Wir präsentieren ein Protokoll zur Bestimmung der multizellulären Chiralität in vitro unter Verwendung der Mikrostrukturierungstechnik. Dieser Assay ermöglicht die automatische Quantifizierung der Links-Rechts-Verzerrungen verschiedener Zelltypen und kann für Screening-Zwecke verwendet werden.
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Methodenartikel
Ein Mikrostrukturierungsassay zur Messung der Zellchiralität
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Chiralität ist eine intrinsische zelluläre Eigenschaft, die die Asymmetrie in Bezug auf die Polarisation entlang der Links-Rechts-Achse der Zelle darstellt. Da diese einzigartige Eigenschaft aufgrund ihrer wichtigen Rolle sowohl bei der Entwicklung als auch bei der Krankheit zunehmend Aufmerksamkeit erregt, würde eine standardisierte Quantifizierungsmethode zur Charakterisierung der Zellchiralität die Forschung und mögliche Anwendungen vorantreiben. In diesem Protokoll beschreiben wir einen multizellulären Chiralitätscharakterisierungsassay, der mikrostrukturierte Zellarrays verwendet. Zelluläre Mikromuster werden auf titan/vergoldeten Glasobjektträgern mittels Mikrokontaktdruck hergestellt. Nach der Aussaat auf den geometrisch definierten (z. B. ringförmigen), proteinbeschichteten Inseln wandern die Zellen in direktionale Richtung und bilden eine verzerrte Ausrichtung entweder im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn, die automatisch analysiert und quantifiziert werden kann durch ein speziell geschriebenes MATLAB-Programm. Hier beschreiben wir detailliert die Herstellung von mikrostrukturierten Substraten, Zellaussaat, Bilderfassung und Datenanalyse und zeigen repräsentative Ergebnisse, die mit den NIH/3T3-Zellen erzielt wurden. Dieses Protokoll wurde zuvor in mehreren veröffentlichten Studien validiert und ist ein effizientes und zuverlässiges Werkzeug zur Untersuchung der Zellchiralität in vitro.
Einleitung
Die Links-Rechts-Asymmetrie (LR) der Zelle, auch bekannt als zelluläre Händigkeit oder Chiralität, beschreibt die Zellpolarität in der LR-Achse und wird als grundlegende, konservierte, biophysikalische Eigenschaft 1,2,3,4,5 anerkannt. Die Zellchiralität wurde sowohl in vivo als auch in vitro auf mehreren Skalen beobachtet. Frühere Ergebnisse zeigten chirale Verwirbelung des Aktin-Zytoskeletts in einzelnen Zellen, die auf kreisförmigen Inselnausgesät waren 6, verzerr....
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Protokoll
1. Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Stempeln16
- Zeichnen Sie mit CAD-Software eine Reihe von Mikroskalenringen mit einem Innendurchmesser von 250 μm und einem Außendurchmesser von 450 μm. Das in diesem Protokoll verwendete Muster ist ein 10 x 10-Array mit einem Abstand von 850 μm zwischen den Ringen.
- Drucken Sie eine Transparenzmaske des Musters in der gewünschten Auflösung mit dem Maskendruckservice eines Mikrofabrikationsunternehmens (siehe Materialverzeichnis).
HINWEIS: Die angegebenen Abmessungen des Rings funktionieren nachweislich für viele Zelltypen7. - Führ....
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Ergebnisse
Fünfzehn Minuten nach der Aussaat von NIH/3T3-Zellen wurde die Zelladhäsion auf dem Ringmuster durch Phasenkontrastbildgebung visuell bestätigt. Nach der anschließenden Kultur von 24 h wurden die Zellen auf den Mustern konfluent und verlängerten sich mit deutlich asymmetrischen Ausrichtungen, die in Richtung Uhrzeigersinn verzerrt waren (Abbildung 2). Die gerichtete Migration der angehängten Zellen wird durch Zeitraffer-Bildgebung aufgezeichnet, die Zellmotilität und die Morphogenese können .......
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Diskussion
Der hier beschriebene ringförmige Musterungsassay bietet ein einfach zu bedienendes Werkzeug zur quantitativen Charakterisierung der multizellulären Chiralität, das in der Lage ist, äußerst zuverlässige und wiederholbare Ergebnisse zu erzielen. Die schnelle Generierung identisch definierter Mikroumgebungen und die unvoreingenommene Analyse ermöglichen eine automatisierte Hochdurchsatzverarbeitung großer Proben. Dieses Protokoll diskutiert die Herstellung der Ringmikromuster, die Zellstrukturierung und die automatische An.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (OD / NICHD DP2HD083961 und NHBLI R01HL148104) finanziert. Leo Q. Wan ist Pew Scholar in Biomedical Sciences (PEW 00026185), unterstützt von den Pew Charitable Trusts. Haokang Zhang wird durch das American Heart Association Predoctoral Fellowship (20PRE35210243) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 200 proof Ethanol | Koptec | DSP-MD-43 | |
| BZX Mikroskopsystem | Keyence | BZX-600 | |
| Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt | Gibco | 11965092 | |
| Elektronenstrahlverdampfer | Temscal | BJD-1800 | Gold-Titanum-Filmbeschichtung |
| Fötales Rinderserum | VWR | 89510-186 | |
| Fibronektin aus Rinderplasma | Sigma | F1141-5MG | |
| Objektträger aus Glas | VWR | 10024-048 | |
| Glaspinzette | Exelta | 390BSAPI | |
| Goldverdampfungspellets | International Advanced Materials | AU18 | |
| HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) | Prochimia | TH 001-m11.n3-0.2 | |
| MATLAB | Mathworks | MATLAB_R2020b | |
| NIH/3T3 Zellen | ATCC | CRL-1658 | |
| OAI Contact Aligner | OAI | 200 | UV-Photolithographie |
| Octadecanthiol (C18) | Sigma | O1858-25ML | |
| Orbitalschüttler | VWR | 89032-088 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Forschungsprodukt international | P32080-100T | |
| Polydimethylsiloxan Sylgard 184 | Dow Corning | DC4019862 | |
| Silizium Wafer | University Wafer | ID # 809 | |
| Natriumpyruvat | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| SU-8 3050 Fotolack | MicroChem | Y311075 0500L1GL | |
| Titan-Verdampfungspellets | International Advanced Materialien | TI14 | |
| Transparenzmaske (mit Feature) | Outputicity.com | N/A | Maskendruckservice |
| Trypsin-EDTA (0,25%) | Thermo fisher scientific | 25200-072 |
Referenzen
- Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413(2016).
- Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q.
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Nachdrucke und Genehmigungen
