Hier stellen wir Protokolle zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen biologisch relevanten Derivaten mittels Chemilumineszenz-basierter Assays mit hoher Sensitivität vor.
Methodenartikel
Hier stellen wir Protokolle zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen biologisch relevanten Derivaten mittels Chemilumineszenz-basierter Assays mit hoher Sensitivität vor.
Die Aktivität von Stickstoffmonoxid (NO) in vivo ist das kombinierte Ergebnis seiner direkten Wirkungen, der Wirkung seiner Derivate, die durch NO-Autoxidation erzeugt werden, und der Wirkung von nitrosierten Verbindungen. Die Messung von NO-Metaboliten ist für die Untersuchung der NO-Aktivität sowohl auf Gefäßebene als auch in anderen Geweben unerlässlich, insbesondere in den experimentellen Umgebungen, in denen exogenes NO verabreicht wird. Ozonbasierte Chemilumineszenz-Assays ermöglichen präzise Messungen von NO- und NO-Metaboliten sowohl in Flüssigkeiten (einschließlich Plasma, Gewebehomogenaten, Zellkulturen) als auch in Gasgemischen (z. B. ausgeatmeter Atem). NO reagiert mit Ozon, um Stickstoffdioxid in einem angeregten Zustand zu erzeugen. Die daraus resultierende Lichtemission ermöglicht die Photodetektion und die Erzeugung eines elektrischen Signals, das den NO-Gehalt der Probe reflektiert. Aliquots aus derselben Probe können verwendet werden, um spezifische NO-Metaboliten wie Nitrat, Nitrit, S-Nitrosothiole und Eisen-Nitrosyl-Komplexe zu messen. Darüber hinaus wird NO, das von zellfreiem Hämoglobin verbraucht wird, auch mit der Chemilumineszenzanalyse quantifiziert. Eine Illustration all dieser Techniken wird zur Verfügung gestellt.
Seit Salvador Moncada und die Nobelpreisträger Robert Furchgott, Louis Ignarro und Ferid Murad Stickstoffmonoxid (NO) als den bisher bekannten Endothel-abgeleiteten Relaxationsfaktor (EDRF) identifiziert haben, wurde die zentrale Rolle von NO in mehreren Schlüsselmechanismen etabliert, die sich über die Gefäßbiologie, die Neurowissenschaften, den Stoffwechsel und die Wirtsantwort erstrecken 1,2,3,4,5,6,7 . Die exogene Verabreichung von N....
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Die in diesem Protokoll angegebenen Verfahren entsprechen dem Überprüfungsausschuss des Massachusetts General Hospital. Die Blutproben, die verwendet wurden, waren während einer früheren Studie gesammelt worden und wurden für den aktuellen Zweckde-identifiziert 18.
HINWEIS: In den Anweisungen des Herstellers finden Sie spezifische Anleitungen zu optimalen Verbindungen zwischen Schläuchen und Glaswaren, die das Spülgefäß, das Waschen und die allgemeine Wartung bilden. Die Verbindungen müssen fest und sorgfältig hergestellt sein, um die Glaswaren nicht zu beschädigen. Identifizieren Sie die Komponenten des Glasspülbehä....
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Der NO-Verbrauch durch zellfreien Hb-Assay wurde in Proben verwendet, die bekannte Konzentrationen von zellfreiem oxyHb enthielten (Abbildung 4). Da ein Häm von oxyHb stöchiometrisch ein NO-Molekül im Assay freisetzt, wird gereinigtes zellfreies oxyHb verwendet, um die Kalibrierkurve für den Assay zu erstellen (Ergänzende Abbildung 3).
Die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen zellfreiem Hb (gemessen mit einem kolorimetrischen Assay) und NO-Verbrauch .......
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Aufgrund der hohen Sensitivität haben Chemilumineszenz-basierte Assays zur Bestimmung von NO und verwandten Verbindungen ein hohes Risiko einerNO2-Kontamination. Jedes Reagenz (insbesondere die NO-2-Blockierungslösung) und jedes Verdünnungsmittel (einschließlich ddH 2 O), das im Experiment verwendet wird, sollte auf seinenNO-2-Gehaltgetestet werden, um das Hintergrundsignal zu korrigieren. Nitrit ist extrem reaktiv mit einer Halbwertszeit im Vol.......
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L.B. erhält Gehaltsunterstützung von K23 HL128882/NHLBI NIH als Principal Investigator für seine Arbeit an Hämolyse und Stickoxid. LB erhält Zuschüsse von "Fast Grants for COVID-19 research" am Mercatus Center der George Mason University und von iNO Therapeutics LLC. B.Y. wird durch Zuschüsse von einem NHLBI/#R21HL130956 und DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244) unterstützt. B.Y. erhielt bei MGH Patente auf die elektrische Erzeugung von Stickstoffmonoxid.
L.B. und B.Y. haben eine Patentanmeldung für NO delivery bei COVID-19-Krankheit eingereicht PCT-Anmeldenummer: PCT/US2021/036269 eingereicht am 7. Juni 2021. RWC erhält Gehaltsunterstützung von Unitaid als Hauptprüfer für die Technologieentwicklung zur dezentralen Diagnose von Tuberkulose bei Kindern in ressourcenarmen Umgebungen.
Die in diesem Manuskript berichteten Protokolle wurden durch die gesammelten Beiträge früherer Stipendiaten von Dr. Warren Zapols Labor für Anästhesieforschung in der Intensivmedizin, Abteilung für Anästhesie am Massachusetts General Hospital, ermöglicht. Wir danken Dr. Akito Nakagawa, Dr. Francesco Zadek, Dr. Emanuele Vassena, Dr. Chong Lei, Dr. Yasuko Nagasaka, Dr. Ester Spagnolli und Dr. Emanuele Rezoagli.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Essigsäure | Sigma | 45754 | 500 mL - flüssig |
| Antifoam B Emulsion | Sigma | A5757 | 250 mL - flüssig |
| DETA NONOate | Cayman | 82120 | 10 mg |
| Gibco DPBS (1x) kein Calcium, kein Magnesium | ThermoFisher | 14190144 | 500 mL |
| Salzsäure 37% (1 M) | Sigma | 258148 | 500 mL - flüssig |
| Jod | SAFC | 207772 | 100 g - fest |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | |
| Quecksilber (II) Chlorid ACS Reagenz> 99,5% | Sigma | 215465 | 100 g - fest (in Wasser löslich) |
| Mili-Q Wasseraufbereitungssystem | Millipore | ||
| Modell 705 RN 50 μ L Spritze | Hamilton | 80530 | Mikroliter Spritze |
| Modell 802 N 25 μ L Spritze | Hamilton | 84854 | Mikroliter-Spritze |
| N-Ethylmaleimid | Sigma | 4260 | 25 g - kristalliner |
| Stickstoffmonoxid-Analysator + Bundle Software - Spülgefäß | Zysense | NOA 280i | Chemilumineszenz-Detektor |
| Nonidet p-40 (NP-40) | ThermoFisher | 85125 | 10% - 500 mL |
| Kaliumhexacyanoferrat (III) ACS Reagenz > 99% | Sigma | 244023 | 100 g - Pulver |
| Kaliumiodid ACS Reagenz> 99% | Sigma | 221945 | 100 g - festes |
| Kaliumnitrit-Kristall. Für die Analyse: EMSURE ACS | Supelco | 105067 | 250 g - kristallin |
| PowerGen 125 | Fisher Scientific | 14-359-251 | Mechanischer Homogenisator |
| RV3 Zweistufige Drehschieberpumpe | Edwards | A65201906 | Vakuumpumpe - Gebündelt mit Analysator |
| Natrium-Heparin - BD Hemogard Clo | BD Biosciences | BD367871 75 USP-Einheiten | |
| Natriumhydroxid wasserfreies ACS-Reagenz ≥ 97% | Sigma | 795429 | 1 kg - Pellets |
| Natriumnitrat ACS Reagenz > 99% | Sigma | 221341 | 500 g - Pulver |
| Natriumnitrit > 99% | Sigma | S2252 | 500 g - kristallines |
| Sulfanilamid > 98% | Sigma | S9251 | 100 g - fest |
| Vanadium (III) Chlorid | Sigma | 112393 | 25 g - fest - Achtung (exotherm) |
| Whatman 1 Filterpapier | Sigma | WHA10010155 |
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