Ein Nagetiermodell der Ross-Operation: Syngene Lungenarterientransplantatimplantation in einer systemischen Position

Die angeborene Aortenklappenstenose ist eine Untergruppe der angeborenen Herzkrankheit, die durch eine Obstruktion des linksventrikulären Traktes gekennzeichnet ist, bei der sich die Läsion auf der Valvularebene befindet. Die Fehlbildung betrifft etwa 0,04-0,38 pro 1000 Lebendgeburten1.

Die verfügbaren Optionen für die Korrektur sind vielfältig, jede mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen. Bei ^{Patienten, die} für eine biventrikuläre Korrektur2 geeignet sind, kann der Ansatz auf eine Klappenreparatur (perkutane oder chirurgische Valvulotomie) oder deren Ersatz ^abzielen3. Letzteres ist bevorzugt, wenn die Aortenklappe als unrettbar gilt; Die verfügbaren Optionen sind jedoch für pädiatrische Patienten begrenzt. Tatsächlich sind bioprothetische Klappen aufgrund ihrer frühen Verkalkung nicht für den Aortenersatz in der jungen Bevölkerung ^indiziert4. Auf der anderen Seite ist die Degeneration in mechanischen Klappen wesentlich langsamer, aber diese erfordern eine lebenslange Antikoagulanzientherapie5. Darüber hinaus wird die Haupteinschränkung dieser Prothesen durch das fehlende Wachstumspotenzial dargestellt, das die Patienten für zusätzliche Reinterventionen prädisponiert.

Eine interessante Therapieoption in der pädiatrischen Population ist die Übertragung des pulmonalen Autotransplantats auf die Aortenposition namens "Ross-Operation". In diesem Fall wird die Pulmonalklappe dann durch ein Homotransplantat ersetzt (Abbildung 1)⁶. Dieses Verfahren kann möglicherweise die beste chirurgische Wahl für Kinder darstellen, da das Lungenautotransplantat sein Wachstumspotenzial bewahrt und nicht die Risiken einer lebenslangen Gerinnungshemmungstherapie birgt. Darüber hinaus kann das Ross-Verfahren auch bei jungen Erwachsenen von großem Wert sein, um eine mechanische oder biologische Klappe zu vermeiden, die das Potenzial hat, die beste chirurgische Lösung zu werden.

Die Ergebnisse nach Aortenklappenersatz mit pulmonalem Autotransplantat sind ausgezeichnet, mit einem Überleben von mehr als 98% und guten Langzeitergebnissen7. Literaturstudien berichten von 93% bzw. 90% Freiheit vom Ersatz des Lungenhomotransplantats nach 4 bzw. 12 ^Jahren8.

Die Haupteinschränkung dieses Verfahrens ist die Tendenz des Autotransplantats, sich langfristig zu erweitern, insbesondere wenn es als freistehender Wurzelersatz eingesetzt wird. Dies kann zu einer klappenförmigen Inkompetenz führen, die eine erneute Intervention erfordern kann. Tatsächlich berichtet die bisher am längsten durchgeführte Follow-up-Studie von einer Reoperationsfreiheit für den Autotransplantatersatz von 88% nach 10 Jahren und 75% nach 20 ^Jahren9.

Die Möglichkeit, eine Ross-Operation in einem experimentellen Setting nachzubilden, stellt eine Grundvoraussetzung dar, um den zugrunde liegenden Mechanismus der Anpassung des pulmonalen Autotransplantats an systemische Belastungen zu untersuchen. In der Vergangenheit wurden mehrere Modelle vorgeschlagen. Diese beschränken sich jedoch meist auf Ex-vivo-Experimente oder In-vivo-Tiermodelle mit relativ teuren Großtieren. In dieser Studie versuchten wir, ein Nagetiermodell der Implantation von Lungenarterientransplantaten (PAG) in einer systemischen Position als freistehende Wurzel zu etablieren.

Alle Verfahren wurden vom Tierpflegeausschuss der Universität Padua (OPBA, Protokollnummer Nr. 55/2017) genehmigt und vom italienischen Gesundheitsministerium (Genehmigung Nr. 700/2018-PR) in Übereinstimmung mit der Richtlinie 2010/63/EU der Europäischen Union und dem italienischen Gesetz 26/2014 über die Pflege und Verwendung von Versuchstieren genehmigt.

1. Tierpflege und Versuchsmodell

1. Stellen Sie sicher, dass alle Lewis-Ratten von einem einzigen Unternehmen bezogen werden (Materialtabelle). Halten Sie die Ratten in konventionellen Einrichtungen mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser.
2. Stellen Sie sicher, dass das Gewicht der Ratten zwischen 320 und 400 g für die Empfängergruppe und 200-250 g für die Spendergruppe liegt.

2. Präoperatives Protokoll

HINWEIS: Alle Operationen müssen unter sauberen Bedingungen durchgeführt werden. Verwenden Sie männliche und weibliche erwachsene Lewis-Ratten als Empfänger und Spender, um eine syngene Transplantation durchzuführen.

1. Führen Sie 15 Minuten vor der Operation eine intraperitoneale Injektion von Tramadol (5 mg/kg) durch.
2. Verabreichen Sie unmittelbar vor der Operation eine Einzeldosis intramuskuläres Gentamicin (5 mg/kg).
3. Zur Anästhesieinduktion 4% Sevofluran in 1 l/min Sauerstoff in eine Poly(methylmethacrylat)-Kammer geben, in der das Tier platziert wird. Verwenden Sie zur Aufrechterhaltung der Anästhesie während des gesamten Verfahrens 2,0-2,5% Sevofluran in 1 l / min Sauerstoff.
4. Rasieren Sie das Tier entlang der Mittellinie für 2 cm Breite vom Brustbein bis 1 cm über dem Genitalbereich mit einem Rasiermesser. Dann sterilisieren Sie die Haut mit Jodlösung.
5. Um zu verhindern, dass das Tier nass wird und um eine Wärmeausbreitung während der Operation zu verhindern, bedecken Sie das Tier mit einer transparenten Kunststofffolie.
6. Bewerten Sie das Niveau der Anästhesie vor der Durchführung des Verfahrens, indem Sie das Fehlen einer Reaktion auf einen schädlichen Reiz beurteilen.

3. Geberbetrieb

1. Tier- und Herzpräparation:
   1. Legen Sie das betäubte Tier auf ein Korktablett mit der Schwanzseite zum Chirurgen. Führen Sie einen xipho-schamartigen Schnitt von ca. 5-6 cm durch und ziehen Sie die beiden muskulokutanen Klappen seitlich zurück.
   2. Verabreichen Sie ein Volumen von 1 ml Kochsalzlösung bei 4 °C mit 500 IE Heparin durch die abdominale Hohlvene.
   3. Schneiden Sie nach 1 Minute das Zwerchfell von links nach rechts und führen Sie eine vordere Thorakotomie durch, um das Herz freizulegen.
   4. Kühlen Sie das schlagende Herz ab, indem Sie Kochsalzlösung bei 4 °C tropfen lassen.
   5. Führen Sie eine Perikardektomie und eine Thymektomie durch, um einen vollständigen Überblick über den Aortenbogen zu erhalten. Entfernen Sie das verbleibende Fettgewebe, das die Aorta umgibt.
   6. Schnitt am Bogen, knapp über dem Ursprung der innominaten Arterie; Trennen Sie auch die letztere.
   7. Schneiden Sie die thorakale Vena cava inferior (IVC) ab und führen Sie eine 22 G Kanüle ein, um das Herz mit 20-25 ml Kochsalzlösung bei 4 ° C unter leichtem Druck zu infundieren. Beenden Sie die Durchblutung, wenn das Herz aufhört zu schlagen und der Fluss aus der Aorta klar wurde.
2. PAG explant:
   HINWEIS: Eine genaue Ernte und schonende Handhabung des PAG ist zwingend erforderlich, um eine optimale Implantation beim Empfänger zu erreichen. Berühren Sie es nicht direkt mit Instrumenten, sondern verwenden Sie Stattdessen Wattestäbchen.
   1. Führen Sie eine Ultraschalluntersuchung durch, um den PA-Durchmesser in seiner nativen Position zu beurteilen.
   2. Führen Sie eine Mikrozange unter die hintere Wand des Gefäßes ein und schneiden Sie diese mit einer Mikroschere so nah wie möglich an ihrer Verzweigung, um die Länge des PAG zu maximieren.
   3. Halten Sie die PA vorsichtig mit der ringförmigen Mikrozange fest und trennen Sie sie mit der Mikrofederschere von der rechten Herzkammer. Ernte den PAG, einschließlich einiger rechtsventrikulärer Muskeln.
3. PAG-Vorbereitung:
   1. Legen Sie den PAG auf eine mit kalter Kochsalzlösung angefeuchtete Gaze auf den Operationstisch und untersuchen Sie das Gefäß unter dem Operationsmikroskop.
   2. Schneiden Sie reichlich vorhandenes umgebendes Gewebe ab und lassen Sie nur 1 mm Ventrikelmuskel zurück. Stellen Sie die Länge des Behälters auf 5 mm ein.

4. Implantation der Lungenarterientransplantation (PAG)

1. Vorbereitung des Empfängertieres:
   1. Legen Sie das betäubte Tier auf ein Korktablett mit der Schwanzseite zum Chirurgen.
   2. Führen Sie einen medianen Längsschnitt durch und verwenden Sie zwei Mini-Retraktoren, um den Bauch offen zu halten.
   3. Extrahieren Sie den Darm mit zwei Wattestäbchen und bedecken Sie ihn mit einer mit 39 ° C Kochsalzlösung getränkten Gaze, die die Visualisierung des retroperitonealen Bereichs unter Exposition der infrarenalen Bauchaorta (AA) ermöglicht.
      HINWEIS: Während der Operation ist es wichtig, den Darm gelegentlich mit einer Spritze mit 39 ° C Kochsalzlösung zu befeuchten, um Hypothermie zu verhindern, ein kritischer Zustand, der bei Nagetieren häufig auftritt.
   4. Streifen Sie das hintere parietale Peritoneum zwischen den beiden Nierenarterien und der Beckenverzweigung mit zwei Wattestäbchen ab und entfernen Sie das Fettgewebe um die infrarenale AA. Lassen Sie nur einen kleinen Teil Fett über dem AA, um die Handhabung auf dem Gefäß zu erleichtern.
   5. Trennen Sie den AA vom IVC. Um dieses Verfahren durchzuführen, passieren Sie zunächst eine gekrümmte Pinzette hinter der hinteren Aortenwand und öffnen Sie damit einen Durchgang zwischen AA und IVC. Verwenden Sie dann eine 2-0-Seidennaht, um eine Schlaufe um die AA zu erstellen, um das Gefäß anzuheben und das AA von IVC zu trennen. Ligatieren Sie jede Lendenarterie, die aus der infrarenalen AA entsteht, mit 6/0 Seidennaht und teilen Sie sie.
   6. Drehen Sie das Tier um 90 ° gegen den Uhrzeigersinn und legen Sie den Kopf auf die linke Seite des Bedieners. Die AA lagen nun horizontal im mikroskopischen Feld.
   7. Verwenden Sie zwei Yasargil-Clips, um das infrarenale AA zu klemmen und platzieren Sie sie in einem Abstand von 1,5 cm voneinander. Transektieren Sie die AA in der Mitte zwischen den beiden Clips.
   8. Bewässern Sie die beiden Enden der Gefäße mit Heparin (1 UI / ml) in Kochsalzlösung, um Gerinnsel zu entfernen. Entfernen Sie alle abenteuerlichen Trümmer aus den Gefäßen.
2. PAG-Implantation:
   1. Platzieren Sie den PAG zwischen den beiden Enden, wobei das ventrikuläre Ende in Richtung des kranialen Teils des Tieres verläuft.
   2. Verwenden Sie eine 10-0-Polypropylennaht, um zwei markante Einzelstiche durchzuführen, die das PG mit dem AA verbinden. Führen Sie den Vorgang an beiden Enden des PAG durch, indem Sie die Naht auf gegenüberliegenden Seiten des Gefäßumfangs platzieren.
   3. Führen Sie eine End-to-End-Anastomose zwischen PAG und AA durch, beginnend mit dem distalen Ende. Verwenden Sie eines der beiden Enden der distalen Landmarknaht für die hintere Anastomose mit einer Empfänger-zu-Transplantat-Out-in/In-Out-Sequenz, um eine laufende Naht von etwa sechs Stichen durchzuführen.
   4. Sobald die Naht die proximale Landmarke erreicht hat, führen Sie eine doppelte halbe Kupplung durch, die durch einen quadratischen Knoten mit der Naht und einem der beiden Enden der proximalen Landmarknaht vervollständigt wird. Tragen Sie eine gummibeschlagene Mückenzange auf die Nähte auf, um Traktion zu gewährleisten.
   5. Führen Sie die gleiche Anastomose an der Vorderwand durch. Setzen Sie den gesamten Vorgang am proximalen Ende des PAG fort. Achten Sie besonders darauf, wenn Sie die proximale Anastomose durchführen, um zu vermeiden, dass eine Packungsbeilage in die Nahtlinie aufgenommen wird.
   6. Lassen Sie zuerst den distalen Clip los, um den PAG mit retrogradem Blut (Niederdruckfluss) füllen zu lassen, um die Anastomose zu überprüfen. Reparieren Sie alle Blutleckagen mit einer einzigen Naht. Sobald die distale Anastomose ausgewertet ist, führen Sie das gleiche Verfahren am proximalen Ende durch.
3. Letzte Schritte der Operation am Empfänger:
   1. Beurteilen Sie die Durchgängigkeit des PAG und tragen Sie zwei Streifen Gelatineschwamm über die Nahtlinien auf beiden Seiten des PAG auf (falls erforderlich). Üben Sie sanften Druck für ein paar Sekunden mit zwei Wattestäbchen aus, um die Hämostase zu unterstützen.
   2. Versetzen Sie den Darm in die Bauchhöhle und schließen Sie die Wände mit einer 4/0 Polypropylen-Laufnaht.

5. Scheinoperatives Verfahren

1. Führen Sie eine identische Vorbereitung des Tieres durch, wie zuvor für Empfängerratten dargestellt.
2. Schneiden Sie die infranale AA, auf halbem Weg zwischen dem Ursprung der Nieren- und der Beckenarterien.
3. Nähern Sie sich den beiden Enden der AA mit einer End-to-End-Anastomose, wie zuvor beschrieben. Entfernen Sie die beiden Clips und führen Sie ein genaues Hämostaseverfahren durch.
4. Positionieren Sie den Darm neu und schließen Sie die Bauchdecke in Schichten, wie bei den Empfängertieren.

6. Postoperative Versorgung und Nachsorge

1. Verabreichen Sie warme Kochsalzlösung (5 ml) in das Unterhautgewebe des Rückens des Tieres zur Hydratation. Legen Sie die Ratte unter eine Heizlampe und überwachen Sie sie visuell bis zum Erwachen, was normalerweise bis zu 5 Minuten dauert, nachdem die Narkose gestoppt wurde. Stellen Sie das Tier in einen Käfig mit einer Raumtemperatur von 22-24 °C mit sofortigem und uneingeschränktem Zugang zu Futter und Wasser.
2. Intramuskuläres Tramadol (5 mg/kg) zur postoperativen Analgesie in den ersten 48 h nach der Operation zweimal täglich verabreichen. Danach überwachen Sie regelmäßig den Gesundheitszustand und das Körpergewicht des Empfängers täglich.
3. Follow-up: Führen Sie während des Follow-ups Seriat-Ultraschalluntersuchungen nach einer Woche, einem Monat und zwei Monaten durch, um die PAG-Funktion zu bewerten. Messen Sie während dieser Studien den Gefäßdurchmesser, die maximale systolische Geschwindigkeit (PSV) und die enddiastolische Geschwindigkeit. Messen Sie diese Parameter innerhalb des PAG und auf der Ebene der proximalen und distalen AA.
4. Euthanasieren Sie die Tiere nach zwei Monaten Follow-up durch Anwendung von _CO2 für einige Minuten und explantieren Sie dann das PAG, das einer histopathologischen Analyse unterzogen wird.

Insgesamt wurden 39 erwachsene Lewis-Ratten in diese Studie eingeschlossen: 17 Tiere wurden als PAG-Spender, 17 Tiere als Empfänger und 5 als scheinoperierte (Kontrollgruppe) verwendet (Tabelle 1). Männliche Ratten waren 22 (56%) und weibliche 17 (44%); Letztere wurden nur in der Spendergruppe verwendet.

Während der Operation trat kein tödliches Ereignis mit 100% igem Überleben auf. Während der Nachuntersuchung hatten zwei Tiere der Transplantationsgruppe nach 12 bzw. 51 Tagen einen tödlichen Ausgang; die Überlebensrate am Ende der Studie betrug 91% (Tabelle 1).

Das Mediangewicht der Ratten betrug 387 g (Interquartilsbereich, IQR, 358-394 g) für die Empfängergruppe und 328 g (IQR=304-337 g) für die Spendergruppe. Eine Woche nach der Operation betrug das Mediangewicht 363 g (IQR = 350-376 g) mit einer Abnahme von 6% im Vergleich zum präoperativen Gewicht. Die Tiere gewannen ihr Gewicht innerhalb des ersten Monats der Nachbeobachtung wieder an Gewicht (Median 387 g, IQR 369-392 g), mit einem Endgewicht von 397 g nach zwei Monaten (IQR =391-402 g) (Abbildung 2).

Die mediane Nachbeobachtungszeit betrug 62,5 Tage (IQR=60-68 Tage) in der Transplantationsgruppe und 62 Tage (IQR=61-67 Tage) in der scheinoperierten Gruppe (p=0,68).

Der präoperative PA-Mediandurchmesser in seiner nativen Position betrug 3,20 mm (IQR = 3,18-3,23 mm). Der mittlere Durchmesser des PAG betrug 4,03 mm (IQR=3,74-4,13 mm) nach einer Woche, 4,07 mm (IQR=3,80-4,28 mm) nach einem Monat und 4,27 mm (IQR=3,90-4,35 mm) nach zwei Monaten (Abbildung 3A). Dies war eine Steigerung von 25,9%, 27,2% bzw. 33,5% im Vergleich zum Durchmesser in der nativen Position. Die Zunahme des Durchmessers unterschied sich signifikant, wenn man den Wert in der nativen Position mit dem Wert nach einer Woche (p = 0,003) vergleicht, während in den folgenden Studien kein signifikanter Anstieg gefunden wurde. Der Aortendurchmesser in der scheinoperierten Gruppe betrug 1,41 mm (IQR = 1,35-1,62 mm) nach einer Woche und 1,41 mm (IQR = 1,29-1,70 mm) nach zwei Monaten. Der mediane PSV auf PAG-Ebene betrug 220,07 mm/s (IQR=210,43-246,41 mm/s) nach einer Woche, 430,88 mm/s (IQR=375,28-495,56 mm/s) nach einem Monat und 373,68 mm/s (IQR=305,78-429,81 mm/s) nach zwei Monaten. Im Vergleich zur scheinoperierten Gruppe wurde nach einer Woche ein signifikanter Unterschied in PSV gefunden (Median 419,12 mm/s, IQR=408,42-561,32 mm/s; p<0,001), während am Ende der Studie kein Unterschied gefunden wurde (392,92 mm/s, IQR=305,89-514,27 mm/s; p=0,5) (Abbildung 3B).

Am Ende der Studie zeigte die histologische Analyse keine Anzeichen einer Endothelthrombose und die Wandverkalkung war in den meisten Fällen nicht signifikant (Abbildung 4).

Abbildung 1: Repräsentatives Bild des Ross-Vorgangs. Das Foto zeigt die Phasen der Ross-Operation. (A) Aortenklappe und Wurzelexplant; (B) Autotransplantattransposition der Lungenarterie in der Aortenposition; (C) Autotransplantatersatz der Lungenarterie durch ein Homotransplantat. A: Aortenklappe und Wurzel; H: Homograft; P: Pulmonalklappe und Wurzel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Zeitlicher Verlauf des Körpergewichts in der Transplantationsgruppe. Die Grafik zeigt den Verlauf des Gewichts der Ratte in der Transplantationsgruppe über die Zeit. Die Werte werden als Median- und Interquartilsbereich ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Variation des Durchmessers und der maximalen systolischen Geschwindigkeit in das pulmonale Arterientransplantat. Die Graphen zeigen die Variation des Durchmessers (A) und der maximalen systolischen Geschwindigkeit (B) innerhalb des Lungenarterientransplantats während der ultraschallsonographischen Auswertungen des Seriats. Die Werte werden als Median- und Interquartilsbereich ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Mikroskopische Auswertung des PAG. Das Bild zeigt das PAG nach explantiert (A). B) Röntgenuntersuchung; (C) Hämatoxylin- und Eosin-Färbung, ursprüngliche Vergrößerung 12,5-fach. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Merkmale und Ergebnisse der Studie. *Die Werte werden als Median- und Interquartilsbereich ausgedrückt.

Die Autoren haben nichts preiszugeben.