Verwendung von Optogenetik zur Umkehrung der Neuroplastizität und zur Hemmung der Kokainsuche bei Ratten

Zusammenfassung

Die hier beschriebenen Methoden skizzieren ein Verfahren, mit dem die Kokain-induzierte Plastizität in einem verhaltensrelevanten Schaltkreis bei Ratten optogenetisch umgekehrt wird. Eine anhaltende niederfrequente optische Stimulation der Thalamo-Amygdala-Synapsen induziert eine langfristige Depression (LTD). In vivo führte eine optogenetisch induzierte LTD bei Kokain-erfahrenen Ratten zu einer anschließenden Abschwächung der Cue-motivierten Drogensuche.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt die Schritte, die erforderlich sind, um optogenetische Werkzeuge zu verwenden, um die Kokain-induzierte Plastizität an Thalamo-Amygdala-Schaltkreisen umzukehren, um das nachfolgende Kokainsuchverhalten bei der Ratte zu reduzieren. In unserer Forschung hatten wir herausgefunden, dass, wenn Ratten intravenöses Kokain gepaart mit einem audiovisuellen Hinweis selbst verabreichen, Synapsen, die an Eingängen aus dem medialen genikulären Kern des Thalamus (MGN) auf die Hauptneuronen der lateralen Amygdala (LA) gebildet werden, stärker werden, wenn die Cue-Kokain-Assoziation erlernt wird. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Umkehrung der Kokain-induzierten Plastizität an diesen Synapsen das Kokain-motivierte Kokain-Suchverhalten reduzieren würde. Um diese Art der Neuromodulation in vivo zu erreichen, wollten wir eine synaptische Langzeitdepression (LTD) induzieren, die die Stärke der MGN-LA-Synapsen verringert. Zu diesem Zweck haben wir die Optogenetik verwendet, die die Neuromodulation von Gehirnschaltkreisen mit Hilfe von Licht ermöglicht. Das exzitatorische Opsin oChiEF wurde an präsynaptischen MGN-Terminals in der LA exprimiert, indem ein AAV, das oChiEF enthält, in das MGN infundiert wurde. Optische Fasern wurden dann in die LA implantiert und 473 nm Laserlicht wurde 15 Minuten lang mit einer Frequenz von 1 Hz gepulst, um LTD zu induzieren und die Kokain-induzierte Plastizität umzukehren. Diese Manipulation führt zu einer lang anhaltenden Verringerung der Fähigkeit von Reizen, die mit Kokain in Verbindung gebracht werden, Drogensuchaktionen zu induzieren.

Einleitung

Drogenmissbrauch ist ein sehr ernstes Problem der öffentlichen Gesundheit in den USA und weltweit. Trotz jahrzehntelanger intensiver Forschung gibt es nur sehr wenige wirksame Therapieoptionen ^1,2. Ein großer Rückschlag für die Behandlung ist die Tatsache, dass chronischer Drogenkonsum langfristige assoziative Erinnerungen zwischen Umweltreizen und der Droge selbst erzeugt. Die erneute Exposition gegenüber drogenbezogenen Hinweisen führt zu physiologischen und Verhaltensreaktionen, die zu fortgesetztem Drogenkonsum und Rückfällen motivieren³. Eine neuartige therapeutische Strategie besteht darin, gedächtnisbasierte Behandlungen durchzuführen, die darauf abzielen, die Schaltkreise zu manipulieren, die an der Regulierung von Medikamenten-Cue-Assoziationen beteiligt sind. Kürzlich wurde beobachtet, dass Synapsen in der lateralen Amygdala (LA), insbesondere solche, die aus dem medialen Genikularkern (MGN) des Thalamus entstehen, durch wiederholte Cue-assoziierte Kokain-Selbstverabreichung verstärkt werden und dass diese Potenzierung das Kokainsuchverhalten unterstützen kann ^4,5. Daher wurde vorgeschlagen, dass die Cue-induzierte Wiedereinsetzung durch Umkehrung der Plastizität an MGN-LA-Synapsen abgeschwächt werden könnte.

Die Fähigkeit, die synaptische Plastizität eines bestimmten Gehirnschaltkreises präzise zu steuern, war eine große Herausforderung für das Feld. Traditionelle pharmakologische Werkzeuge haben einige Erfolge bei der Verringerung des Rückfallverhaltens erzielt, sind jedoch durch die Unfähigkeit, einzelne Synapsen zu manipulieren, begrenzt. Die jüngste Entwicklung der In-vivo-Optogenetik hat jedoch die Werkzeuge zur Verfügung gestellt, die benötigt werden, um diese Einschränkungen zu überwinden und neuronale Bahnen mit zeitlicher und räumlicher Präzision zu kontrollieren ^6,7,8. Durch die Expression von lichtempfindlichen Opsinen in einem bestimmten Gehirnschaltkreis kann Laserlicht dann verwendet werden, um den Schaltkreis zu aktivieren oder zu hemmen. Frequenzabhängige optische Stimulation kann genutzt werden, um die synaptische Plastizität des Schaltkreises in einem sich verhaltenden Tier gezielt zu manipulieren.

Dieses Manuskript skizziert das Verfahren zur Manipulation des verhaltensrelevanten MGN-LA-Schaltkreises mit Hilfe von In-vivo-Optogenetik . Zuerst wurde das exzitatorische Opsin oChIEF im MGN exprimiert und optische Fasern wurden bilateral in das LA implantiert. Die Tiere wurden dann darauf trainiert, Kokain in einer reizabhängigen Art und Weise selbst zu verabreichen, was den MGN-LA-Signalweg potenziert. Als nächstes wurde eine anhaltende, niederfrequente Stimulation mit 473 nm Laserlicht verwendet, um schaltungsspezifische LTD zu erzeugen. Die Umkehrung der durch Kokainkonsum induzierten Plastizität führte zu einer lang anhaltenden Verringerung der Fähigkeit von Reizen, Handlungen auszulösen, die mit Drogensuchverhalten verbunden sind.

Protokoll

Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente entsprachen den Richtlinien des National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh genehmigt. Alle Verfahren wurden mit erwachsenen, naiven Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt, die bei der Ankunft 275-325 g wogen.

1. Konstruktion von Lichtwellenleiterimplantaten und Patchkabeln

1. Bereiten Sie Glasfaserimplantate nach zuvor veröffentlichten Protokollen^{vor 9}. Die in diesem Protokoll beschriebenen Experimente verwendeten eine 200-μm-Kernfaser (0,5 NA) und eine Ø1,25-mm-Multimode-LC/PC-Keramikferrule, eine Lochgröße von Ø230 μm.
   1. Verwenden Sie ein Dremel-Werkzeug, um das untere Drittel einer Ferrule (am nächsten am flachen Ende der Ferrule) zu bewerten. Das Ritzen der Aderendhülsen hilft ihnen, mit Zahnzement verbunden zu bleiben, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass sie während des gesamten Experimentierens sicher bleiben.
   2. Verwenden Sie Drahtschneider, um ~ 35 mm Faser zu schneiden. Verwenden Sie ein Faserabisolierwerkzeug, um ~ 25 mm Faser zu entfernen und 10 mm unbelichtet zu lassen.
   3. Bereiten Sie wärmehärtendes Epoxidharz gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. 1 g Harzpulver in 100 mg Härtermasse auflösen. Befestigen Sie eine abgestumpfte 25-Gauge-Nadel an einer 1-ml-Spritze. Füllen Sie die Spritze mit Epoxidharz und befestigen Sie eine abgestumpfte 25-Gauge-Nadelspitze.
   4. Verwenden Sie einen Schraubstock oder eine Klemme, um die Ferrule sicher zu halten, wobei die flache Seite nach oben und die konvexe Seite nach unten zeigt. Geben Sie mit der mit Epoxidharz gefüllten Spritze einen Tropfen Epoxidharz auf die flache Seite der Ferrule und wischen Sie überschüssiges Epoxidharz vorsichtig von den Seiten der Ferrule ab.
   5. Führen Sie den abgestreiften Teil der Faser durch die Ferrule ein, so dass zusätzliche 5 mm der abgestreiften Faser freigelegt werden. Im Falle von LA-Implantaten wird die Faser 7,9 mm ventral zu Bregma implantiert, so dass die exponierte Länge der nicht abgestreiften Faser ~ 13 mm betragen sollte.
   6. Härten Sie das Epoxidharz mit einer Heißluftpistole für ca. 30-40 s aus, bis es schwarz / bernsteinfarben wird.
   7. Ritzen Sie die Faser direkt an der Schnittstelle des konvexen Endes der Ferrule mit einem Diamantmesser ein und klopfen Sie die Faser mit einem Finger vorsichtig ab.
   8. Polieren Sie das konvexe Ende der Ferrule mit einem Hämostaten, achten Sie darauf, gleichmäßigen Druck auszuüben und machen Sie jeweils 20 kreisförmige Drehungen auf einer Reihe von Polierpapier (von hoher Qualität bis zu niedriger Qualität; 5, 3, 1, 0,3 μm).
   9. Befestigen Sie die nicht abisolierte Faser mit Klebeband und Rillenabzug auf dem Tisch, so dass zusätzliche 2 mm über die ventrale Koordinate hinaus verbleiben (bei LA-Implantaten beträgt die endgültige Länge der Faser ~ 10 mm). Verwenden Sie einen Hämostaten, um an der Ferrule zu ziehen und die Faser gleichmäßig zu brechen, wo sie geritzt wurde. Achten Sie darauf, die Faser beim Schneiden nicht vollständig zu schneiden, da sonst der Kern der Faser beschädigt wird.
2. Bauen Sie Patchkabel, die mit Glasfaserimplantaten kompatibel sind. Es wurden kundenspezifische Patchkabel angeschafft (siehe Materialtabelle). Alternativ können Patchkabel nach zuvor veröffentlichten Protokollen⁹ aufgebaut werden.
   HINWEIS: Der Durchmesser und die NA der Ferrulenfaser und der Patchkabelfaser müssen an der Koppelverbindung übereinstimmen, um einen übermäßigen Lichtverlust zu vermeiden, der dazu führen kann, dass die neuronale Aktivität nicht ausreichend stimuliert wird.
3. Messen Sie die Lichtleistung durch das Patchkabel und die Lichtwellenleiterimplantate, indem Sie das Patchkabel/die optische Faser an eine geeignete Laserlichtquelle (473 nm, 1 mW Leistung) anschließen und die Leistung mit einem Lichtsensor messen. Eine erfolgreich konstruierte Faser emittiert einen konzentrischen Lichtkreis und hat nicht mehr als 30% Lichtverlust.

2. Intravenöse Katheterisierung von Nagetieren, Virusabgabe und Glasfaserimplantation

1. Bereiten Sie das Tier auf die Operation vor.
   1. Ratten vollständig anästhesieren Sie mit einem Anästhetikum Ihrer Wahl auf der Grundlage institutioneller Richtlinien. Eine Option ist Ketaminhydrochlorid (87,5-100 mg/kg, i.m.) und Xylazinhydrochlorid (5 mg/kg, i.m.). Stellen Sie sicher, dass die Ratte vollständig betäubt ist, indem Sie prüfen, ob kein Zehenklemmreflex vorhanden ist.
      VORSICHT: Ketamin ist eine kontrollierte Substanz, die gemäß den institutionellen Richtlinien gehandhabt werden muss.
      HINWEIS: Die intramuskuläre Injektion von Anästhetika wird in dieser Studie verwendet, da sie eine schnellere und zuverlässigere Anästhesieinduktion als die intraperitoneale Injektion bewirkt. Überwachen Sie kontinuierlich die Atmung und Reaktionsfähigkeit der Ratte und bieten Sie während der gesamten Operation thermische Unterstützung.
   2. Rasieren Sie einen großen Bereich des Rückens der Ratte (oberer Rücken von knapp über den Schulterblättern bis zur Mitte des Rückens) sowie den Bereich des Halses unter dem rechten Vorderbein und die Kopfhaut.
   3. Legen Sie die Ratte in den Operationsbereich und tragen Sie Puralube (künstliche Tränen) auf die Augen auf. Injizieren Sie ein Körpergewichtsvolumen von Carprofen (Analgetikum) subkutan (s.c.) durch die Haut des oberen Rückens und injizieren Sie dann 5 ml Lactated Ringer's Lösung s.c. durch die Haut des unteren Rückens.
   4. Desinfizieren Sie alle Operationsstellen, indem Sie ein Stück sterile Gaze mit Betadin benetzen und mit kreisenden Bewegungen über den rasierten Operationsbereich wischen. Dann wiederholen Sie den Vorgang mit 70% Ethanol. Wiederholen Sie diesen abwechselnden Zyklus dreimal.
2. Führen Sie eine intravenöse Katheterimplantation gemäß den zuvor veröffentlichten Protokollen ^4,10 durch.
   HINWEIS: Während dieser Operation wird kein chirurgischer Tuch verwendet, um Reizungen während der Katheterimplantation zu vermeiden. Sterilisieren Sie alle Instrumente und Geräte vor dem Gebrauch. Verwenden Sie sterile Handschuhe und wechseln Sie die Handschuhe, wenn eine nicht sterile Oberfläche berührt wird.
3. Unmittelbar nach der Katheterimplantation wird die Ratte in einem stereotaktischen Rahmen gesichert, um AAV-Injektionen durchzuführen.
   1. Verabreichen Sie eine subkutane (s.c) Injektion von 2% Lidocain (0,2-0,3 ml) als Lokalanästhetikum auf die Kopfhaut.
      HINWEIS: Während der intravenösen Katheterimplantation wird kein Lokalanästhetikum verwendet, um Veränderungen der Operationsergebnisse zu vermeiden.
   2. Schließen Sie eine 26-Gauge-Injektionskanüle aus Edelstahl an eine Hamilton-Spritze an, die mit 1 μl konzentrierter AAV-Lösung gefüllt ist: entweder AAV5-hSyn-tdTomato oder AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      HINWEIS: oChIEF ist eine Variante des blaulichtempfindlichen Opsin-Kanalrhodopsins (ChR2), das auf einen weiten Frequenzbereich ^8,11 reagieren kann und daher für die in diesem Protokoll diskutierten niederfrequenten LTD-Experimente, aber auch für hochfrequente LTP-Experimente (hier nicht diskutiert) nützlich ist. Das oChIEF-Konstrukt wurde von Dr. Roger Tsien gespendet und vom Duke Viral Vector Core für die Verpackung und Aufreinigung aufbereitet. Zwischen dem Tag der Injektion und dem Tag der LTD-Induktion sind mindestens 3-4 Wochen erforderlich, um eine optimale Virusexpression in den MGN-Axon-Terminals zu ermöglichen.
      VORSICHT: Im Allgemeinen wird AAV als Organismus der Biosicherheitsstufe 1 (BSL-1) mit geringem Risiko einer Selbstinfektion angesehen, es sei denn, es wird ein Helfervirus bei seiner Herstellung verwendet. Seine Verwendung erfordert die IACUC-Zulassung, und es muss jederzeit eine geeignete PSA in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien verwendet werden, um unnötige Exposition zu begrenzen.
   3. Machen Sie mit einem Skalpell einen 0,5 mm langen Schnitt von der Vorderseite zur Rückseite des Schädels und entfernen Sie das darüber liegende Gewebe, um die Oberfläche des Schädels freizulegen.
   4. Nivellieren Sie den Kopf der Ratte in der vorderen / hinteren Achse und null stereotaktische Koordinaten zu Bregma.
   5. Bohren Sie drei kleine Löcher durch den Schädel mit einem Dremel-Werkzeug, das mit einem kleinen Bohrer ausgestattet ist. Verwenden Sie einen Schraubendreher, um Edelstahlschrauben (M2x4 965-A2) fest zu montieren.
      HINWEIS: Schrauben sind notwendig, um Zahnzement richtig zu binden und stabile, langlebige Kopfkappen zu schaffen. Die Position der Schrauben sollte über die vorder-hintere Achse des Schädels und weg von der AAV-Injektionsstelle verteilt sein.
   6. Bilaterale Löcher für die Injektion von AAV auf der Grundlage der Koordinaten aus dem Ratten-Hirnatlas (Watson und Paxinos)¹² für den medialen Teil des medialen Genikulatkerns (MGN) bohren; in mm von bregma, AP: -5,4; ML: ±3,0; DV: -6,6. Senken Sie die Injektionskanülen langsam ab (4 mm/min), bis sie im MGN positioniert sind. Injizieren Sie konzentrierte AAV-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 0,1 μl/min.
   7. Lassen Sie die Injektionskanüle nach Abschluss der Infusionen 5 Minuten an Ort und Stelle, um eine Diffusion von der Kanüle weg zu ermöglichen, und ziehen Sie die Kanüle dann langsam aus dem Gehirn heraus.
4. Unmittelbar nach der Virusinjektion werden weiterhin Glasfasern^4,9 implantiert^, die auf MGN-LA-Terminals abzielen.
   1. Verwenden Sie ein Dremel-Werkzeug, um bilaterale Löcher für Glasfaserimplantate zu bohren, die auf die laterale Amygdala abzielen (in mm von bregma, AP: -3,0; ML ±5.1).
   2. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Ferrule des Glasfaserimplantats zu greifen und an den stereotaktischen Adaptern zu befestigen, so dass sie sicher an Ort und Stelle gehalten werden.
   3. Senken Sie die Fasern langsam mit einer Geschwindigkeit von 2 mm / min, bis die Spitze der Faser im dorsalen Teil des LA sitzt (DV: -7,9 mm).
   4. Befestigen Sie den Schädel zuerst mit einer dünnen Schicht Loctite-Sofortkleber, gefolgt von Zahnzement und decken Sie Aderendhülsen mit einem Durchmesser von 1,25 mm und Staubabdeckungen ab.
      HINWEIS: Die Wahl des Klebstoffs zur Befestigung der Aderendhülsen am Schädel sollte vom örtlichen oder institutionellen Tierpflege- und Verwendungsausschuss genehmigt werden. Loctite wird für diese Studie verwendet, um die Aderendhülsen nach Versuch und Irrtum mit mehreren Klebstoffen zuverlässig am Schädel zu befestigen. Es können jedoch verfügbare Alternativen in Betracht gezogen werden.
5. Nach chirurgischen Eingriffen beherbergen Sie Ratten einzeln und bieten freien Zugang zu Futter und Wasser. Bereitstellung einer postoperativen Versorgung im Einklang mit den institutionellen Richtlinien. Spülen Sie die Katheter täglich mit Kochsalzlösung, die Gentamicin (5 mg / ml) und Heparin (30 USP / ml) enthält, um die Durchgängigkeit zu erhalten. Mindestens 5 Tage nach der Operation und 24 Stunden vor Beginn der Verhaltensexperimente beschränken die Nahrungsmittel Ratten auf ~ 90% ihres freien Fütterungsgewichts.

3. Selbstverabreichung von Kokain bei Nagetieren und Aussterben des instrumentellen Hebels

HINWEIS: Alle Verhaltensverfahren werden in Standard-OPANT-Konditionierungskammern durchgeführt, die mit zwei versenkbaren Hebeln an einer Wand, einem Reizlicht über jedem Hebel, einem Tongenerator, einem Hauslicht und einer Infusionspumpe ausgestattet sind.

1. Ratten wurden täglich 1 Stunde Kokain (2 mg/ml) Selbstverabreichungstrainings im Rahmen eines FR1-Verstärkungsplans unterzogen.
   1. Legen Sie die Ratten jeden Tag in die Operationskammer und lassen Sie die Ratten die Presse hebeln. Ein Druck auf den dafür vorgesehenen "aktiven Hebel" (ausgeglichen über linke und rechte Hebel) führt zu einer Kokaininfusion (1,0 mg/kg/Infusion) und einer 10-s-Präsentation eines zusammengesetzten Licht- und Tonsignals. Ein Druck auf den dafür vorgesehenen "inaktiven Hebel" hat keine programmierten Effekte.
   2. Setzen Sie die Selbstverabreichungsexperimente für mindestens 10 Tage fort und bis die Ratten mindestens 8 Infusionen pro Tag an 3 aufeinanderfolgenden Tagen erfolgreich erhalten haben. Das Nichterreichen der Akquisitionskriterien bis zum 20. Tag führt zum Ausschluss von der Studie.
2. Nachdem die Aufnahmekriterien erfolgreich erfüllt wurden, werden die Ratten 6-10 Tage lang einer 1-stündigen instrumentellen Extinktionssitzung unterzogen.
   1. Platzieren Sie Ratten in operanten Kammern und lassen Sie Ratten frei hebeln. Reaktionen sowohl auf die aktiven als auch auf die inaktiven Hebel haben jedoch keine programmierten Konsequenzen.
   2. Lassen Sie Ratten das instrumentelle Aussterben täglich fortsetzen, bis durchschnittlich < 25 Hebeldrücke an zwei aufeinanderfolgenden Tagen auftreten.

4. In vivo Optogenetische Induktion von LTD

HINWEIS: Optogenetische Inhibitionsexperimente finden 24 Stunden nach dem letzten Tag der instrumentellen Extinktion statt.

1. Verbinden Sie Patchkabel mit einer blauen 473-nm-Laserdiode über ein Drehgelenk, das über einem sauberen Standard-Nagetierkäfig aufgehängt ist, wobei die Abdeckung entfernt wird. Dieser Aufbau ermöglicht es Nagetieren, sich während der optogenetischen Stimulation frei im Käfig zu bewegen.
2. Schalten Sie die Laserdiode gemäß Bedienungsanleitung ein und schließen Sie sie an einen Impulsgeber an. Passen Sie die Einstellungen so an, dass die Ratte beim Einschalten 900 2-ms-Lichtimpulse bei 1 Hz empfängt.
   VORSICHT: Während des Betriebs des Lasers muss immer ein geeigneter Augenschutz verwendet werden.
3. Messen Sie die Lichtintensität durch das Patchkabel mit einem Lichtsensor. Stellen Sie die Intensität des Lasers so ein, dass die Lichtleistung durch das Patchkabel ~ 5-7 mW beträgt.
4. Legen Sie Ratten in einen sauberen Käfig. Entfernen Sie Staubschutzabdeckungen und Aderendhülsen und legen Sie die Aderendhülsen frei. Verbinden Sie Patchkabel bilateral mit den Glasfaserimplantaten. Lassen Sie Ratten vor der LTD-Induktion 3 Minuten lang die Umgebung erkunden.
5. Schalten Sie den Pulsgenerator ein, um die optogenetische Stimulation einzuleiten.
   HINWEIS: Obwohl es unwahrscheinlich ist, wird das Experiment sofort beendet, wenn bei der Ratte Nebenwirkungen auf die Stimulation auftreten, und die Ratten werden auf der Grundlage der institutionellen Richtlinien ordnungsgemäß eingeschläfert.
6. Nach der LTD-Induktion halten Sie die Ratten für 3 Minuten im Käfig und setzen Sie sie dann wieder in ihre Heimatkäfige ein.
7. Für Kontrollexperimente verwenden Sie das gleiche Stimulationsverfahren bei Ratten, die das AAV5-tdTomato-Kontrollvirus exprimieren. Für Scheinexperimente befestigen Sie ein Patchkabel an der Glasfaser von Ratten, die das AAV5-oChIEF-Virus exprimieren, aber während einer 15-minütigen Sitzung wird keine Stimulation abgegeben.

5. Testen Sie die Wirkung der optogenetischen Stimulation auf die Cue-induzierte Kokainsuche

1. 24 Stunden nach der optogenetischen In-vivo-Stimulation werden die Ratten wieder in operante Konditionierungskammern gebracht. Ratten werden einer 1-stündigen Standard-Cue-induzierten Wiedereinsetzungssitzung unterzogen, um das Kokain-Suchverhalten zu beurteilen.
   ANMERKUNG: Während der Reiz-induzierten Wiedereinsetzung führt eine Reaktion auf den aktiven Hebel zu einer 10-s-Präsentation des Kokain-assoziierten Reizes, aber zu keinen Kokain-Infusionen.
2. Führen Sie mindestens 1 Woche nach dem ersten Test einen zweiten Wiedereinsetzungstest durch, um festzustellen, ob die optogenetische LTD-Induktion zu einer langfristigen Unterdrückung der Kokainsuche führt

6. Färbung, Fluoreszenz und Bildgebung zur histologischen Überprüfung der Virusexpression und der Platzierung von Glasfasern

1. Stellen Sie 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 4% Paraformaldehyd (PFA) her. Lagern Sie beide Lösungen auf Eis. Das Gesamtvolumen hängt von der Anzahl der Ratten in der Studie ab (~ 100 ml PBS und 200 ml PFA werden pro Ratte verwendet).
   VORSICHT: PFA ist eine giftige Chemikalie und bekanntermaßen krebserregend. Achten Sie darauf, sowohl das Einatmen als auch den Kontakt mit der Haut zu vermeiden. Die Verwendung und Entsorgung sollte im Einklang mit den institutionellen Leitlinien erfolgen, einschließlich der Verwendung geeigneter PSA und einer Dunstabzugshaube.
2. Stellen Sie die Peristaltikpumpe mit einer Durchflussrate von 20 ml/min ein. Füllen Sie den Schlauch der Pumpe mit 1x PBS. Befestigen Sie eine abgestumpfte 20-Gauge-Nadel am Ende des Schlauchs.
3. Ratten werden mit Natrium-Pentobarbital (100 mg/kg, i.p.) tief betäubt. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch fehlende Reaktion auf Zehenkneifen, bevor Sie fortfahren.
   HINWEIS: Natrium-Pentobarbital wird verwendet, da die Perfusion ein terminales Verfahren ist.
4. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Bauchhöhle der Ratte unter dem Zwerchfell aufzuschneiden. Schneiden Sie den Brustkorb rostral entlang der seitlichen Ränder durch, um das Herz der Ratte freizulegen. Verwenden Sie Hämostat, um den rostralen Teil des Brustkorbs vom Herzen weg zu klemmen. Schneiden Sie das darüber liegende Fettgewebe ab, das das Herz umgibt.
5. Führen Sie die stumpfe Nadel durch den linken Ventrikel und bis in die Aorta ein. Schneiden Sie ein kleines Loch in den rechten Vorhof, um die Lösung abzulassen, wenn sie zum Herzen zurückkehrt.
6. Perfundiert Sie jede Ratte mit 1x PBS für 5 min, gefolgt von 4% PFA, pH 7,4 für 10 min.
7. Enthaupten Sie die Ratte, extrahieren Sie das Gehirn und fixieren Sie es in 4% PFA für 24 Stunden. Dann übertragen Sie das Gehirn auf 30% ige Saccharoselösung für 2-3 d.
8. Schneiden Sie Gehirne bei 50 μm mit einem Kryostaten.
9. Montieren Sie alle Scheiben, die den LA oder MGN enthalten, auf Objektträger und Deckglas.
10. Bildschnitte mit einem Epifluoreszenzmikroskop zur Überprüfung der AAV-oChIEF-tdTomato-Expression im MGN und seiner Projektionen auf den LA sowie die Platzierung der optischen Faser über dem LA.

7. Perfusion und akute Hirnschnittvorbereitung für elektrophysiologische Experimente

HINWEIS: Elektrophysiologische Experimente werden an einer Teilmenge von Tieren durchgeführt, um den Erfolg von in vivo LTD zu validieren.

1. Mit den in den Tabellen 1-3 ^4,13 aufgeführten Reagenzien werden elektrophysiologische Lösungen hergestellt. Stellen Sie den pH-Wert aller Lösungen mit HCl auf 7,4 ein und stellen Sie die Osmolarität auf 300-310 mOsm/kg_H2Oein. Sättigen Sie alle Lösungen während des Gebrauchs immer mit Carbogen (95% O 2 / 5% CO₂).
2. Verwenden Sie Isofluran gemäß den lokalen oder institutionellen Tierpflege- und Verwendungsrichtlinien, betäuben Sie die Ratte in einer geschlossenen Euthanasiekammer.  Bestätigen Sie, dass das Tier vollständig betäubt ist, indem Sie den Zehenklemmreflex anwenden.
3. Füllen Sie ein kleines Becherglas mit 50 ml eiskalter Schneidlösung. Füllen Sie den Schlauch der Schlauchpumpe mit Lösung und stellen Sie die Durchflussrate auf 20 ml / min ein. Befestigen Sie eine abgestumpfte 20-Gauge-Nadel am Ende des Schlauchs.
4. Öffnen Sie die Bauchhöhle (siehe Schritte 6.4 und 6.5) und perfundierten Sie die Ratte kurz mit Schneidelösung (maximal 1-2 min).
5. Nach der Perfusion sofort Ratte enthaupten. Das Gehirn wird entnommen und für 30 s-1 min in ein kleines Becherglas gegeben, das mit 4 °C Schneidlösung gefüllt ist.
6. Übertragen Sie Gehirne mit einem Spatel und fixieren Sie sie schnell in der Kammer eines Vibratoms. Entfernen Sie die Pia mit einer feinen Pinzette. Die Kammer wird mit 4 °C Schneidlösung gefüllt und mit einer Geschwindigkeit von 0,37 mm/s und einer Frequenz von 70 Hz akute koronale Schnitte (250 μm dick) der Amygdala hergestellt.
7. Nach der Gewinnung der Scheiben wird jede Schicht in eine mit Schneidlösung gefüllte Haltekammer gegeben und bei 37 °C für 10-12 min inkubiert. Pro Tier können etwa 5-7 Scheiben mit LA erhalten werden.
8. Die Scheiben werden in ein Becherglas mit einer Lösung bei Raumtemperatur (RT) gegeben und vor dem Versuch >30 Minuten lang zurückgestellt.
   HINWEIS: Die Scheiben bleiben in der Regel gesund, während sie 4-6 Stunden in Haltelösung gehalten werden. Aufgrund der fluoreszierenden Natur des AAV werden die Scheiben bei schlechten Lichtverhältnissen aufbewahrt.

8. Ex vivo Elektrophysiologische Messungen

1. Intrazelluläre Lösungen werden unter Verwendung der in den Tabellen 4-5 aufgeführten Reagenzien hergestellt.
   HINWEIS: Intrazelluläre Lösungen sollten vor den Experimenten hergestellt werden und können langfristig (3-12 Monate) bei -80 °C oder kurzfristig (1-2 Monate) bei -20 °C gelagert werden. Die Lösungen werden auf 7,3 pH-Wert eingestellt (mit CsOH für Cs-basierte intrazelluläre Lösung und mit KOH für K-basierte intrazelluläre Lösung). Stellen Sie sich auf eine Endosmolarität von 290-300 mOsm/kg_H2Oein.
2. 500 mM Picrotoxin-Stammlösung, gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO), werden hergestellt.
   HINWEIS: Picrotoxinvorräte werden aliquotiert und bei -20 °C gelagert. Am Tag der Anwendung werden Aliquots aufgetaut und bis zu einer Endkonzentration von 100 μM in die Aufnahmelösung gegeben.
   VORSICHT: Picrotoxin ist ein nicht-kompetitiver Antagonist von GABA-A-Rezeptoren, so dass die Infusion von Picrotoxin eine stimulierende Wirkung hat. Es ist stark toxisch durch orale Einnahme oder Hautresorption. Bei der Arbeit mit Picrotoxin muss immer eine geeignete PSA verwendet werden.
3. Übertragen Sie Schnitte auf ein aufrechtes Mikroskop, das für elektrophysiologische Experimente entwickelt wurde.
4. Während der Experimente werden die Perfusionsscheiben kontinuierlich mit einer auf 31-33 °C erhitzten Aufnahmelösung gebadet.
5. Vergrößern Sie den LA mit einem 4-fachen Objektiv. Identifizieren Sie die wichtigsten Neuronen anhand der Morphologie mit einer 40-fachen Wasserimmersionslinse.
6. Verwenden Sie eine Glaspipette (3-5 MΩ), die entweder mit einer Cs-basierten intrazellulären Lösung (für Spannungsklemmenexperimente) oder einer K-basierten intrazellulären Lösung (für Stromklemmenexperimente) gefüllt ist, um Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen zu erhalten.
7. Identifizieren Sie AAV-infizierte MGN-axonale Projektionen unter Fluoreszenz (mit einem RFP-Filter). Stimulieren Sie Projektionen mit einem DPSS-Laser mit blauem Licht (473 nm), der an einen Pulsgenerator angeschlossen ist.
   VORSICHT: Um die Laserbelichtung zu begrenzen, wird kollimiertes Laserlicht an einen Fluoreszenzanschluss am Mikroskop gekoppelt und durch das Objektiv auf die Scheibe fokussiert.
   HINWEIS: Im Spannungsklemmenmodus werden exzitatorische postsynaptische Ströme (EPSCs) optisch bei 0,1 Hz evoziert. Neuronen, die Eingaben von AAV-infizierten MGN-Neuronen erhalten, weisen zuverlässige EPSCs auf.
8. Um ex vivo LTD zu induzieren, wird im Stromklemmmodus eine stabile Baseline der exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSPs) für mindestens 10 Minuten aufgezeichnet. Als nächstes liefern Sie 900 2-ms-Impulse von 473-nm-Licht mit einer Frequenz von 1 Hz (Gesamtzeit = 15 Minuten). Dann nehmen Sie EPSPs kontinuierlich bei 0,1 Hz für ≥60 min auf.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine Zeitleiste mit der Reihenfolge der Experimente. In Verhaltensexperimenten dient die Anzahl der Kokaininfusionen sowie die Anzahl der Reaktionen auf den aktiven Hebel als Maß für die Intensität des Kokainsuchverhaltens. In den ersten Tagen der Selbstverabreichung von Kokain sollte die Anzahl der aktiven Reaktionen an jedem Erwerbstag allmählich zunehmen, bevor sie sich in der zweiten Woche stabilisiert. Umgekehrt sollten die inaktiven Hebelreaktionen während des gesamte...

Diskussion

Wie oben beschrieben, gibt es mehrere kritische Schritte, die wichtig sind, um die richtigen experimentellen Ergebnisse zu erzielen. Das Protokoll wird wahrscheinlich nur bei Tieren wirksam sein, die eine ordnungsgemäße Selbstverabreichung von Kokain erhalten, und bisher wurde es nur mit den oben genannten Parametern getestet. Es ist möglich, dass die Kokaindosis, das Verstärkungsschema und die Cue-Parameter mit wahrscheinlich geringen Auswirkungen auf die Verhaltensergebnisse modifiziert werden können, mit der Ausnahme,...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,9 % Kochsalzlösung	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vector Core (über Roger Tsien)	#268	Siehe Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Kontrolle)	Duke Viral Vector Core Control		Siehe Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Künstliche Tränen (Augensalbe)	Covetrus	70349
ATP Magnesiumsalz	Fisher Scientific	A9187
Betadine	Butler Schein	38250
Calciumchlorid	Fisher Scientific	C1016
Cäsiumchlorid	Fisher Scientific	289329
Cäsium Hydroxid	Fisher Scientific	516988
Cäsiummethansulfonat	Fisher Scientific	C1426
Kokain HCl	NIDA Drug Supply Center	9041-001
Kryostat	Leica	CM1950
D-Glukose	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
Zweikanal-Temperaturregler	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
Ethanol	University of Pittsburgh Chemie Lagerraum	200C5000
Ferrule Staubschutzkappen	Thor Labs	CAPL	Weiße Kunststoff-Staubschutzkappen für 1,25 mm Aderendhülsen
Ferrule Gegenhülsen	Doric Lenses	F210-3011	Sleeve_BR_1,25, Bronze, 1,25 mm Innendurchmesser
	Präzisionsfaserprodukte	MM-FER2007C-2300	& Oslash; 1,25 mm Multimode LC/PC Keramik-Ferrule, & Oslash; 230 μ m Lochgröße
Faseroptik	Thor Labs	FP200URT	200 μ m core Multimode-Faser (0,5 NA)
Glasfaser-Drehdurchführung	Prizmatix	(bei Amazon bestellt)	18 mm Durchmesser, FC-FC-Steckverbinder für
Faser Faserabisolierwerkzeug	Thor Labs	T12S21
Fluoroshield mit DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamicin	Henry Schein	6913
GTP Natriumsalz	Fisher Scientific	G8877
Hamilton Spritze	Hamilton	80085	10 μ L-Volumen, 26 Gauge, 2 Zoll, Spitzenausführung 3
Heißluftpistole	Allied Electronics	972-6966	250 V, 750-800 ° F
Wärmehärtende	Epoxid-Präzisionsfaserprodukte	PFP-353ND-8OZ
Heparin	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Salzsäure	Fisher Scientific	219405490
Isofluran	Henry Schein	29405
Ketamin HCl	Henry Schein	55853	Ketamin ist eine kontrollierte Substanz und sollte gemäß den institutionellen Richtlinien gehandhabt werden
Lactated Ringer' s	Henry Schein	9846
Laser, Treiber und Laser-zu-Faser-Koppler	OEM Laser Systems	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473 nm, diodengepumpter Festkörperlaser (eine Option)
L-Glutathion	Fisher Scientific	G4251
Lidocain	Butler Schein	14583
Lichtsensor	Thor Labs	PM100D	Kompakte Energiezählerkonsole mit Digitalanzeige
Loctite Sekundenkleber	Grainger	5E207
Magnesiumsulfat	Sigma-Aldrich	203726
Mikroelektrode Verstärker/Datenerfassung	Molecular Devices	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Mikroinjektorpumpe	Harvard Apparatus	70-4501	Doppelspritze
Mikromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Mikroskop	Olympus	BX51WI	Aufstehendes Mikroskop für Elektrophysiologie
Mikroskop	Olympus	BX61VS	Epifluoreszierendes Objektträger-Scanning-Mikroskop
N-Methyl-D-Glukamin	Sigma-Aldrich	M2004
Orthojet Dentalzement, flüssig	Lang Dental	1504BLK	schwarz
Orthojet Zahnzement, Pulver	Lang Dental	1530BLK	Zeitgenössisches Pulver, schwarz
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
Patchkabel	Thor Labs	FP200ERT	Multimode, FT030 Schlauch
Picrotoxin	Fisher Scientific	AC131210010
Polierscheibe	Thor Labs	D50FC
Polierpad	Thor Labs	NRS913	9" x 13"
Polierpapier	Thor Labs	LFG5P	5 μ m körnung
Polierpapier	Thor Labs	LFG3P	3 μ m Körnung
Polierpapier	Thor Labs	LFG1P	1 μ m Körnung
Polierpapier	Thor Labs	LFG03P	0.3 μ m grit
Kaliumchlorid	Sigma-Aldrich	P9333
Kaliumhydroxid	Fisher Scientific	P5958
Kaliummethansulfonat	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
Rimadyl (Carprofen)	Henry Schein	24751
Selbstverwaltung Med	Associates	MED-NP5L-D1
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	S5761
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S7653
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	1064980500
Natrium-L-Ascorbat	Sigma-Aldrich	A7631
Natrium-Pentobarbital	Henry Schein	24352
Natriumphosphat	Sigma-Aldrich	S9638
Natriumphosphokreatin	Fisher Scientific	P7936
Natriumpyruvat	Sigma-Aldrich	P2256
Edelstahl Maschinenschrauben	WW Grainger	& 6GB25	M2-0,40 mm Maschinenschraube, Pfanne, Phillips, A2 Edelstahl, glatt, 3 mm Länge
Stereotaxischer Adapter für Aderendhülsen	Thor Labs	XCL
Stereotaxic Frame	Stoelting	51603
Saccharose	Sigma-Aldrich	S8501
Nahtfaden	Fine Science Tools	18020-50	Seidenfaden; Größe: 5/0, Durchmesser: 0.12 mm
TEA-Chloride	Fisher Scientific	T2265
Thioharnstoff	Sigma-Aldrich	T8656
Vetbond Gewebekleber	Covetrus	001505
Vibratome	Leica	VT1200S
Xylazin	Butler Schein	33198