Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Levende bildebehandling av mitokondrieglutathione-redokstilstanden i primære nevroner ved hjelp av en ratiometrisk indikator

Published: October 20, 2021 doi: 10.3791/63073
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Medical Cell Biology, Institute for Anatomy and Cell Biology, Heidelberg University, 2Department of Neurogenetics, Max-Planck-Institute for Experimental Medicine

Summary

Denne artikkelen beskriver en protokoll for å bestemme forskjeller i basal redokstilstand og redoksresponser på akutte perturbasjoner i primære hippocampale og kortikale nevroner ved hjelp av konfokal levende mikroskopi. Protokollen kan brukes på andre celletyper og mikroskoper med minimale modifikasjoner.

Abstract

Mitokondrie redoks homeostase er viktig for nevronal levedyktighet og funksjon. Selv om mitokondrier inneholder flere redokssystemer, anses den svært rikelige tiol-disulfid-redoksbufferglutsionen som en sentral aktør i antioksidantforsvar. Derfor gir måling av mitokondrieglutathione redokspotensial nyttig informasjon om mitokondrie-redoksstatus og oksidativt stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) er et genetisk kodet, grønt fluorescerende protein (GFP)-basert forholdsmålingsindikator for glutathione redokspotensialet som har to redoks-tilstandssensitive eksitasjonstopper på 400 nm og 490 nm med en enkelt utslippstopp på 510 nm. Denne artikkelen beskriver hvordan du utfører konfekt levende mikroskopi av mitokondrier-målrettet Grx1-roGFP2 i primære hippocampale og kortikale nevroner. Den beskriver hvordan man vurderer steady-state mitokondrie-redoksuspotensial (f.eks. for å sammenligne sykdomstilstander eller langsiktige behandlinger) og hvordan man måler redoksendringer ved akutte behandlinger (ved hjelp av det eksytoksiske stoffet N-metyl-D-aspartat (NMDA) som eksempel). I tillegg presenterer artikkelen co-imaging av Grx1-roGFP2 og mitokondriemembranpotensialindikatoren, tetrametylrhodamin, etylester (TMRE), for å demonstrere hvordan Grx1-roGPF2 kan multiplekses med tilleggsindikatorer for multiparametriske analyser. Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse av hvordan du (i) optimaliserer konfokale laserskanningsmikroskopinnstillinger, (ii) bruker legemidler for stimulering etterfulgt av sensorkalibrering med diamid og dithiothreitol, og (iii) analysere data med ImageJ / FIJI.

Introduction

Flere viktige mitokondrie enzymer og signalmolekyler er underlagt tiol redoksregulering1. Videre er mitokondrier en viktig cellulær kilde til reaktive oksygenarter og er selektivt sårbare for oksidativ skade2. Følgelig påvirker mitokondrie-redokspotensialet bioenergetikk, cellesignalering, mitokondriefunksjon og til slutt celle levedyktighet3,4. Mitokondriematrisen inneholder høye mengder (1-15 mM) av tiol-disulfid redoks buffer glutathione (GSH) for å opprettholde redoks homeostase og montere antioksidantforsvar5,6. GSH kan kovalent festes til målproteiner (S-glutathionylation) for å kontrollere deres redoksstatus og aktivitet og brukes av en rekke avgiftende enzymer som reduserer oksiderte proteiner. Derfor er mitokondrieglutathione redokspotensialet en svært informativ parameter når du studerer mitokondriefunksjon og patofysiologi.

roGFP2 er en variant av GFP som har blitt gjort redoksensitiv ved tilsetning av to overflateutsatte cysteiner som danner et kunstig dithiol-disulfidpar7,8. Den har en enkelt utslippstopp på ~ 510 nm og to eksitasjonstopper på ~ 400 nm og 490 nm. Det er viktig at de relative amplitudene til de to eksitasjonstoppene avhenger av redokstilstanden til roGFP2 (figur 1), noe som gjør dette proteinet til en ratiometrisk sensor. I Grx1-roGFP2-sensoren har human glutaredoxin-1 (Grx1) blitt smeltet sammen til N-terminus av roGFP29,10. Kovalent festing av Grx1-enzymet til roGFP2 gir to store forbedringer av sensoren: det gjør sensorresponsen spesifikk for GSH / GSSG-glutathione-redoksparet (figur 1), og det øker likevekten mellom GSSG og roGFP2 med en faktor på minst 100,0009. Grx1-roGFP2 muliggjør derfor spesifikk og dynamisk avbildning av det cellulære glutathione-redokspotensialet.

Grx1-roGFP2-avbildning kan utføres på et bredt spekter av mikroskoper, inkludert widefield fluorescensmikroskoper, roterende skivekonfokale mikroskoper og laserskanning av konfokale mikroskoper. Uttrykk for sensoren i primære nevroner kan oppnås ved ulike metoder som inkluderer lipofeksjon11, DNA/kalsiumfosfatkopecipitation12, virusmediert genoverføring eller bruk av transgene dyr som cellekilde (figur 2). Pseudotypede rekombinante adeno-assosierte virus (rAAV) som inneholder et 1:1-forhold mellom AAV1 og AAV2 kapsidproteiner 13,14 ble brukt til forsøkene i denne artikkelen. Med denne vektoren oppnås maksimal sensoruttrykk vanligvis 4-5 dager etter infeksjon og holder seg stabil i minst to uker. Vi har med hell brukt Grx1-roGFP2 i primære hippocampal og kortikale nevroner fra mus og rotter.

I denne artikkelen brukes rAAV-mediert uttrykk for mitokondrier-målrettet Grx1-roGFP2 i primær rotte hippocampal og kortikale nevroner til å vurdere basal mitokondrie-glutathione redokstilstand og dens akutte perturbasjon. En protokoll er gitt for konfokal live bildebehandling med detaljerte instruksjoner om hvordan du (i) optimaliserer laserskanning konfokale mikroskopinnstillinger, (ii) kjører et live bildebehandlingseksperiment og (iii) analyserer data med FIJI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk i samsvar med nasjonale og institusjonelle retningslinjer, inkludert Rådsdirektivet 2010/63/EU i Europaparlamentet, og hadde full hjemmekontor etisk godkjenning (University of Heidelberg Animal Welfare Office og Regierungspraesidium Karlsruhe, lisenser T14/21 og T13/21). Primære hippocampale og kortikale nevroner ble tilberedt fra nyfødte mus- eller rottevalper i henhold til standardprosedyrer og ble opprettholdt i 12-14 dager som tidligere beskrevet13.

1. Utarbeidelse av løsninger

  1. Lagerløsninger for bildebuffer
    1. Klargjør hver lagerløsning i henhold til tabell 1 og hold dem ved 4 °C. For langtidslagring (>3 måneder), hold aliquots ved -20 °C.
Komponent MW Konsentrasjon (M) Beløp (g) Volum (ml)
NaCl 58.44 5 14.61 50
KCl 74.55 3 1.12 5
MgCl2· 6H2O 203.3 1.9 2 5
CaCl2·2H2O 147.01 1 1.47 10
Glysin 75.07 0.1 0.375 50
Sukrose 342.3 1.5 25.67 50
Natrium pyruvat 110.04 0.1 0.55 50
HEPES 238.3 1 11.9 50
Glukose 180.15 2.5 45 100

Tabell 1: Lagerløsninger for bildebuffer.

  1. Lagerløsninger av narkotika og fargestoffer
    1. Løs opp diamid (DA; brukes til kalibrering av maksimalt 405:488-forhold) i vann for å oppnå en 0,5 M lagerløsning (f.eks. 1 g i 11,615 ml vann). Aliquot og oppbevar ved -20 °C.
    2. Løs opp dithiothreitol (DTT, som brukes til kalibrering av minimalt med 405:488-forhold) i vann for å oppnå en 1 M lagerløsning (f.eks. 5 g i 32,425 ml vann). Aliquot og oppbevar ved -20 °C i maksimalt 3 måneder.
    3. Løs opp N-metyl-D-aspartat (NMDA, som brukes til å indusere ekstoksisitet og mitokondrieoksidasjon) i vann for å oppnå en 10 mM lageroppløsning (f.eks. 25 mg i 16.991 ml vann). Oppbevar aliquots ved -20 °C. For langtidslagring (>6 måneder), hold aliquots ved -80 °C.
    4. Tetrametylrhodamin etyl ester perklorat (TMRE; en liten molekylindikator for mitokondriemembranpotensialet)
      1. Løs opp TMRE-pulveret i metanol for å få et 20 mM lager (f.eks. 25 mg i 2,427 ml metanol).
      2. Fortynn 20 mM-lageret 1:1,000 i metanol for å få en 20 μM lager.
      3. Aliquot 20 mM og 20 μM lagerløsninger, forsegle med parafilm, og lagre beskyttet mot lys ved -20 °C.
        MERK: Begge lagerløsningene er stabile i flere år. Bruk 1000x lagerløsning (20 μM) for eksperimenter.
  2. Imaging-buffer
    1. Forbered 100 ml bildebuffer ved å tilsette alle komponenter fra tabell 2 til 80 ml sterilt vann i en målesylinder. Ta volumet opp til 100 ml med sterilt vann. Bland ved å riste målesylinderen forsiktig til løsningen virker homogen.
      MERK: Det anbefales å bruke et osmometer for å kontrollere osmolariteten til bufferen. Det bør være så nært som mulig til vekstmediet til cellene. Her er dette 315 mOsmol/L. Øk eller reduser sukrosekonsentrasjonen etter behov for å matche osmolariteten til bildebufferen og vekstmediet.
    2. Juster pH til 7,4. Lag aliquots og hold dem ved 4 °C i opptil to uker. For langtidslagring, hold aliquots ved -20 °C. La bildebufferen nå romtemperatur før bruk.
Komponent Lagerløsning (M) Endelig konsentrasjon (mM) Volum (ml)
NaCl 5 114 2.3
KCl 3 5.29 0.176
MgCl2 1.9 1 0.053
CaCl2 1 2 0.2
Glysin 0.1 0.005 0.005
Sukrose 1.5 52 3.5
Natrium pyruvat 0.1 0.5 0.5
HEPES 1 10 1
Glukose 2.5 5 0.2

Tabell 2: Sammensetning av bildebuffer. De angitte volumene brukes til fremstilling av 100 ml bildebuffer.

  1. Løsninger for stimulering og kalibrering
    MERK: Forbered alltid ferske stimuleringsløsninger ved å tilsette lagerløsninger av indikerte legemidler til bildebufferen like før eksperimentet. Løsninger for stimulering og kalibrering vil bli lagt til bildekammeret sekvensielt under et eksperiment (se pkt. 3-5). Avhengig av type eksperiment, er det nødvendig med forskjellige løsninger for å nå samme endekonsentrasjon i det respektive endelige volumet i bildekammeret.
    1. Forbered 3x NMDA-oppløsning (90 μM; endelig konsentrasjon i kammeret: 30 μM) ved å tilsette 63 μL av en 10 mM NMDA-lager til 6,937 ml bildebuffer. Tilsett 500 μL av den resulterende løsningen i kammeret (sluttvolum: 1,5 ml).
    2. Forbered 2x DA-løsning for trinn 3 og 4 (1 mM; endelig konsentrasjon i kammeret: 0,5 mM) ved å tilsette 14 μL av en 0,5 M DA-lager til 6,986 ml bildebuffer. Tilsett 1 ml i kammeret (sluttvolum: 2 ml).
    3. Forbered 4x DA-løsning for trinn 5 (2 mM; endelig konsentrasjon i kammeret: 0,5 mM) ved å tilsette 28 μL av en 0,5 M DA-lager til 6,972 ml bildebuffer. Tilsett 500 μL i kammeret (sluttvolum: 2 ml).
    4. Forbered 1x DTT-oppløsning (5 mM, endelig konsentrasjon i kammeret: 5 mM) ved å tilsette 45 μL 1 M DTT-lager til 8955 μL bildebuffer. Tilsett 1 ml av denne løsningen i kammeret etter å ha aspirert bildebufferen (sluttvolum: 1 ml).

2. Lasting av celler med TMRE

MERK: I denne protokollen brukes TMRE i ikke-slukkemodus15 ved en endelig konsentrasjon på 20 nM. Generelt bør den lavest mulige konsentrasjonen av TMRE som fortsatt gir tilstrekkelig signalintensitet på det valgte mikroskopet brukes. På grunn av ujevn fordampning kan medievolumet i forskjellige brønner variere i langsiktige primærkulturer. For å sikre en konsistent TMRE-konsentrasjon i alle brønner må du ikke tilsette TMRE direkte i brønnene. I stedet erstatter du mediet i hver brønn med samme mengde TMRE-inneholdende medium. Protokollen nedenfor er designet for primære nevroner i 24-brønnsplater som inneholder ~ 1 ml medium per brønn.

  1. Arbeid i en vevskultur laminær strømningshette, samle 500 μL medium fra hver brønn til et enkelt konisk rør.
  2. Per brønn tilsettes 0,5 μL 20 μM TMRE-lager i konisk rør (f.eks. 12 μL for 24 brønner).
  3. Aspirer forsiktig det gjenværende mediet fra den første brønnen og erstatt det med 500 μL TMRE-inneholdende medium. Fortsett, godt for brønn, med de resterende brønnene.
    MERK: Pass på at du ikke lar cellene tørke ut og ikke forstyrre cellene.
  4. Returner cellene til inkubatoren og vent i minst 60 min for fargelikevekt.
    MERK: Lastetiden kan forlenges til flere timer uten bivirkninger.
  5. For å sikre konsistente TMRE-konsentrasjoner og likevekt gjennom bildebehandlingseksperimentet, må du sørge for å inkludere en endelig konsentrasjon på 20 nM TMRE i bildebufferen og alle stimuleringsløsninger.

3. Optimalisering av innstillinger for konfektmikroskop

MERK: Dette trinnet tar sikte på å finne det beste kompromisset mellom bildekvalitet og celle levedyktighet under live bildebehandling. Denne delen beskriver optimalisering av innstillinger for roGFP-avbildning. Hvis multiparametrisk avbildning utføres, må lignende optimalisering, inkludert kontroll av en stabil basislinje uten tegn på bleking eller fototoksisitet, utføres for tilleggsindikatorene.

  1. Start det konfokale mikroskopet og last standardinnstillinger for GFP-avbildning (488 nm eksitasjon, 505 - 550 nm utslipp).
  2. Sett detektoren på 12 biter eller 16 biter.
    MERK: Vanligvis er 8 biter ikke tilstrekkelig for kvantitativ avbildning.
  3. Aktiver sekvensiell skannemodus og legg til andre sekvens/spor (405 nm eksitasjon, 505 - 550 nm utslipp).
  4. For begge kanalene velger du en oppslagstabell for pseudofarge som angir over- og undervisningspiksler (f.eks.
  5. Velg en målsetting som passer for interesseobjektet.
    MERK: 10x-40x er egnet for encellet analyse, 63x-100x er egnet for enkelt mitokondrieanalyse.
  6. Monter en coverlip med celler i bildekammeret, tilsett 1 ml bildebuffer, og plasser kammeret på mikroskopet.
  7. Bruk okularet og det overførte lyset til å fokusere cellene.
    MERK: Ikke bruk epifluorescenslys til å finne og fokusere celler. Selv ved lav effekt vil dette påvirke cellene negativt.
  8. Ta opp bilder med forskjellige pikselformater. Basert på disse bildene velger du det laveste pikselnummeret som gir en akseptabel oppløsning av interessestrukturen.
    MERK: Vanligvis fungerer 512 x 512 piksler bra for encellede bilder med 20x og 40x mål, og 1024 x 1024 eller 2048 x2048 piksler fungerer vanligvis bra for enkelt mitokondriebilder med et 63x mål.
  9. Ta opp bilder med forskjellige hullstørrelser. Basert på disse bildene velger du den største pinhole-størrelsen som gir en akseptabel oppløsning av strukturen av interesse.
    MERK: Vanligvis fungerer 3-7 luftige enheter godt.
  10. Ta opp bilder med forskjellige laserintensiteter.
    1. Juster detektorforsterkningen og terskelen tilsvarende. Basert på disse bildene velger du den laveste laserintensiteten som gir akseptabel signalintensitet og signal-til-bakgrunn-forhold.
      1. For å bestemme signal-til-bakgrunn-forholdet måler du signalintensiteten i et interesseområde (ROI) som inneholder celler eller mitokondrier (ROI1) og i en avkastning uten celler eller mitokondrier (ROI2). Del deretter intensiteten av AVKASTNING1 etter intensiteten av ROI2.
        MERK: Sikt mot et signal-til-bakgrunn-forhold på >3 og signalintensiteter av individuelle ROIer på 200-1000 for 405 nm eksitasjon med 1-3% laserkraft og intensiteter av individuelle ROIer på 300-1500 for 488 nm eksitasjon med 1% lasereffekt.
  11. Ta opp bilder med forskjellige skannehastigheter og antall bildegjennomsnitt. Ta opp 4-5 bilder for hver kombinasjon av innstillinger. Basert på disse bildeseriene velger du den høyeste hastigheten og de laveste gjennomsnittsinnstillingene som gir akseptabel bildestøy og bilde-til-bilde-variasjon.
    MERK: En skannehastighet på 600 Hz og 1-2 bilder for gjennomsnittlig arbeid i de fleste tilfeller.
  12. Bruk en ny coverlip til å registrere en intervallserie med de optimaliserte innstillingene.
    MERK: Varigheten og bildeintervallet til serien skal ligne på de planlagte eksperimentene.
  13. På slutten av tidsforløpserien legger du til 1 ml 2x DA-løsning i opptakskammeret. Bilde i ytterligere 2 min.
  14. Aspirer bildebufferen ved hjelp av en peristaltisk pumpe eller håndholdt pipette. Tilsett 1 ml 1x DTT-oppløsning. Bilde i ytterligere 5 min.
  15. Analysere tidsforløpeksperimentet (se avsnitt 5).
    1. Kontroller at ingen av de to kanalene blir over- eller underutsatt under DA- og DTT-behandling med de optimaliserte innstillingene.
    2. Forsikre deg om at ingen av de to kanalene viser betydelig bleking under tidsforløpopptaket; sikte på <2 % tap av intensitet mellom første og siste bilde.
    3. Kontroller at forholdet 405:488 ikke endres betraktelig under bildebehandling.
  16. Gjenta hele prosedyren på en gjentakende måte ved hjelp av flere omslagsslipper, til innstillinger som konsekvent gir akseptable resultater, er definert.

4. Vurdering av basal redoksstatus

  1. Start mikroskopet og last inn de optimaliserte innstillingene fra avsnitt 3.
  2. Sett rammegjennomsnittet til 3-5.
  3. Monter en coverlip med celler i bildekammeret, tilsett 1 ml bildebuffer, og plasser kammeret på mikroskopet.
  4. Bruk okularet og det overførte lyset til å fokusere cellene.
    MERK: Ikke bruk epifluorescenslys til å finne og fokusere celler. Selv ved lav effekt vil dette påvirke cellene negativt.
  5. Bytt til skannemodus og bruk 488 nm-kanalen i live view for å fokusere og finne celler for avbildning.
  6. Bruk multipunktfunksjonen til å velge 3-5 synsfelt på omslagsslipet.
  7. Registrer et grunnlinjebilde.
  8. Tilsett 1 ml 2x DA-oppløsning i kammeret.
  9. Etter 1, 2 og 3 min bruker du live view til å bekrefte/justere fokus og deretter ta opp et bilde.
    MERK: Celler oksideres vanligvis fullstendig etter 2 min.
  10. Bytt ut bufferen i bildekammeret med 1 ml 1x DTT-oppløsning.
  11. Etter 3 og 5 min, bruk live view for å bekrefte / justere fokuset og deretter spille inn et bilde.
    MERK: Cellene er vanligvis fullstendig redusert etter 4-5 min.

5. Levende avbildning av akutte behandlinger

MERK: Protokollen nedenfor beskriver avbildning av mitokondrie-redoksresponsen på NMDA-behandling. Bildeintervaller og varigheten av eksperimentet må kanskje justeres for andre behandlinger.

  1. Start mikroskopet og last inn de optimaliserte innstillingene fra avsnitt 3.
  2. Sett intervallet for tidsforløp til 30 s og varighet til 25 min.
  3. Monter en coverlip med celler i bildekammeret, tilsett 1 ml bildebuffer, og plasser kammeret på mikroskopet.
    MERK: For å unngå termisk fokusdrift, la cellene stå på mikroskopstadiet i 10-15 minutter før du starter tidsforløpavbildning.
  4. Bruk okularet og det overførte lyset til å fokusere cellene.
    MERK: Ikke bruk epifluorescenslys til å finne og fokusere celler. Selv ved lav effekt vil dette påvirke cellene negativt.
  5. Bytt til skannemodus og bruk 488 nm-kanalen i live view for å fokusere og finne celler for avbildning.
  6. Valgfritt: Hvis du vil øke antall registrerte celler per kjøring, bruker du flerpunktsfunksjonen til å bilde 2-3 synsfelt per omslag.
  7. Start tidsforløpanskaffelsen og ta opp 5 bilder som 2 min basislinjeopptak.
  8. Tilsett 500 μL 3x NMDA-løsning i kammeret (endelig konsentrasjon 30 μM) og ta opp ytterligere 20 bilder som en 10 min NMDA-respons.
    MERK: Nevroner er svært følsomme for endringer i osmolaritet. Sørg derfor for å minimere fordampning av bildebufferen. For lengre behandlinger bør bildekammeret dekkes med et lokk.
  9. Tilsett 500 μL 4x DA-løsning i kammeret og ta opp 6 flere bilder (3 min maksimal kalibrering).
  10. Aspirer bufferen fra bildekammeret og erstatt den med 1 ml 1x DTT-oppløsning. Ta opp 10 bilder til (5 min minimumskalibrering).
  11. Avslutt innspillingen og lagre bildeserien.

6. Dataanalyse

  1. Forhåndsbehandling av dataimport og bilde i FIJI
    1. Bruk Bio-Formats Importer til å åpne en gruppe bilder fra trinn 4 eller en bildefil fra trinn 5. Klikk på Plugins | | i bioformat Importør for bioformater. I dialogboksen bruker du Vis stakk med: Hyperstakk, angi Fargemodus: standard, velg Autoskalering, og ikke del opp i separate vinduer.
      MERK: Autoskalering optimaliserer visningen av dataene på dataskjermen. Det endrer ikke pikselintensiteter.
    2. Hvis enkeltbilder fra trinn 4 ble åpnet, klikker du på Bilde | Stabler | Verktøy | Sett sammen for å slå dem sammen til en stakk med ett bilde.
    3. Hvis det er XY-drift under bildeserien, klikker du på Plugins | StackReg for å registrere bildene. Velg Stiv brødtekst eller Oversettelse i dialogboksen.
    4. Endre bildeformatet til 32 bit ved å klikke på Bilde | Skriv inn | 32-biters.
    5. Del fargekanalene i separate vinduer ved å klikke på Bilde | Farge | Delte kanaler.
    6. Velg kanal 1 (405 nm) og juster terskelen for å velge mitokondriene for analyse ved å klikke på Bilde | Juster | Terskelverdi. Velg Standard, Rød, Mørk bakgrunn og Stable histogram i dialogboksen, og vent til de valgte bildepunktene vises røde. Klikk Bruk. Velg Angi bakgrunnsbilder til NaN og Behandle alle bilder.
      MERK: For å unngå potensielle observatørskjevheter, bør automatisk terskelbestemmelse brukes. FIJI tilbyr flere automatiserte metoder (for eksempel Standard, Huang, Intermodes, Otsu) som kan velges fra en rullegardinmeny i terskeldialogboksen. Vanligvis gir Standard -metoden et godt resultat. Det anbefales å sammenligne flere metoder under den første analysen for å finne den beste terningsmetoden for det gitte settet med bilder. Når en metode er valgt, må den brukes på alle bilder.
    7. Gjenta trinn 6.1.6 for kanal 2 (488 nm).
    8. Lag et forholdsbilde for å visualisere forholdet 405: 488 nm ved å klikke på Prosess | Bildekalkulator. I dialogboksen velger du Bilde 1: kanal 1, Operasjon: Del, Bilde 2: kanal 2, Opprett nytt vindu, Behandle alle bilder.
    9. Endre oppslagstabellen for forholdet mellom bildet og pseudocoloren. Hvis du for eksempel vil bytte til Brann, klikker du på Bilde | Oppslagstabeller | Skyt.
  2. Bildeanalyse
    1. Tegn ROIer rundt enkeltceller eller mitokondrier på forholdsbildet. Når du har tegnet hver avkastning, legger du den til i ROI Manager. Analysere | Verktøy | ROI Manager | Legg til. (hurtigtast: 'T') Velg Vis alle.
      MERK: Fordi bakgrunnspiksler er satt til 'ikke et tall' (NaN) i trinn 6.1.6 og 6.1.7, vil de ikke påvirke resultatet av målingen. Derfor er det akseptabelt å inkludere noen bakgrunnspiksler i avkastningen.
    2. Mål 405:488-forholdet mellom enkeltceller ved å klikke ROI Manager | ctrl+A for å velge alle ROIer | Mer | Multi mål. Velg Mål alle stykker og Én rad per stykke i dialogboksen .
    3. Eksporter målene til regnearkprogramvare.
    4. Velg 405 nm-bildet. Mål intensitetene til alle ROIer som i trinn 6.2.2. ved hjelp av ROI-ene som er lagret i ROI-behandling.
    5. Eksporter målene til regnearkprogramvare.
    6. Velg 488 nm-bildet. Mål intensiteter av alle ROIer som i trinn 6.2.2. ved hjelp av ROI-ene som er lagret i ROI-behandling.
    7. Eksporter målene til regnearkprogramvare.
    8. Lagre ROIer for fremtidig referanse ved å klikke ROI Manager | ctrl+A for å velge alle ROIer | Mer | Lagre.
    9. Anbefalt: Generer intensitet vs. tidsplott av sporene på 405 og 488 nm. Kontroller at det ikke er merket bleking i noen av kanalene (signalintensiteten på slutten av bildeserien skal være ≥98 % av det første bildet) og at de to sporene beveger seg i motsatt retning under sensorresponser (f.eks. 405 nm-sporet skal øke under oksidasjon mens 488 nm-sporet skal reduseres).
  3. Normalisering av data
    1. For hver avkastning fra forholdsbildet, bestem maksimumsverdien under DA-behandling (Rmax) og minimumsverdien under DTT-behandling (Rmin).
    2. Beregn det normaliserte forholdet på følgende måte:
      Equation 1
      MERK: Dette vil sette maksimumsforholdet til 1,0 og minimumsforholdet til 0.
  4. Analyse av mitokondriemorfologi
    1. Hvis du vil ha målinger av mitokondriemorfologi parallelt med roGFP-intensiteter i trinn 6.2.6, går du til Analysere | Angi mål og kontroller figurbeskrivelser og Tilpass ellipse.
      MERK: I tillegg til gjennomsnittlig intensitet, vil målingene i resultatvinduet inkludere lengden på hovedaksen (Major), lengden på den mindre aksen (Minor), størrelsesforholdet (AR; hovedakse delt på mindre akse; runde mitokondrier har en AR ~ 1, langstrakte mitokondrier har en større AR), samt målinger av sirkularitet (Circ.) og rundhet (Rund).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kvantifisering av forskjeller i steady-state mitokondrie-redokstilstand etter tilbaketrekking av vekstfaktor
For å demonstrere kvantifiseringen av steady-state forskjeller i mitokondrie redoks tilstand, ble primære nevroner dyrket i standard medium sammenlignet med nevroner dyrket uten vekstfaktorer i 48 timer før avbildning. Vekstfaktoruttak resulterer i apoptotisk nevroncelledød etter 72 h16. Celler ble avbildet etter 48 timer for å teste om dette innledes med endringer i mitokondrie-redokstilstand. Primærrotte kortikale nevroner dyrket på poly-L-ornitinbelagte deksler ble smittet med rAAV-mito-Grx1-roGFP2 på dager in vitro 6 (DIV6) og ble avbildet på DIV12. Levende bildebehandling ble utført ved romtemperatur i henhold til avsnitt 4 i denne protokollen på et invertert laserskanningskonfokalt mikroskop utstyrt med et 40x / 1.10 vanninnlevelsesmål. Confocal-innstillingene var pinhole 7 luftige enheter, pikselstørrelse 568,7 nm (512 x 512 piksler), skannehastighet 600 Hz, lasereffekt 405 nm 3%, lasereffekt 488 nm 1%, utslippsbåndbredde 505-550 nm og rammegjennomsnitt 4. Det var ingen stor forskjell mellom de rå 405:488 nm-forholdene mellom de to forholdene (figur 3B). Etter datanormalisering var et delsett av celler med økt forhold på 405:488 nm detekterbart i abstinensgruppen for vekstfaktor (figur 3C). Dette indikerer at mitokondrie-redoksendringer kan komme før nevronal celledød, og det understreker relevansen av maks / min data normalisering for sammenligning av basale redokstilstander mellom grupper.

Dynamiske endringer i mitokondrie-redokstilstand ved behandling av nevroner med NMDA
NMDA-type glutamatreseptor (NMDAR) spiller en sentral rolle i nevronal plastisitet, men kan også formidle nevronskader og celledød. Patologisk aktivering av NMDAR fører til flere bivirkninger på mitokondrier som inkluderer matrisekalsiumoverbelastning, mitokondrieoksidasjon og fragmentering, og mitokondriell permeabilitetsovergang. I en tidligere studie ble den ovenfor beskrevne protokollen brukt til å undersøke en årsakssammenheng mellom NMDA-indusert mitokondriekalsiumoverbelastning og mitokondrieoksidasjon13. Primær rotte hippocampal nevroner dyrket på poly-D-lysin / laminin-belagte coverlips ble smittet med rAAV-mito-Grx1-roGFP2 på DIV4 og avbildet på DIV12. Levende avbildning ble utført ved 37 °C på et invertert roterende platekonfokalt mikroskop utstyrt med et 20x/0,75 multi nedsenkingsmål (vanninnlevelse ble brukt) og et inkubasjonssystem på scenen. Mito-Grx1-roGFP2 var sekvensielt begeistret hver 20 s ved hjelp av 405 nm og 488 nm laserlinjer, og utslipp ble samlet inn med et 527/55 nm utslippsfilter for begge eksitasjonsbølgelengder. Behandling av nevroner med 30 μM NMDA forårsaket oksidasjon av mitokondrier i løpet av få minutter (figur 4A,B). Spesielt forårsaket NMDA-indusert mitokondriesyreose betydelig slukking av roGFP2 fluorescens, i tråd med den velkjente pH-følsomheten8. For å bekrefte at denne pH-avhengige slukkingen ikke påvirket forholdet 405:4889, ble mitokondrier fullstendig oksidert av DA før NMDA ble tilføyd i et kontrolleksperiment. Forbehandling med DA utelukker ytterligere oksidasjon av mitokondrier av NMDA, og følgelig endret ikke 405:488-forholdet seg i dette eksperimentet til tross for en betydelig slukking av roGFP2 fluorescensintensitet (figur 4C).

Multiparametrisk analyse av NMDA-induserte endringer i dendritiske mitokondrier
For å vurdere den tidsmessige sekvensen av NMDA-induserte endringer i mitokondriemorfologi, membranpotensial og redokstilstand, ble parallell avbildning av TMRE- og mitok-Grx1-roGFP2 fluorescens utført ved høy romlig og tidsmessig oppløsning. Primærrotte kortikale nevroner dyrket på poly-L-ornitinbelagte deksler ble smittet med rAAV-mito-Grx1-roGFP2 på DIV6 og avbildet på DIV12. Levende bildebehandling ble utført ved romtemperatur på et invertert konfokalt laserskanningsmikroskop ved hjelp av et 63x / 1,40 olje nedsenkingsmål, en skannehastighet på 600 Hz, en pikselstørrelse på 90,2 nm (1024 x 1024 piksler ved 2x skannezoom), en pinhole-størrelse på 3 luftige enheter og et rammegjennomsnitt på 2. Hver 30 s ble tre bilder tatt i sekvensiell modus: 405 nm eksitasjon/ 505-550 nm utslipp; 488 nm eksitasjon/505-550 nm utslipp; 552 nm eksitasjon/560-600 nm utslipp. Behandling av nevroner med 60 μM NMDA resulterte i tap av TMRE-signal og en økning i 405:488 nm roGFP-forholdet, etterfulgt av en viss forsinket avrunding av mitokondrier (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk representasjon av Grx1-roGFP2-funksjonen og roGFP2 eksitasjonsspektra. (A) Oksidativt stress og virkningen av antioksidantforsvarssystemer oksiderer det cellulære glutathionebassenget. Grx1 i Grx1-roGPF2 fusjonsprotein fremmer rask likevekt av roGFP2 redokstilstanden med redokstilstanden til glutathionebassenget. Redoksstatusen til roGFP2-bassenget kan vurderes ved å overvåke forholdet mellom GFP-fluorescensutslipp ved 510 nm etter eksitasjon ved 405 nm og 488 nm. Reduserte arter er vist i blått; oksidert art er vist i rødt. (B) Eksitasjonsspektra av fullt redusert (blå) og oksidert (rød) roGFP2. Ved oksidasjon av roGFP2 øker fluorescensutslippet ved 400 nm eksitasjon, mens utslippet ved 490 nm eksitasjon reduseres. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon13. Eksitasjonsspektra i B ble trukket basert på figur 1B fra 8. Stiplede linjer i B indikerer bølgelengdene til vanlige 405 nm og 488 nm laserlinjer. Forkortelser: GSH = glutathione; GSSG = oksidert glutathione; Grx = glutaredoxin; roGFP = redoksensitiv grønn fluorescerende proteinvariant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Metodens arbeidsflyt. Uttrykk for eksitasjons-ratiometrisk redoksensitiv fluorescerende protein roGFP2 i nevroner kan oppnås gjennom flere metoder som inkluderer transfeksjon, lipofeksjon, viral genoverføring og transgene dyr. Sensoren kan brukes til å studere nevronal redokstilstand i dyrkede primære nevroner, ex vivo vev utviser og intakte dyr. roGFP2-avbildning kan utføres på en rekke mikroskoper som inkluderer widefield fluorescerende mikroskoper, konfokale mikroskoper og 2-fotonmikroskoper. Analyse av roGFP2 bildedata kan utføres med den fritt tilgjengelige programvaren ImageJ / FIJI. Forkortelse: roGFP = redoksensitiv grønn fluorescerende proteinvariant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Tilbaketrekking av vekstfaktor forårsaker oksidasjon av nevronal mitokondrier. (A) Representant 405:488 nm ratio bilder av nevroner dyrket i nærvær (+ GF) eller fravær (- GF) av vekstfaktorer i 48 timer før avbildning. Fargekodede vekter representerer ikke-normaliserte 405:488 nm-forhold (lavere forhold tilsvarer redusert tilstand, høyere forhold tilsvarer en oksidert tilstand). Skalastenger = 50 μm. (B) Kvantifisering av forholdet 405:488 nm i individuelle nevroner. (C) Maks/min kalibrert 405:488 nm forhold mellom individuelle nevroner. Runde symboler representerer enkeltceller. representerer middelverdi. N = 40-44 celler fra 3 deksler fra ett preparat. Forkortelse: GF = vekstfaktor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: NMDA-indusert oksidasjon av nevronal mitokondrier. (A) Representative 405:488 nm ratio bilder før og etter behandling med 30 μM NMDA og etter maks/min kalibrering med DA og DTT. Ved denne forstørrelsen oppdages roGFP-signal for det meste i soma og proksimale dendritter. Den fargekodede skalaen representerer ikke-normaliserte 405:488 nm-forhold (lavere forhold tilsvarer redusert tilstand; høyere forhold tilsvarer en oksidert tilstand). Skalastolper = 50 μm. (B) Kvantifisering av bildebehandlingskjøringen vist i A. NMDA induserer en rask og vedvarende mitokondrieoksidasjon som kan kalibreres ved hjelp av DA og DTT. (C) NMDA-indusert mitokondriesyreose forårsaker en dråpe GFP-fluorescens på både 405 nm og 488 nm eksitasjon (øvre panel). For å isolere den pH-drevne effekten og bekrefte at forholdet mellom 405:488 nm er pH-ufølsomt, ble nevroner først maksimalt oksidert ved hjelp av DA og deretter utfordret med NMDA i nærvær av DA (nedre panel). Under disse forholdene forårsaker NMDA fortsatt mitokondriesyreose, men ingen ytterligere mitokondrieoksidasjon. Selv om både 405 nm og 488 nm spor viser et pH-drevet fall i fluorescensintensitet, forblir forholdet på 405:488 nm stabilt. Denne figuren er endret fra 13. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; roGFP = redoksensitiv grønn fluorescerende proteinvariant; NMDA = N-metyl-D-aspartat; DA = diamid; DTT = dithiothreitol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: NMDA-induserte endringer i membranpotensial, redokstilstand og morfologi av dendritiske mitokondrier. (A) Tre høyforstørrelsesbilder fra et intervalleksperiment, anskaffet ved t = 1, 4 og 9 min, som viser dendritiske og axonale mitokondrier. Fargelegging representerer TMRE-intensitet (se kalibreringslinjen). (B) 405:488 nm roGFP ratio bilder fra samme tidsforløp eksperiment som i (A) ved t = 1, 4 og 9 min. Merk at på grunn av begrenset AAV-infeksjonseffektivitet uttrykker bare en undergruppe av nevroner mitokt-Grx1-roGFP2, og derfor er ikke alle TMRE-positive mitokondrier roGFP-positive. Den fargekodede kalibreringslinjen representerer ikke-normaliserte 405:488 nm-forhold (lavere forhold tilsvarer redusert tilstand; høyere forhold tilsvarer en oksidert tilstand). (C) Kvantifisering av TMRE-intensitet, roGFP 405:488 nm-forhold og rundhet av en enkelt mitokondrie (indikert med piler i A, B). Etter 1 min basisopptak ble 60 μM NMDA lagt til badeløsningen. Skalastenger = 5 μm. Y-aksen i C viser roGFP-forholdet på 405:488 nm i forhold til grunnlinje T0 (grønn stiplet linje), TMRE-fluorescensintensiteten i forhold til grunnlinje T0 (rød prikket linje) og FIJI/ImageJ-figurbeskrivelsen "rundhet" (svart, heltrukket linje). Forkortelser: GFP = roGFP = redokssensitiv grønn fluorescerende proteinvariant; mito-Grx1-roGFP2 = Glutaredoxin-1 smeltet sammen til N-terminus av roGFP; AAV = adeno-assosiert virus; TMRE = tetrametylrhodamin, etyl ester; NMDA = N-metyl-D-aspartat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvantitative og dynamiske målinger av mitokondrie-redokstilstanden gir viktig informasjon om mitokondrie og cellulær fysiologi. Flere fluorogene kjemiske sonder er tilgjengelige som oppdager reaktive oksygenarter, "redoksstress" eller "oksidativt stress". De sistnevnte begrepene er imidlertid ikke veldefinerte og mangler ofte spesifisitet9,17,18. Sammenlignet med kjemiske fargestoffer, tilbyr Grx1-roGFP2 flere fordeler9,19: (i) som en eksitasjons-ratiometrisk sensor, gir den iboende normalisering for sensoruttrykksnivå, absolutt fluorescensintensitet og celle- eller organelletetthet; (ii) som en genetisk kodet sonde, kan den målrettes mot organeller eller spesifikke subcellulære rom som presynaptiske terminaler eller postsynaptiske dendrittiske spines; (iii) genetisk uttrykk for sensoren motvirker behovet for fargebelastning, som i tilfelle kjemiske fargestoffer kan være stressende for primære nevroner; (iv) i motsetning til generelle redokssensitive kjemiske fargestoffer, er Grx1-roGFP2 svært spesifikk for glutathione redokspotensialet; (v) oksidasjon og reduksjon av sensoren er reversibel, noe som muliggjør måling av forbigående redoksendringer; (vi) i motsetning til kjemiske fargestoffer som bare tillater påvisning av relative endringer, kan Grx1-roGPF2 fluorescensforhold kalibreres for å bestemme absolutte redokspotensialer i mV9.

Denne protokollen beskriver dynamiske målinger av mitokondrie-glutathione-redokspotensialet i primære nevroner. Analyse av mitokondrier i intakte celler har flere fordeler15. Sammenlignet med studiet av isolerte mitokondrier, beholder mitokondrier i celler fysiologisk relevante kontakter med andre organeller (f.eks. endoplasmatiske retikulum-mitokondrier kontakter, mitokondrier-lysosomkontakter) og er utsatt for cellulære konsentrasjoner av signalmolekyler og metabolitter. Sammenlignet med studiet av intakte dyr, gir primære nevroner bedre tilgjengelighet for genetiske og farmakologiske manipulasjoner og mikroskopi. Men for visse spørsmål vil analyse av isolerte mitokondrier være bedre egnet, da dette gir presis kontroll over leverte substrater og inhibitorer. Spesielt kan mitokondrie-roGFP2 også brukes i isolert mitokondrier20. For å studere nevronal mitokondrier i intakt vev eller dyr, er transgene fly- og muselinjer tilgjengelige som uttrykker mitokt-Grx1-roGFP2 i nervesystemet21,22,23. Spesielt er eksitasjonsspekteret av roGFP2 egnet til to-foton eksitasjon, noe som muliggjør ex vivo og in vivo to-foton bildebehandling i vev utviser og intakte dyr, henholdsvis23,24. Spektralvarianter av tiol redokssensitive fluorescerende proteiner er også tilgjengelige som gul rxYFP-Grx1p25 og rød Grx1-roCherry26. Disse gir ekstra fleksibilitet for multipleksing og muliggjør i prinsippet samtidig måling av redoksresponser i forskjellige celletyper eller cellulære rom.

Som beskrevet i protokollen, kan forholdet 405:488 nm kalibreres ved å måle henholdsvis maksimal og minimal fluorescens etter påføring av HENHOLDSVIS DA og DTT. Denne normaliseringen er ikke viktig fordi sensoren gir en viss grad av iboende normalisering på grunn av dens rasjonmetriske natur. Vi anbefaler imidlertid å utføre maks/min kalibrering etter hver bildebehandling, for det meste av to grunner. For det første sikrer det at sensorresponsene ikke ble mettet under eksperimentet. For det andre er det absolutte forholdet på 405: 488 nm et vilkårlig tall som avhenger av mikroskopinnstillingene til begge kanalene. Selv når man beholder de samme innstillingene, kan man ikke være sikker på at laserkraft og detektorytelse vil forbli den samme mellom eksperimenter, spesielt når disse er flere uker fra hverandre. En løsning ville være å sette det gjennomsnittlige grunnlinjeforholdet for kontrollceller til 1,0 i hvert eksperiment. Dette muliggjør relativ kvantifisering av behandlingsinduserte redoksperturbasjoner i et gitt eksperiment, men begrenser sammenlignbarheten av forskjellige eksperimenter. Spesielt når du sammenligner den basale redokstilstanden til celler fra forskjellige eksperimenter eller celletyper, er det viktig å oppnå maks / min kalibrert absolutt kvantifisering. Av og til faller ikke forholdet mellom 405:488 nm under grunnlinjeforholdet etter DTT-behandling, spesielt hvis mitokondriene allerede var i en relativt redusert tilstand ved baseline. Dette er vanligvis et tegn på sensorbleking under langvarige intervalleksperimenter. I dette tilfellet gjentar du eksperimentet med mikroskopinnstillinger som forårsaker mindre lyseksponering.

Det er viktig å bruke mikroskopinnstillinger som ikke forårsaker bleking av sensoren eller fototoksisitetsindusert oksidasjon av mitokondrier. Sørg for å ta tilstrekkelig tid til protokolloptimalisering før du starter faktiske eksperimenter. Når akseptable innstillinger er definert, kan de brukes i etterfølgende eksperimenter med minimale justeringer. mito-Grx1-roGFP2 avbildning kan utføres ved romtemperatur eller 35-37 °C på et oppvarmet stadium. Sensoren vil fungere i begge tilfeller; Kinetikken til signalkaskader og enzymreaksjoner inne i cellene vil imidlertid naturlig variere basert på temperatur. Derfor kan kinetikk og amplituder av sensorresponser variere avhengig av valgt temperatur. Valget av temperatur er opp til brukeren, avhengig av eksperimentets spesifikke behov.

Til slutt vil vi påpeke to begrensninger på sensoren. For det første er intensiteten av avgitt lys betydelig lavere med eksitasjon ved 405 nm enn med eksitasjon ved 488 nm, noe som ofte resulterer i ganske støyende 405 nm bilder. Høyere lasereffekt er nødvendig for å forbedre signalet til støy i 405 nm-kanalen. Eksitasjon ved 405 nm er imidlertid vanligvis mer fototoksisk og genererer mer autofluorescens enn eksitasjon ved 488 nm, noe som begrenser den tillatte 405 nm laserintensiteten. For eksempel forhindret svak roGFP-fluorescens kombinert med betydelig 405 nm-spent vevs autofluorescence oppkjøpet av robuste data fra mito-Grx1-roGFP2-uttrykkende ganglionceller i levende netthinne flatmounts (Depp og Bas-Orth, upublisert observasjon). For det andre, selv om forholdet mellom 405:488 nm er ufølsomt for pH-endringer innenfor et fysiologisk område rundt pH 5,5 til pH 8,5 (figur 4)9, kan pH-avhengig slukking av roGFP2-utslipp føre til at det typisk svake 405 nm-signalet faller under deteksjonsgrensen for mikroskopet, noe som forhindrer oppkjøpet av kvantifiserbare forholdsforhold. For eksempel var dette tilfelle under NMDA-indusert acidose i nevronal cytosol13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; FOR 2289: BA 3679/4-2). A.K. støttes av et ERASMUS+-stipend. Vi takker Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner og Andrea Schlicksupp for utarbeidelsen av primære nevroner. Vi takker Dr. Tobias Dick for å ha levert pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Eksperimenter vist i figur 4 ble utført ved Nikon Imaging Center, University of Heidelberg. Figur 2 ble utarbeidet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
reagents
Calcium chloride (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306
Diamide (DA) Sigma-Aldrich D3648
Dithiothreitol (DTT) Carl Roth GmbH 6908.1
Glucose (2.5 M stock solution) Sigma-Aldrich G8769
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Glycine neoFroxx GmbH LC-4522.2
HEPES (1 M stock solution) Sigma-Aldrich 15630-080
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich 442611-M
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Sigma-Aldrich M3262
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Sodium chloride (NaCl) neoFroxx GmbH LC-5932.1
Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) Sigma-Aldrich S8636
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P8574
Sucrose Carl Roth GmbH 4621.1
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) Sigma-Aldrich 87917
equipment
imaging chamber Life Imaging Services (Basel, Switzerland) 10920 Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips
laser scanning confocal microscope, microscope Leica DMI6000
laser scanning confocal microscope, scanning unit Leica SP8
peristaltic pump VWR PP1080 181-4001
spinning disc confocal microscope, camera Hamamatsu C9100-02 EMCCD
spinning disc confocal microscope, incubationsystem TokaiHit INU-ZILCF-F1
spinning disc confocal microscope, microscope Nikon Ti microscope
spinning disc confocal microscope, scanning unit Yokagawa CSU-X1
software
FIJI https://fiji.sc
StackReg plugin https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java
TurboReg plugin https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
  2. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, Pt 2 335-344 (2003).
  3. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  4. Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
  5. Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
  6. Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
  7. Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  8. Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  9. Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
  10. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
  11. Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
  12. Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
  13. Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
  14. Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).
  17. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  18. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  19. Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
  20. Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
  21. Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
  22. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
  23. Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
  24. Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
  25. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
  26. Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071 (2019).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 176 Grx1-roGFP2 konfikal mikroskopi oksidativt stress hippocampale nevroner eksitotoksisitet mitokondriemembranpotensial
Levende bildebehandling av mitokondrieglutathione-redokstilstanden i primære nevroner ved hjelp av en ratiometrisk indikator
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katsalifis, A., Casaril, A. M.,… More

Katsalifis, A., Casaril, A. M., Depp, C., Bas-Orth, C. Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator. J. Vis. Exp. (176), e63073, doi:10.3791/63073 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter