Methodenartikel

Chemilumineszenz-basierte Assays zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen Derivaten aus Autoxidation und nitrosierten Verbindungen

4.7K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/63107

⸱

16. Februar 2022

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir Protokolle zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen biologisch relevanten Derivaten mittels Chemilumineszenz-basierter Assays mit hoher Sensitivität vor.

Zusammenfassung

Die Aktivität von Stickstoffmonoxid (NO) in vivo ist das kombinierte Ergebnis seiner direkten Wirkungen, der Wirkung seiner Derivate, die durch NO-Autoxidation erzeugt werden, und der Wirkung von nitrosierten Verbindungen. Die Messung von NO-Metaboliten ist für die Untersuchung der NO-Aktivität sowohl auf Gefäßebene als auch in anderen Geweben unerlässlich, insbesondere in den experimentellen Umgebungen, in denen exogenes NO verabreicht wird. Ozonbasierte Chemilumineszenz-Assays ermöglichen präzise Messungen von NO- und NO-Metaboliten sowohl in Flüssigkeiten (einschließlich Plasma, Gewebehomogenaten, Zellkulturen) als auch in Gasgemischen (z. B. ausgeatmeter Atem). NO reagiert mit Ozon, um Stickstoffdioxid in einem angeregten Zustand zu erzeugen. Die daraus resultierende Lichtemission ermöglicht die Photodetektion und die Erzeugung eines elektrischen Signals, das den NO-Gehalt der Probe reflektiert. Aliquots aus derselben Probe können verwendet werden, um spezifische NO-Metaboliten wie Nitrat, Nitrit, S-Nitrosothiole und Eisen-Nitrosyl-Komplexe zu messen. Darüber hinaus wird NO, das von zellfreiem Hämoglobin verbraucht wird, auch mit der Chemilumineszenzanalyse quantifiziert. Eine Illustration all dieser Techniken wird zur Verfügung gestellt.

Einleitung

Seit Salvador Moncada und die Nobelpreisträger Robert Furchgott, Louis Ignarro und Ferid Murad Stickstoffmonoxid (NO) als den bisher bekannten Endothel-abgeleiteten Relaxationsfaktor (EDRF) identifiziert haben, wurde die zentrale Rolle von NO in mehreren Schlüsselmechanismen etabliert, die sich über die Gefäßbiologie, die Neurowissenschaften, den Stoffwechsel und die Wirtsantwort erstrecken 1,2,3,4,5,6,7 . Die exogene Verabreichung von NO-Gas hat sich zu einer etablierten Behandlung für Ateminsuffizienz aufgrund von pulmonaler Hypertonie beim Neugeborenenentwickelt 8. Stickstoffmonoxidgas wurde auch zur Behandlung von Infektionen mit dem respiratorischen Synzytialvirus (RSV), Malaria und anderen Infektionskrankheiten, Ischämie-Reperfusionsverletzungen und zur Vorbeugung akuter Nierenschäden bei Patienten, die sich einer Herzoperation unterziehen, untersucht 9,10,11,12. Der Bedarf an präzisen Messtechniken zur Beurteilung der NO-Werte, seiner Metaboliten und der seiner Zielproteine und -verbindungen ergibt sich sowohl aus mechanistischen als auch aus interventionellen Studien.

Aufgrund seiner hohen Reaktivität kann NO je nach biologischer Matrix, in der es hergestellt und/oder freigesetzt wird, unterschiedliche Reaktionen erfahren. In Abwesenheit von Hämoglobin (Hb) oder anderen Oxy-Hämoproteinen wird NO fast vollständig zu Nitrit oxidiert (NO2-).

2NEIN + O 2 → 2NR.2

NR. 2 + NR. → N2O3

N2O3 + H 2 O → NO2- + H+

NO wird zunächst mit molekularem Sauerstoff (O2) zu Stickstoffdioxid (NO2) autoxidiert und reagiert selbst mitNO2 zur Erzeugung von Distickstofftrioxid (N2O3). Ein MolekülN2O3reagiert mit Wasser (H2O) zu zwei Molekülen von NO2- und einem Proton (H+)13. Im Vollblutwerden 14,15, NO und NO 2- schnell in Nitrat (NO3-) umgewandelt, da diese Moleküle eifrig mit den oxidierten Hämgruppen von Hb [Hb-Fe2+-O2 oder Oxyhämoglobin (oxyHb)] reagieren, um NO3- zu erhalten. Diese Reaktion ist mit dem Übergang der Hämgruppe in den ferrischen Zustand [Hb-Fe 3+ oder Methämoglobin (metHb)] gekoppelt:

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-

Die Barriere der roten Blutkörperchen (RBC) und der unmittelbar an das Endothel angrenzende Raum sind die Hauptfaktoren, die diese Reaktion begrenzen und es einem kleinen Teil des vom Endothel freigesetzten NO ermöglichen, als EDRF16,17 zu wirken. Tatsächlich ist bekannt, dass zellfreies Hb im Kreislauf die Vasodilatation in experimentellen und klinischen Umgebungen stört17,18. Innerhalb der RBC reagiert je nach Oxygenierung undNO2-Konzentration ein Teil von NO mit Desoxyhämoglobin (Hb-Fe 2+) zu Eisen-Nitrosyl Hb (Hb-Fe2+-NO oder HbNO):

Hb-Fe2 + + NEIN → Hb-Fe2+-NEIN

Im RBC15,17 kann NO 2- Hb-Fe 3+ bilden, indem es Hb-Fe 2+ reduziert, was zur Freisetzung von NO führt, das wiederum Hb-Fe 2+-O2 (bevorzugt) oder Hb-Fe 2+ bindet.

Die Erzeugung von NO-Derivaten sollte nicht als streng unidirektional betrachtet werden, da NO aus NO2- und NO3- in verschiedenen Geweben und durch verschiedene Enzyme (z.B. durch Darmbakterien oder in Mitochondrien, insbesondere unter hypoxischen Bedingungen) regeneriert werden kann19,20.

Eine variable Menge an produziertem (oder verabreichtem) NO führt zur nachgeschalteten Erzeugung von S-Nitrosothen, hauptsächlich durch Thiol-Transnitrosierung aus N2O3 in Gegenwart eines Nucleophils, wodurch ein NO+-Donorzwischenprodukt entsteht (Nuc-NO+-NO2-):

N 2 O3 + RS- → RS-NO + NO2-

Eine weitere Möglichkeit zur Erzeugung von S-Nitrosothiolen ist die Nitrosylierung oxidierter Thiole (KEINE Reaktion mit einem oxidierten Thiol):

RS• + NEIN → RS-NEIN

Dieser Mechanismus und die direkte Thioloxidation durch NR.2 sind möglicherweise nur unter sehr spezifischen Bedingungen möglich, die an anderer Stelle21 beschrieben werden. S-Nitrosothiole reichen von leichten Molekülen wie S-Nitrosoglutathion bis hin zu großen Thiol-haltigen Proteinen. S-Nitrosohämoglobin (S-NO-Hb) wird durch Nitrosierung einer Thiolgruppe eines konservierten Cysteinrests in der β-Kette (β93C)22 gebildet.

Die Erzeugung und der Stoffwechsel von S-Nitrosothiolen sind Teil wichtiger Regulationsmechanismen. Beispiele hierfür sind die Regulation von Glutathion, Caspasen, N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) und Ryanodinrezeptoren23,24,25,26,27,28. Nitrosiertes Albumin (S-Nitroso-Albumin), das bisher als wichtiger Vermittler der NO-Biologie in vivo galt, scheint ein NO/NO+-Transporter ohne spezifische zusätzliche biologische Aktivitätzu sein 29.

Bei der Messung der Konzentration von NO und seinen Derivaten aus einer bestimmten biologischen Probe innerhalb einer biologischen Matrix ist es wichtig, Eigenschaften wie Säuregehalt, Sauerstoffversorgung, Temperatur und das Vorhandensein von Reagenzien zu berücksichtigen. Beispiele hierfür sind verabreichte exogene NO-Donatoren und, im Rahmen einer akuten Entzündung, Wasserstoffperoxid (H2O2), das mitNO2 reagiert, was zur Erzeugung einer übernormalen Konzentration von freien Radikalen wie Peroxynitrit (ONOO-)21 führt. Neben der verwendeten Analysemethode ist die präanalytische Phase der Probenvorbereitung und -lagerung von grundlegender Bedeutung. Nachgeschaltete Reaktionen, die nicht die in vivo NO-Aktivität darstellen, sind vorherzusagen, zu berücksichtigen und zu blockieren. Ein valides Beispiel ist die Instabilität von S-NO-Hb, die eine spezielle Behandlung von Blutproben erfordert, wenn es für die Messungvorgesehen ist 22.

Chemilumineszenz-basierte Assays sind der Goldstandard für den Nachweis der NO-Spiegel und seiner Hauptmetaboliten [NO2-, NO3-, S-NO- und Eisen-Nitrosyl-Komplexe (Fe-NO)] in jeder biologischen Flüssigkeit, einschließlich Gewebehomogenaten30,31. Diese Methoden basieren auf dem Chemilumineszenzdetektor (CLD), einem Gerät, das die Reaktion von NO mit Ozon (O3) beherbergt und NO 2 in einem angeregten Zustand (NO2•) erzeugt. Die Relaxation von NO2• verursacht die Emission eines Lichtphotons, das von einem Photomultiplierrohr detektiert wird, wodurch ein elektrisches Signal erzeugt wird, das direkt proportional zum NO-Gehalt des abgetasteten Gasgemisches32 ist. Es wird ein vereinfachter Schaltplan der CLD dargestellt.

Chemilumineszenz-Aufbau: NO + O₃ zu NO₂* Reaktion; Photomultiplier-Röhre; Das Diagramm zeigt die optische Emission.
Abbildung 1: Vereinfachtes Schema eines Chemilumineszenzdetektors für Stickoxidgas. Der Chemilumineszenz-basierte Nachweis von Stickstoffmonoxid (NO) ist die stöchiometrische Erzeugung eines Photons pro NO-Gasmolekül, das in den Chemilumineszenzdetektor (CLD) eingeführt wird. Die Chemilumineszenzreaktion wird in einer dafür vorgesehenen Kammer erhalten, die mit Ozon (O3) von einem internen Generator versorgt wird, der durch Verbindung mit einer externen Pumpe auf Unterdruck gehalten wird, was einen kontinuierlichen und konstanten Zufluss von Messgas ermöglicht. Die Erzeugung von O3 erfordert zweiatomigen Sauerstoff (O2), der von einem speziellenO2-Tank geliefert wird, der mit dem CLD verbunden ist (andere Hersteller bieten CLDs an, die mit Umgebungsluft betrieben werden). Innerhalb der Reaktionskammer reagiert jedes im beprobten Gas enthaltene NO-Gasmolekül mit Sauerstoff zu einem Molekül Stickstoffdioxid im aktivierten Zustand (NO2*). Durch die Rückkehr in seinen Grundzustand emittiert jedes NO2*-Molekül ein Photon, das von einer Photomultiplierröhre (PMT) neben der Reaktionskammer detektiert wird. Das PMT mit dem zugehörigen Verstärker und der zentralen Verarbeitungseinheit erzeugt ein Signal, das proportional zur Photonenzahl und der Anzahl der NO-Moleküle in der Reaktionskammer ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Der Probeneinlass des CLD kann an ein Glaswarensystem angeschlossen werden, das eine Reaktionskammer für flüssige Proben enthält. Das System wird kontinuierlich mit einem Inertgas wie Stickstoff, Helium oder Argon gespült, wodurch NO von der Reaktionskammer auf die CLD übertragen wird. Flüssigphasenproben werden durch eine spezielle Membran in den Spülbehälter injiziert.

Diagramm eines chemischen Apparates, das den Gasfluss in einem Spülgefäß mit PTFE-Hülse, NaOH-Falle, veranschaulicht.
Abbildung 2: Struktur eines Spülgefäßes für die chemilumineszenzbasierte Detektion von Stickoxidgas Das Spülgefäß (rechts) ermöglicht den Nachweis von Stickstoffmonoxid (NO) -Gas oder einer anderen Verbindung, die leicht in NO-Gas umgewandelt werden kann, wenn sie aus einem flüssigen Phasenreagenz freigesetzt wird. Der Inertgaseinlass ist an eine Quelle (Tank) eines Inertgases wie Argon, Xeon oder zweiatomigen Stickstoff (N2) angeschlossen. Das Nadelventil (öffnet sich nach links) dient zur Druckregelung innerhalb des Spülbehälters und kann zur Reinigung des Behälters vollständig entfernt werden. Der Injektionsanschluss ist von einer Kappe mit einem Membranseptum für die Probeninjektion bedeckt. Die Membran sollte oft ausgetauscht werden. Ein beheizter Mantel umgibt die Reaktionskammer und ist an ein Warmwasserbad angeschlossen, um denVCl 3 in HCl-Assay durchzuführen. Der Spülgefäßauslass ist mit dem Chemilumineszenzdetektor (CLD) oder mit der NaOH-Falle (erforderlich fürVCl 3 in HCl-Assays) verbunden. Um den Inhalt der Reaktionskammer abzulassen, schließen Sie zunächst die Absperrhähne am Inertgaseinlass und am Spülbehälterauslass, schließen Sie das Nadelventil, entfernen Sie die Kappe am Einspritzanschluss und öffnen Sie schließlich den Absperrhahn am Abfluss. Die NaOH-Falle (links) muss inline zwischen dem Spülgefäß und dem CLD platziert werden, wenn derVCl 3 in HCl-Assay aufgrund der Korrosivität von HCl durchgeführt wird. Die Verbindung mit dem CLD erfordert immer, dass ein Intensivfeld-Dielektrikum (IFD) zwischen dem CLD und dem Ausgang des Spülbehälters (oder der NaOH-Falle, falls verwendet) platziert wird. Der IFD-Filter entfernt luftgetragene Partikel und verhindert, dass Flüssigkeit durch das Spülgefäß gelangt. PTFE = Polytetrafluorethylen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Infolgedessen kann jede Verbindung, die durch eine spezifische und kontrollierte chemische Reaktion in NO umgewandelt werden kann, mit hoher Empfindlichkeit in jeder biologischen Flüssigkeit und jedem Gewebehomogenat24 nachgewiesen werden. Die direkte Messung von Gasphasen-NO durch Chemilumineszenz wird sowohl in experimentellen als auch in klinischen Umgebungen durchgeführt. Diese Techniken werden an anderer Stelle ausführlich beschrieben33,34,35. Die Messung von NO2-, S-Nitrosothiolen, S-nitrosierten Proteinen und Fe-NOs kann durch Zugabe von Proben in einem Reaktionsgemisch mit Triiodid (I3-) durchgeführt werden, das stöchiometrisch KEIN Gas aus all diesen Verbindungen freisetzt:

I3- → I2 + I-

2NO 2− +2I− +4H+ → 2NO + I 2 +2H 2 O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NEIN + I2

während I 3- nicht mit NO 3-15 reagiert. Präzise Messungen jeder Verbindung werden durch die Vorbehandlung von Probenaliquoten mit angesäuertem Sulfanilamid (AS) mit oder ohne Quecksilberchlorid (HgCl2) ermöglicht. Insbesondere entfernt die Vorbehandlung mit AS alle NO 2-Inhalte. Infolgedessen spiegelt der von der CLD gemessene NO-Gehalt nur die Summe der S-NO- und Fe-NOs-Konzentration wider. Die Injektion von HgCl 2 in eine Probe aliquot vor der AS-Injektion bewirkt, dass NO2- durch S-NO freigesetzt wird. Die Behandlung mit AS (die zur NO2-Entfernung führt) stellt sicher, dass der gemessene NO-Gehalt nur die Konzentration von Fe-NOs widerspiegelt. Eine Reihe von Subtraktionen zwischen den Bewertungen ermöglicht es, die genaue Konzentration der drei NO-Derivatezu berechnen 22.

Sequenzielles biochemisches Analysediagramm mit Schritten zum Mischen von Reagenzien, Inkubation und Messung von Verbindungen.
Abbildung 3: Schritte in der Probenvorbereitung für denI3- in Essigsäure-Chemilumineszenz-Assay. Die sequentiellen Schritte zur Herstellung des I-3-in-Essigsäure-Chemilumineszenz-Assays sind dargestellt. Die Verwendung von lichtgeschützten Zentrifugenröhrchen ist erforderlich. Die Röhrchen 1, 2 und 3 werden zur Vorbereitung auf den Assay verwendet. Ein weiteres Probenaliquot (Tube 4) wird für denVCl 3 in HCl-Assay benötigt, wenn die Messung von Nitrat (NO3-) erforderlich ist. Die Schritte werden durch rot markierte Zahlen gekennzeichnet. Vorfüllen (Schritt 1) wie angegeben mit Phosphatpufferkochsalzlösung (PBS) oder HgCl2 vor Zugabe des Probenvolumens. Fügen Sie das Probenvolumen (2) wie angegeben hinzu, wirbeln Sie es ein und inkubieren Sie es für 2 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Fügen Sie (3) PBS oder angesäuertes Sulfanilamid (AS) wie angegeben, Wirbel hinzu und inkubieren Sie für 3 Minuten bei RT. Führen Sie den Assay aus (4). Die durch den Assay gemessene Konzentration ist die Summe der Konzentration der Verbindungen, die unter jedem Röhrchen berichtet werden. Röhre Nummer 1 ermöglicht Messungen von Nitrit (NO2-), S-Nitrosothiolen (S-NO) und Eisen-Nitrosyl-Komplexen (Fe-NOs) als ein einziges Signal. Für die Nitratmessung (NR.3-) sind die Proben sowohl mit I 3- in Essigsäure als auch mitVCl 3 in HCl-Assays zu verwenden, und der aus Röhrchen 1 erhaltene Wert ist von dem aus Röhrchen 4 erhaltenen Wert zu subtrahieren. *empfohlene Mengen für die Hb-Analyse zur Bestimmung vonRest-NO2-, S-Nitrosohämoglobin und Eisen-Nitrosyl-Hämoglobin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Für die NO3-Messung wird Vanadium(III)-chlorid (VCl3) in Salzsäure (HCl) zur Umwandlung von NO 3- in NO im Spülgefäß verwendet, um NO3- stöchiometrisch mit der CLD zu messen:

2 NR.3-+ 3V+3 + 2H 2 O →2NO+ 3VO2+ + 4H+

Um eine ausreichend schnelle Umwandlung zu erreichen, muss die Reaktion bei 90-95 °C durchgeführt werden. Die Reduktion von NO3- auf NO 2- ist gekoppelt mit der Reduktion von NO2- auf NO durch HCl. Vanadiummetall reduziert auch S-NOs und setzt ihre NO-Einheit 22,36 frei. Die endgültige Konzentration, die CLD mitVCl 3 in HCl erhält, spiegelt die Gesamtkonzentration von NO3-, NO2 und anderen nitrosierten Verbindungen wider. Die Subtraktion des letztgenannten Wertes von der mit CLD mit I 3- ergebenden Konzentration ermöglicht die Berechnung der NO 3- Konzentration36,37 (Abbildung 3).

Im NO-Verbrauchsassay erzeugt die kontinuierliche Freisetzung von NO im Spülgefäß durch NO-Donatoren wie (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolate (DETA-NONOate) ein stabiles Signal, das die Quantifizierung von zellfreiem oxyHb in den injizierten Proben ermöglicht. Die Menge an NO, die im Spülgefäß verbraucht wird, steht in einer stöchiometrischen Beziehung zur Menge an oxyHb in der Probe38.

Protokolle zur Messung vonNO2-,NO3-, S-Nitrosothiolen, Eisen-Nitrosyl-Komplexen und NO-Verbrauch durch zellfreies Hb in Plasmaproben sind dargestellt. Studien zu NO in der RBC-Umgebung erfordern eine spezifische Probenbehandlung, gefolgt von einer Ausschlusschromatographie, um extrem fragile S-NO-Hb und Hb-NO in Verbindung mit der Bestimmung der Hb-Gesamtkonzentration15,22 zu messen. Die Probenvorbereitung ist für die Korrektur der Messung von entscheidender Bedeutung. Die Präexistenz von NO2- inH2Ound die Freisetzung vonNO2- während des Assays können zur Messung künstlich höherer Konzentrationen von NO-Derivaten wie S-NO-Hb 14,39 führen. Wichtige Aspekte der Probenvorbereitung werden ebenfalls vorgestellt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die in diesem Protokoll angegebenen Verfahren entsprechen dem Überprüfungsausschuss des Massachusetts General Hospital. Die Blutproben, die verwendet wurden, waren während einer früheren Studie gesammelt worden und wurden für den aktuellen Zweckde-identifiziert 18.

HINWEIS: In den Anweisungen des Herstellers finden Sie spezifische Anleitungen zu optimalen Verbindungen zwischen Schläuchen und Glaswaren, die das Spülgefäß, das Waschen und die allgemeine Wartung bilden. Die Verbindungen müssen fest und sorgfältig hergestellt sein, um die Glaswaren nicht zu beschädigen. Identifizieren Sie die Komponenten des Glasspülbehälters: Gaseinlassleitung, Spülbehälter mit Heizmantel und Kondensator, Natriumhydroxid (NaOH) Gasblasenfalle, Verbindungsleitung zwischen dem Spülbehälter und dem Bubbler, Spülbehälterauslassgasleitung (zu CLD), die mit einem Intensivfeld-Dielektrikum (IFD) ausgestattet ist. Eine IFD-Filterleitung zwischen dem Spülgefäß und dem Probeneinlass des CLD muss jedes Mal vorhanden sein, wenn KEINE Metaboliten in flüssiger Form (Plasma, Zellkulturen, Gewebehomogenate) gemessen werden (alle im Protokoll vorgestellten Assays). Die Probenvorbereitung hängt von der analysierten Flüssigkeit oder dem analysierten Gewebe und von den interessanten Verbindungen ab. Wichtige Aspekte der präanalytischen Phase werden in den Abschnitten 1 und 2 behandelt. Spezifische Vorbereitungsschritte für spezifische Assays sind in den Abschnitten 3-5 enthalten. Die Abschnitte 6-8 gelten für alle Assays.

1. Herstellung spezieller Reagenzien

HINWEIS: Weitere Einzelheiten sind den früheren Veröffentlichungen15,22 zu entnehmen.

  1. Bereiten Sie 5% (290 mM) angesäuerte Sulfanilamid (AS) Lösung zur NO 2-Entfernung vor, indem Sie 500 mg Sulfanilamid in 10 ml 1N HCl auflösen. Diese Lösung ist monatelang stabil.
  2. 50 mM Quecksilberchlorid (HgCl2)-Lösung für die NO2-Freisetzung aus S-NOs herzustellen, indem67,9 mgHgCl2 in 5 ml PBS aufgelöst werden. Schützen Sie die Lagerlösung vor Licht.
  3. Herstellen einer NO2-blockierenden Lösung mit 800 mM Ferricyanid [K3Fe(CN)6] zur Oxidation von Hb zusammen mit 100 mM N-ethylmaleimid (NEM) zur Blockierung von Thiolgruppen und (OPTIONAL) 10% Nonylphenyl-Polyethylenglykollösung (Nonidet p-40) zur Auflösung von Erythrozytenmembranen.
    1. Fügen Sie K3Fe (CN) 6 zu deionisiertem und destilliertem Wasser (ddH2O, 263,5 g Pulver pro Liter) hinzu, um eine Endkonzentration von 800 mM zu erhalten.
    2. Geben Sie NEM zu der 800 mM K3Fe (CN) 6 in ddH2O-Lösung (12,5 g Pulver pro Liter bei einer Konzentration von 100 mM) und mischen Sie die Lösung, um alle Kristalle aufzulösen.
    3. Fügen Sie einen Teil von 10% NP-40 zu neun Teilen der 800 mM NEM K3Fe (CN) 6 100 mM NEM-Lösung (111 ml pro Liter) hinzu und mischen Sie gut (obligatorischer Schritt für die Vollblutanalyse).
  4. Bereiten Sie die S-NO-Hb-Stabilisierungslösung vor, die 12 mM K 3 Fe(CN)6,10 mM NEM, 100 μM Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA, für Metallchelatierung) und 1% Nonidet p-40 Reinigungsmittel aus ihren Stammlösungen enthält.
    1. Bereiten Sie eine 200 mM NEM-Lösung vor, indem Sie NEM-Kristalle zu PBS geben (25 mg/ml, z. B. 250 mg in 10 ml PBS) und mischen Sie die Lösung, bis alle Kristalle gelöst sind (am Experimenttag herzustellen).
    2. Es wird eine 800 mM K3 Fe(CN)6-Lösung durch Zugabe von K3 Fe(CN)6 zu ddH2 O (263,5mg/ml, z. B.1,32gin 5 mL ddH2O) hergestellt, um eine Endkonzentration von 800 mM zu erhalten (am Versuchstag vorzunehmen).
    3. Bereiten Sie eine 10 mM DTPA-Stammlösung vor, indem Sie 786 mg DTPA zu 200 ml ddH2O hinzufügen und den pH-Wert mit 5N NaOH auf 7,0 einstellen, um DTPA vollständig zu lösen.
    4. 5 ml 200 mM NEM-Lösung, 1,5 ml 800 mM K3Fe(CN)6-Lösung und 1 mL DTPA-Stammlösung zu 81,5 ml PBS bei 7,2 pH und schließlich 11 ml 10% NP-40 hinzufügen, um das Endvolumen auf 100 ml zu bringen.

2. Probenentnahme

HINWEIS: Weitere Informationen zur Beispielsammlung finden Sie in den zuvor veröffentlichten Werken 15,22,40.

  1. Vollblut sammeln
    1. Sammeln Sie Blut in heparinbeschichteten Röhrchen, wobei Sie venöse gegenüber arteriellen Gefäßen bevorzugen (sofern nicht ausdrücklich erforderlich) und Katheterplatzierung gegenüber Venenpunktion (wenn möglich) mit Katheter oder Nadelbohrung von mindestens 20 G oder mehr bevorzugen, um die Hämolyse zu minimieren.
    2. Sofort die NO 2-blockierende Lösung (1 Teil der Lösung zu 4 Teilen Vollblut) hinzufügen, verarbeiten (Abschnitte 3 oder 4) oder einfrieren und bei -80 °C lagern.
  2. Sammeln Sie Plasma und rote Blutkörperchen (RBCs)
    1. Sammeln Sie Blut in heparinbeschichteten Röhrchen, die venöses gegenüber arteriellem Blut bevorzugen (sofern nicht ausdrücklich erforderlich) und Nadeln von mindestens 20 g oder mehr, um die Hämolyse zu minimieren, und zentrifen Sie sofort für 5 min bei 4000 x g bei 4 ° C.
    2. Mischen Sie den Überstand (Plasma) mit der NO 2-blockierenden Lösung (1 Teil der Lösung auf 4 Teile des Überstands) in einem neuen Röhrchen und Verfahren (Abschnitte 3 oder 4) oder frieren Sie es ein und lagern Sie es bei -80 °C.
      HINWEIS: Für den NO-Verbrauchsassay kann die NO 2-Blockierungslösung nicht verwendet werden. Der Assay kann ohne Plasmavorbehandlung durchgeführt werden.
    3. Resuspendiert das RBC-Pellet von unten in ein neues Röhrchen, das mit S-NO-Stabilisierungslösung vorgefüllt ist (siehe Schritt 1.4) (1 ml Pellet auf 9 ml Lösung) und 5 min inkubieren.
    4. Führen Sie das RBC-Lysat in einer Größensäule mit G-25 Sephadex-Polymer durch, das zuvor mit ddH2O für die Ausschlusschromatographie gespült wurde
    5. Die Hb-Fraktion wird gesammelt, um sie zu verarbeiten (Abschnitt 4) und die Hb-Konzentration mit dem Drabkin-Reagenz zu messen (zur Hb-Messung siehe zuvor veröffentlichte Arbeit22).
      HINWEIS: Um ein bestimmtes Gewebe / Organ vorzubereiten und zu beproben, identifizieren Sie sein Hilum und isolieren Sie es chirurgisch. Schneiden Sie die Vene ein, punktieren Sie die Arterie und injizieren Sie heparinisierte Kochsalzlösung (10 U / ml) über die Arterie. Schneiden Sie das Gewebe aus, wenn die Kochsalzlösung am venösen Schnitt zu fließen beginnt. Homogenisieren Sie das Gewebe mit einem mechanischen Homogenisator, während Sie 1 Teil der NO 2-blockierenden Lösung zu 4 Teilen des homogenisierten Gewebes hinzufügen.

3.VCl3 in der HCl-Assay-Vorbereitung

HINWEIS: Weitere Einzelheiten zuVCl 3 in der HCl-Assay-Vorbereitung finden Sie in den zuvor veröffentlichten Arbeiten37,41.

ACHTUNG: Die CLD wird beschädigt, wenn die NaOH-Falle bei der Durchführung dieses Assays nicht ordnungsgemäß angebracht ist. Dies ist auf die Korrosivität von HCl zurückzuführen.

  1. Bereiten Sie Standardlösungen von NO3- für die Standardkurve vor
    1. 85 mgNaNO3 in 10 ml ddH2O auflösen, um 0,1 M NaNO3- zu erhalten (diese Lösung bleibt einige Wochen stabil).
    2. Verwenden Sie die Stammlösung, um Standards durch Verdünnung in ddH2O herzustellen, um Konzentrationen von 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μMNaNO 3 zu erhalten, um eine Kalibrierkurve für Plasma- oder Urinproben durchzuführen (verwenden Sie niedrigere Konzentrationen, wenn Sie mit Zellkulturen arbeiten).
  2. Herstellung der mitVCl 3 (Vanadiumchlorid) gesättigten Lösung zur NO3- Reduktion im Spülgefäß
    ACHTUNG: Die Reaktion von Wasser undVCl3 ist exotherm. Achten Sie beim Hinzufügen von Säure und beim Spülen der Glaswaren am Ende des Experiments auf eine hohe Glasindustrie.
    1. 1,6 g VCl 3 in 200 ml 1 M HCl lösen, indem zuerstVCl 3 in einensauberen Kolben gegeben und dann 200 ml 1 M HCl zugegeben werden.
    2. Vakuumfiltern Sie die Lösung durch Filterpapier (z. B. 11 μm Filterpapier, aber jedes Filterpapier kann verwendet werden).
      HINWEIS: Die gefilterte Lösung wird klar blau, während die ungefilterteVCl 3-Lösung aufgrund ungelöster Partikel braun ist.
    3. Halten Sie die gesättigte Lösung entweder mit Aluminiumfolie oder Polytetrafluorethylen (PTFE) -Band bedeckt, da die Verbindung lichtempfindlich ist.
  3. Bereiten Sie das zirkulierende Wasserbad vor
    1. Schließen Sie ein zirkulierendes Wasserbadgerät an den Wassermantel des Spülgefäßes an. Stellen Sie sicher, dass die Leitungen vor dem Grundieren trocken sind.
    2. Starten Sie das Wasserbad bei 95 ° C und überprüfen Sie, ob keine Lecks an den Wasserleitungen vorhanden sind, indem Sie (nicht haftende) Papiertücher um die Leitungen herum anbringen.
  4. Richten Sie die Gasblasenfalle ein
    1. Stellen Sie sicher, dass die PTFE-Hülse des Bubblers an Ort und Stelle ist und nicht beschädigt ist.
    2. Öffnen Sie den Gasblaser und injizieren Sie 15 ml 1 M NaOH in den Bubbler-Boden.
    3. Positionieren Sie den Gasblaser neu und dichten Sie die Verbindung dicht ab, indem Sie die Unterseite nach oben drücken und die beiden Teile leicht verdrehen. Die Unmöglichkeit, die Oberseite des Bubblers ohne Kraftaufwand zu drehen, deutet auf eine korrekte Abdichtung hin.
    4. Schließen Sie den Auslass des Spülbehälters an den Einlass der Gasblasenfalle an.

4. I3- in Essigsäure-Assay-Zubereitung

ANMERKUNG: Weitere Einzelheiten zu I3- in der Essigsäure-Assay-Vorbereitung finden Sie in den zuvor veröffentlichten Arbeiten15,22,38,41,42.

  1. Standardkurve für NO2- vorbereiten
    1. Bereiten Sie eine Stammlösung vor, indem Sie 69 mg Natriumnitrit (NaNO2) in 10 ml ddH2O auflösen, um eine 100 mM Lösung zu erhalten. Diese Lösung ist stabil, wenn sie in einem luftdichten Behälter gelagert, gekühlt und vor Licht geschützt ist.
    2. Verdünnen Sie die Stammlösung seriell in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 900 μL ddH2O vorgefüllt ist: Geben Sie 100 μL der Stammlösung in das erste Zentrifugenröhrchen, mischen, etikettieren und verwenden Sie 100 μL des Röhrchens für das zweite Röhrchen, dann wiederholen Sie es, was zu 10 mM, 1 mM und dann 100 μM führt.
    3. Weiter verdünnen mit ddH2O, um 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM und 500 nMNaNO2 Aliquots zu erhalten, die in der Kalibrierkurve verwendet werden sollen.
  2. Bereiten Sie die I3- in Essigsäure für das Spülgefäß vor (kann bei Raumtemperatur (RT) für 1 Woche gelagert werden)22
    1. 2 g Kaliumiodid (KI) und 1,3 g Jod (I2) zu 40 ml ddH2O und 140 ml Essigsäure hinzufügen.
    2. Gründlich mischen, indem Sie die Mischung für mindestens 30 min umrühren.
  3. Vorbereitung der Proben für die differentielle Bestimmung von NO2-, S-Nitrosothiolen (S-NO-Hb, wenn Hb gesammelt wird) und Eisen-Nitrosyl-Komplexen (Hb-NO, wenn Hb gesammelt wird) (Abbildung 3)
    1. Teilen Sie jede Probe in 3 Aliquots von 270 μL (900 μL Hb bei Messung von S-NO-Hb und Hb-NO) in lichtgeschützten Mikrozentrifugenröhrchen, von denen 2 mit 30 μL 1x PBS (100 μL bei Messung von S-NO-Hb und Hb-NO) und das dritte Röhrchen mit 30 μL HgCl2 (100 μL bei Messung von S-NO-Hb und Hb-NO) vorgefüllt sind, 2 Minuten lang bei RT vorwirbeln und inkubieren (Abbildung 3).
    2. 30 μL von 5% AS in die Probe mit HgCl2 zur Messung von Fe-NOs (100 μL für Hb-NO) und zu einer mit zugesetztem PBS zur Messung von S-NOs und Fe-NOs (100 μL für S-NO-Hb undHb-NO) und 30 μL PBS zu der bereits mit 1x PBS vorgefüllten PBS hinzufügen, um NO2-, S-NOs und Fe-NOs (100 μL für Rest-NO2- aus der Hb-Sammlung) zu messen, S-NO und Hb-NO). Vortex und Inkubation bei RT für 3 min (Abbildung 3).

5. KEIN Verbrauch durch zellenlosen Hb-Aufbau

HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in der zuvor veröffentlichten Arbeit38.

  1. Herstellung von Standard-oxyHb-Lösungen aus einer gereinigten Hb-Lösung mit bekannter Konzentration
    1. Die Stammlösung wird durch Zugabe von ddH2O in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen verdünnt, um die Lösungen zu erhalten, die für die Kalibrierkurve verwendet werden: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM, 1,56 μM.
  2. Vorbereiten der DETA-NONOate-Lösung
    1. Fügen Sie 10 mg DETA-NONOat zu 610 μL 10 μM NaOH in pH 7,4 PBS hinzu, um 100 mM DETA-NONOat zu erzeugen und es auf Eis zu halten.

6. Starten Sie den Chemilumineszenzdetektor (CLD) und bereiten Sie das Spülgefäß vor

HINWEIS: Für die Vorbereitung des Spülgefäßes verweisen wir auf die zuvor veröffentlichte Arbeit43.

  1. Überprüfen der Hauptverbindungen zur und von der CLD
    1. Schließen Sie die Sauerstoffleitung an die CLD an und öffnen Sie den Sauerstofftank bei einem Druck, der mit dem Hersteller der CLD übereinstimmt.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Intense Field Dielectric (IFD)-Filterleitung mit dem CLD, aber nicht mit dem Spülbehälter oder der NaOH-Falle verbunden ist.
  2. CLD starten
    1. Starten Sie auf der CLD-Schnittstelle das Detektionsprogramm für Flüssigphasenassays.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Sauerstoffversorgung ausreichend ist. Wenn dies der Fall ist, startet der CLD erfolgreich die Abtastung von seinem Eingang und zeigt die Detektion durch ein Signal in Millivolt (0-5 mV) an. Andernfalls fordert die CLD ein negatives Diagnosesignal an.
  3. Bereiten Sie das Spülgefäß vor
    1. Schließen Sie das Spülgefäß an allen drei Anschlüssen: Schrauben Sie das Nadelventil vollständig nach rechts, schließen Sie die Einlass- und Auslasshähne.
    2. Entfernen Sie die Kappe aus dem Spülgefäß und geben Sie der Reaktionskammer eine ausreichende Menge des für den geplanten Assay spezifischen Reagenzes hinzu (Tabelle 1), damit die zum Einspritzen der Proben verwendete Spritzennadel die Flüssigkeitssäule erreichen kann.
    3. Überprüfen Sie, ob eine stabile gewünschte Baseline vorhanden ist (Tabelle 1).
  4. Starten Sie den Spülgasstrom
    1. Stellen Sie sicher, dass der Inertgastank (z. B.N2) mit einem zweistufigen Regler ausgestattet ist, und verbinden Sie den Inertgastank mit dem Gaseinlass des Behälters.
    2. Öffnen Sie das Gas mit einem Ausgangsdruck am Regler von 1-5 psi, öffnen Sie den Einlass des Spülbehälters und öffnen Sie langsam das Nadelventil des Spülbehälters, um den Zufluss von Gas zu ermöglichen. Überprüfen Sie das Blubbern innerhalb des Spülgefäßes.
  5. Passen Sie den Gasfluss an
    1. Erfassen Sie den vom CLD gemessenen Zelldruck mit der IFD-Filterleitung zur Probenahme der Umgebungsluft.
    2. Positionieren Sie die Kappe am Spülbehälter neu, schließen Sie die IFD-Filterleitung an den Spülbehälter (oder an die NaOH-Falle imVCl 3 im HCl-Assay) an und öffnen Sie den Auslass des Spülbehälters.
    3. Verwenden Sie das Nadelventil, um den gleichen Zelldruck auf dem CLD-Niveau zu erreichen, der in der Umgebungsluft aufgezeichnet wird.

7. Experiment

HINWEIS: Weitere Informationen zum Experiment finden Sie in der zuvor veröffentlichten Arbeit43.

  1. Starten Sie das Programm zur Erfassung von Chemilumineszenzsignalen
    1. Verbinden Sie die serielle Schnittstelle des CLD mit der seriellen Schnittstelle des Computers, in der das Erfassungsprogramm installiert wurde.
    2. Führen Sie das Analyseprogramm aus.
    3. Klicken Sie auf Erwerben, wählen Sie den Ordner aus, in dem die .data-Datei gespeichert werden soll, geben Sie den Dateinamen ein und klicken Sie auf Speichern.
      HINWEIS: Beachten Sie die voreingestellte Laufzeit auf dem Bildschirm, da die Aufzeichnung automatisch beendet wird, wenn die voreingestellte Zeit abgelaufen ist. Bei Bedarf kann die voreingestellte Laufzeit erhöht werden.
  2. Bereiten Sie sich auf wiederholte Probeninjektionen vor
    1. Passen Sie die Spannungsskala auf dem Bildschirm an, um die Kontrolle über die angestrebte Baseline zu haben, indem Sie auf die Schaltflächen Minimum und / oder Maximum klicken und dann den gewünschten Wert eingeben.
    2. Lassen Sie ein 20- oder 50-ml-Röhrchen mit ddH2O füllen, um die Spritze zwischen den Proben zu spülen.
    3. Halten Sie eine Schachtel mit empfindlichen Aufgabentüchern bereit.
  3. Probeninjektion
    HINWEIS: Beginnen Sie mit den Standardlösungen für die Kalibrierkurve (injizieren Sie von den am wenigsten konzentrierten zu den konzentriertesten Proben), fahren Sie dann mit den Experimentproben fort (erwägen Sie, dies in Duplikaten oder Verdreifachungen zu tun).
    1. Spülen Sie die Spritze mindestens zweimal oder öfter mit ddH 2 O ab, bevor Sie jede Probe entnehmen (und nach jeder Injektion), und überprüfen Sie jedes Mal den ungehinderten Wasserauswurf auf einem Aufgabentuch.
    2. Setzen Sie die Spritze in das Probenröhrchen ein, während Sie sowohl die Spritze als auch das Röhrchen in einem engen Abstand halten, ziehen Sie den Kolben auf das gewünschte Volumen hoch, während Sie sicherstellen, dass keine Luftblase und / oder nicht homogenisierte feste Teile eingeschlossen werden.
    3. Reinigen Sie die Spitze der Spritze mit einem Aufgabenwischer, setzen Sie die Spritze dann in die Septakappe am Injektionsanschluss ein und injizieren Sie, nachdem Sie überprüft haben, dass sich die Spitze der Spritze innerhalb der flüssigen Phase in der Reaktionskammer befindet.
  4. Markieren Sie die Injektion im Softwareprogramm und warten Sie
    1. Stellen Sie sicher, dass die Injektion eine Veränderung des Signals nach oben bewirkt (Ergänzende Abbildung 1) (nach unten im NO-Verbrauch durch zellfreien Hb-Assay), geben Sie den Probennamen ein, indem Sie auf das graue Feld unter Probennamen klicken und dann auf Injektion markieren klicken.
      HINWEIS: Vermuten Sie eine Spritzenobstruktion, wenn die Probeninjektion kein Signal erzeugt.
    2. Warten Sie, bis das elektrische Signal wieder die Grundlinie erreicht hat (dies dauert normalerweise 3-4 Minuten). Diese Zeit kann verwendet werden, um Schritt 7.3.1 auszuführen.
  5. Wiederholen Sie alle in den Schritten 7.3 und 7.4 angegebenen Schritte während und nach jeder Injektion bis zum Ende des Experiments. Denken Sie daran, eine Stichprobe der Erhaltungslösung auszuführen (falls verwendet)
  6. Stoppen Sie das Experiment
    1. Klicken Sie auf STOP , um die Signalerfassung zu unterbrechen, stoppen Sie die CLD und schalten Sie das Wasserbad aus (wenn NO3- gemessen wird).
    2. Unterbrechen Sie den Gasfluss, öffnen Sie das Nadelventil, entfernen Sie die Kappe aus dem Spülbehälter, stellen Sie einen Abfallbehälter unter den Abfluss und öffnen Sie den Abtropfarmhahn.
      HINWEIS: Wenn das Experiment eine Datenerfassung von mehr als 60 Minuten erfordert, ist es notwendig, die Erfassung nach 60 Minuten Laufzeit neu zu starten (Schritt 7.1.3 wiederholen) und eine neue Datei zu erstellen.

8. Messungen und Berechnungen

HINWEIS: Messungen und Berechnungen werden offline durchgeführt und können zu einem anderen Zeitpunkt durchgeführt werden.

  1. Starten Sie das Chemilumineszenz-Erfassungsprogramm für die Offline-Datenanalyse
    1. Starten Sie das Programm und klicken Sie auf Verarbeiten.
    2. Wählen Sie die Experimentdatei aus und klicken Sie dann auf Öffnen.
  2. Berechnen Sie die Fläche unter der Kurve für jede Verwaltung
    1. Die Software stellt automatisch auf dem Bildschirm die Basislinie (Ergänzende Abbildung 2A, horizontale gelbe Linie) und die Peakachse jeder Welle dar, die von jeder Probenverabreichung erzeugt wird (vertikale gelbe Linien): Überprüfen Sie ihre korrekte Position (oder passen Sie sie an, indem Sie auf jede Linie klicken und sie mit der Maus oder den Pfeilen bewegen) und klicken Sie auf Schwellenwert OK (Ergänzende Abbildung 2B).
      HINWEIS: Beim NO-Verbrauch durch zellfreien Hb-Messassay gelingt es der Software in der Regel nicht, die durch die Probeninjektion erzeugte Wellenform korrekt zu erfassen. Durch Zoomen auf jede Wellenform kann der Bediener die Software bei der Flächenberechnung leicht unterstützen (Ergänzende Abbildung 2).
    2. Die Software stellt automatisch den Anfang (vertikale grüne Linie) und das Ende (vertikale rote Linie) jedes Peaks grafisch dar, der durch jede Probenverabreichung verursacht wird: Überprüfen Sie ihre korrekte Position (oder passen Sie sie an, indem Sie auf jede Linie klicken und sie mit der Maus oder den Pfeilen bewegen) und klicken Sie auf Integrieren (Ergänzende Abbildung 2C).
      HINWEIS: Einige Bereiche in der Spur können an dieser Stelle fälschlicherweise als Injektionen definiert werden, und einige Spitzen können automatisch zweimal gezählt werden. Beide Fehler können in Schritt 8.2.2 erneut identifiziert und entfernt werden.
    3. Die Software gleicht automatisch jeden Signalbereich nach einer während des Experiments markierten Injektion und dem zugewiesenen Namen ab: Navigieren Sie zu jedem Gipfel (gekennzeichnet durch eine gelbe vertikale Linie) mit dem zugewiesenen Namen, indem Sie auf Nächster Peak und Vorheriger Peak klicken, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche All OK, um schließlich die Berechnung für alle Bereiche auf dem Bildschirm zu erhalten.
    4. Um alle vom Benutzer oder vom Programm gemachten Benennungs- oder Übereinstimmungsfehler zu korrigieren, verwenden Sie nach Bedarf die in der Zusatzdatei 1 angegebenen Schaltflächen.
  3. Übertragen Sie die Werte der Kalibrierkurve in eine Kalkulationstabelle und generieren Sie eine lineare Regressionsgleichung (Ergänzende Abbildung 3)
    1. Übertragen Sie die Daten aus dem CLD-Programm per Kopieren und Einfügen in eine neue Tabelle. Ordnen Sie die beiden Spalten im Datenblatt als Stichprobenkonzentration und Fläche unter der Kurve an, und fügen Sie in beiden Spalten den übereinstimmenden Wert Null hinzu.
    2. Wählen Sie die beiden Spalten aus, klicken Sie auf > Punkt, und wählen Sie dann im Menü Diagrammentwurf die Option Diagrammelement > Trendlinie > linear hinzufügen aus.
    3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die generierte Trendlinie, klicken Sie auf Trendlinie formatieren und klicken Sie dann im Menü Trendlinie formatieren auf die Optionen Gleichungen im Diagramm anzeigen und R-Quadrat-Wert im Diagramm anzeigen, um eine einfache lineare Kalibrierungsgleichung zu erhalten.
  4. Übertragen Sie die berechnete Fläche jeder Probe, um ihre Konzentration zu berechnen (Ergänzende Abbildung 3)
    1. Melden Sie jeden Wert in der Tabelle. In der nächsten Spalte ist die Gleichung aus Schritt 8.3.3 anzuwenden, um die Konzentration jeder injizierten Probe zu erhalten, wobei y die Konzentration (Wert der neuen Säule) und x die nach der Injektion gemessene Fläche unter der Kurve ist.
      HINWEIS: Denken Sie daran, die in der Konservierungslösung gemessene Konzentration (falls verwendet) zu berücksichtigen und die Werte entsprechend zu subtrahieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Der NO-Verbrauch durch zellfreien Hb-Assay wurde in Proben verwendet, die bekannte Konzentrationen von zellfreiem oxyHb enthielten (Abbildung 4). Da ein Häm von oxyHb stöchiometrisch ein NO-Molekül im Assay freisetzt, wird gereinigtes zellfreies oxyHb verwendet, um die Kalibrierkurve für den Assay zu erstellen (Ergänzende Abbildung 3).

Die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen zellfreiem Hb (gemessen mit einem kolorimetrischen Assay) und NO-Verbrauch ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Aufgrund der hohen Sensitivität haben Chemilumineszenz-basierte Assays zur Bestimmung von NO und verwandten Verbindungen ein hohes Risiko einerNO2-Kontamination. Jedes Reagenz (insbesondere die NO-2-Blockierungslösung) und jedes Verdünnungsmittel (einschließlich ddH 2 O), das im Experiment verwendet wird, sollte auf seinenNO-2-Gehaltgetestet werden, um das Hintergrundsignal zu korrigieren. Nitrit ist extrem reaktiv mit einer Halbwertszeit im Vol...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

L.B. erhält Gehaltsunterstützung von K23 HL128882/NHLBI NIH als Principal Investigator für seine Arbeit an Hämolyse und Stickoxid. LB erhält Zuschüsse von "Fast Grants for COVID-19 research" am Mercatus Center der George Mason University und von iNO Therapeutics LLC. B.Y. wird durch Zuschüsse von einem NHLBI/#R21HL130956 und DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244) unterstützt. B.Y. erhielt bei MGH Patente auf die elektrische Erzeugung von Stickstoffmonoxid.

L.B. und B.Y. haben eine Patentanmeldung für NO delivery bei COVID-19-Krankheit eingereicht PCT-Anmeldenummer: PCT/US2021/036269 eingereicht am 7. Juni 2021. RWC erhält Gehaltsunterstützung von Unitaid als Hauptprüfer für die Technologieentwicklung zur dezentralen Diagnose von Tuberkulose bei Kindern in ressourcenarmen Umgebungen.

Danksagungen

Die in diesem Manuskript berichteten Protokolle wurden durch die gesammelten Beiträge früherer Stipendiaten von Dr. Warren Zapols Labor für Anästhesieforschung in der Intensivmedizin, Abteilung für Anästhesie am Massachusetts General Hospital, ermöglicht. Wir danken Dr. Akito Nakagawa, Dr. Francesco Zadek, Dr. Emanuele Vassena, Dr. Chong Lei, Dr. Yasuko Nagasaka, Dr. Ester Spagnolli und Dr. Emanuele Rezoagli.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EssigsäureSigma45754500 mL - flüssig
Antifoam B EmulsionSigmaA5757250 mL - flüssig
DETA NONOateCayman8212010 mg
Gibco DPBS (1x) kein Calcium, kein MagnesiumThermoFisher14190144500 mL
Salzsäure 37% (1 M)Sigma258148500 mL - flüssig
JodSAFC207772100 g - fest
KimwipesKimtech34155
Quecksilber (II) Chlorid ACS Reagenz> 99,5%Sigma215465100 g - fest (in Wasser löslich)
Mili-Q WasseraufbereitungssystemMillipore
Modell 705 RN 50 μ L SpritzeHamilton80530Mikroliter Spritze
Modell 802 N 25 μ L SpritzeHamilton84854Mikroliter-Spritze
N-EthylmaleimidSigma426025 g - kristalliner
Stickstoffmonoxid-Analysator + Bundle Software - SpülgefäßZysenseNOA 280iChemilumineszenz-Detektor
Nonidet p-40  (NP-40)ThermoFisher8512510% - 500 mL
Kaliumhexacyanoferrat (III) ACS Reagenz > 99%Sigma244023100 g - Pulver
Kaliumiodid ACS Reagenz> 99%Sigma221945100 g - festes
Kaliumnitrit-Kristall. Für die Analyse: EMSURE ACSSupelco105067250 g - kristallin
PowerGen 125Fisher Scientific14-359-251Mechanischer Homogenisator
RV3 Zweistufige DrehschieberpumpeEdwardsA65201906Vakuumpumpe - Gebündelt mit Analysator
Natrium-Heparin - BD Hemogard CloBD BiosciencesBD367871 75 USP-Einheiten
Natriumhydroxid wasserfreies ACS-Reagenz ≥ 97%Sigma7954291 kg - Pellets
Natriumnitrat ACS Reagenz > 99%Sigma221341500 g - Pulver
Natriumnitrit > 99%SigmaS2252500 g - kristallines
Sulfanilamid > 98%SigmaS9251100 g - fest
Vanadium (III) ChloridSigma11239325 g - fest - Achtung (exotherm)
Whatman 1 FilterpapierSigmaWHA10010155

Referenzen

  1. Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  2. Furchgott, R. F. The discovery of endothelium-derived relaxing factor and its importance in the identification of nitric oxide. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 276 (14), 1186(1996).
  3. Ignarro, L. J., Buga, G. M., Byrns, R. E., Wood, K. S., Chaudhuri, G. Endothelium-derived relaxing factor and nitric oxide possess identical pharmacologic properties as relaxants of bovine arterial and venous smooth muscle. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 246 (1), 218-226 (1998).
  4. Arnold, W. P., Mittal, C. K., Katsuki, S., Murad, F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3':5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8), 3203-3207 (1977).
  5. Hayashida, K., et al. Depletion of vascular nitric oxide contributes to poor outcomes after cardiac arrest. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (10), 1288-1290 (2019).
  6. Ignarro, L. J. Inhaled NO and COVID-19. British Journal of Pharmacology. 177 (16), 3848-3849 (2020).
  7. Gantner, B. N., LaFond, K. M., Bonini, M. G. Nitric oxide in cellular adaptation and disease. Redox Biology. 34, 101550(2020).
  8. Clark, R. H., et al. Low-dose nitric oxide therapy for persistent pulmonary hypertension of the newborn. New England Journal of Medicine. 342 (7), 469-474 (2000).
  9. Goldbart, A., et al. Inhaled nitric oxide therapy in acute bronchiolitis: A multicenter randomized clinical trial. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  10. Bangirana, P., et al. Inhaled nitric oxide and cognition in pediatric severe malaria: A randomized double-blind placebo controlled trial. PloS One. 13 (1), 0191550(2018).
  11. Jiang, S., Dandu, C., Geng, X. Clinical application of nitric oxide in ischemia and reperfusion injury: A literature review. Brain Circulation. 6 (4), 248-253 (2020).
  12. Lei, C., et al. Nitric oxide decreases acute kidney injury and stage 3 chronic kidney disease after cardiac surgery. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (10), 1279-1287 (2018).
  13. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  14. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radical Biology and Medicine. 43 (5), 645-657 (2007).
  15. Macarthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. Journal of Chromatography B. 851 (1-2), 93-105 (2007).
  16. Helms, C., Kim-Shapiro, D. B. Hemoglobin-mediated nitric oxide signaling. Free Radical Biology and Medicine. 61, 464-472 (2013).
  17. Kim-Shapiro, D. B., Schechter, A. N., Gladwin, M. T. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (4), 697-705 (2006).
  18. Rezoagli, E., et al. Pulmonary and systemic vascular resistances after cardiopulmonary bypass: role of hemolysis. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 31 (2), 505-515 (2017).
  19. Shiva, S. Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function. Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).
  20. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
  21. Heinrich, T. A., Da Silva, R. S., Miranda, K. M., Switzer, C. H., Wink, D. A., Fukuto, J. M. Biological nitric oxide signalling: chemistry and terminology. British Journal of Pharmacology. 169 (7), 1417-1429 (2013).
  22. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of s -nitrosothiols, iron-nitrosyls, and nitrite in biological samples. Free Radical Research. 37 (1), 1-10 (2003).
  23. Hayashida, K., et al. Improvement in outcomes after cardiac arrest and resuscitation by inhibition of s-nitrosoglutathione reductase. Circulation. 139 (6), 815-827 (2019).
  24. Rodríguez-Ortigosa, C. M., et al. Biliary secretion of S-nitrosoglutathione is involved in the hypercholeresis induced by ursodeoxycholic acid in the normal rat. Hepatology. 52 (2), Baltimore, Md. 667-677 (2010).
  25. Mitchell, D. A., Marletta, M. A. Thioredoxin catalyzes the S-nitrosation of the caspase-3 active site cysteine. Nature Chemical Biology. 1 (3), 154-158 (2005).
  26. Mannick, J. B., et al. Fas-induced caspase denitrosylation. Science. 284 (5414), New York, NY. 651-654 (1999).
  27. Choi, Y. -B., et al. Molecular basis of NMDA receptor-coupled ion channel modulation by S-nitrosylation. Nature Neuroscience. 3 (1), 15-21 (2000).
  28. Eu, J. P., Sun, J., Xu, L., Stamler, J. S., Meissner, G. The skeletal muscle calcium release channel: Coupled O2 sensor and NO signaling functions. Cell. 102 (4), 499-509 (2000).
  29. Stamler, J. S., et al. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (16), 7674-7677 (1992).
  30. Dunham, A. J., Barkley, R. M., Sievers, R. E. Aqueous nitrite ion determination by selective reduction and gas phase nitric oxide chemiluminescence. Analytical Chemistry. 67 (1), 220-224 (1995).
  31. Hogg, N., Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Detection of Nitric Oxide and Peroxynitrite in Biological Systems: A State-of-the-Art Review. Nitric Oxide (Third Edition). Ignarro, L. J., Freeman, B. A. , Academic Press. Chapter 3 23-44 (2017).
  32. Gudem, M., Hazra, A. Mechanism of the chemiluminescent reaction between nitric oxide and ozone. The Journal of Physical Chemistry A. 123 (4), 715-722 (2019).
  33. Ishibe, Y., Liu, R., Hirosawa, J., Kawamura, K., Yamasaki, K., Saito, N. Exhaled nitric oxide level decreases after cardiopulmonary bypass in adult patients. Critical Care Medicine. 28 (12), 3823-3827 (2000).
  34. American Thoracic Society, European Respiratory Society. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide, 2005. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 171 (8), 912-930 (2005).
  35. Cuthbertson, B. H., Stott, S. A., Webster, N. R. Exhaled nitric oxide as a marker of lung injury in coronary artery bypass surgery. British Journal of Anaesthesia. 89 (2), 247-250 (2002).
  36. Ewing, J. F., Janero, D. R. Specific S-nitrosothiol (thionitrite) quantification as solution nitrite after vanadium(III) reduction and ozone-chemiluminescent detection. Free Radical Biology and Medicine. 25 (4-5), 621-628 (1998).
  37. Braman, R. S., Hendrix, S. A. Nanogram nitrite and nitrate determination in environmental and biological materials by vanadium(III) reduction with chemiluminescence detection. Analytical Chemistry. 61 (24), 2715-2718 (1989).
  38. Wang, X., et al. Biological activity of nitric oxide in the plasmatic compartment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11477-11482 (2004).
  39. Bryan, N. S., Rassaf, T., Rodriguez, J., Feelisch, M. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10 (4), 221-228 (2004).
  40. Kida, K., Shirozu, K., Yu, B., Mandeville, J. B., Bloch, K. D., Ichinose, F. Beneficial effects of nitric oxide on outcomes after cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in hypothermia-treated mice. Anesthesiology. 120 (4), 880-889 (2014).
  41. Gladwin, M. T., et al. S-Nitrosohemoglobin is unstable in the reductive erythrocyte environment and lacks O2/NO-linked allosteric function. The Journal of Biological Chemistry. 277 (31), 27818-27828 (2002).
  42. Feelisch, M., et al. and heme-nitros(yl)ation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. The FASEB Journal. 16 (13), 1775-1785 (2002).
  43. Liu, T., et al. L-NAME releases nitric oxide and potentiates subsequent nitroglycerin-mediated vasodilation. Redox Biology. 26, 101238(2019).
  44. Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54879(2016).
  45. Keefer, L. K., Nims, R. W., Davies, K. M., Wink, D. A. 34;NONOates" (1-substituted diazen-1-ium-1,2-diolates) as nitric oxide donors: Convenient nitric oxide dosage forms. Methods in Enzymology. , Academic Press. 281-293 (1996).
  46. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radical Biology and Medicine. 42 (8), 1146-1154 (2007).
  47. Doctor, A., et al. Hemoglobin conformation couples erythrocyte S-nitrosothiol content to O2 gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (16), 5709-5714 (2005).
  48. Zhang, Y., Keszler, A., Broniowska, K. A., Hogg, N. Characterization and application of the biotin-switch assay for the identification of S-nitrosated proteins. Free Radical Biology and Medicine. 38 (7), 874-881 (2005).
  49. Davies, I. R., Zhang, X. Nitric Oxide Selective Electrodes. Methods in enzymology. Poole, R. K. , Academic Press. Chapter 5 63-95 (2008).
  50. Saito, J., et al. Comparison of fractional exhaled nitric oxide levels measured by different analyzers produced by different manufacturers. Journal of Asthma. 57 (11), 1216-1226 (2020).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Chemilumineszenz AssayStickoxid NachweisStickoxid MetabolitenOzon Chemilumineszenzzellfreies H moglobinNitritmessungNitratmessungS Nitrosothiol NachweisEisen Nitrosyl Komplexe

Verwandte Artikel