Methodenartikel

Isolierung von retinen retinalen Endothelzellen für die Sequenzierung der nächsten Generation

DOI:

10.3791/63133

⸱

11. Oktober 2021

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Cardiology, University of Virginia School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, University of Virginia School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von murinen postnatalen retinalen Endothelzellen, die für Zellertrag, Reinheit und Lebensfähigkeit optimiert sind. Diese Zellen eignen sich für Next-Generation-Sequenzierungsansätze.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jüngste Verbesserungen in der Next-Generation-Sequenzierung haben das Wissen der Forscher über Molekular- und Zellbiologie erweitert, wobei mehrere Studien neue Paradigmen in der vaskulären Biologie aufdecken. Die Anwendung dieser Methoden auf Modelle der vaskulären Entwicklung erfordert die Optimierung von Zellisolierungstechniken aus embryonalen und postnatalen Geweben. Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit müssen alle maximal sein, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse aus Sequenzierungsansätzen der nächsten Generation zu erhalten. Das retinale Vaskularisationsmodell der neonatalen Maus wird von Forschern verwendet, um Mechanismen der vaskulären Entwicklung zu untersuchen. Forscher haben dieses Modell verwendet, um Mechanismen der Angiogenese und der arteriell-venösen Schicksalsspezifikation während der Blutgefäßbildung und -reifung zu untersuchen. Die Anwendung von Next-Generation-Sequenzierungstechniken zur Untersuchung des retinalen vaskulären Entwicklungsmodells erfordert die Optimierung einer Methode zur Isolierung von retinalen Endothelzellen, die die Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit maximiert. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung, Verdauung und Reinigung von retinem retinalem Gewebe unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die FACS-gereinigte CD31+/CD45-Endothelzellpopulation für die Genexpression von Endothelzellen stark angereichert ist und keine Veränderung der Lebensfähigkeit für 60 Minuten nach FACS aufweist. Enthalten sind repräsentative Ergebnisse von Next-Generation-Sequenzierungsansätzen an Endothelzellen, die mit dieser Methode isoliert wurden, einschließlich Bulk-RNA-Sequenzierung und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, die zeigen, dass diese Methode zur retinalen Endothelzellisolierung mit Next-Generation-Sequenzierungsanwendungen kompatibel ist. Diese Methode der retinalen Endothelzellisolierung wird fortschrittliche Sequenzierungstechniken ermöglichen, um neue Mechanismen der vaskulären Entwicklung aufzudecken.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die hohe Durchsatzkapazität der Sequenzierung von Nukleinsäuren über Next-Generation-Sequencing-Ansätze hat das Wissen der Forscher über Molekular- und Zellbiologie erheblich erweitert. Diese fortschrittlichen Techniken umfassen die Sequenzierung der gesamten Transkriptom-RNA, die DNA-Sequenzierung von Zielregionen zur Identifizierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), die DNA-Sequenzierung gebundener Transkriptionsfaktoren bei der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)-Sequenzierung oder offene Chromatinregionen in der ATAC-Sequenzierung (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) und die Einzelzell-RNA-Sequenzierung1 . In der G....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Institutional Animal Care and Use Committees der Yale University und der University of Virginia genehmigten alle in diesem Protokoll aufgeführten Tierversuche.

1. Besorgen Sie sich Mausaugen für die Netzhautisolierung

  1. Bereiten Sie 1x eiskaltes PBS vor und geben Sie 500 μL in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte.
  2. Euthanasieren Sie neugeborene Mäuse am sechsten postnatalen Tag (P6) gemäß genehmigten institutionellen Richtlinien. Für dieses Experiment werden Würfe von etwa 4-8 neonatalen Mäusen bei P6 durch Isofluran-Inhalation für mindestens drei Minuten nach dem Atemstillstand eingeschläfert,....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Verdauung von Netzhautgewebe und die Immunfärbung für CD31 und CD45 führt zu einer identifizierbaren Population von CD31+/CD45-Endothelzellen nach Gating für Zellen, einzelne Zellen und Lebensfähigkeit (Abbildung 2A). Eine CD45-Immunfärbung ist erforderlich, um CD31+/CD45+-Zellen zu eliminieren, zu denen Blutplättchen und einige Leukozyten gehören21. Für jedes Experiment sollten Kontrollen durchgeführt werden, um die Antikörperspezifität und die Gating-Strategie z.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen aus postnatalem murinem Netzhautgewebe, die für eine hohe Zellzahl, Reinheit und Lebensfähigkeit optimiert wurde. Die Zellreinheit wird durch FACS-Isolierung von Endothelzellpopulationen aus der verdauten Einzelzellsuspension durch CD31+/CD45-Immunfärbung erreicht. Die Qualität der Isolierung wird in Assays auf Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Färbung und Genexpression mittels qPCR für CD31, CD45 und VE-Cadherin quantifiziert (obwohl VE-Cadherin n.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine relevanten Angaben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vielen Dank an die Yale Flow Cytometry Facility, die University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, das Yale Center for Genomic Analysis und den University of Virginia Genome Analysis and Technology Core für ihre Bemühungen, ihr Fachwissen und ihre Beratung bei der Durchführung der vorgestellten Experimente. Diese Studie wurde durch NIH-Zuschüsse an N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) und K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765) finanziert.

....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2 mL Eppendorf  safe-lockUSA Scientific<em>4036-3352
5 ml Falcon Reagenzgläser mit Zellsieb SchnappverschlussCorning352235
60 mm Nicht TC-behandelte KulturschaleCorning430589
APC Ratte Anti-Maus CD31BD Biosciences551262
APC Rat IgG2a & Kappa; Isotyp-KontrolleBD Biosciences553932
BD FACSChorus SoftwareBD BiosciencesFACSCHORUS
BD FACSMelody Cell SorterBD BiosciencesFACSMELODY
Kollagenase Typ IISigma-Aldrich234115
Costar 48-Well-Clear-TC-behandelte Multi-Well-Platten, einzeln verpackt, sterilCorning3548
D-GlucoseGibcoA2494001
Einweg-MesspipettenFisher Scientific12-711-9AM
Dissektion Pan WaxCarolina629100
PräparierschereFine Science Tools14085-08
Dissektions-Stereomikroskop M165 FCLeicaM165FC
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-052
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco14190144
Eppendorf  Flex-Tubes Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mLSigma-Aldrich22364120
Fötales Rinderserum (FBS)Gemini Bio100-106
Feine DissektionszangeFine Science Tools11250-00
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)Gibco14175095
HEPES (1M)Gibco15630130
iScript cDNA Synthese-KitBio-Rad1708890
Isofluran, USPCovetrus11695067772
Isotemp Allzweck-Deluxe-WasserbadFisher ScientificFSGPD20
Grundierung: ActB_Forward: 5'- agagggaaatcgtgcgtgac -3'Integrated DNATechnologies N/A
Primer: ActB_Reverse: 5'- caatagtgatgacctggccgt -3'Integrated DNATechnologies N/A
Primer: CD31_Forward: 5'- gagcccaatcacgtttcagttt -3'Integrated DNATechnologies N/A
Primer: CD31_Reverse: 5'- tccttcctgcttcttgctagct -3'Integrated DNATechnologies N/A
Primer: CD45_Forward: 5'- gggttgttctgtgccttgtt -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
Primer: CD45_Reverse: 5'- ctggacggacacagttagca -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
Grundierung: VE-Cadherin_Forward: 5'- tcctctgcatcctcactatcaca -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5'- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3'Integrated DNA TechnologiesN/A
PropidiumiodidSigma-AldrichP4864
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134
Sorvall Legend Micro 21R Zentrifuge, gekühltThermoFisher75002477
SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5120
Trypan Blue LösungThermoFisher15250061
V450 Ratte Anti-Maus CD45BD Biosciences560501
V450 Ratte IgG2b, κ Isotyp-KontrolleBD Biosciences560457
tubes

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59(2018).
  2. Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine<....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Zelisolationfluoreszenzaktivierte ZellsortierungVerdauung von NetzhautgewebeEinzelzell RNA SequenzierungCD31 CD45 GatingGef entwicklungZellviabilit tRNA Sequenzierung

Verwandte Artikel