING: Deze stap is bedoeld om het beste compromis te vinden tussen beeldkwaliteit en levensvatbaarheid van cellen tijdens live imaging. In dit gedeelte wordt de optimalisatie van instellingen voor roGFP-beeldvorming beschreven. Als multiparametrische beeldvorming wordt uitgevoerd, moet een vergelijkbare optimalisatie, inclusief het controleren op een stabiele uitgangswaarde zonder tekenen van bleken of fototoxiciteit, worden uitgevoerd voor de aanvullende indicatoren.

  1. Start de confocale microscoop en laad standaardinstellingen voor GFP-beeldvorming (488 nm excitatie, 505 - 550 nm emissie).
  2. Stel de detector in op 12 bits of 16 bits.
    OPMERKING: Meestal zijn 8 bits niet voldoende voor kwantitatieve beeldvorming.
  3. Activeer de sequentiële scanmodus en voeg een tweede reeks/track toe (405 nm excitatie, 505 - 550 nm emissie).
  4. Selecteer voor beide kanalen een pseudokleuropzoektabel die over- en onderbelichte pixels aangeeft (bijvoorbeeld GLOW OU).
  5. Selecteer een doelstelling die geschikt is voor het object van interesse.
    OPMERKING: 10x-40x zijn geschikt voor eencellige analyse, 63x-100x zijn geschikt voor single-mitochondrion-analyse.
  6. Monteer een coverslip met cellen in de beeldvormingskamer, voeg 1 ml beeldbuffer toe en plaats de kamer op de microscoop.
  7. Gebruik het oculair en het doorgelaten licht om de cellen scherp te stellen.
    OPMERKING: Gebruik geen epifluorescentielicht om cellen te lokaliseren en te focussen. Zelfs bij een laag vermogen zal dit de cellen nadelig beïnvloeden.
  8. Neem afbeeldingen op met verschillende pixelindelingen. Selecteer op basis van deze afbeeldingen het laagste pixelaantal dat een acceptabele resolutie van de interessante structuur geeft.
    OPMERKING: Meestal werken 512 x 512 pixels goed voor eencellige beeldvorming met 20x en 40x objectieven, en 1024 x 1024 of 2048 x2048 pixels werken meestal goed voor single-mitochondrion imaging met een 63x objectief.
  9. Neem beelden op met verschillende pinhole-formaten. Selecteer op basis van deze afbeeldingen de grootste pinhole-grootte die een acceptabele resolutie van de interessante structuur geeft.
    OPMERKING: Meestal werken 3-7 luchtige eenheden goed.
  10. Neem beelden op met verschillende laserintensiteiten.
    1. Pas de detectorversterking en -drempel dienovereenkomstig aan. Selecteer op basis van deze afbeeldingen de laagste laserintensiteit die een acceptabele signaalintensiteit en signaal-achtergrondverhouding geeft.
      1. Om de signaal-achtergrondverhouding te bepalen, meet u de signaalintensiteit in een interessegebied (ROI) dat cellen of mitochondriën bevat (ROI1) en in een ROI zonder cellen of mitochondriën (ROI2). Deel vervolgens de intensiteit van ROI1 door de intensiteit van ROI2.
        OPMERKING: Streef naar een signaal-achtergrondverhouding van >3 en signaalintensiteiten van individuele ROI's van 200-1.000 voor 405 nm excitatie met 1-3% laservermogen en intensiteiten van individuele ROI's van 300-1.500 voor 488 nm excitatie met 1% laservermogen.
  11. Neem afbeeldingen op met verschillende scansnelheden en het aantal framegemiddelden. Neem 4-5 afbeeldingen op voor elke combinatie van instellingen. Selecteer op basis van deze afbeeldingsreeksen de hoogste snelheid en laagste gemiddelde instellingen die acceptabele beeldruis en beeld-naar-beeldvariabiliteit bieden.
    OPMERKING: Een scansnelheid van 600 Hz en 1-2 frames voor gemiddelden werken in de meeste gevallen goed.
  12. Gebruik een nieuwe coverslip om een time-lapse-serie op te nemen met de geoptimaliseerde instellingen.
    OPMERKING: De duur en het beeldinterval van de serie moeten lijken op die van de geplande experimenten.
  13. Voeg aan het einde van de time-lapse-serie 1 ml 2x DA-oplossing toe aan de opnamekamer. Afbeelding voor nog eens 2 min.
  14. Zuig de beeldvormingsbuffer op met behulp van een peristaltische pomp of handheld pipet. Voeg 1 ml 1x DTT-oplossing toe. Afbeelding voor nog eens 5 min.
  15. Analyseer het time-lapse-experiment (zie rubriek 5).
    1. Controleer of geen van de twee kanalen over- of onderbelicht raakt tijdens DA- en DTT-behandeling met de geoptimaliseerde instellingen.
    2. Zorg ervoor dat geen van de twee kanalen een aanzienlijke verbleking vertoont tijdens de time-lapse-opname; streef naar <2% intensiteitsverlies tussen de eerste en laatste beelden.
    3. Controleer of de verhouding 405:488 niet aanzienlijk verandert tijdens het maken van de beeldvorming.
  16. Herhaal de hele procedure op een iteratieve manier, met behulp van verschillende coverslips, totdat instellingen zijn gedefinieerd die consistent acceptabele resultaten bieden.

4. Beoordeling van de basale redoxstatus

  1. Start de microscoop en laad de geoptimaliseerde instellingen uit sectie 3.
  2. Stel het framegemiddelde in op 3-5.
  3. Monteer een coverslip met cellen in de beeldvormingskamer, voeg 1 ml beeldbuffer toe en plaats de kamer op de microscoop.
  4. Gebruik het oculair en het doorgelaten licht om de cellen scherp te stellen.
    OPMERKING: Gebruik geen epifluorescentielicht om cellen te lokaliseren en te focussen. Zelfs bij een laag vermogen zal dit de cellen nadelig beïnvloeden.
  5. Schakel over naar de scanmodus en gebruik het 488 nm-kanaal in liveweergave om cellen scherp te stellen en te lokaliseren voor beeldvorming.
  6. Gebruik de multipoint-functie om 3-5 gezichtsvelden op de coverslip te selecteren.
  7. Neem een basislijnafbeelding op.
  8. Voeg 1 ml 2x DA-oplossing toe aan de kamer.
  9. Gebruik na 1, 2 en 3 minuten live view om de focus te bevestigen /aanpassen en neem vervolgens een afbeelding op.
    OPMERKING: Cellen zijn meestal volledig geoxideerd na 2 minuten.
  10. Vervang de buffer in de beeldvormingskamer door 1 ml 1x DTT-oplossing.
  11. Gebruik na 3 en 5 minuten live view om de focus te bevestigen/aanpassen en neem vervolgens een afbeelding op.
    OPMERKING: Cellen zijn meestal volledig verminderd na 4-5 minuten.

5. Live beeldvorming van acute behandelingen

OPMERKING: Het onderstaande protocol beschrijft beeldvorming van de mitochondriale redoxrespons op NMDA-behandeling. Beeldintervallen en duur van het experiment moeten mogelijk worden aangepast voor andere behandelingen.

  1. Start de microscoop en laad de geoptimaliseerde instellingen uit sectie 3.
  2. Stel het time-lapse-interval in op 30 s en de duur op 25 minuten.
  3. Monteer een coverslip met cellen in de beeldvormingskamer, voeg 1 ml beeldbuffer toe en plaats de kamer op de microscoop.
    OPMERKING: Om thermische focusdrift te voorkomen, laat u de cellen 10-15 minuten op het microscooppodium staan voordat u begint met time-lapse-beeldvorming.
  4. Gebruik het oculair en het doorgelaten licht om de cellen scherp te stellen.
    OPMERKING: Gebruik geen epifluorescentielicht om cellen te lokaliseren en te focussen. Zelfs bij een laag vermogen zal dit de cellen nadelig beïnvloeden.
  5. Schakel over naar de scanmodus en gebruik het 488 nm-kanaal in liveweergave om cellen scherp te stellen en te lokaliseren voor beeldvorming.
  6. Optioneel: Als u het aantal opgenomen cellen per run wilt verhogen, gebruikt u de multipointfunctie om 2-3 gezichtsvelden per coverslip weer te geven.
  7. Start de time-lapse acquisitie en neem 5 beelden op als 2 min baseline opname.
  8. Voeg 500 μL 3x NMDA-oplossing toe aan de kamer (eindconcentratie 30 μM) en neem nog eens 20 beelden op als nmda-respons van 10 minuten.
    OPMERKING: Neuronen zijn erg gevoelig voor veranderingen in osmolariteit. Zorg er daarom voor dat de verdamping van de beeldvormingsbuffer tot een minimum wordt beperkt. Voor langere behandelingen moet de beeldvormingskamer worden bedekt met een deksel.
  9. Voeg 500 μL 4x DA-oplossing toe aan de kamer en neem nog 6 beelden op (maximale kalibratie van 3 minuten).
  10. Zuig de buffer uit de beeldvormingskamer en vervang deze door 1 ml 1x DTT-oplossing. Neem nog 10 beelden op (minimaal 5 minuten kalibratie).
  11. Beëindig de opname en sla de beeldreeks op.

6. Data-analyse

  1. Gegevensimport en voorbewerking van afbeeldingen in FIJI
    1. Gebruik de importfunctie voor bio-indelingen om een groep afbeeldingen uit stap 4 of een afbeeldingsbestand uit stap 5 te openen. Klik op Plugins | Bio-Formaten | Bio-Formats Importeur. Gebruik in het dialoogvenster Stapel weergeven met: Hyperstack, stel Kleurmodus: standaard in, selecteer Automatisch schalen en splits niet in afzonderlijke vensters.
      OPMERKING: Automatisch schalen optimaliseert de weergave van de gegevens op het computerscherm. Het verandert de pixelintensiteiten niet.
    2. Als afzonderlijke afbeeldingen uit stap 4 zijn geopend, klikt u op Afbeelding | Stapels | Gereedschap | Voeg ze samen om ze samen te voegen tot een stapel met één afbeelding.
    3. Als er XY-drift is tijdens de afbeeldingsreeks, klikt u op Plugins | StackReg om de afbeeldingen te registreren. Selecteer in het dialoogvenster Rigid Body of Translation.
    4. Wijzig het beeldformaat naar 32 bit door op Image | Soort | 32-bits.
    5. Splits de kleurkanalen in afzonderlijke vensters door op Afbeelding | Kleur | Gesplitste kanalen.
    6. Selecteer kanaal 1 (405 nm) en pas de drempel aan om de mitochondriën voor analyse te selecteren door op Afbeelding | | aanpassen Drempel. Selecteer in het dialoogvenster Standaard, Rood, Donkere achtergrond en Histogram stapelen en wacht tot de geselecteerde pixels rood worden weergegeven. Klik op Toepassen. Selecteer Achtergrondpixels instellen op NaN en Alle afbeeldingen verwerken.
      OPMERKING: Om mogelijke vooringenomenheid van de waarnemer te voorkomen, moet geautomatiseerde drempelbepaling worden gebruikt. FIJI biedt verschillende geautomatiseerde methoden (zoals Default, Huang, Intermodes, Otsu) die kunnen worden geselecteerd in een vervolgkeuzemenu in het drempeldialoogvenster. Meestal geeft de standaardmethode een goed resultaat. Het wordt aanbevolen om tijdens de eerste analyse verschillende methoden te vergelijken om de beste drempelmethode voor de gegeven set afbeeldingen te vinden. Zodra een methode is gekozen, moet deze op alle afbeeldingen worden toegepast.
    7. Herhaal stap 6.1.6 voor kanaal 2 (488 nm).
    8. Maak een verhoudingsafbeelding om de verhouding van 405:488 nm te visualiseren door op proces- | Beeldcalculator. Selecteer in het dialoogvenster Afbeelding 1: kanaal 1, Bewerking: Verdelen, Afbeelding 2: kanaal 2, Nieuw venster maken, Alle afbeeldingen verwerken.
    9. Wijzig de opzoektabel van de verhoudingsafbeelding in pseudokleur. Als u bijvoorbeeld wilt overschakelen naar Fire, klikt u op Afbeelding | | opzoektabellen Vuur.
  2. Beeldanalyse
    1. Teken op de verhoudingsafbeelding ROI's rond individuele cellen of mitochondriën. Nadat u elke ROI hebt getekend, voegt u deze toe aan de ROI Manager. | analyseren Gereedschap | ROI Manager | Toevoegen. (sneltoets: 'T') Selecteer Alles weergeven.
      OPMERKING: Omdat achtergrondpixels in stap 6.1.6 en 6.1.7 zijn ingesteld op 'geen getal' (NaN), hebben ze geen invloed op het resultaat van de meting. Daarom is het acceptabel om enkele achtergrondpixels in de ROI op te nemen.
    2. Meet de 405:488-verhoudingen van afzonderlijke cellen door op ROI Manager | ctrl+A te klikken om alle ROI's te selecteren | Meer | Multi Meten. Selecteer in het dialoogvenster Alle segmenten meten en Eén rij per segment.
    3. Exporteer de metingen naar spreadsheetsoftware.
    4. Selecteer de afbeelding van 405 nm. Meet de intensiteiten van alle ROIs zoals in stap 6.2.2. met behulp van de ROI's die zijn opgeslagen in de ROI-manager.
    5. Exporteer de metingen naar spreadsheetsoftware.
    6. Selecteer de afbeelding van 488 nm. Meet de intensiteiten van alle ROIs zoals in stap 6.2.2. met behulp van de ROI's die zijn opgeslagen in de ROI-manager.
    7. Exporteer de metingen naar spreadsheetsoftware.
    8. Sla ROI's op voor toekomstig gebruik door te klikken op ROI Manager | ctrl+A om alle ROI's te selecteren | Meer | Opslaan.
    9. Aanbevolen: Genereer intensiteit versus tijdplots van de sporen van 405 en 488 nm. Controleer of er geen duidelijke bleeking is in een van de kanalen (de signaalintensiteit aan het einde van de beeldvormingsreeks moet worden ≥98% van het eerste beeld) en of de twee sporen tijdens sensorreacties in tegengestelde richting bewegen (het spoor van 405 nm zou bijvoorbeeld moeten toenemen tijdens oxidatie terwijl het 488 nm-spoor zou moeten afnemen).
  3. Gegevensnormalisatie
    1. Bepaal voor elke ROI van de verhoudingsafbeelding de maximale waarde tijdens DA-behandeling (Rmax) en de minimale waarde tijdens DTT-behandeling (Rmin).
    2. Bereken de genormaliseerde verhouding als volgt:
      Equation 1
      OPMERKING: Hiermee wordt de maximale verhouding ingesteld op 1,0 en de minimale verhouding op 0.
  4. Analyse van mitochondriale morfologie
    1. Om metingen van mitochondriale morfologie parallel aan roGFP-intensiteiten in stap 6.2.6 te verkrijgen, gaat u naar | analyseren Stel metingen in en controleer Vormbeschrijvingen en Fit-ellips.
      OPMERKING: Naast de gemiddelde intensiteit omvatten de metingen in het resultatenvenster de lengte van de hoofdas (Major), de lengte van de secundaire as (Minor), de beeldverhouding (AR; hoofdas gedeeld door kleine as; ronde mitochondriën hebben een AR ~ 1, langwerpige mitochondriën hebben een grotere AR), evenals metingen van circulariteit (Circ.) en rondheid (Rond).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kwantificering van verschillen in steady-state mitochondriale redoxtoestand na terugtrekking van de groeifactor
Om de kwantificering van steady-state verschillen in mitochondriale redoxtoestand aan te tonen, werden primaire neuronen gekweekt in standaardmedium vergeleken met neuronen gekweekt zonder groeifactoren gedurende 48 uur vóór beeldvorming. Onttrekking van groeifactoren resulteert in apoptotische neuronale celdood na 72 h16. Cellen werden na 48 uur in beeld gebracht om te testen of dit wordt voorafgegaan door veranderingen in mitochondriale redoxtoestand. Primaire corticale neuronen van ratten gekweekt op poly-L-ornithine-gecoate coverslips werden geïnfecteerd met rAAV-mito-Grx1-roGFP2 op dagen in vitro 6 (DIV6) en werden afgebeeld op DIV12. Live beeldvorming werd uitgevoerd bij kamertemperatuur volgens sectie 4 van dit protocol op een omgekeerde laserscanning confocale microscoop uitgerust met een 40x / 1.10 waterdompelingsobjectief. Confocale instellingen waren pinhole 7 luchtige eenheden, pixelgrootte 568,7 nm (512 x 512 pixels), scansnelheid 600 Hz, laservermogen 405 nm 3%, laservermogen 488 nm 1%, emissiebandbreedte 505-550 nm en framegemiddelde 4. Er was geen groot verschil tussen de ruwe 405:488 nm verhoudingen van de twee condities (figuur 3B). Na gegevensnormalisatie was een subset van cellen met een verhoogde 405:488 nm-verhouding detecteerbaar in de groeifactorontwenningsgroep (figuur 3C). Dit geeft aan dat mitochondriale redoxveranderingen vooraf kunnen gaan aan neuronale celdood, en het onderstreept de relevantie van max / min datanormalisatie voor de vergelijking van basale redoxtoestanden tussen groepen.

Dynamische veranderingen in mitochondriale redoxtoestand bij behandeling van neuronen met NMDA
De NMDA-type glutamaatreceptor (NMDAR) speelt een centrale rol in neuronale plasticiteit, maar kan ook neuronale schade en celdood bemiddelen. Pathologische activering van de NMDAR leidt tot verschillende nadelige effecten op mitochondriën, waaronder matrixcalciumoverbelasting, mitochondriale oxidatie en fragmentatie en mitochondriale permeabiliteitsovergang. In een eerdere studie werd het hierboven beschreven protocol gebruikt om een oorzakelijk verband te onderzoeken tussen NMDA-geïnduceerde mitochondriale calciumoverbelasting en mitochondriale oxidatie13. Primaire hippocampusneuronen van ratten gekweekt op poly-D-lysine /laminine-gecoate coverslips waren geïnfecteerd met rAAV-mito-Grx1-roGFP2 op DIV4 en afgebeeld op DIV12. Live beeldvorming werd uitgevoerd bij 37 °C op een omgekeerde draaiende schijf confocale microscoop uitgerust met een 20x/0.75 multi immersie objectief (water onderdompeling werd gebruikt) en een on-stage incubatiesysteem. Mito-Grx1-roGFP2 werd elke 20 s sequentieel geëxciteerd met behulp van de 405 nm en 488 nm laserlijnen, en emissie werd verzameld met een 527/55 nm emissiefilter voor beide excitatiegolflengten. Behandeling van neuronen met 30 μM NMDA veroorzaakte oxidatie van mitochondriën binnen enkele minuten (figuur 4A,B). Met name NMDA-geïnduceerde mitochondriale acidose veroorzaakte een significante doving van roGFP2-fluorescentie, in overeenstemming met de bekende pH-gevoeligheid8. Om te bevestigen dat deze pH-afhankelijke doving de 405:488 ratio9 niet beïnvloedde, werden mitochondriën volledig geoxideerd door DA vóór de toevoeging van NMDA in een controle-experiment. Voorbehandeling met DA sluit verdere oxidatie van mitochondriën door NMDA uit en dienovereenkomstig veranderde de 405:488-verhouding niet in dit experiment, ondanks een aanzienlijke doving van de fluorescentie-intensiteit van roGFP2 (figuur 4C).

Multiparametrische analyse van NMDA-geïnduceerde veranderingen van dendritische mitochondriën
Om de temporele sequentie van NMDA-geïnduceerde veranderingen in mitochondriale morfologie, membraanpotentiaal en redoxtoestand te beoordelen, werd parallelle beeldvorming van TMRE- en mito-Grx1-roGFP2-fluorescentie uitgevoerd bij hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Primaire corticale neuronen van ratten gekweekt op poly-L-ornithine-gecoate coverslips werden geïnfecteerd met rAAV-mito-Grx1-roGFP2 op DIV6 en afgebeeld op DIV12. Live imaging werd uitgevoerd bij kamertemperatuur op een omgekeerde confocale laserscanmicroscoop met behulp van een 63x /1.40 olie-onderdompelingsobjectief, een scansnelheid van 600 Hz, een pixelgrootte van 90,2 nm (1024 x 1024 pixels bij 2x scanzoom), een pinhole-grootte van 3 luchtige eenheden en een framegemiddelde van 2. Elke 30 s werden drie beelden in sequentiële modus opgenomen: 405 nm excitatie / 505-550 nm emissie; 488 nm excitatie/505-550 nm emissie; 552 nm excitatie/560-600 nm emissie. Behandeling van neuronen met 60 μM NMDA resulteerde in een verlies van TMRE-signaal en een toename van de 405:488 nm roGFP-verhouding, gevolgd door enige vertraagde afronding van mitochondriën (figuur 5).

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van Grx1-roGFP2-functie en roGFP2 excitatiespectra. (A) Oxidatieve stress en de werking van antioxiderende afweersystemen oxideren de cellulaire glutathionpool. Grx1 in het Grx1-roGPF2 fusie-eiwit bevordert de snelle evenwichtsbalans van de roGFP2-redoxtoestand met de redoxtoestand van de glutathionpool. De redoxstatus van de roGFP2-pool kan worden beoordeeld door de verhouding van GFP-fluorescentie-emissie bij 510 nm na excitatie bij 405 nm en 488 nm te bewaken. Gereduceerde soorten worden in blauw weergegeven; geoxideerde soorten worden in rood weergegeven. (B) Excitatiespectra van volledig gereduceerde (blauwe) en geoxideerde (rode) roGFP2. Bij oxidatie van roGFP2 neemt de fluorescentie-emissie bij 400 nm excitatie toe, terwijl de emissie bij 490 nm excitatie afneemt. Dit cijfer is aangepast ten opzichte van een eerdere publicatie13. Excitatiespectra in B werden getekend op basis van figuur 1B uit 8. Stippellijnen in B geven de golflengten aan van veelgebruikte 405 nm en 488 nm laserlijnen. Afkortingen: GSH = glutathion; GSSG = geoxideerd glutathion; Grx = glutaredoxine; roGFP = redoxgevoelige groene fluorescerende eiwitvariant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Workflow van de methode. Expressie van het excitatie-ratiometrische redox-gevoelige fluorescerende eiwit roGFP2 in neuronen kan worden bereikt door middel van verschillende methoden die transfectie, lipofectie, virale genoverdracht en transgene dieren omvatten. De sensor kan worden gebruikt om de neuronale redoxtoestand in gekweekte primaire neuronen, ex vivo weefselexplantaten en intacte dieren te bestuderen. roGFP2-beeldvorming kan worden uitgevoerd op een verscheidenheid aan microscopen, waaronder widefield fluorescerende microscopen, confocale microscopen en 2-fotonmicroscopen. Analyse van roGFP2-beeldvormingsgegevens kan worden uitgevoerd met de vrij beschikbare software ImageJ / FIJI. Afkorting: roGFP = redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitvariant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Onttrekking van groeifactoren veroorzaakt oxidatie van neuronale mitochondriën. (A) Representatieve 405:488 nm-verhoudingsbeelden van neuronen gekweekt in de aanwezigheid (+ GF) of afwezigheid (- GF) van groeifactoren gedurende 48 uur vóór beeldvorming. Kleurgecodeerde schalen vertegenwoordigen niet-genormaliseerde 405:488 nm-verhoudingen (lagere verhoudingen komen overeen met een verminderde toestand; hogere verhoudingen komen overeen met een geoxideerde toestand). Schaalstaven = 50 μm. (B) Kwantificering van de 405:488 nm-verhouding in individuele neuronen. (C) Max/min gekalibreerde 405:488 nm verhouding van individuele neuronen. Ronde symbolen vertegenwoordigen afzonderlijke cellen; balk staat voor gemiddelde. N = 40-44 cellen uit 3 coverslips van één preparaat. Afkorting: GF = groeifactor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: NMDA-geïnduceerde oxidatie van neuronale mitochondriën. (A) Representatieve 405:488 nm-verhoudingsbeelden voor en na behandeling met 30 μM NMDA en na max/min kalibratie met DA en DTT. Bij deze vergroting wordt het roGFP-signaal meestal gedetecteerd in de soma en proximale dendrieten. De kleurgecodeerde schaal vertegenwoordigt niet-genormaliseerde 405:488 nm-verhoudingen (lagere verhoudingen komen overeen met een gereduceerde toestand; hogere verhoudingen komen overeen met een geoxideerde toestand). Schaalbalken = 50 μm. (B) Kwantificering van de beeldvormingsrun weergegeven in A. NMDA induceert een snelle en aanhoudende mitochondriale oxidatie die kan worden gekalibreerd met behulp van DA en DTT. (C) NMDA-geïnduceerde mitochondriale acidose veroorzaakt een daling van GFP-fluorescentie op zowel 405 nm als 488 nm excitatie (bovenste paneel). Om het pH-gedreven effect te isoleren en te bevestigen dat de 405:488 nm-verhouding pH-ongevoelig is, werden neuronen eerst maximaal geoxideerd met BEHULP VAN DA en vervolgens uitgedaagd met NMDA in aanwezigheid van DA (onderste paneel). Onder deze omstandigheden veroorzaakt NMDA nog steeds mitochondriale acidose, maar geen verdere mitochondriale oxidatie. Dienovereenkomstig, hoewel zowel het 405 nm- als het 488 nm-spoor een pH-gedreven daling van de fluorescentie-intensiteit vertonen, blijft de verhouding van 405: 488 nm stabiel. Dit cijfer is gewijzigd van 13. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; roGFP = redoxgevoelige groene fluorescerende eiwitvariant; NMDA = N-methyl-D-aspartaat; DA = diamide; DTT = dithiothreitol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: NMDA-geïnduceerde veranderingen in membraanpotentiaal, redoxtoestand en morfologie van dendritische mitochondriën. (A) Drie hoge vergrotingsbeelden van een time-lapse-experiment, verkregen bij t = 1, 4 en 9 min, met dendritische en axonale mitochondriën. Kleuring vertegenwoordigt tmre-intensiteit (zie kalibratiebalk). (B) 405:488 nm roGFP-verhoudingsbeelden van hetzelfde time-lapse-experiment als in (A) bij t = 1, 4 en 9 min. Merk op dat vanwege de beperkte AAV-infectie-efficiëntie slechts een subset van neuronen mito-Grx1-roGFP2 tot expressie brengt, en daarom zijn niet alle TMRE-positieve mitochondriën roGFP-positief. De kleurgecodeerde kalibratiebalk vertegenwoordigt niet-genormaliseerde 405:488 nm-verhoudingen (lagere verhoudingen komen overeen met een verminderde toestand; hogere verhoudingen komen overeen met een geoxideerde toestand). (C) Kwantificering van tmre-intensiteit, roGFP 405:488 nm-verhouding en ronding van een enkel mitochondrion (aangegeven door pijlen in A, B). Na 1 minuut baseline-opname werd 60 μM NMDA aan de badoplossing toegevoegd. Schaalbalken = 5 μm. De y-as in C toont de roGFP-verhouding van 405:488 nm ten opzichte van baseline T0 (groene stippellijn), de TMRE-fluorescentie-intensiteit ten opzichte van baseline T0 (rode stippellijn) en de FIJI/ImageJ-vormdescriptor "roundness" (zwarte ononderbroken lijn). Afkortingen: GFP = roGFP = redox-sensitive green fluorescent protein variant; mito-Grx1-roGFP2 = Glutaredoxine-1 gefuseerd tot N-eindpunt van roGFP; AAV = adeno-geassocieerd virus; TMRE = tetramethylrhodamine, ethylester; NMDA = N-methyl-D-aspartaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kwantitatieve en dynamische metingen van de mitochondriale redoxtoestand leveren belangrijke informatie op over mitochondriale en cellulaire fysiologie. Er zijn verschillende fluorogene chemische sondes beschikbaar die reactieve zuurstofsoorten, "redoxstress" of "oxidatieve stress" detecteren. Deze laatste termen zijn echter niet goed gedefinieerd en missen vaak specificiteit9,17,18. In vergelijking met chemische kleurstoffen biedt Grx1-roGFP2 verschillende voordelen9,19: (i) als excitatie-ratiometrische sensor biedt het inherente normalisatie voor sensorexpressieniveau, absolute fluorescentie-intensiteit en cel- of organeldichtheid; ii) als genetisch gecodeerde sonde kan het gericht zijn op organellen of specifieke subcellulaire compartimenten zoals presynaptische terminals of postsynaptische dendritische stekels; iii) genetische expressie van de sensor voorkomt de noodzaak van kleurstofbelasting, wat in het geval van chemische kleurstoffen stressvol kan zijn voor primaire neuronen; iv) in tegenstelling tot algemene redoxgevoelige chemische kleurstoffen is Grx1-roGFP2 zeer specifiek voor het glutathion-redoxpotentiaal; v) oxidatie en reductie van de sensor omkeerbaar zijn, zodat voorbijgaande redoxveranderingen kunnen worden gemeten; vi) in tegenstelling tot chemische kleurstoffen die alleen de detectie van relatieve veranderingen mogelijk maken, kunnen Grx1-roGPF2-fluorescentieverhoudingen worden gekalibreerd om de absolute redoxpotentialen in mV9 te bepalen.

Dit protocol beschrijft dynamische metingen van het mitochondriale glutathion redoxpotentiaal in primaire neuronen. Analyse van mitochondriën in intacte cellen heeft verschillende voordelen15. Vergeleken met de studie van geïsoleerde mitochondriën, behouden mitochondriën in cellen fysiologisch relevante contacten met andere organellen (bijv. Endoplasmatisch reticulum-mitochondria contacten, mitochondria-lysosoomcontacten) en worden ze blootgesteld aan cellulaire concentraties van signaalmoleculen en metabolieten. Vergeleken met de studie van intacte dieren bieden primaire neuronen een betere toegankelijkheid voor genetische en farmacologische manipulaties en microscopie. Voor bepaalde vragen zal analyse van geïsoleerde mitochondriën echter beter geschikt zijn, omdat dit nauwkeurige controle over geleverde substraten en remmers mogelijk maakt. Met name mito-Grx1-roGFP2 kan ook worden gebruikt in geïsoleerde mitochondriën20. Om neuronale mitochondriën in intacte weefsels of dieren te bestuderen, zijn transgene vlieg- en muislijnen beschikbaar die mito-Grx1-roGFP2 in het zenuwstelsel tot expressie brengen21,22,23. Met name het excitatiespectrum van roGFP2 is vatbaar voor excitatie met twee fotonen, waardoor ex vivo en in vivo beeldvorming van twee fotonen in weefselexplantaten en intacte dieren mogelijk is, respectievelijk23,24. Spectrale varianten van thiol redox-gevoelige fluorescerende eiwitten zijn ook beschikbaar, zoals gele rxYFP-Grx1p25 en rode Grx1-roCherry26. Deze bieden extra flexibiliteit voor multiplexing en maken in principe de gelijktijdige meting van redoxresponsen in verschillende celtypen of cellulaire compartimenten mogelijk.

Zoals beschreven in het protocol, kan de 405:488 nm-verhouding worden gekalibreerd door maximale en minimale fluorescentieverhoudingen te meten na de toepassing van respectievelijk DA en DTT. Deze normalisatie is niet essentieel omdat de sensor een zekere mate van inherente normalisatie biedt vanwege zijn ratiometrische aard. We raden echter aan om max/min kalibratie uit te voeren na elke beeldvormingsrun, meestal om twee redenen. Ten eerste zorgt het ervoor dat sensorreacties niet verzadigd waren tijdens het experiment. Ten tweede is de absolute 405:488 nm-verhouding een willekeurig getal dat afhankelijk is van de microscoopinstellingen van beide kanalen. Zelfs bij het behouden van dezelfde instellingen, kan men er niet zeker van zijn dat het laservermogen en de detectorprestaties hetzelfde blijven tussen experimenten, vooral wanneer deze enkele weken uit elkaar liggen. Een tijdelijke oplossing zou zijn om de gemiddelde basislijnverhouding van controlecellen in te stellen op 1,0 binnen elk experiment. Dit maakt relatieve kwantificering van door de behandeling geïnduceerde redoxverstoringen in een bepaald experiment mogelijk, maar beperkt de vergelijkbaarheid van verschillende experimenten. Vooral bij het vergelijken van de basale redoxtoestand van cellen uit verschillende experimenten of celtypen, is het belangrijk om max/min gekalibreerde absolute kwantificering te verkrijgen. Af en toe daalt de 405:488 nm-verhouding niet onder de uitgangswaarde na DTT-behandeling, vooral als de mitochondriën zich al in een relatief verminderde toestand bevonden bij baseline. Dit is meestal een teken van sensorbleking tijdens langdurige time-lapse-experimenten. Herhaal in dit geval het experiment met microscoopinstellingen die minder blootstelling aan licht veroorzaken.

Het is van het grootste belang om microscoopinstellingen te gebruiken die geen bleken van de sensor of door fototoxiciteit geïnduceerde oxidatie van mitochondriën veroorzaken. Zorg ervoor dat u voldoende tijd neemt voor protocoloptimalisatie voordat u met daadwerkelijke experimenten begint. Zodra acceptabele instellingen zijn gedefinieerd, kunnen ze met minimale aanpassingen in volgende experimenten worden gebruikt. mito-Grx1-roGFP2 beeldvorming kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur of 35-37 °C op een verwarmd podium. De sensor werkt in beide gevallen; de kinetiek van signaalcascades en enzymreacties in de cellen zal echter van nature verschillen op basis van temperatuur. Daarom kunnen kinetiek en amplitudes van sensorresponsen variëren afhankelijk van de gekozen temperatuur. De keuze van de temperatuur is aan de gebruiker, afhankelijk van de specifieke behoeften van het experiment.

Tot slot willen we wijzen op twee beperkingen van de sensor. Ten eerste is de intensiteit van het uitgezonden licht aanzienlijk lager bij excitatie bij 405 nm dan bij excitatie bij 488 nm, wat vaak resulteert in nogal luidruchtige beelden van 405 nm. Een hoger laservermogen is nodig om het signaal naar ruis in het 405 nm-kanaal te verbeteren. Excitatie bij 405 nm is echter doorgaans fototoxischer en genereert meer autofluorescentie dan excitatie bij 488 nm, waardoor de toegestane laserintensiteit van 405 nm wordt beperkt. In deze studie verhinderde bijvoorbeeld zwakke roGFP-fluorescentie in combinatie met aanzienlijke 405 nm-geëxciteerde weefselautofluorescentie de verwerving van robuuste gegevens van mito-Grx1-roGFP2-tot expressie brengende ganglioncellen in levende retina flatmounts (Depp en Bas-Orth, ongepubliceerde observatie). Ten tweede, hoewel de verhouding van 405:488 nm ongevoelig is voor pH-veranderingen binnen een fysiologisch bereik rond pH 5,5 tot pH 8,5 (figuur 4)9, kan pH-afhankelijke doving van roGFP2-emissie ertoe leiden dat het typisch zwakke 405 nm-signaal onder de detectiegrens van de microscoop zakt, waardoor het verkrijgen van kwantificeerbare verhoudingsbeelden wordt voorkomen. Dit was bijvoorbeeld het geval tijdens NMDA-geïnduceerde acidose in het neuronale cytosol13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; VOOR 2289: BA 3679/4-2). A.K. wordt ondersteund door een ERASMUS+ beurs. We bedanken Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner en Andrea Schlicksupp voor de voorbereiding van primaire neuronen. Wij danken Dr. Tobias Dick voor het leveren van pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. De experimenten in figuur 4 werden uitgevoerd in het Nikon Imaging Center van de Universiteit van Heidelberg. Figuur 2 is opgesteld met BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
reagents
Calcium chloride (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306
Diamide (DA) Sigma-Aldrich D3648
Dithiothreitol (DTT) Carl Roth GmbH 6908.1
Glucose (2.5 M stock solution) Sigma-Aldrich G8769
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Glycine neoFroxx GmbH LC-4522.2
HEPES (1 M stock solution) Sigma-Aldrich 15630-080
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich 442611-M
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Sigma-Aldrich M3262
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Sodium chloride (NaCl) neoFroxx GmbH LC-5932.1
Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) Sigma-Aldrich S8636
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P8574
Sucrose Carl Roth GmbH 4621.1
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) Sigma-Aldrich 87917
equipment
imaging chamber Life Imaging Services (Basel, Switzerland) 10920 Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips
laser scanning confocal microscope, microscope Leica DMI6000
laser scanning confocal microscope, scanning unit Leica SP8
peristaltic pump VWR PP1080 181-4001
spinning disc confocal microscope, camera Hamamatsu C9100-02 EMCCD
spinning disc confocal microscope, incubationsystem TokaiHit INU-ZILCF-F1
spinning disc confocal microscope, microscope Nikon Ti microscope
spinning disc confocal microscope, scanning unit Yokagawa CSU-X1
software
FIJI https://fiji.sc
StackReg plugin https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java
TurboReg plugin https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
  2. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, Pt 2 335-344 (2003).
  3. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  4. Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
  5. Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
  6. Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
  7. Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  8. Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  9. Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
  10. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
  11. Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
  12. Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
  13. Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
  14. Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).
  17. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  18. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  19. Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
  20. Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
  21. Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
  22. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
  23. Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
  24. Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
  25. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
  26. Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071 (2019).

Tags

Neurowetenschappen Grx1-roGFP2 confocale microscopie oxidatieve stress hippocampale neuronen excitotoxiciteit mitochondriaal membraanpotentiaal
Live imaging van de mitochondriale glutathion redoxtoestand in primaire neuronen met behulp van een ratiometrische indicator
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katsalifis, A., Casaril, A. M.,… More

Katsalifis, A., Casaril, A. M., Depp, C., Bas-Orth, C. Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator. J. Vis. Exp. (176), e63073, doi:10.3791/63073 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter