Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

एक Ratiometric संकेतक का उपयोग कर प्राथमिक न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल ग्लूटाथियोन रेडॉक्स राज्य की लाइव इमेजिंग

Published: October 20, 2021 doi: 10.3791/63073
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Medical Cell Biology, Institute for Anatomy and Cell Biology, Heidelberg University, 2Department of Neurogenetics, Max-Planck-Institute for Experimental Medicine

Summary

यह आलेख बेसल रेडॉक्स राज्य में अंतर को निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और कॉन्फोकल लाइव माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्राथमिक हिप्पोकैम्पल और कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में तीव्र गड़बड़ी के लिए रेडॉक्स प्रतिक्रियाएं। प्रोटोकॉल को न्यूनतम संशोधनों के साथ अन्य सेल प्रकारों और माइक्रोस्कोप पर लागू किया जा सकता है।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स होमोस्टैसिस न्यूरोनल व्यवहार्यता और कार्य के लिए महत्वपूर्ण है। यद्यपि माइटोकॉन्ड्रिया में कई रेडॉक्स सिस्टम होते हैं, अत्यधिक प्रचुर मात्रा में थिओल-डाइसल्फ़ाइड रेडॉक्स बफर ग्लूटाथियोन को एंटीऑक्सिडेंट सुरक्षा में एक केंद्रीय खिलाड़ी माना जाता है। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल ग्लूटाथियोन रेडॉक्स क्षमता को मापने से माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स स्थिति और ऑक्सीडेटिव तनाव के बारे में उपयोगी जानकारी मिलती है। Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) -ग्लूटाथियोन रेडॉक्स क्षमता का अनुपातमित संकेतक है जिसमें 400 एनएम और 490 एनएम पर दो रेडॉक्स-राज्य-संवेदनशील उत्तेजना चोटियां हैं, जिसमें 510 एनएम पर एकल उत्सर्जन शिखर के साथ 400 एनएम और 490 एनएम पर दो रेडॉक्स-राज्य-संवेदनशील उत्तेजना चोटियां हैं। यह आलेख वर्णन करता है कि प्राथमिक हिप्पोकैम्पल और कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित Grx1-roGFP2 की कॉन्फोकल लाइव माइक्रोस्कोपी कैसे करें। यह वर्णन करता है कि स्थिर-राज्य माइटोकॉन्ड्रियल ग्लूटाथियोन रेडॉक्स क्षमता का आकलन कैसे किया जाए (उदाहरण के लिए, रोग राज्यों या दीर्घकालिक उपचारों की तुलना करने के लिए) और तीव्र उपचारों पर रेडॉक्स परिवर्तनों को कैसे मापें (एक उदाहरण के रूप में एक्साइटोटॉक्सिक दवा एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट (एनएमडीए) का उपयोग करके)। इसके अलावा, लेख Grx1-roGFP2 और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित संकेतक, टेट्रामेथिलरोडामाइन, एथिल एस्टर (टीएमआरई) की सह-इमेजिंग प्रस्तुत करता है, यह प्रदर्शित करने के लिए कि कैसे Grx1-roGPF2 को मल्टीपैरामीट्रिक विश्लेषण के लिए अतिरिक्त संकेतकों के साथ मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल (i) कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप सेटिंग्स को अनुकूलित करने के तरीके का एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है, (ii) डायमाइड और डाइथिओथ्रिटोल के साथ सेंसर अंशांकन के बाद उत्तेजना के लिए दवाओं को लागू करता है, और (iii) ImageJ / FIJI के साथ डेटा का विश्लेषण करता है।

Introduction

कई महत्वपूर्ण माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइम और सिग्नलिंग अणु थिओल रेडॉक्स विनियमन 1 के अधीन हैं। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का एक प्रमुख सेलुलर स्रोत है और ऑक्सीडेटिव क्षति 2 के लिए चुनिंदा रूप से कमजोर है। तदनुसार, माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स क्षमता सीधे बायोएनर्जेटिक्स, सेल सिग्नलिंग, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और अंततः सेल व्यवहार्यता 3,4 को प्रभावित करती है। माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में रेडॉक्स होमियोस्टैसिस को बनाए रखने और एंटीऑक्सिडेंट सुरक्षा 5,6 को माउंट करने के लिए थिओल-डाइसल्फ़ाइड रेडॉक्स बफर ग्लूटाथियोन (जीएसएच) की उच्च मात्रा (1-15 एमएम) होती है। जीएसएच को उनकी रेडॉक्स स्थिति और गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए लक्ष्य प्रोटीन (एस-ग्लूटाथियोनाइलेशन) से सहसंयोजक रूप से जोड़ा जा सकता है और इसका उपयोग ऑक्सीकरण प्रोटीन को कम करने वाले डिटॉक्सिफाइंग एंजाइमों की एक श्रृंखला द्वारा किया जाता है। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल ग्लूटाथियोन रेडॉक्स क्षमता माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और पैथोफिजियोलॉजी का अध्ययन करते समय एक अत्यधिक जानकारीपूर्ण पैरामीटर है।

roGFP2 जीएफपी का एक संस्करण है जिसे दो सतह-उजागर सिस्टीन के अलावा रेडॉक्स-संवेदनशील बनाया गया है जो एक कृत्रिम डाइथिओल-डाइसल्फ़ाइड जोड़ी 7,8 बनाते हैं। इसमें ~ 510 एनएम पर एक एकल उत्सर्जन शिखर और ~ 400 एनएम और 490 एनएम पर दो उत्तेजना चोटियां हैं। महत्वपूर्ण रूप से, दो उत्तेजना चोटियों के सापेक्ष आयाम roGFP2 (चित्रा 1) के रेडॉक्स राज्य पर निर्भर करते हैं, जिससे यह प्रोटीन एक रेशियोमेट्रिक सेंसर बन जाता है। Grx1-roGFP2 सेंसर में, मानव ग्लूटारेडॉक्सिन -1 (Grx1) को roGFP29,10 के एन-टर्मिनस से जोड़ा गया है। RoGFP2 के लिए Grx1 एंजाइम का सहसंयोजक लगाव सेंसर के दो प्रमुख सुधारों को प्रदान करता है: यह GSH / GSSG ग्लूटाथियोन रेडॉक्स जोड़ी (चित्रा 1) के लिए सेंसर प्रतिक्रिया को विशिष्ट बनाता है, और यह कम से कम 100,0009 के कारक द्वारा GSSG और roGFP2 के बीच संतुलन को गति देता है। इसलिए, Grx1-roGFP2 सेलुलर ग्लूटाथियोन रेडॉक्स क्षमता के विशिष्ट और गतिशील इमेजिंग को सक्षम बनाता है।

Grx1-roGFP2 इमेजिंग माइक्रोस्कोप की एक विस्तृत श्रृंखला पर किया जा सकता है, जिसमें वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप, कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप शामिल हैं। प्राथमिक न्यूरॉन्स में सेंसर की अभिव्यक्ति विभिन्न तरीकों से प्राप्त की जा सकती है जिसमें लिपोफेक्शन 11, डीएनए / कैल्शियम-फॉस्फेट कोप्रिसिपिटेशन 12, वायरस-मध्यस्थता जीन हस्तांतरण, या सेल स्रोत के रूप में ट्रांसजेनिक जानवरों का उपयोग शामिल है (चित्रा 2)। स्यूडोटाइप्ड पुनः संयोजक एडेनो-संबद्ध वायरस (आरएएवी) जिसमें एएवी 1 और एएवी 2 कैप्सिड प्रोटीन 13,14 का 1: 1 अनुपात होता है, का उपयोग इस लेख में प्रयोगों के लिए किया गया था। इस वेक्टर के साथ, अधिकतम सेंसर अभिव्यक्ति आमतौर पर संक्रमण के 4-5 दिनों के बाद तक पहुंच जाती है और कम से कम दो सप्ताह तक स्थिर रहती है। हमने चूहों और चूहों से प्राथमिक हिप्पोकैम्पस और कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में Grx1-roGFP2 का सफलतापूर्वक उपयोग किया है।

इस लेख में, प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पस और कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रिया-लक्षित Grx1-roGFP2 की आरएएवी-मध्यस्थता अभिव्यक्ति का उपयोग बेसल माइटोकॉन्ड्रियल ग्लूटाथियोन रेडॉक्स राज्य और इसकी तीव्र गड़बड़ी का आकलन करने के लिए किया जाता है। एक प्रोटोकॉल confocal लाइव इमेजिंग के लिए विस्तृत निर्देशों के साथ प्रदान किया जाता है कि कैसे (i) लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का अनुकूलन करने के लिए, (ii) एक लाइव इमेजिंग प्रयोग चलाने के लिए, और (iii) फिजी के साथ डेटा का विश्लेषण।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु प्रयोगों ने राष्ट्रीय और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुरूप, यूरोपीय संसद के परिषद निर्देश 2010/63 / यूरोपीय संघ सहित, और पूर्ण गृह कार्यालय नैतिक अनुमोदन (हीडलबर्ग पशु कल्याण कार्यालय और Regierungspraesidium कार्ल्सरूहे विश्वविद्यालय, लाइसेंस T14/21 और T13/21) था। प्राथमिक हिप्पोकैम्पस और कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को मानक प्रक्रियाओं के अनुसार नवजात माउस या चूहे के पिल्ले से तैयार किया गया था और 12-14 दिनों के लिए बनाए रखा गया था जैसा कि पहले वर्णित किया गया था।

1. समाधान की तैयारी

  1. इमेजिंग बफ़र के लिए स्टॉक समाधान
    1. तालिका 1 के अनुसार प्रत्येक स्टॉक समाधान तैयार करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। लंबी अवधि के भंडारण (>3 महीने) के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर एलीकोट रखें।
घटक मेगावाट एकाग्रता (M) राशि (छ) वॉल्यूम (mL)
NaCl 58.44 5 14.61 50
KCl 74.55 3 1.12 5
MgCl2· 6H2O 203.3 1.9 2 5
CaCl2·2H2O 147.01 1 1.47 10
ग्लाइसिन 75.07 0.1 0.375 50
शर्करा 342.3 1.5 25.67 50
सोडियम पाइरूवेट 110.04 0.1 0.55 50
HEPES 238.3 1 11.9 50
ग्लूकोज़ 180.15 2.5 45 100

तालिका 1: इमेजिंग बफ़र के लिए स्टॉक समाधान.

  1. दवाओं और रंगों के स्टॉक समाधान
    1. 0.5 एम स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए पानी में डायमाइड (डीए; अधिकतम 405: 488 अनुपात के अंशांकन के लिए उपयोग किया जाता है) को भंग करें (उदाहरण के लिए, 11.615 मिलीलीटर पानी में 1 ग्राम)। ऐलीकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. 1 एम स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए पानी में डाइथिओथ्रिटोल (डीटीटी; न्यूनतम 405: 488 अनुपात के अंशांकन के लिए उपयोग किया जाता है) को भंग करें (उदाहरण के लिए, 32.425 मिलीलीटर पानी में 5 ग्राम)। ऐलीकोट और अधिकतम 3 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. 10 mM स्टॉक समाधान (उदाहरण के लिए, 16.991 मिलीलीटर पानी में 25 मिलीग्राम) प्राप्त करने के लिए पानी में एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टेट (एनएमडीए; एक्साइटोटॉक्सिसिटी और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीकरण को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जाता है)। -20 डिग्री सेल्सियस पर ऐलीकोट स्टोर करें। लंबी अवधि के भंडारण (>6 महीने) के लिए, एलीकोट को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    4. Tetramethylrhodamine एथिल एस्टर perchlorate (TMRE; माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का एक छोटा अणु संकेतक)
      1. 20 mM स्टॉक प्राप्त करने के लिए मेथनॉल में TMRE पाउडर को भंग करें (उदाहरण के लिए, मेथनॉल के 2.427 मिलीलीटर में 25 मिलीग्राम)।
      2. एक 20 μM स्टॉक प्राप्त करने के लिए मेथनॉल में 20 mM स्टॉक 1: 1,000 पतला।
      3. 20 mM और 20 μM स्टॉक समाधान, पैराफिल्म के साथ सील, और -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित स्टोर को एलीकोट करें।
        नोट: दोनों स्टॉक समाधान कई वर्षों के लिए स्थिर हैं। प्रयोगों के लिए 1,000x स्टॉक समाधान (20 μM) का उपयोग करें।
  2. इमेजिंग बफर
    1. एक मापने वाले सिलेंडर में बाँझ पानी के तालिका 2 से 80 मिलीलीटर तक के सभी घटकों को जोड़कर इमेजिंग बफर का 100 मिलीलीटर तैयार करें। बाँझ पानी के साथ 100 मिलीलीटर तक मात्रा लाएं। सावधानी से मापने सिलेंडर हिलाकर मिश्रण जब तक समाधान सजातीय दिखाई देता है.
      नोट:: यह बफ़र की osmolarity की जाँच करने के लिए एक osmometer का उपयोग करने के लिए अनुशंसित है। यह कोशिकाओं के विकास माध्यम के जितना संभव हो उतना करीब होना चाहिए। यहां, यह 315 mOsmol / L है इमेजिंग बफर और विकास माध्यम की osmolarity से मेल खाने के लिए आवश्यक के रूप में सुक्रोज एकाग्रता को बढ़ाएं या कम करें।
    2. पीएच को 7.4 पर समायोजित करें। ऐलीकोट बनाएं और उन्हें दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, एलीकोट को -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें। उपयोग करने से पहले इमेजिंग बफर को कमरे के तापमान तक पहुंचने दें।
घटक स्टॉक समाधान (M) अंतिम एकाग्रता (mM) वॉल्यूम (mL)
NaCl 5 114 2.3
KCl 3 5.29 0.176
MgCl2 1.9 1 0.053
CaCl2 1 2 0.2
ग्लाइसिन 0.1 0.005 0.005
शर्करा 1.5 52 3.5
सोडियम पाइरूवेट 0.1 0.5 0.5
HEPES 1 10 1
ग्लूकोज़ 2.5 5 0.2

तालिका 2: इमेजिंग बफर की संरचना। इंगित वॉल्यूम का उपयोग इमेजिंग बफर के 100 एमएल की तैयारी के लिए किया जाता है।

  1. उत्तेजना और अंशांकन के लिए समाधान
    नोट: हमेशा प्रयोग से ठीक पहले इमेजिंग बफर के लिए संकेतित दवाओं के स्टॉक समाधान जोड़कर ताजा उत्तेजना समाधान तैयार करें। उत्तेजना और अंशांकन के लिए समाधान एक प्रयोग के दौरान क्रमिक रूप से इमेजिंग कक्ष में जोड़ा जाएगा (अनुभाग 3-5 देखें)। प्रयोग के प्रकार के आधार पर, इमेजिंग कक्ष में संबंधित अंतिम मात्रा में एक ही अंत एकाग्रता तक पहुंचने के लिए विभिन्न समाधानों की आवश्यकता होती है।
    1. इमेजिंग बफर के 6.937 मिलीलीटर में 10 mM NMDA स्टॉक के 63 μL को जोड़कर 3x NMDA समाधान (90 μM; कक्ष में अंतिम एकाग्रता: 30 μM) तैयार करें। कक्ष (अंतिम मात्रा: 1.5 मिलीलीटर) के लिए परिणामी समाधान के 500 μL जोड़ें।
    2. चरण 3 और 4 के लिए 2x DA समाधान तैयार करें (1 mM; कक्ष में अंतिम एकाग्रता: 0.5 mM) इमेजिंग बफर के 6.986 mL करने के लिए एक 0.5 M DA स्टॉक के 14 μL जोड़कर। कक्ष में 1 मिलीलीटर जोड़ें (अंतिम मात्रा: 2 एमएल)।
    3. चरण 5 (2 mM; कक्ष में अंतिम एकाग्रता: 0.5 mM) के लिए 4x DA समाधान तैयार करें इमेजिंग बफर के 6.972 mL में 0.5 M DA स्टॉक के 28 μL जोड़कर। कक्ष में 500 μL जोड़ें (अंतिम मात्रा: 2 mL).
    4. इमेजिंग बफर के 8955 μL में 1 M DTT स्टॉक के 45 μL जोड़कर 1x DTT समाधान (5 mM; कक्ष में अंतिम एकाग्रता: 5 mM) तैयार करें। इमेजिंग बफ़र (अंतिम मात्रा: 1 मिलीलीटर) aspirating के बाद कक्ष के लिए इस समाधान के 1 mL जोड़ें।

2. TMRE के साथ कोशिकाओं की लोडिंग

नोट:: इस प्रोटोकॉल में, TMRE 20 nM की अंतिम एकाग्रता पर गैर-बुझाने mode15 में उपयोग किया जाता है। सामान्य तौर पर, टीएमआरई की सबसे कम संभव एकाग्रता जो अभी भी पसंद के माइक्रोस्कोप पर पर्याप्त संकेत तीव्रता प्रदान करती है, का उपयोग किया जाना चाहिए। असमान वाष्पीकरण के कारण, विभिन्न कुओं में माध्यम की मात्रा दीर्घकालिक प्राथमिक संस्कृतियों में भिन्न हो सकती है। सभी कुओं में एक सुसंगत TMRE एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए, सीधे कुओं में TMRE न जोड़ें। इसके बजाय, प्रत्येक कुएं में माध्यम को टीएमआरई युक्त माध्यम की समान मात्रा के साथ बदलें। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल को 24-अच्छी तरह से प्लेटों में प्राथमिक न्यूरॉन्स के लिए डिज़ाइन किया गया है जिसमें ~ 1 एमएल प्रति अच्छी तरह से माध्यम होता है।

  1. एक ऊतक संस्कृति लैमिनर प्रवाह हुड में काम करते हुए, प्रत्येक कुएं से एक एकल शंक्वाकार ट्यूब में माध्यम के 500 μL एकत्र करें।
  2. प्रति अच्छी तरह से, शंक्वाकार ट्यूब में 20 μM TMRE स्टॉक के 0.5 μL जोड़ें (उदाहरण के लिए, 24 कुओं के लिए 12 μL)।
  3. पहले कुएं से शेष माध्यम को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें और इसे TMRE-युक्त माध्यम के 500 μL के साथ बदलें। जारी रखें, अच्छी तरह से अच्छी तरह से, शेष कुओं के साथ।
    नोट: ध्यान रखें कि कोशिकाओं को सूखने न दें और कोशिकाओं को परेशान न करें।
  4. इनक्यूबेटर को कोशिकाओं को वापस करें और डाई संतुलन के लिए कम से कम 60 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    नोट: लोड िंग समय प्रतिकूल प्रभाव के बिना कई घंटे तक बढ़ाया जा सकता है।
  5. इमेजिंग प्रयोग के दौरान सुसंगत TMRE सांद्रता और संतुलन सुनिश्चित करने के लिए, इमेजिंग बफर और सभी उत्तेजना समाधानों में 20 nM TMRE की अंतिम एकाग्रता को शामिल करना सुनिश्चित करें।

3. स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का अनुकूलन

नोट:: इस चरण का उद्देश्य लाइव इमेजिंग के दौरान छवि की गुणवत्ता और सेल व्यवहार्यता के बीच सबसे अच्छा समझौता ढूँढना है। यह अनुभाग roGFP इमेजिंग के लिए सेटिंग्स के अनुकूलन का वर्णन करता है। यदि मल्टीपैरामीट्रिक इमेजिंग की जाती है, तो इसी तरह के अनुकूलन, जिसमें ब्लीचिंग या फोटोटॉक्सिसिटी के संकेतों के बिना एक स्थिर बेसलाइन की जांच शामिल है, को अतिरिक्त संकेतकों के लिए प्रदर्शन करने की आवश्यकता है।

  1. जीएफपी इमेजिंग (488 एनएम उत्तेजना, 505 - 550 एनएम उत्सर्जन) के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और लोड मानक सेटिंग्स शुरू करें।
  2. डिटेक्टर को 12 बिट्स या 16 बिट्स पर सेट करें।
    नोट: आमतौर पर, 8 बिट्स मात्रात्मक इमेजिंग के लिए पर्याप्त नहीं हैं।
  3. अनुक्रमिक स्कैन मोड को सक्रिय करें और दूसरा अनुक्रम / ट्रैक (405 एनएम उत्तेजना, 505 - 550 एनएम उत्सर्जन) जोड़ें।
  4. दोनों चैनलों के लिए, एक छद्म रंग लुकअप तालिका का चयन करें जो ओवर- और अंडर-एक्सपोज़्ड पिक्सेल (जैसे, ग्लो ओयू) को इंगित करता है।
  5. किसी ऐसे उद्देश्य का चयन करें जो ब्याज की वस्तु के लिए उपयुक्त हो.
    नोट: 10x-40x एकल-सेल विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं, 63x-100x एकल-माइटोकॉन्ड्रियन विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं।
  6. इमेजिंग चैंबर में कोशिकाओं के साथ एक कवरस्लिप माउंट करें, इमेजिंग बफर के 1 एमएल जोड़ें, और कक्ष को माइक्रोस्कोप पर रखें।
  7. कोशिकाओं को केंद्रित करने के लिए आईपीस और संचारित प्रकाश का उपयोग करें।
    नोट:: कक्षों का पता लगाने और फ़ोकस करने के लिए epifluorescence प्रकाश का उपयोग न करें। यहां तक कि कम शक्ति पर, यह कोशिकाओं को प्रतिकूल रूप से प्रभावित करेगा।
  8. विभिन्न पिक्सेल स्वरूपों के साथ छवियों को रिकॉर्ड करें. इन छवियों के आधार पर, सबसे कम पिक्सेल संख्या का चयन करें जो ब्याज की संरचना का स्वीकार्य रिज़ॉल्यूशन देता है।
    नोट: आमतौर पर, 512 x 512 पिक्सेल 20x और 40x उद्देश्यों के साथ एकल-सेल इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, और 1024 x 1024 या 2048 x2048 पिक्सेल आमतौर पर 63x उद्देश्य के साथ एकल-माइटोकॉन्ड्रियन इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं।
  9. विभिन्न pinhole आकार के साथ रिकॉर्ड छवियों. इन छवियों के आधार पर, सबसे बड़े पिनहोल आकार का चयन करें जो ब्याज की संरचना का स्वीकार्य संकल्प देता है।
    नोट: आमतौर पर, 3-7 हवादार इकाइयां अच्छी तरह से काम करती हैं।
  10. विभिन्न लेजर तीव्रता के साथ रिकॉर्ड छवियों.
    1. तदनुसार डिटेक्टर लाभ और दहलीज को समायोजित करें। इन छवियों के आधार पर, सबसे कम लेजर तीव्रता का चयन करें जो स्वीकार्य संकेत तीव्रता और सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात देता है।
      1. सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात निर्धारित करने के लिए, ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) में सिग्नल तीव्रता को मापें जिसमें कोशिकाएं या माइटोकॉन्ड्रिया (आरओआई 1) और कोशिकाओं या माइटोकॉन्ड्रिया (आरओआई 2) के बिना आरओआई में कोशिकाएं या माइटोकॉन्ड्रिया (आरओआई 2) शामिल हैं। फिर, ROI2 की तीव्रता से ROI1 की तीव्रता को विभाजित करें।
        नोट: >3 के सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात और 1-3% लेजर शक्ति के साथ 405 एनएम उत्तेजना के लिए 200-1,000 के व्यक्तिगत आरओआई की सिग्नल तीव्रता और 1% लेजर शक्ति के साथ 488 एनएम उत्तेजना के लिए 300-1,500 के व्यक्तिगत आरओआई की तीव्रता के लिए लक्ष्य रखें।
  11. विभिन्न स्कैन गति और फ्रेम औसत की संख्या के साथ रिकॉर्ड छवियों. सेटिंग्स के प्रत्येक संयोजन के लिए 4-5 छवियों को रिकॉर्ड करें। इन छवि श्रृंखलाओं के आधार पर, उच्चतम गति और सबसे कम औसत सेटिंग्स का चयन करें जो स्वीकार्य छवि शोर और छवि-से-छवि परिवर्तनशीलता देते हैं।
    नोट: औसत के लिए 600 हर्ट्ज और 1-2 फ्रेम की स्कैन गति ज्यादातर मामलों में अच्छी तरह से काम करती है।
  12. एक नए coverslip का उपयोग कर, अनुकूलित सेटिंग्स के साथ एक समय-चूक श्रृंखला रिकॉर्ड करें।
    नोट:: अवधि और श्रृंखला की छवि अंतराल नियोजित प्रयोगों के उन लोगों के समान होना चाहिए।
  13. समय-अंतराल श्रृंखला के अंत में, रिकॉर्डिंग कक्ष में 2x DA समाधान के 1 mL जोड़ें। अतिरिक्त 2 मिनट के लिए छवि.
  14. एक peristaltic पंप या handheld पिपेट का उपयोग कर इमेजिंग बफर aspirate. 1x DTT समाधान के 1 mL जोड़ें। अतिरिक्त 5 मिनट के लिए छवि.
  15. समय-अंतराल प्रयोग का विश्लेषण करें (अनुभाग 5 देखें)।
    1. सत्यापित करें कि दो चैनलों में से कोई भी अनुकूलित सेटिंग्स के साथ डीए- और डीटीटी-उपचार के दौरान ओवर-या अंडर-एक्सपोज़ नहीं हो जाता है।
    2. सुनिश्चित करें कि दो चैनलों में से कोई भी समय-अंतराल रिकॉर्डिंग के दौरान काफी ब्लीचिंग नहीं दिखाता है; पहली और अंतिम छवियों के बीच तीव्रता के <2% नुकसान के लिए लक्ष्य।
    3. सत्यापित करें कि 405:488 अनुपात इमेजिंग के दौरान काफी परिवर्तित नहीं होता है।
  16. कई coverslips का उपयोग करके एक पुनरावर्ती तरीके से पूरी प्रक्रिया को दोहराएं, जब तक कि लगातार स्वीकार्य परिणाम प्रदान करने वाली सेटिंग्स को परिभाषित नहीं किया गया है।

4. बेसल रेडॉक्स स्थिति का आकलन

  1. माइक्रोस्कोप प्रारंभ करें और अनुभाग 3 से अनुकूलित सेटिंग्स लोड करें।
  2. फ़्रेम औसत को 3-5 पर सेट करें.
  3. इमेजिंग चैंबर में कोशिकाओं के साथ एक कवरस्लिप माउंट करें, इमेजिंग बफर के 1 एमएल जोड़ें, और कक्ष को माइक्रोस्कोप पर रखें।
  4. कोशिकाओं को केंद्रित करने के लिए आईपीस और संचारित प्रकाश का उपयोग करें।
    नोट:: कक्षों का पता लगाने और फ़ोकस करने के लिए epifluorescence प्रकाश का उपयोग न करें। यहां तक कि कम शक्ति पर, यह कोशिकाओं को प्रतिकूल रूप से प्रभावित करेगा।
  5. स्कैनिंग मोड पर स्विच करें और इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को फ़ोकस करने और उनका पता लगाने के लिए लाइव दृश्य में 488 एनएम चैनल का उपयोग करें।
  6. कवरस्लिप पर दृश्य के 3-5 फ़ील्ड का चयन करने के लिए मल्टीपॉइंट फ़ंक्शन का उपयोग करें.
  7. कोई आधार रेखा छवि रिकॉर्ड करें.
  8. कक्ष में 2x DA समाधान के 1 mL जोड़ें।
  9. 1, 2, और 3 मिनट के बाद, फ़ोकस की पुष्टि करने/समायोजित करने के लिए लाइव दृश्य का उपयोग करें और फिर एक छवि रिकॉर्ड करें।
    नोट: कोशिकाओं को आमतौर पर 2 मिनट के बाद पूरी तरह से ऑक्सीकरण किया जाता है।
  10. इमेजिंग कक्ष में बफ़र को 1x DTT समाधान के 1 mL के साथ बदलें।
  11. 3 और 5 मिनट के बाद, फ़ोकस की पुष्टि/समायोजित करने के लिए लाइव दृश्य का उपयोग करें और फिर एक छवि रिकॉर्ड करें।
    नोट: कोशिकाओं को आमतौर पर 4-5 मिनट के बाद पूरी तरह से कम कर दिया जाता है।

5. तीव्र उपचार के लाइव इमेजिंग

नोट: नीचे दिया गया प्रोटोकॉल NMDA उपचार के लिए माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स प्रतिक्रिया की इमेजिंग का वर्णन करता है। छवि अंतराल और प्रयोग की अवधि को अन्य उपचारों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

  1. माइक्रोस्कोप प्रारंभ करें और अनुभाग 3 से अनुकूलित सेटिंग्स लोड करें।
  2. टाइम-लैप्स अंतराल को 30 सेकंड और अवधि को 25 मिनट पर सेट करें।
  3. इमेजिंग चैंबर में कोशिकाओं के साथ एक कवरस्लिप माउंट करें, इमेजिंग बफर के 1 एमएल जोड़ें, और कक्ष को माइक्रोस्कोप पर रखें।
    नोट: थर्मल फोकस बहाव से बचने के लिए, समय-अंतराल इमेजिंग शुरू करने से पहले कोशिकाओं को 10-15 मिनट के लिए माइक्रोस्कोप चरण पर छोड़ दें।
  4. कोशिकाओं को केंद्रित करने के लिए आईपीस और संचारित प्रकाश का उपयोग करें।
    नोट:: कक्षों का पता लगाने और फ़ोकस करने के लिए epifluorescence प्रकाश का उपयोग न करें। यहां तक कि कम शक्ति पर, यह कोशिकाओं को प्रतिकूल रूप से प्रभावित करेगा।
  5. स्कैनिंग मोड पर स्विच करें और इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को फ़ोकस करने और उनका पता लगाने के लिए लाइव दृश्य में 488 एनएम चैनल का उपयोग करें।
  6. वैकल्पिक: प्रति रन रिकॉर्ड किए गए कक्षों की संख्या बढ़ाने के लिए, प्रति कवरस्लिप दृश्य के 2-3 फ़ील्ड की छवि के लिए मल्टीपॉइंट फ़ंक्शन का उपयोग करें.
  7. समय-चूक अधिग्रहण शुरू करें और 5 छवियों को 2 मिनट बेसलाइन रिकॉर्डिंग के रूप में रिकॉर्ड करें।
  8. कक्ष (अंतिम एकाग्रता 30 μM) के लिए 3x NMDA समाधान के 500 μL जोड़ें और एक 10 मिनट NMDA प्रतिक्रिया के रूप में अतिरिक्त 20 छवियों को रिकॉर्ड करें।
    नोट: न्यूरॉन्स osmolarity में परिवर्तन के लिए बहुत संवेदनशील हैं। इसलिए, इमेजिंग बफर के वाष्पीकरण को कम करना सुनिश्चित करें। लंबे समय तक उपचार के लिए, इमेजिंग चैंबर को ढक्कन के साथ कवर किया जाना चाहिए।
  9. कक्ष में 4x DA समाधान के 500 μL जोड़ें और 6 और छवियों (3 मिनट अधिकतम अंशांकन) रिकॉर्ड करें।
  10. इमेजिंग कक्ष से बफर aspirate और इसे 1x DTT समाधान के 1 mL के साथ प्रतिस्थापित करें। रिकॉर्ड 10 और छवियों (5 मिनट न्यूनतम अंशांकन).
  11. रिकॉर्डिंग समाप्त करें और छवि श्रृंखला को सहेजें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. FIJI में डेटा आयात और छवि preprocessing
    1. चरण 4 से छवियों का एक समूह या चरण 5 से एक छवि फ़ाइल खोलने के लिए जैव-स्वरूप आयातक का उपयोग करें। Plugins | पर क्लिक करें जैव-प्रारूप | जैव स्वरूपों आयातक. संवाद बॉक्स में, इसके साथ स्टैक देखें का उपयोग करें: हाइपरस्टैक, सेट रंग मोड: डिफ़ॉल्ट, ऑटोस्केल का चयन करें, और अलग-अलग विंडो में विभाजित न हों.
      नोट:: Autoscale कंप्यूटर स्क्रीन पर डेटा के प्रदर्शन को ऑप्टिमाइज़ करता है। यह पिक्सेल तीव्रता को नहीं बदलता है।
    2. यदि चरण 4 से अलग-अलग छवियों को खोला गया था, तो छवि | पर क्लिक करें स्टैक्स | उपकरण | उन्हें एक एकल-छवि स्टैक में विलय करने के लिए concatenate।
    3. यदि छवि श्रृंखला के दौरान XY-बहाव है, तो प्लगइन्स | पर क्लिक करें StackReg छवियों को पंजीकृत करने के लिए। संवाद बॉक्स में, कठोर मुख्य भाग या अनुवाद का चयन करें.
    4. छवि | पर क्लिक करके छवि स्वरूप को 32 बिट में बदलें टाइप | 32-बिट.
    5. छवि | पर क्लिक करके रंग चैनलों को अलग-अलग खिड़कियों में विभाजित करें रंग | चैनलों को विभाजित करें.
    6. चैनल 1 (405 एनएम) का चयन करें और छवि | पर क्लिक करके विश्लेषण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया का चयन करने के लिए थ्रेशोल्ड को समायोजित करें | समायोजित करें दहलीज। संवाद बॉक्स में, डिफ़ॉल्ट, लाल, गहरा पृष्ठभूमि और स्टैक हिस्टोग्राम का चयन करें और चयनित पिक्सेल के लाल दिखाई देने की प्रतीक्षा करें. लागू करेंक्लिक करें। NaN करने के लिए पृष्ठभूमि पिक्सेल सेट करें का चयन करें और सभी छवियों को संसाधित करें।
      नोट:: संभावित पर्यवेक्षक पूर्वाग्रह से बचने के लिए, स्वचालित थ्रेशोल्ड निर्धारण का उपयोग किया जाना चाहिए। FIJI कई स्वचालित तरीके (जैसे डिफ़ॉल्ट, हुआंग, Intermodes, Otsu) प्रदान करता है जिसे थ्रेशोल्ड संवाद बॉक्स में एक ड्रॉपडाउन मेनू से चुना जा सकता है। आमतौर पर, डिफ़ॉल्ट विधि एक अच्छा परिणाम देता है। छवियों के दिए गए सेट के लिए सबसे अच्छी थ्रेशोल्डिंग विधि खोजने के लिए पहले विश्लेषण के दौरान कई तरीकों की तुलना करने की सिफारिश की जाती है। एक बार एक विधि चुने जाने के बाद, इसे सभी छवियों पर लागू करने की आवश्यकता होती है।
    7. चैनल 2 (488 nm) के लिए चरण 6.1.6 दोहराएँ।
    8. प्रक्रिया | पर क्लिक करके 405:488 nm अनुपात विज़ुअलाइज़ करने के लिए एक अनुपात छवि बनाएँ छवि कैलकुलेटर. संवाद बॉक्स में, छवि 1: चैनल 1, कार्रवाई: विभाजित करें, छवि 2: चैनल 2, नई विंडो बनाएँ, सभी छवियों को संसाधित करें का चयन करें।
    9. स्यूडोकलर के लिए अनुपात छवि की लुकअप तालिका परिवर्तित करें. उदाहरण के लिए, फायर में बदलने के लिए, छवि | पर क्लिक करें लुकअप तालिकाएँ | आग।
  2. छवि विश्लेषण
    1. अनुपात छवि पर, व्यक्तिगत कोशिकाओं या माइटोकॉन्ड्रिया के आसपास आरओआई आकर्षित करें। प्रत्येक ROI ड्राइंग के बाद, इसे ROI प्रबंधक में जोड़ें। | का विश्लेषण करें उपकरण | ROI प्रबंधक | जोड़ें. (कुंजीपटल शॉर्टकट: 'टी') सभी दिखाएँ का चयन करें.
      नोट:: पृष्ठभूमि पिक्सेल चरण 6.1.6 और 6.1.7 में 'कोई संख्या नहीं' (NaN) करने के लिए सेट किया गया है, क्योंकि वे माप के परिणाम को प्रभावित नहीं करेगा। इसलिए, ROI में कुछ पृष्ठभूमि पिक्सेल शामिल करने के लिए स्वीकार्य है।
    2. सभी ROIs का चयन करने के लिए CTRL + A के | ROI प्रबंधक पर क्लिक करके अलग-अलग कोशिकाओं के 405:488 अनुपात को मापें | अधिक | बहु उपाय. संवाद बॉक्स में, सभी स्लाइस मापें और प्रति स्लाइस एक पंक्ति का चयन करें.
    3. स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर के लिए माप निर्यात करें।
    4. 405 एनएम छवि का चयन करें। चरण 6.2.2 के रूप में सभी ROIs की तीव्रता को मापें। ROI प्रबंधक में संग्रहीत ROIs का उपयोग कर रहे हैं।
    5. स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर के लिए माप निर्यात करें।
    6. 488 एनएम छवि का चयन करें। चरण 6.2.2 के रूप में सभी ROIs की तीव्रता को मापें। ROI प्रबंधक में संग्रहीत ROIs का उपयोग कर रहे हैं।
    7. स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर के लिए माप निर्यात करें।
    8. सभी ROIs का चयन करने के लिए CTRL + A | ROI प्रबंधक पर क्लिक करके भविष्य के संदर्भ के लिए ROIs सहेजें | अधिक | सहेजें।
    9. अनुशंसित: 405 और 488 एनएम निशान की तीव्रता बनाम समय भूखंडों उत्पन्न करें। सत्यापित करें कि किसी भी चैनल में कोई चिह्नित ब्लीचिंग नहीं है (इमेजिंग श्रृंखला के अंत में सिग्नल तीव्रता पहली छवि का ≥98%) होनी चाहिए और यह कि सेंसर प्रतिक्रियाओं के दौरान दो निशान विपरीत दिशाओं में चले जाते हैं (उदाहरण के लिए, 405 एनएम ट्रेस ऑक्सीकरण के दौरान बढ़ना चाहिए जबकि 488 एनएम ट्रेस कम होना चाहिए)।
  3. डेटा सामान्यीकरण
    1. अनुपात छवि से प्रत्येक ROI के लिए, DA उपचार (Rmax) के दौरान अधिकतम मान और DTT उपचार (Rmin) के दौरान न्यूनतम मान निर्धारित करें।
    2. निम्नानुसार सामान्यीकृत अनुपात की गणना करें:
      Equation 1
      नोट:: यह अधिकतम अनुपात 1.0 करने के लिए और न्यूनतम अनुपात 0 करने के लिए सेट करेगा।
  4. माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का विश्लेषण
    1. चरण 6.2.6 में roGFP तीव्रता के समानांतर में माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के माप प्राप्त करने के लिए, विश्लेषण | पर जाएँ माप सेट करें और आकृति वर्णनकर्ता और फ़िट दीर्घवृत्त की जाँच करें.
      नोट: माध्य तीव्रता के अलावा, परिणाम विंडो में माप में प्रमुख अक्ष (मेजर) की लंबाई, मामूली अक्ष (माइनर) की लंबाई, पहलू अनुपात (एआर; प्रमुख अक्ष को मामूली अक्ष से विभाजित किया गया है; गोल माइटोकॉन्ड्रिया में एआर ~ 1 होता है, लम्बी माइटोकॉन्ड्रिया में अधिक एआर होता है), साथ ही परिपत्रता (Circ.) और गोलाई (राउंड) के माप शामिल होते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

विकास कारक वापसी के बाद स्थिर-राज्य माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स राज्य में अंतर का परिमाणीकरण
माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स राज्य में स्थिर-राज्य मतभेदों के परिमाणीकरण को प्रदर्शित करने के लिए, मानक माध्यम में उगाए गए प्राथमिक न्यूरॉन्स की तुलना इमेजिंग से पहले 48 घंटे के लिए विकास कारकों के बिना सुसंस्कृत न्यूरॉन्स से की गई थी। विकास कारक वापसी के परिणामस्वरूप 72 h16 के बाद एपोप्टोटिक न्यूरोनल सेल मृत्यु होती है। कोशिकाओं को 48 घंटे के बाद यह परीक्षण करने के लिए चित्रित किया गया था कि क्या यह माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स राज्य में परिवर्तन से पहले है। पॉली-एल-ऑर्निथिन-लेपित कवरलिप्स पर उगाए गए प्राथमिक चूहे कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को विट्रो 6 (DIV6) में दिनों में rAAV-mito-Grx1-roGFP2 से संक्रमित किया गया था और DIV12 पर चित्रित किया गया था। लाइव इमेजिंग को इस प्रोटोकॉल के अनुभाग 4 के अनुसार कमरे के तापमान पर एक उल्टे लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर किया गया था जो 40x / 1.10 पानी विसर्जन उद्देश्य से सुसज्जित था। Confocal सेटिंग्स pinhole 7 हवादार इकाइयों, पिक्सेल आकार 568.7 एनएम (512 x 512 पिक्सेल), स्कैन गति 600 हर्ट्ज, लेजर शक्ति 405 एनएम 3%, लेजर शक्ति 488 एनएम 1%, उत्सर्जन बैंडविड्थ 505-550 एनएम, और फ्रेम औसत 4 थे। दो स्थितियों के कच्चे 405: 488 एनएम अनुपात (चित्रा 3 बी) के बीच कोई बड़ा अंतर नहीं था। डेटा सामान्यीकरण के बाद, वृद्धि कारक वापसी समूह (चित्रा 3 C) में 405: 488 एनएम अनुपात में वृद्धि के साथ कोशिकाओं का एक सबसेट पता लगाने योग्य था। यह इंगित करता है कि माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स परिवर्तन न्यूरोनल सेल की मृत्यु से पहले हो सकते हैं, और यह समूहों के बीच बेसल रेडॉक्स राज्यों की तुलना के लिए अधिकतम / मिनट डेटा सामान्यीकरण की प्रासंगिकता को रेखांकित करता है।

NMDA के साथ न्यूरॉन्स के उपचार पर माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स राज्य में गतिशील परिवर्तन
NMDA-प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर (NMDAR) न्यूरोनल प्लास्टिसिटी में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, लेकिन न्यूरोनल क्षति और सेल मृत्यु की मध्यस्थता भी कर सकता है। NMDAR के पैथोलॉजिकल सक्रियण माइटोकॉन्ड्रिया पर कई प्रतिकूल प्रभावों की ओर जाता है जिसमें मैट्रिक्स कैल्शियम अधिभार, माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीकरण और विखंडन, और माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण शामिल हैं। पिछले अध्ययन में, उपरोक्त वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग एनएमडीए-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम अधिभार और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीकरण 13 के बीच एक कारण संबंध की जांच करने के लिए किया गया था। प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स पॉली-डी-लाइसिन / लैमिनिन-लेपित कवरलिप्स पर उगाए गए थे, जो DIV4 पर rAAV-mito-Grx1-roGFP2 से संक्रमित थे और DIV12 पर चित्रित किए गए थे। लाइव इमेजिंग को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक उल्टे कताई डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर किया गया था, जो 20x / 0.75 बहु विसर्जन उद्देश्य (जल विसर्जन का उपयोग किया गया था) और एक ऑन-स्टेज इनक्यूबेशन सिस्टम से सुसज्जित था। Mito-Grx1-roGFP2 अनुक्रमिक रूप से 405 एनएम और 488 एनएम लेजर लाइनों का उपयोग करके हर 20 सेकंड में उत्साहित था, और उत्सर्जन दोनों उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए 527/55 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के साथ एकत्र किया गया था। 30 μM NMDA के साथ न्यूरॉन्स के उपचार ने कुछ ही मिनटों के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया के ऑक्सीकरण का कारण बना (चित्रा 4ए, बी)। विशेष रूप से, एनएमडीए-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल एसिडोसिस ने roGFP2 प्रतिदीप्ति के महत्वपूर्ण शमन का कारण बना, इसकी प्रसिद्ध पीएच-संवेदनशीलता 8 के अनुरूप। यह पुष्टि करने के लिए कि इस पीएच-निर्भर शमन ने 405: 488 अनुपात 9 को प्रभावित नहीं किया, माइटोकॉन्ड्रिया को नियंत्रण प्रयोग में एनएमडीए के अतिरिक्त से पहले डीए द्वारा पूरी तरह से ऑक्सीकरण किया गया था। डीए के साथ pretreatment NMDA द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया के किसी भी आगे ऑक्सीकरण को रोकता है और तदनुसार, 405: 488 अनुपात roGFP2 प्रतिदीप्ति तीव्रता (चित्रा 4 सी) के काफी शमन के बावजूद इस प्रयोग में नहीं बदला।

डेंड्राइटिक माइटोकॉन्ड्रिया के NMDA-प्रेरित परिवर्तनों का मल्टीपैरामेट्रिक विश्लेषण
माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान, झिल्ली क्षमता और रेडॉक्स राज्य में एनएमडीए-प्रेरित परिवर्तनों के अस्थायी अनुक्रम का आकलन करने के लिए, TMRE- और mito-Grx1-roGFP2 प्रतिदीप्ति के समानांतर इमेजिंग को उच्च स्थानिक और अस्थायी संकल्प पर किया गया था। पॉली-एल-ऑर्निथिन-लेपित कवरलिप्स पर उगाए गए प्राथमिक चूहे कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को DIV6 पर rAAV-mito-Grx1-roGFP2 से संक्रमित किया गया था और DIV12 पर चित्रित किया गया था। लाइव इमेजिंग को 63x/ 1.40 तेल विसर्जन उद्देश्य, 600 हर्ट्ज की स्कैन गति, 90.2 एनएम (1024 x 1024 पिक्सेल 2x स्कैन ज़ूम पर 1024 x 1024 पिक्सेल) का एक पिक्सेल आकार, 3 हवादार इकाइयों का पिनहोल आकार, और 2 के फ्रेम औसत का उपयोग करके एक उल्टे कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर कमरे के तापमान पर किया गया था। प्रत्येक 30 सेकंड, तीन छवियों को अनुक्रमिक मोड में दर्ज किया गया था: 405 एनएम उत्तेजना / 505-550 एनएम उत्सर्जन; 488 एनएम उत्तेजना / 505-550 एनएम उत्सर्जन; 552 एनएम उत्तेजना / 560-600 एनएम उत्सर्जन। 60 μM NMDA के साथ न्यूरॉन्स के उपचार के परिणामस्वरूप TMRE सिग्नल का नुकसान हुआ और 405: 488 nm roGFP अनुपात में वृद्धि हुई, इसके बाद माइटोकॉन्ड्रिया (चित्रा 5) के कुछ विलंबित राउंडिंग के बाद।

Figure 1
चित्रा 1: Grx1-roGFP2 फ़ंक्शन और roGFP2 उत्तेजना स्पेक्ट्रा का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व( A) ऑक्सीडेटिव तनाव और एंटीऑक्सिडेंट रक्षा प्रणालियों की कार्रवाई सेलुलर ग्लूटाथियोन पूल को ऑक्सीकरण करती है। Grx1-roGPF2 संलयन प्रोटीन में Grx1 ग्लूटाथियोन पूल के रेडॉक्स राज्य के साथ roGFP2 रेडॉक्स राज्य के तेजी से संतुलन को बढ़ावा देता है। roGFP2 पूल की रेडॉक्स स्थिति का आकलन 405 एनएम और 488 एनएम पर उत्तेजना के बाद 510 एनएम पर जीएफपी-प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के अनुपात की निगरानी करके किया जा सकता है। कम प्रजातियों को नीले रंग में दिखाया गया है; ऑक्सीकृत प्रजातियों को लाल रंग में दिखाया गया है। (बी) पूरी तरह से कम (नीले) और ऑक्सीकरण (लाल) roGFP2 के उत्तेजना स्पेक्ट्रा। roGFP2 के ऑक्सीकरण पर, 400 एनएम उत्तेजना पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन बढ़ जाता है, जबकि 490 एनएम उत्तेजना पर उत्सर्जन कम हो जाता है। यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन 13 से संशोधित किया गया है। बी में उत्तेजना स्पेक्ट्रा को 8 से चित्र 1 बी के आधार पर तैयार किया गया था। बी में बिंदीदार रेखाएं आमतौर पर उपयोग की जाने वाली 405 एनएम और 488 एनएम लेजर लाइनों की तरंग दैर्ध्य को इंगित करती हैं। संक्षेप: जीएसएच = ग्लूटाथियोन; GSSG = ऑक्सीकृत ग्लूटाथियोन; Grx = glutaredoxin; roGFP = रेडॉक्स संवेदनशील हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन संस्करण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: विधि का वर्कफ़्लो. न्यूरॉन्स में उत्तेजना-अनुपातमित रेडॉक्स-संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन roGFP2 की अभिव्यक्ति को कई तरीकों के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है जिसमें अभिकर्मक, लिपोफेक्शन, वायरल जीन स्थानांतरण और ट्रांसजेनिक जानवर शामिल हैं। सेंसर का उपयोग सुसंस्कृत प्राथमिक न्यूरॉन्स, पूर्व विवो ऊतक स्पष्टीकरण, और बरकरार जानवरों में न्यूरोनल रेडॉक्स राज्य का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। roGFP2 इमेजिंग को विभिन्न प्रकार के माइक्रोस्कोप पर किया जा सकता है जिसमें वाइडफील्ड फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और 2-फोटॉन माइक्रोस्कोप शामिल हैं। roGFP2 इमेजिंग डेटा का विश्लेषण स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर ImageJ/ FIJI के साथ किया जा सकता है। संक्षिप्त नाम: roGFP = रेडॉक्स-संवेदनशील हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन संस्करण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विकास कारक वापसी न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रिया के ऑक्सीकरण का कारण बनती है। (ए) प्रतिनिधि 405: 488 एनएम अनुपात इमेजिंग से पहले 48 घंटे के लिए विकास कारकों की उपस्थिति (+ जीएफ) या अनुपस्थिति (- जीएफ) में सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की छवियां। रंग-कोडित तराजू गैर-सामान्यीकृत 405: 488 एनएम अनुपात का प्रतिनिधित्व करते हैं (कम अनुपात कम स्थिति के अनुरूप होते हैं; उच्च अनुपात एक ऑक्सीकरण राज्य के अनुरूप होते हैं)। स्केल बार = 50 μm. (B) व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में 405: 488 एनएम अनुपात का परिमाणीकरण। (सी) अधिकतम / मिनट अलग-अलग न्यूरॉन्स के 405: 488 एनएम अनुपात को कैलिब्रेट किया गया। गोल प्रतीक एकल कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं; पट्टी माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। एन = 40-44 कोशिकाओं से 3 कवर एक तैयारी सेlips. संक्षिप्त नाम: GF = विकास कारक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रिया के NMDA-प्रेरित ऑक्सीकरण( A) प्रतिनिधि 405:488 nm अनुपात छवियों से पहले और बाद में 30 μM NMDA के साथ उपचार के बाद और DA और DTT के साथ अधिकतम / मिनट अंशांकन के बाद। इस आवर्धन पर, roGFP संकेत ज्यादातर सोमा और समीपस्थ डेंड्राइट्स में पाया जाता है। रंग-कोडित पैमाने गैर-सामान्यीकृत 405: 488 एनएम अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है (कम अनुपात कम स्थिति के अनुरूप हैं; उच्च अनुपात एक ऑक्सीकरण राज्य के अनुरूप हैं)। स्केल बार = 50 μm. (B) A में दिखाए गए इमेजिंग रन का परिमाणीकरण। एनएमडीए एक तेजी से और निरंतर माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीकरण को प्रेरित करता है जिसे डीए और डीटीटी का उपयोग करके कैलिब्रेट किया जा सकता है। (सी) एनएमडीए-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल एसिडोसिस 405 एनएम और 488 एनएम उत्तेजना (ऊपरी पैनल) दोनों पर जीएफपी प्रतिदीप्ति की गिरावट का कारण बनता है। पीएच-संचालित प्रभाव को अलग करने और यह पुष्टि करने के लिए कि 405: 488 एनएम अनुपात पीएच-असंवेदनशील है, न्यूरॉन्स को पहले डीए का उपयोग करके अधिकतम ऑक्सीकरण किया गया था और बाद में डीए (निचले पैनल) की उपस्थिति में एनएमडीए के साथ चुनौती दी गई थी। इन स्थितियों के तहत, एनएमडीए अभी भी माइटोकॉन्ड्रियल एसिडोसिस का कारण बनता है लेकिन आगे कोई माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीकरण नहीं है। तदनुसार, हालांकि 405 एनएम और 488 एनएम ट्रेस दोनों प्रतिदीप्ति तीव्रता में पीएच-संचालित गिरावट दिखाते हैं, 405: 488 एनएम अनुपात स्थिर रहता है। इस आंकड़े को 13 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: GFP = हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन; roGFP = रेडॉक्स-संवेदनशील हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन संस्करण; NMDA = N-methyl-D-aspartate; DA = diamide; DTT = dithiothreitol कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: झिल्ली क्षमता, रेडॉक्स राज्य, और डेंड्राइटिक माइटोकॉन्ड्रिया की आकृति विज्ञान में NMDA-प्रेरित परिवर्तन( A) एक समय-अंतराल प्रयोग से तीन उच्च-आवर्धन छवियां, t = 1, 4, और 9 मिनट में प्राप्त की जाती हैं, जो डेंड्राइटिक और अक्षीय माइटोकॉन्ड्रिया दिखाती हैं। रंगीकरण TMRE तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है (अंशांकन पट्टी देखें)। (बी) 405: 488 एनएम roGFP अनुपात छवियों को एक ही समय-अंतराल प्रयोग से (ए) में t = 1, 4, और 9 मिनट में। ध्यान दें कि सीमित एएवी संक्रमण दक्षता के कारण, न्यूरॉन्स का केवल एक सबसेट माइटो-Grx1-roGFP2 व्यक्त करता है, और इसलिए, सभी TMRE-सकारात्मक माइटोकॉन्ड्रिया roGFP-सकारात्मक नहीं हैं। रंग-कोडित अंशांकन पट्टी गैर-सामान्यीकृत 405: 488 एनएम अनुपात का प्रतिनिधित्व करती है (कम अनुपात कम स्थिति के अनुरूप हैं; उच्च अनुपात एक ऑक्सीकरण राज्य के अनुरूप हैं)। (सी) टीएमआरई तीव्रता का परिमाणीकरण, roGFP 405: 488 एनएम अनुपात, और एक एकल माइटोकॉन्ड्रियन की गोलाई ( ए, बी में तीर द्वारा इंगित)। बेसलाइन रिकॉर्डिंग के 1 मिनट के बाद, 60 μM NMDA स्नान समाधान में जोड़ा गया था। स्केल सलाखों = 5 μm. C में y-अक्ष बेसलाइन T0 (हरी धराशायी रेखा) के सापेक्ष 405:488 nm roGFP अनुपात को दर्शाता है, बेसलाइन T0 (लाल बिंदीदार रेखा) के सापेक्ष TMRE प्रतिदीप्ति तीव्रता, और FIJI / ImageJ आकार डिस्क्रिप्टर "गोलाई" (काली ठोस रेखा)। संक्षेप: GFP = roGFP = रेडॉक्स-संवेदनशील हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन संस्करण; mito-Grx1-roGFP2 = Glutaredoxin-1 roGFP के N-टर्मिनस से जुड़ा हुआ है; AAV = एडेनो से जुड़े वायरस; TMRE = tetramethylrhodamine, एथिल एस्टर; NMDA = N-methyl-D-aspartate। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स राज्य के मात्रात्मक और गतिशील माप माइटोकॉन्ड्रियल और सेलुलर फिजियोलॉजी के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं। कई फ्लोरोजेनिक रासायनिक जांच उपलब्ध हैं जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, "रेडॉक्स तनाव" या "ऑक्सीडेटिव तनाव" का पता लगाते हैं। हालांकि, बाद के शब्द अच्छी तरह से परिभाषित नहीं हैं और अक्सर विशिष्टता 9,17,18 की कमी होती है। रासायनिक रंगों की तुलना में, Grx1-roGFP2 कई फायदे प्रदान करता है9,19: (i) एक उत्तेजना-ratiometric सेंसर के रूप में, यह सेंसर अभिव्यक्ति स्तर, पूर्ण प्रतिदीप्ति तीव्रता, और सेल या ऑर्गेनेल घनत्व के लिए अंतर्निहित सामान्यीकरण प्रदान करता है; (ii) आनुवांशिक रूप से एन्कोडेड जांच के रूप में, इसे ऑर्गेनेल या विशिष्ट उपकोशिकीय डिब्बों जैसे प्रीसिनेप्टिक टर्मिनलों या पोस्टसिनेप्टिक डेंड्रिटिक स्पाइन को लक्षित किया जा सकता है; (iii) संवेदक की आनुवांशिक अभिव्यक्ति डाई लोडिंग की आवश्यकता को कम करती है, जो रासायनिक रंगों के मामले में प्राथमिक न्यूरॉन्स के लिए तनावपूर्ण हो सकती है; (iv) सामान्य रेडॉक्स-संवेदनशील रासायनिक रंगों के विपरीत, Grx1-roGFP2 ग्लूटाथियोन रेडॉक्स क्षमता के लिए अत्यधिक विशिष्ट है; (v) संवेदक का ऑक्सीकरण और कमी प्रतिवर्ती हैं, जो क्षणिक रेडॉक्स परिवर्तनों के माप को सक्षम करते हैं; (vi) रासायनिक रंजक के विपरीत जो केवल सापेक्ष परिवर्तनों का पता लगाने की अनुमति देते हैं, Grx1-roGPF2 प्रतिदीप्ति अनुपात को mV9 में पूर्ण रेडॉक्स क्षमता निर्धारित करने के लिए कैलिब्रेट किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल प्राथमिक न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल ग्लूटाथियोन रेडॉक्स क्षमता के गतिशील माप का वर्णन करता है। बरकरार कोशिकाओं के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया के विश्लेषण के कई फायदे हैं15। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के अध्ययन की तुलना में, कोशिकाओं के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया अन्य ऑर्गेनेल (जैसे, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम-माइटोकॉन्ड्रिया संपर्क, माइटोकॉन्ड्रिया-लाइसोसोम संपर्क) के साथ शारीरिक रूप से प्रासंगिक संपर्कों को बनाए रखता है और सिग्नलिंग अणुओं और चयापचयों की सेलुलर सांद्रता के संपर्क में आता है। बरकरार जानवरों के अध्ययन की तुलना में, प्राथमिक न्यूरॉन्स आनुवंशिक और औषधीय जोड़तोड़ और माइक्रोस्कोपी के लिए बेहतर पहुंच प्रदान करते हैं। हालांकि, कुछ सवालों के लिए, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का विश्लेषण बेहतर अनुकूल होगा क्योंकि यह वितरित सब्सट्रेट और अवरोधकों पर सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है। विशेष रूप से, mito-Grx1-roGFP2 का उपयोग पृथक माइटोकॉन्ड्रिया 20 में भी किया जा सकता है। बरकरार ऊतकों या जानवरों के भीतर न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रिया का अध्ययन करने के लिए, ट्रांसजेनिक मक्खी और माउस लाइनें उपलब्ध हैं जो तंत्रिका तंत्र 21,22,23 में माइटो-जीआरएक्स 1-roGFP2 व्यक्त करती हैं। विशेष रूप से, roGFP2 का उत्तेजना स्पेक्ट्रम दो-फोटॉन उत्तेजना के लिए उपयुक्त है, जो क्रमशः 23,24 ऊतक स्पष्टीकरण और बरकरार जानवरों में पूर्व विवो और विवो दो-फोटॉन इमेजिंग को सक्षम करता है। थिओल रेडॉक्स-संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन के वर्णक्रमीय संस्करण भी उपलब्ध हैं जैसे कि पीले rxYFP-Grx1p25 और लाल Grx1-roCherry26। ये मल्टीप्लेक्सिंग के लिए अतिरिक्त लचीलापन प्रदान करते हैं और सिद्धांत रूप में, विभिन्न सेल प्रकारों या सेलुलर डिब्बों में रेडॉक्स-प्रतिक्रियाओं के एक साथ माप को सक्षम करते हैं।

जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है, 405: 488 एनएम अनुपात को क्रमशः डीए और डीटीटी के आवेदन के बाद अधिकतम और न्यूनतम प्रतिदीप्ति अनुपात को मापकर कैलिब्रेट किया जा सकता है। यह सामान्यीकरण आवश्यक नहीं है क्योंकि सेंसर अपनी रेशियोमेट्रिक प्रकृति के कारण अंतर्निहित सामान्यीकरण की एक निश्चित डिग्री प्रदान करता है। हालांकि, हम प्रत्येक इमेजिंग रन के बाद अधिकतम / मिनट अंशांकन करने की सलाह देते हैं, ज्यादातर दो कारणों से। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करता है कि प्रयोग के दौरान सेंसर प्रतिक्रियाएं संतृप्त नहीं थीं। दूसरा, निरपेक्ष 405: 488 एनएम अनुपात एक मनमाना संख्या है जो दोनों चैनलों की माइक्रोस्कोप सेटिंग्स पर निर्भर करता है। यहां तक कि एक ही सेटिंग्स रखते समय, कोई यह सुनिश्चित नहीं कर सकता है कि लेजर पावर और डिटेक्टर प्रदर्शन प्रयोगों के बीच समान रहेगा, खासकर जब ये कई हफ्तों के अलावा होते हैं। एक समाधान प्रत्येक प्रयोग के भीतर नियंत्रण कक्षों के औसत आधार रेखा अनुपात को 1.0 पर सेट करना होगा। यह किसी दिए गए प्रयोग में उपचार-प्रेरित रेडॉक्स गड़बड़ी के सापेक्ष परिमाणीकरण की अनुमति देता है, लेकिन विभिन्न प्रयोगों की तुलनात्मकता को सीमित करता है। विशेष रूप से जब विभिन्न प्रयोगों या सेल प्रकारों से कोशिकाओं के बेसल रेडॉक्स राज्य की तुलना की जाती है, तो अधिकतम / मिनट कैलिब्रेटेड पूर्ण परिमाणीकरण प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। कभी-कभी, 405: 488 एनएम अनुपात डीटीटी उपचार के बाद बेसलाइन अनुपात से नीचे नहीं आता है, खासकर अगर माइटोकॉन्ड्रिया पहले से ही बेसलाइन पर अपेक्षाकृत कम स्थिति में थे। यह आमतौर पर लंबे समय तक समय-अंतराल प्रयोगों के दौरान सेंसर ब्लीचिंग का संकेत है। इस मामले में, माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के साथ प्रयोग को दोहराएं जो कम प्रकाश जोखिम का कारण बनता है।

माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का उपयोग करना सर्वोपरि है जो सेंसर के ब्लीचिंग या माइटोकॉन्ड्रिया के फोटोटॉक्सिसिटी-प्रेरित ऑक्सीकरण का कारण नहीं बनता है। वास्तविक प्रयोगों को शुरू करने से पहले प्रोटोकॉल ऑप्टिमाइज़ेशन के लिए पर्याप्त समय लेना सुनिश्चित करें। एक बार स्वीकार्य सेटिंग्स को परिभाषित करने के बाद, उनका उपयोग कम से कम समायोजन के साथ बाद के प्रयोगों में किया जा सकता है। mito-Grx1-roGFP2 इमेजिंग कमरे के तापमान या एक गर्म मंच पर 35-37 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया जा सकता है। सेंसर दोनों मामलों में काम करेगा; हालांकि, कोशिकाओं के अंदर सिग्नलिंग कैस्केड और एंजाइम प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स स्वाभाविक रूप से तापमान के आधार पर भिन्न होंगे। इसलिए, सेंसर प्रतिक्रियाओं के कैनेटीक्स और आयाम चुने गए तापमान के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। तापमान का विकल्प उपयोगकर्ता पर निर्भर करता है, प्रयोग की विशिष्ट आवश्यकताओं पर निर्भर करता है।

अंत में, हम सेंसर की दो सीमाओं को इंगित करना चाहते हैं। सबसे पहले, उत्सर्जित प्रकाश की तीव्रता 488 एनएम पर उत्तेजना की तुलना में 405 एनएम पर उत्तेजना के साथ काफी कम होती है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर शोर 405 एनएम छवियां होती हैं। 405 एनएम चैनल में शोर करने के लिए संकेत में सुधार करने के लिए उच्च लेजर शक्ति की आवश्यकता होती है। हालांकि, 405 एनएम पर उत्तेजना आमतौर पर अधिक फोटोटॉक्सिक होती है और 488 एनएम पर उत्तेजना की तुलना में अधिक ऑटोफ्लोरेसेंस उत्पन्न करती है, जो अनुमेय 405 एनएम लेजर तीव्रता को सीमित करती है। उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में, कमजोर roGFP प्रतिदीप्ति काफी 405 एनएम-उत्साहित ऊतक autofluorescence के साथ संयुक्त mito-Grx1-roGFP2-लाइव रेटिना flatmounts (डेप और बास-Orth, अप्रकाशित अवलोकन) में गैंग्लियन कोशिकाओं को व्यक्त करने से मजबूत डेटा के अधिग्रहण को रोका। दूसरा, हालांकि 405: 488 एनएम अनुपात पीएच 5.5 से पीएच 8.5 (चित्रा 4)9 के आसपास एक शारीरिक सीमा के भीतर पीएच परिवर्तनों के प्रति असंवेदनशील है, roGFP2 उत्सर्जन के पीएच-निर्भर शमन आमतौर पर कमजोर 405 एनएम सिग्नल को माइक्रोस्कोप की पहचान सीमा से नीचे छोड़ने का कारण बन सकता है, मात्रात्मक अनुपात छवियों के अधिग्रहण को रोकता है। उदाहरण के लिए, यह न्यूरोनल साइटोसोल 13 में एनएमडीए-प्रेरित एसिडोसिस के दौरान मामला था।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को ड्यूश Forschungsgemeinschaft (बीए 3679/5-1) द्वारा समर्थित किया गया था; 2289 के लिए: बीए 3679/4-2)। A.K. एक ERASMUS + फैलोशिप द्वारा समर्थित है। हम प्राथमिक न्यूरॉन्स की तैयारी के लिए आइरिस Bünzli-Ehret, रीटा Rosner, और एंड्रिया Schlicksupp धन्यवाद. हम pLPCX-mito-Grx1-roGFP2 प्रदान करने के लिए डॉ Tobias डिक को धन्यवाद देते हैं। चित्रा 4 में दिखाए गए प्रयोगों को हीडलबर्ग विश्वविद्यालय के निकॉन इमेजिंग सेंटर में किया गया था। चित्र 2 BioRender.com के साथ तैयार किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
reagents
Calcium chloride (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306
Diamide (DA) Sigma-Aldrich D3648
Dithiothreitol (DTT) Carl Roth GmbH 6908.1
Glucose (2.5 M stock solution) Sigma-Aldrich G8769
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Glycine neoFroxx GmbH LC-4522.2
HEPES (1 M stock solution) Sigma-Aldrich 15630-080
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich 442611-M
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Sigma-Aldrich M3262
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Sodium chloride (NaCl) neoFroxx GmbH LC-5932.1
Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) Sigma-Aldrich S8636
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P8574
Sucrose Carl Roth GmbH 4621.1
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) Sigma-Aldrich 87917
equipment
imaging chamber Life Imaging Services (Basel, Switzerland) 10920 Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips
laser scanning confocal microscope, microscope Leica DMI6000
laser scanning confocal microscope, scanning unit Leica SP8
peristaltic pump VWR PP1080 181-4001
spinning disc confocal microscope, camera Hamamatsu C9100-02 EMCCD
spinning disc confocal microscope, incubationsystem TokaiHit INU-ZILCF-F1
spinning disc confocal microscope, microscope Nikon Ti microscope
spinning disc confocal microscope, scanning unit Yokagawa CSU-X1
software
FIJI https://fiji.sc
StackReg plugin https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java
TurboReg plugin https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
  2. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, Pt 2 335-344 (2003).
  3. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  4. Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
  5. Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
  6. Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
  7. Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  8. Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  9. Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
  10. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
  11. Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
  12. Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
  13. Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
  14. Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).
  17. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  18. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  19. Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
  20. Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
  21. Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
  22. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
  23. Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
  24. Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
  25. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
  26. Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071 (2019).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 176 Grx1-roGFP2 confocal माइक्रोस्कोपी ऑक्सीडेटिव तनाव हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स excitotoxicity माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता
एक Ratiometric संकेतक का उपयोग कर प्राथमिक न्यूरॉन्स में माइटोकॉन्ड्रियल ग्लूटाथियोन रेडॉक्स राज्य की लाइव इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katsalifis, A., Casaril, A. M.,… More

Katsalifis, A., Casaril, A. M., Depp, C., Bas-Orth, C. Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator. J. Vis. Exp. (176), e63073, doi:10.3791/63073 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter