Summary
Os métodos aqui descritos descrevem um procedimento usado para reverter optogeneticamente a plasticidade induzida pela cocaína em um circuito comportamentalmente relevante em ratos. A estimulação óptica sustentada de baixa frequência das sinapses tálamo-amígdala induz depressão a longo prazo (LTD). A LTD induzida optogeneticamente in vivo em ratos com experiência em cocaína resultou na subsequente atenuação da procura de droga motivada por pistas.
Abstract
Este protocolo demonstra os passos necessários para o uso de ferramentas optogenéticas para reverter a plasticidade induzida pela cocaína nos circuitos tálamo-amígdala para reduzir os comportamentos subsequentes de busca de cocaína no rato. Em nossa pesquisa, descobrimos que, quando os ratos autoadministram cocaína intravenosa emparelhada com uma sugestão audiovisual, as sinapses formadas nas entradas do núcleo geniculado medial do tálamo (MGN) nos neurônios principais da amígdala lateral (LA) tornam-se mais fortes à medida que a associação cue-cocaína é aprendida. Levantamos a hipótese de que a reversão da plasticidade induzida pela cocaína nessas sinapses reduziria o comportamento de busca de cocaína motivado por pistas. Para realizar esse tipo de neuromodulação in vivo, queríamos induzir depressão sináptica de longo prazo (LTD), que diminui a força das sinapses MGN-LA. Para tanto, utilizou-se a optogenética, que permite a neuromodulação dos circuitos cerebrais utilizando a luz. A opsina excitatória oChiEF foi expressa em terminais MGN pré-sinápticos no AL por infusão de um AAV contendo oChiEF no MGN. Fibras ópticas foram então implantadas no AL e a luz laser de 473 nm foi pulsada na frequência de 1 Hz por 15 minutos para induzir LTD e reverter a plasticidade induzida pela cocaína. Essa manipulação produz uma redução duradoura na capacidade das pistas associadas à cocaína de induzir ações de busca de drogas.
Introduction
O abuso de substâncias é um problema de saúde pública muito sério nos EUA e no mundo. Apesar de décadas de intensa pesquisa, existem pouquíssimas opções terapêuticas efetivas 1,2. Um grande revés para o tratamento é o fato de que o uso crônico de drogas gera memórias associativas de longo prazo entre pistas ambientais e a própria droga. A reexposição a pistas relacionadas a drogas impulsiona respostas fisiológicas e comportamentais que motivam o uso contínuo de drogas e a recaída3. Uma nova estratégia terapêutica é promulgar tratamentos baseados na memória que visam manipular os circuitos envolvidos na regulação das associações medicamentosas. Recentemente, observou-se que as sinapses da amígdala lateral (AE), especificamente aquelas decorrentes do núcleo geniculado medial (MGN) do tálamo, são fortalecidas pela autoadministração repetida de cocaína associada a pistas, e que essa potencialização pode apoiar o comportamento de busca de cocaína 4,5. Portanto, foi proposto que a reintegração induzida por pistas poderia ser atenuada pela reversão da plasticidade nas sinapses MGN-LA.
A capacidade de atingir com precisão a plasticidade sináptica de um circuito cerebral específico tem sido um grande desafio para o campo. As ferramentas farmacológicas tradicionais têm tido algum sucesso na diminuição dos comportamentos de recaída, mas são limitadas pela incapacidade de manipular sinapses individuais. No entanto, o recente desenvolvimento da optogenética in vivo forneceu as ferramentas necessárias para superar essas limitações e controlar as vias neurais com precisão temporal e espacial 6,7,8. Ao expressar opsinas sensíveis à luz em um circuito cerebral específico, a luz laser pode então ser usada para ativar ou inibir o circuito. A estimulação óptica dependente de frequência pode ser utilizada para manipular especificamente a plasticidade sináptica do circuito em um animal que se comporta.
Este manuscrito descreve o procedimento adotado para manipular o circuito MGN-LA comportamentalmente relevante usando optogenética in vivo. Primeiramente, a opsina excitatória oChIEF foi expressa no MGN e as fibras ópticas foram implantadas bilateralmente no AE. Os animais foram então treinados para auto-administrar cocaína de forma dependente de pista, o que potencializa a via MGN-LA. Em seguida, a estimulação sustentada de baixa frequência com luz laser de 473 nm foi usada para produzir LTD específica do circuito. A reversão da plasticidade induzida pelo uso de cocaína gerou uma redução duradoura na capacidade das pistas de desencadear ações associadas ao comportamento de busca de drogas.
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Protocol
Os experimentos descritos neste protocolo foram consistentes com as diretrizes estabelecidas pelo National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh. Todos os procedimentos foram realizados com ratos Sprague-Dawley adultos e ingênuos que pesavam 275-325 g na chegada.
1. Construção de implantes de fibra óptica e cabos de remendo
- Preparar implantes de fibra óptica seguindo protocolos previamente publicados9. Os experimentos descritos neste protocolo utilizaram uma ferrule cerâmica de núcleo de 200 μm (0,5 NA) e uma ferrule cerâmica Ø1,25 mm Multimodo LC/PC, tamanho do furo de Ø230 μm.
- Use uma ferramenta de Dremel para pontuar o terço inferior de uma ferrule (mais próxima da extremidade plana da ferrule). Pontuar as ferrules ajuda-os a permanecer apegados ao cimento dental, aumentando a probabilidade de que permaneçam seguros durante toda a extensão da experimentação.
- Use cortadores de arame para cortar ~ 35 mm de fibra. Use a ferramenta de decapagem de fibra para retirar ~ 25 mm de fibra, deixando 10 mm não expostos.
- Prepare o epóxi curável pelo calor de acordo com as instruções do fabricante. Dissolver 1 g de resina em pó em 100 mg de composto endurecedor. Ligue uma agulha embotada de calibre 25 a uma seringa de 1 ml. Encha a seringa com epóxi e prenda uma ponta de agulha embotada de calibre 25.
- Use um vice ou grampo para segurar com segurança a ponteira com o lado plano voltado para cima e o lado convexo voltado para baixo. Com a seringa cheia de epóxi, adicione uma gota de epóxi ao lado plano da ferrule, tomando cuidado para limpar o excesso de epóxi dos lados da ferrule.
- Insira a porção despojada de fibra através da ponteira permitindo um extra de 5 mm de fibra despojada exposta. No caso de implantes de AL, a fibra será implantada de 7,9 mm ventral a bregma, de modo que o comprimento exposto da fibra não despojada deve ser de ~ 13 mm.
- Cure o epóxi com uma pistola de calor por cerca de 30-40 s até que ele fique preto / âmbar na cor.
- Marque a fibra diretamente na interface da extremidade convexa da ferrule com faca de diamante e use um dedo para tocar suavemente a fibra.
- Polir a extremidade convexa da ferrule segurando com um hemostático, certificando-se de aplicar pressão uniforme e fazendo 20 rotações circulares cada uma em uma série de papel de polimento (de alto grau a baixo grau; 5, 3, 1, 0,3 μm).
- Prenda a fibra não despojada à mesa usando fita adesiva e marque a fibra despojada, deixando 2 mm extras além da coordenada ventral (para implantes LA, o comprimento final da fibra é de ~10 mm). Use um hemostático para puxar a ferrule e quebrar uniformemente a fibra onde ela foi marcada. Tenha cuidado para não cortar a fibra completamente ao marcar, ou então o núcleo da fibra será danificado.
- Construa cabos de patch compatíveis com implantes de fibra óptica. Cabos de patch personalizados foram comprados (Consulte Tabela de Materiais). Alternativamente, os cabos de patch podem ser construídos seguindo protocolos publicados anteriormente9.
NOTA: O diâmetro e o NA da fibra da ponteira e da fibra do cabo de remendo devem corresponder na junção de acoplamento para evitar o excesso de perda de luz, o que pode resultar em uma falha em estimular suficientemente a atividade neural. - Meça a saída de luz através do cabo de remendo e implantes de fibra óptica conectando o cabo de patch/fibra óptica a uma fonte de luz laser apropriada (saída de 473 nm, 1 mW) e medindo a saída com um sensor de luz. Uma fibra construída com sucesso emitirá um círculo concêntrico de luz e não terá mais de 30% de perda de luz.
2. Cateterismo Intravenoso de Roedores, Entrega de Vírus e Implantação de Fibra Óptica
- Prepare o animal para a cirurgia.
- Anestesiar totalmente ratos com anestésico de escolha com base em diretrizes institucionais. Uma opção é o cloridrato de cetamina (87,5-100 mg/kg, i.m.) e o cloridrato de xilazina (5 mg/kg, i.m.). Certifique-se de que o rato esteja totalmente anestesiado, verificando a falta de um reflexo de beliscar o dedo do pé.
CUIDADO: A cetamina é uma substância controlada que deve ser manuseada de acordo com as diretrizes institucionais.
NOTA: A injeção intramuscular de anestésicos é utilizada neste estudo, pois produziu uma indução anestésica mais rápida e confiável do que a injeção intraperitoneal. Monitore continuamente a respiração e a capacidade de resposta do rato e forneça suporte térmico durante toda a cirurgia. - Raspe uma grande área das costas do rato (parte superior das costas logo acima das omoplatas até o meio das costas), bem como a área do pescoço abaixo do membro anterior direito e do couro cabeludo.
- Coloque o rato na área cirúrgica e aplique puralube (lágrimas artificiais) nos olhos. Injete um volume de peso corporal de carprofeno (analgésico) por via subcutânea (s.c.) através da pele da parte superior das costas e, em seguida, injete 5 mL de solução de Lactated Ringer s.c. através da pele da parte inferior das costas.
- Higienize todos os locais cirúrgicos molhando um pedaço de gaze estéril com betadine e limpando-o pela área cirúrgica raspada usando um movimento circular. Em seguida, repita o processo com etanol a 70%. Repita este ciclo alternado três vezes.
- Anestesiar totalmente ratos com anestésico de escolha com base em diretrizes institucionais. Uma opção é o cloridrato de cetamina (87,5-100 mg/kg, i.m.) e o cloridrato de xilazina (5 mg/kg, i.m.). Certifique-se de que o rato esteja totalmente anestesiado, verificando a falta de um reflexo de beliscar o dedo do pé.
- Realizar o implante de cateter intravenoso de acordo com protocolos previamente publicados 4,10.
NOTA: Uma cortina cirúrgica não é usada durante esta cirurgia para evitar irritação durante o implante do cateter. Esterilize todos os instrumentos e equipamentos antes de usar. Use luvas estéreis e troque as luvas se qualquer superfície não estéril for contatada. - Imediatamente após as implantações do cateter, prenda o rato em uma estrutura estereotáxica para realizar injeções de AAV.
- Administrar uma injeção subcutânea (s.c) de lidocaína a 2% (0,2-0,3 mL) no couro cabeludo como anestésico local.
NOTA: O anestésico local não é utilizado durante o implante do cateter intravenoso para evitar alterações nos resultados cirúrgicos. - Conecte uma cânula de injeção de aço inoxidável de calibre 26 a uma seringa Hamilton cheia com 1 μL de solução concentrada de AAV: AAV5-hSyn-tdTomato ou AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
NOTA: oChIEF é uma variante da canalrodopsina opsina sensível à luz azul (ChR2), que pode responder a uma ampla gama de frequências 8,11 e, portanto, tem utilidade para os experimentos LTD de baixa frequência discutidos neste protocolo, mas também para experimentos LTP de alta frequência (não discutidos aqui). A construção do oChIEF foi doada pelo Dr. Roger Tsien e processada para embalagem e purificação pelo Duke Viral Vector Core. Pelo menos 3-4 semanas são necessárias entre o dia da injeção e o dia da indução de LTD para permitir a expressão ideal do vírus nos terminais axônicos MGN.
CUIDADO: Geralmente, o AAV é considerado um organismo de nível 1 de biossegurança (BSL-1), com baixo risco de autoinfecção, a menos que um vírus auxiliar seja usado em sua produção. Seu uso requer a aprovação da IACUC e os EPIs adequados devem ser usados em todos os momentos, de acordo com as diretrizes institucionais, para limitar a exposição desnecessária. - Usando um bisturi, faça uma incisão de 0,5 mm da frente para a parte traseira do crânio e remova o tecido sobrejacente para expor a superfície do crânio.
- Nivelar a cabeça do rato no eixo anterior/posterior e zero coordenadas estereotáxicas para o bregma.
- Faça três pequenos furos através do crânio usando uma ferramenta Dremel equipada com uma pequena broca. Use chave de fenda para montar firmemente parafusos de aço inoxidável (M2x4 965-A2) no lugar.
NOTA: Os parafusos são necessários para a ligação adequada do cimento dentário e a criação de tampas de cabeça resistentes e duradouras. A posição dos parafusos deve ser espalhada pelo eixo anteroposterior do crânio e longe do local de injeção de AAV. - Fazer furos bilaterais para injeção de AAV com base nas coordenadas do Atlas do Cérebro de Rato (Watson e Paxinos)12 para a porção medial do núcleo geniculado medial (MGN); em mm do bregma, AP: -5,4; ML: ±3,0; DV: -6.6. Reduzir lentamente as cânulas de injeção (4 mm/min) até ficar posicionado no MGN. Injetar solução concentrada de AAV a uma taxa de 0,1 μL/min.
- Deixe a cânula de injeção no lugar por 5 minutos após as infusões estarem completas para permitir a difusão para longe da cânula e, em seguida, retire lentamente a cânula do cérebro.
- Administrar uma injeção subcutânea (s.c) de lidocaína a 2% (0,2-0,3 mL) no couro cabeludo como anestésico local.
- Imediatamente após as injeções de vírus, continue a implantar fibras ópticas 4,9 visando os terminais MGN-LA.
- Use uma ferramenta Dremel para perfurar furos bilaterais para implantes de fibra óptica visando a amígdala lateral (em mm de bregma, AP: -3,0; ML ±5.1).
- Use fórceps para pegar a ponteira do implante de fibra óptica e fixá-la aos adaptadores estereotáxicos para que eles sejam mantidos firmemente no lugar.
- Abaixe lentamente as fibras a uma taxa de 2 mm/min, até que a ponta da fibra fique na porção dorsal do AE (DV: -7,9 mm).
- Prenda as esferrules ao crânio usando primeiro uma fina camada de adesivo instantâneo Loctite seguida de cimento dental e marrulas de cobertura com mangas de ferrule de 1,25 mm de diâmetro e capas de poeira.
NOTA: A escolha do adesivo para fixar as esferrules ao crânio deve ser aprovada pelo comitê local ou institucional de cuidados e uso de animais. A loctita é usada para este estudo para fixar de forma confiável as ferragens ao crânio após tentativa e erro com múltiplos adesivos; no entanto, alternativas disponíveis podem ser consideradas.
- Após os procedimentos cirúrgicos, abrigar ratos individualmente e fornecer acesso gratuito a alimentos e água. Prestar cuidados pós-operatórios consistentes com as diretrizes institucionais. Lavar cateteres diariamente com solução salina contendo gentamicina (5 mg/mL) e heparina (30 USP/mL) para manter a permeabilidade. Pelo menos 5 dias após a cirurgia e 24 horas antes do início dos experimentos comportamentais, a comida restringe os ratos a ~ 90% de seu peso de alimentação livre.
3. Autoadministração de cocaína de roedores e extinção de alavancas instrumentais
NOTA: Todos os procedimentos comportamentais são conduzidos em câmaras de condicionamento operante padrão, equipadas com duas alavancas retráteis em uma parede, uma luz de estímulo acima de cada alavanca, um gerador de tons, uma luz de casa e uma bomba de infusão.
- Submeter ratos a sessões diárias de treinamento de autoadministração de cocaína de 1 h (2 mg/mL) sob um esquema de reforço FR1.
- Coloque os ratos na câmara operante todos os dias e permita que os ratos lever pressionem. Uma pressão na designada "alavanca ativa" (contrabalançada entre as alavancas esquerda e direita) resulta em uma infusão de cocaína (1,0 mg/kg/infusão) e uma apresentação de 10 s de uma sugestão composta de luz e tom. Uma pressão na designada "alavanca inativa" não tem efeitos programados.
- Continue os experimentos de autoadministração por pelo menos 10 d e até que os ratos ganhem com sucesso pelo menos 8 infusões/dia durante 3 dias consecutivos. O não cumprimento dos critérios de aquisição até o dia 20 resulta na exclusão do estudo.
- Após o cumprimento bem-sucedido dos critérios de aquisição, os ratos são submetidos a sessões de extinção instrumental de 1 h por 6-10 d.
- Coloque os ratos em câmaras operantes e permita que os ratos lever livremente pressionem. No entanto, as respostas nas alavancas ativas e inativas não têm consequências programadas.
- Fazer com que os ratos continuem a extinção instrumental diariamente até que ocorra uma média de < 25 pressões de alavanca durante dois dias consecutivos.
4. Indução Optogenética In vivo de LTD
NOTA: Experimentos de inibição optogenética ocorrem 24 h após o último dia de extinção instrumental.
- Conecte os cabos de remendo a um diodo laser azul de 473 nm através de uma junta rotativa suspensa acima de uma gaiola de alojamento de roedores limpa e padrão com a tampa removida. Essa configuração permite que os roedores se movam livremente pela gaiola durante a estimulação optogenética.
- Ligue o diodo laser de acordo com as instruções de operação e conecte-se a um gerador de pulsos. Ajuste as configurações, de modo que, quando ligado, o rato receba 900 pulsos de luz de 2 ms a 1 Hz.
CUIDADO: A proteção ocular adequada deve ser usada em todos os momentos durante a operação do laser. - Meça a intensidade da luz através do patch cord usando um sensor de luz. Ajuste a intensidade do laser para que a saída de luz através do cabo de remendo seja de ~ 5-7 mW.
- Coloque os ratos em uma gaiola de alojamento limpa. Remova as tampas de poeira e as mangas de ferrule, expondo as ferrules. Conecte os cabos de remendo bilateralmente aos implantes de fibra óptica. Permita que os ratos explorem o ambiente por 3 minutos antes da indução do LTD.
- Ligue o gerador de pulsos para iniciar a estimulação optogenética.
NOTA: Embora improvável, se o rato apresentar quaisquer reações adversas à estimulação, o experimento é imediatamente encerrado e os ratos são devidamente sacrificados com base em diretrizes institucionais. - Após a indução de LTD, mantenha os ratos na gaiola por 3 minutos e, em seguida, coloque de volta em suas gaiolas domésticas.
- Para experimentos de controle, use o mesmo procedimento de estimulação em ratos que expressam o vírus de controle AAV5-tdTomato. Para experimentos simulados, prenda um cordão de remendo à fibra óptica de ratos que expressam o vírus AAV5-oChIEF, mas nenhuma estimulação é entregue durante uma sessão de 15 minutos.
5. Teste o efeito da estimulação optogenética na busca de cocaína induzida por pistas
- 24 h após as estimulações optogenéticas in vivo, coloque os ratos de volta em câmaras de condicionamento operantes. Os ratos são submetidos a uma sessão de reintegração induzida por sinalização padrão de 1 hora para avaliar o comportamento de busca de cocaína.
NOTA: Durante a reintegração induzida por sinalização, uma resposta na alavanca ativa produz uma apresentação de 10 s da sugestão associada à cocaína, mas nenhuma infusão de cocaína. - Dê um segundo teste de reintegração pelo menos 1 semana após o primeiro teste para determinar se a indução optogenética de LTD resulta em uma supressão a longo prazo da busca de cocaína
6. Coloração, Fluorescência e Imagem para Verificação Histológica da Expressão Viral e Colocação de Fibra Óptica
- Faça 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 4% de paraformaldeído (PFA). Armazene ambas as soluções no gelo. O volume total dependerá do número de ratos no estudo (~100 mL de PBS e 200 mL de PFA serão usados por rato).
CUIDADO: O PFA é um produto químico tóxico e carcinógeno conhecido. Tome os devidos cuidados para evitar a inalação, bem como o contato com a pele. Seu uso e descarte devem estar de acordo com as diretrizes institucionais, incluindo o uso de EPIs adequados e um exaustor de fluxo químico. - Configure a bomba peristáltica a uma taxa de fluxo de 20 mL/min. Tubo de enchimento da bomba com 1x PBS. Fixe uma agulha embotada de calibre 20 na extremidade da tubulação.
- Anestesiar profundamente ratos com pentobarbital sódico (100 mg/kg, i.p.). Confirme a profundidade da anestesia por falta de resposta à pinça do dedo do pé antes de prosseguir.
NOTA: O pentobarbital sódico é usado, uma vez que a perfusão é um procedimento terminal. - Use uma tesoura cirúrgica para abrir a cavidade abdominal do rato abaixo do diafragma. Corte a caixa torácica rostralmente ao longo das bordas laterais para expor o coração do rato. Use hemostat para prender a porção rostral da caixa torácica longe do coração. Corte qualquer tecido adiposo sobrejacente que envolva o coração.
- Insira a agulha embotada através do ventrículo esquerdo e até a aorta. Corte um pequeno orifício no átrio direito para drenar a solução à medida que ela retorna ao coração.
- Perfundir cada rato com 1x PBS por 5 min seguido de 4% de PFA, pH 7,4 por 10 min.
- Decapitar o rato, extrair o cérebro e pós-fixá-lo em 4% de PFA por 24 h. Em seguida, transfira o cérebro para a solução de sacarose a 30% para 2-3 d.
- Cérebros de seção a 50 μm usando um criostato.
- Monte todas as fatias que contenham o LA ou MGN em lâminas de vidro e tampa.
- Fatias de imagem utilizando microscópio epifluorescente para verificar a expressão de AAV-oChIEF-tdTomate no MGN e suas projeções para o LA, bem como a colocação da fibra óptica acima do LA.
7. Perfusão e Preparação de Fatias Cerebrais Agudas para Experimentos de Eletrofisiologia
NOTA: Experimentos eletrofisiológicos são realizados em um subconjunto de animais para validar o sucesso do LTD in vivo.
- Preparar soluções eletrofisiológicas utilizando os reagentes listados nas Tabelas 1-3 4,13. Ajustar o pH de todas as soluções para 7,4 com HCl e ajustar a osmolaridade para 300-310 mOsm/kg H2O. Tornar as soluções frescas antes das experiências e conservar a 4 °C até 1 semana. Sature todas as soluções com carbogênio (95% O 2/5% CO2) em todos os momentos durante o uso.
- Usando isoflurano de acordo com as diretrizes locais ou institucionais de cuidados com animais e uso, anestesiar profundamente o rato em uma câmara de eutanásia fechada. Confirme se o animal está totalmente anestesiado através do reflexo da beliscão do dedo do pé.
- Encha um copo pequeno com 50 mL de solução de corte a frio. Encher a tubulação da bomba peristáltica com solução e ajustar a vazão para 20 mL/min. Fixe uma agulha embotada de calibre 20 na extremidade da tubulação.
- Abra a cavidade abdominal (ver passos 6.4 e 6.5) e perfunda brevemente o rato com solução de corte (máximo de 1-2 min).
- Após a perfusão, decapitar imediatamente o rato. Remova o cérebro e coloque-o em um pequeno copo cheio de solução de corte de 4 °C por 30 s-1 min.
- Transfira cérebros com uma espátula e fixe-os rapidamente na câmara de um vibratome. Remova a pia, usando pinça fina. Encher a câmara com uma solução de corte a 4 °C e preparar fatias coronais agudas (250 μm de espessura) da amígdala a uma velocidade de 0,37 mm/seg e uma frequência de 70 Hz.
- À medida que as fatias são obtidas, colocar cada uma delas numa câmara de retenção cheia de solução de corte e incubar a 37 °C durante 10-12 min. Cerca de 5-7 fatias contendo o LA podem ser obtidas por animal.
- Transfira as fatias para um copo de solução de retenção à temperatura ambiente (RT) e deixe recuperar por >30 minutos antes da experimentação.
NOTA: As fatias geralmente permanecem saudáveis enquanto mantidas em solução de retenção por 4-6 h. Devido à natureza fluorescente do AAV, as fatias são mantidas em condições de pouca luz.
8. Gravações Eletrofisiológicas Ex vivo
- Preparar soluções intracelulares utilizando os reagentes listados nas Tabelas 4-5.
NOTA: As soluções intracelulares devem ser feitas antes dos experimentos e podem ser armazenadas a longo prazo (3-12 meses) a -80 °C ou a curto prazo (1-2 meses) a -20 °C. As soluções são ajustadas ao pH para 7,3 (com CsOH para solução intracelular à base de Cs e com KOH para solução intracelular à base de K). Ajustar para uma osmolaridade final de 290-300 mOsm/kg H2O. - Preparar solução de reserva de picrotoxina 500 mM dissolvida em dimetilsulfóxido (DMSO).
NOTA: As existências de picrotoxinas são alicotadas e armazenadas a -20 °C. No dia de utilização, as alíquotas são descongeladas e adicionadas à solução de registo até uma concentração final de 100 μM.
CUIDADO: Picrotoxina é um antagonista não competitivo dos receptores GABAA , de modo que a infusão de picrotoxina tem um efeito estimulante. É severamente tóxico por ingestão oral ou absorção da pele. O EPI adequado deve ser usado em todos os momentos ao trabalhar com picrotoxina. - Transfira fatias para um microscópio vertical projetado para experimentos de eletrofisiologia.
- Durante os experimentos, o banho perfunde continuamente fatias com solução de gravação que é aquecida a 31-33 °C.
- Amplie o LA usando um objetivo de 4x. Identifique os neurônios principais por morfologia com uma lente de imersão em água 40x.
- Use uma pipeta de vidro (3-5 MΩ) preenchida com uma solução intracelular baseada em Cs (para experimentos de pinça de tensão) ou uma solução intracelular baseada em K (para experimentos de pinça de corrente) para obter registros de grampo de célula inteira.
- Identifique projeções axonais MGN infectadas por AAV sob fluorescência (usando um filtro RFP). Estimule projeções usando um laser DPSS de luz azul (473 nm) conectado a um gerador de pulsos.
CUIDADO: Para limitar a exposição ao laser, a luz laser colimada é acoplada a uma porta fluorescente no microscópio e focada na fatia através da objetiva.
NOTA: No modo de pinça de tensão, as correntes pós-sinápticas excitatórias (EPSCs) são evocadas opticamente a 0,1 Hz. Os neurônios que recebem entradas de neurônios MGN infectados por AAV exibirão EPSCs confiáveis. - Para induzir LTD ex vivo , no modo de fixação atual, registre uma linha de base estável de potenciais pós-sinápticos excitatórios (EPSPs) por pelo menos 10 min. Em seguida, forneça 900 pulsos de 2 ms de luz de 473 nm a uma frequência de 1 Hz (tempo total = 15 min). Em seguida, grave continuamente EPSPs a 0,1 Hz por ≥60 min.
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Representative Results
Uma linha do tempo descrevendo a ordem dos experimentos é mostrada na Figura 1. Ao longo de experimentos comportamentais, o número de infusões de cocaína, bem como o número de respostas feitas na alavanca ativa, servem como uma medida da intensidade do comportamento de busca de cocaína. Durante os primeiros dias de autoadministração de cocaína, o número de respostas ativas deve aumentar gradualmente em cada dia de aquisição, antes de se estabilizar durante a segunda semana. Por outro lado, as respostas inativas da alavanca devem permanecer baixas durante todo o experimento (Figura 2A). No primeiro dia de extinção instrumental, normalmente há um aumento no número de respostas ativas da alavanca, já que a ausência inesperada de cocaína resulta na escalada do comportamento de busca de cocaína. No entanto, essa resposta diminuirá gradualmente com as sessões subsequentes, à medida que os ratos aprenderem a nova contingência, resultando em um número baixo e estável de respostas de alavanca ativa dentro de 6-10 d (Figura 2B). Ratos que não conseguem atingir os critérios de aquisição especificados nas fases de autoadministração ou extinção instrumental do experimento são removidos do estudo, e os dados não são incluídos na análise final.
Após a extinção instrumental, a reexposição a pistas associadas à cocaína restabelece o comportamento de busca de cocaína, resultando em um aumento no número de respostas ativas da alavanca. Esse aumento é observado em ambos os grupos de experimentos controle: ratos que foram injetados com vírus sem oChIEF (controle AAV) e ratos que não receberam estimulação a laser (controle SHAM; Figura 3A) No entanto, o LTD optogenéticoin vivo dos terminais MGN-LA causou uma redução na subsequente busca de cocaína induzida por pistas. 24 h após a indução optogenética do LTD, o número de prensas de alavanca ativas foi significativamente reduzido em relação aos controles AAV e SHAM (Figura 3A). Esse baixo nível de resposta foi mantido durante um teste de reintegração subsequente 7 dias depois (realizado em um subconjunto de ratos) (Figura 3B), indicando uma redução persistente na busca de cocaína motivada por pistas em vários testes de reintegração.
Registros eletrofisiológicos ex vivo de animais expostos à estimulação óptica confirmaram que a atenuação na reintegração foi de fato devida, pelo menos em parte, a uma modulação da plasticidade sináptica MGN-LA. Isso foi evidenciado por uma diminuição na amplitude EPSC evocada opticamente em neurônios LA após a exposição ao LTD óptico (Figura 4A). Essa atenuação na amplitude da CPEP foi específica para neurônios que receberam estimulação óptica, uma vez que a amplitude da CPEP permaneceu inalterada nos controles SHAM. Além disso, o LTD não pôde ser gerado em fatias de ratos que já haviam recebido estimulação óptica in vivo, mas foi evocado de forma confiável em neurônios de ratos submetidos à estimulação SHAM, como evidenciado por uma redução sustentada na inclinação de elevação do EPSP (Figura 4B). Assim, a estimulação óptica in vivo parece ocluir mais indução de LTD em fatia. Durante a gravação, é importante medir a resistência em série durante a duração da gravação para garantir a manutenção da integridade do adesivo. Células com uma mudança na resistência em série além de 20% não são aceitas para análise de dados. Isso é especialmente importante para experimentos de LTD que duram >60 min, pois mudanças na resistência em série podem influenciar a dinâmica do receptor e do canal. Para garantir que os aferentes que estão sendo estimulados durante os registros eletrofisiológicos se originem no MGN, é importante coletar fatias através da extensão do tálamo. Isso serve como validação de que os corpos celulares do MGN de fato expressam fluorescentemente o AAV. Além da confirmação visual, a validação funcional também é necessária. Sob condições de grampo de corrente, os neurônios MGN infectados por AAV-oChIEF disparam potenciais de ação em resposta a altas e baixas frequências de estimulação de luz de 473 nm (Figura 4C).
Todos os resultados comportamentais foram considerados provisórios até que a expressão viral e os implantes de fibra óptica fossem histologicamente verificados e a colocação adequada fosse confirmada (Figura 5). A ausência de expressão de AAV no MGN ou no AE e/ou naqueles em que as fibras ópticas não estavam corretamente posicionadas dentro do AE dorsal foram excluídas da análise experimental, mas em alguns casos podem ser incluídas como controle anatômico negativo.
Figura 1: Cronograma do procedimento experimental. Um esboço das etapas críticas do protocolo, incluindo o curso sequencial e a duração de cada fase experimental. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Aquisição e extinção da autoadministração de cocaína. (A) Os animais apresentam um número crescente de infusões de cocaína e respostas ativas de alavanca ao longo da aquisição, e um baixo nível de respostas de alavanca inativas. (B) Após um impulso inicial na pressão da alavanca no dia 1 da extinção, os animais diminuem a resposta em alavancas ativas e inativas para um nível baixo e estável. Barras de erro, média ±SEM. Esse número foi modificado a partir de Rich et al. 20194. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O LTD optogenético in vivo atenua a reintegração induzida por pistas. (A) O LTD óptico causa uma redução significativa nas prensas de alavanca ativas durante a reintegração em relação aos animais que receberam estimulação de controle do vírus ou SHAM. ANOVA two-way, principal efeito do grupo (F(2,27) = 7,04, P = 0,004) e uma interação dia x grupo (F(2,27) = 8,08, P = 0,002); Análise post hoc de Bonferroni: ***p < 0,001. (B) 7 dias depois, os ratos foram submetidos a um segundo teste de reintegração, revelando uma redução significativa na pressão ativa da alavanca em animais que foram previamente submetidos à MGN-LA LTD em relação aos controles SHAM. ANOVA two-way, principal efeito do grupo (F(1,32) = 5,04, P = 0,032), interação significativa (F(1,32) = 7,69, P = 0,009); Análise post hoc de Bonferroni, **p < 0,01. Barras de erro, ±SEM, n em barras, número de ratos. Esse número foi modificado a partir de Rich et al. 20194. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Validação funcional da estimulação optogenética in vivo de baixa frequência (A) LTD in vivo de hemisfério duplo das sinapses MGN-LA atenua a amplitude da CPEP em relação aos controles SHAM (teste t não pareado, t(10) = 2,73, *P = 0,021). Inserção: Amostra média de traços EPSC evocados em Erev-70 mV. Barras de escala: 50 ms, 200 pA, n em barras, número de ratos (neurônios). (B) Oclusões de indução óptica in vivo de LTD ex vivo LTD. 24 h após a indução in vivo de LTD, foram preparados cortes de amígdala e aplicado o mesmo protocolo de estimulação. A inclinação de elevação do EPSP nos terminais MGN-LA foi reduzida pela estimulação óptica ex vivo em neurônios de animais que receberam estimulação SHAM in vivo, mas não em neurônios de animais que receberam LTD. n in vivo em itálico, número de neurônios. (C) Amostra de registros atuais de grampo de neurônios MGN infectados por AAV-oChIEF. Os potenciais de ação foram provocados pela estimulação da luz azul (5-100 Hz). Barras de escala: 100 ms, 40 mV. Barras de erro, média ±SEM. Esse número foi modificado a partir de Rich et al. 20194. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Verificação histológica da expressão viral e do posicionamento das fibras ópticas. (A ) Imagens microscópicas representativas mostrando expressão de DAPI e AAV-oChIEF-tdTomate em AL (Esquerda) e MGN (Direita). Barra da escala: 2 mm. ( B ) Esquema mostrando injeção de AAV-oChIEF-tdTomateiro e em toda a extensão anteroposterior do AE (Esquerda) e MGN (Direita), e posicionamentos de fibra óptica no AE. O sombreamento vermelho escuro mostra a representação da menor disseminação aceitável do vírus, e o sombreamento rosa claro mostra a representação da maior disseminação aceitável. Os círculos azuis correspondem à colocação bem-sucedida da fibra óptica em ambos os hemisférios. Círculos pretos correspondem à colocação bem-sucedida de fibra óptica em apenas um hemisfério. O "X" preto corresponde à colocação malsucedida da fibra. Para serem incluídos na análise final, os ratos necessitaram de expressão viral de hemisfério duplo no AE, bem como colocação bem-sucedida de fibras. As coordenadas estão em mm, posterior do bregma. Esse número foi modificado a partir de Rich et al. 20194. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Químico | milímetro | MW | g/1000 ml |
| N-metil-D-glucamina | 92 | 195.215 | 17.96 |
| Cloreto de potássio | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Fosfato de sódio monobásico | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Bicarbonato de sódio | 30 | 84.01 | 2.52 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glicose | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Ascorbato de sódio | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Thiourea | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Piruvato de sódio | 3 | 110 | 0.33 |
| Sulfato de magnésio | 10 | Use 5,0 mL de estoque de 2,0 M | |
| Cloreto de cálcio | 0.5 | Use 250 μL de 2,0 m de estoque | |
| 1. Para 1 L de solução, adicionar sais na ordem indicada para 850 ml ddH2O | |||
| 2. pH com HCl concentrado para 7,3-7,4 (NMDG faz uma solução básica) | |||
| 3. Oxigenar por 5-10 min, em seguida, adicione MgSO4 e CaCl2 | |||
| 4. Traga a volutme final para 1 L com ddH2O e verifique novamente o pH final | |||
| 5. Verifique a osmolaridade com o osmômetro e ajuste para 300-310 mOsm/kg H2O | |||
Tabela 1: Lista de ingredientes para solução de corte extracelular. Ingredientes e instruções utilizados para a preparação da solução de corte extracelular à base de NMDG.
| Químico | milímetro | MW | g/1000 ml |
| N-metil-D-glucamina | 86 | 195.215 | 5.03 |
| Cloreto de potássio | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Fosfato de sódio monobásico | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Bicarbonato de sódio | 35 | 84.01 | 2.94 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glicose | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Ascorbato de sódio | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Thiourea | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Piruvato de sódio | 3 | 110 | 0.33 |
| Sulfato de magnésio | 1 | Use 500 μL de 2,0 m de estoque | |
| Cloreto de cálcio | 2 | Use 1000 μL de 2,0 m de estoque | |
| 1. Para 1 L de solução, adicionar sais na ordem indicada para 850 ml ddH2O | |||
| 2. pH com 1 N HCl ou KOH para 7.3-7.4 | |||
| 3. Oxigenar por 5-10 min, em seguida, adicione MgSO4 e CaCl2 | |||
| 4. Traga a volutme final para 1 L com ddH2O e verifique novamente o pH final | |||
| 5. Verifique a osmolaridade com o osmômetro e ajuste para 300-310 mOsm/kg H2O | |||
Tabela 2: Lista de ingredientes para solução de retenção extracelular. Ingredientes e instruções utilizados para a preparação da solução de retenção extracelular.
| Químico | milímetro | MW | g/1000 ml |
| N-metil-D-glucamina | 119 | 195.215 | 6.95 |
| Cloreto de potássio | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Fosfato de sódio monobásico | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Bicarbonato de sódio | 26 | 84.01 | 2.18 |
| HEPES | 5 | 238.301 | 1.19 |
| D-glicose | 12.5 | 180.16 | 2.25 |
| Sulfato de magnésio | 1 | Use 500 μL de 2,0 m de estoque | |
| Cloreto de cálcio | 2 | Use 1000 μL de 2,0 m de estoque | |
| 1. Para 1 L de solução, adicionar sais na ordem indicada para 850 ml ddH2O | |||
| 2. pH com 1 N HCl ou KOH para 7.3-7.4 | |||
| 3. Oxigenar por 5-10 min, em seguida, adicione MgSO4 e CaCl2 | |||
| 4. Traga a volutme final para 1 L com ddH2O e verifique novamente o pH final | |||
| 5. Verifique a osmolaridade com o osmômetro e ajuste para 300-310 mOsm/kg H2O | |||
Tabela 3: Lista de ingredientes para solução de gravação extracelular. Ingredientes e instruções utilizados para a preparação da solução de gravação extracelular.
| Químico | milímetro | MW | mg/50 ml |
| Metanossulfonato de Césio | 108 | 227.997 | 1231.3 |
| Cloreto de césio | 15 | 168.36 | 126.3 |
| Césio-EGTA | 0.4 | Adicionar 80 μL de 250 mM Cs-EGTA | |
| CHÁ-Cloreto | 5 | 165.705 | 41.4 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 238.3 |
| QX-314-Br | 1 | 343.31 | 17.2 |
| L-glutationa | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Fosfocreatina de sódio | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2.5 | 507.18 | 63.4 |
| Na-GTP | 0.25 | 523.18 | 6.5 |
| 1. Comece com 40-45 mL de grau de HPLC H2O | |||
| 2. Mantenha a fosfocreatina, ATP e GTP no gelo em todos os momentos. | |||
| 3. Adicione os ingredientes na ordem listada na tabela | |||
| 4. pH a 7,3 com CsOH (cerca de 200 μL de 2 M CsOH) | |||
| 5. Use osmômetro para verificar a osmolaridade. | |||
| 6. Adicionar H2O de grau HPLC a uma osmolaridade final de cerca de 285-290 mOsm/kg H2O | |||
| 7. Preparar alíquotas de 500-1000 μL e conservar a -80 °C ou -20 °C | |||
Tabela 4: Lista de ingredientes para solução de eletrofisiologia intracelular de metanossulfonato de césio. Ingredientes e instruções utilizados para a preparação de solução intracelular de metanossulfonato de césio.
| Químico | milímetro | MW | mg/50 ml |
| Gluconato de potássio | 145 | 234.246 | 1698.2 |
| Cloreto de potássio | 2.5 | 74.56 | 9.3 |
| Cloreto de sódio | 2.5 | 58.44 | 7.3 |
| K-BAPTA | 0.1 | Adicionar 80 μL de K-BAPTA | |
| HEPES | 10 | 238.301 | 119.2 |
| L-glutationa | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Fosfocreatina de sódio | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2 | 507.18 | 63.4 |
| Tris-GTP | 0.25 | 886.59 | 11.1 |
| 1. Comece com 40-45 mL de grau de HPLC H2O | |||
| 2. Mantenha a fosfocreatina, ATP e GTP no gelo em todos os momentos. | |||
| 3. Adicione os ingredientes na ordem listada na tabela | |||
| 4. pH a 7,3 com KOH (cerca de 200 μL de 2 M KOH) | |||
| 5. Use osmômetro para verificar a osmolaridade. | |||
| 6. Adicionar H2O de grau HPLC a uma osmolaridade final de cerca de 285-290 mOsm/kg H2O | |||
| 7. Preparar alíquotas de 500-1000 μL e conservar a -80 °C ou -20 °C | |||
Tabela 5: Lista de ingredientes para a solução de eletrofisiologia intracelular de gluconato de potássio. Ingredientes e instruções utilizados para a preparação de gluconato de potássio solução intracelular.
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Discussion
Como descrito acima, existem várias etapas críticas que são importantes para alcançar os resultados experimentais adequados. O protocolo provavelmente só será eficaz em animais que adquirem adequadamente a autoadministração de cocaína e, até o momento, ele só foi testado usando os parâmetros descritos acima. É possível que a dose de cocaína, o esquema de reforço e os parâmetros de sinalização possam ser modificados com provavelmente pouco efeito sobre os resultados comportamentais, com a exceção de que um esquema de reforço de segunda ordem pode levar à busca de cocaína independente da amígdala que poderia reduzir a eficácia do procedimento, embora isso não tenha sido testado diretamente14 . Existem vários pontos ao longo do protocolo em que a validação da construção e funcionamento adequados das fibras ópticas ajudará a garantir o sucesso da estimulação óptica. É necessário pontuar adequadamente as ponteiras para evitar a perda da calota da cabeça e polir as fibras ópticas, e testar que a perda de saída de luz através dos implantes não exceda 30%9. Além disso, os parâmetros de estimulação a laser são considerações importantes. O laser deve ser operado a uma potência relativamente baixa (5-7 mW). A estimulação sustentada de baixa frequência é usada para induzir LTD, e isso pode ser validado funcionalmente pela medição da força sináptica MGN-LA com registros eletrofisiológicos. Finalmente, os resultados indicaram uma redução significativa na reintegração induzida por pistas com um n final de 10 animais por grupo, no entanto, os experimentadores devem antecipar o início com um n maior, pois é provável que alguns animais precisem ser excluídos da análise final. É crucial verificar o posicionamento anatômico adequado e a expressão de vírus e fibras ópticas, e usar apenas dados de animais em que a histologia tenha sido verificada.
Apesar do robusto efeito comportamental sobre a busca de cocaína observado com este protocolo, existem várias limitações que devem ser consideradas. Por um lado, o método só foi testado em ratos que foram treinados com uma única pista audiovisual emparelhada com cocaína. Não está claro o que aconteceria em um cenário em que múltiplas pistas diferentes fossem condicionadas, o que seria uma representação mais precisa da dependência humana, em que múltiplos estímulos ambientais se tornam altamente associados ao uso de drogas15,16,17. Evidências de nosso laboratório indicam que a capacidade do LTD optogenético de reduzir a busca por drogas é devido a uma diminuição na força sináptica que enfraquece as memórias associadas a sinais de drogas. No entanto, não está claro até que ponto a neutralidade ou as memórias que não estão associadas à autoadministração de cocaína podem ser afetadas por esse protocolo. Além disso, enquanto o método afeta apenas a força sináptica em um circuito, outros circuitos também podem ser importantes para codificar a memória e/ou conduzir o comportamento de busca de cocaína18,19,20. Finalmente, deve-se notar que a LTD só pode ser induzida em sinapses onde o vírus está suficientemente expresso, provavelmente deixando algumas conexões sinápticas não afetadas pelo protocolo de estimulação, o que potencialmente limita o impacto comportamental. Além disso, evidências sugerem que apenas pequenos conjuntos de neurônios e sinapses estão envolvidos na codificação de uma memória particular, dando credibilidade à ideia de que a indução de LTD dentro de toda uma região do cérebro não é a melhor estratégia para efetuar mudanças comportamentais, enquanto outras abordagens existem para direcionar especificamente populações de neurônios de sinalização ou contextualmente ativas21, 22. Apesar disso, o protocolo é eficaz em atenuar a busca de drogas motivadas por pistas, provavelmente porque a estimulação óptica de baixa frequência limita a indução de LTD a sinapses que foram previamente potencializadas por repetidos pares cocaína-pista4.
Esse protocolo proporciona um avanço significativo para estudos comportamentais optogenéticos mais comumente utilizados, onde a atividade dos neurônios é ativada ou inibida enquanto o animal está realizando o comportamento em tempo real 19,23. Em vez disso, a optogenética é usada aqui como uma ferramenta neuromoduladora para reverter a plasticidade induzida pela cocaína. Uma vantagem deste método é que a manipulação optogenética é independente do teste comportamental, de modo que potenciais efeitos de confusão da optogenética (por exemplo, efeitos do circuito local, período refratário após a estimulação da luz, efeitos de estimulação antidrômica, etc. 24 não devem afetar os resultados, aumentando assim a confiança de que o mecanismo neural hipotético está mediando mudanças de comportamento. Este método pode, portanto, ser utilizado em uma série de aplicações que investigam como a plasticidade sináptica, particularmente um aumento na força sináptica como ocorre com a LTP, se relaciona com mudanças no comportamento. Abordagens semelhantes também podem ser relevantes para a aplicação clínica de tecnologias de estimulação neural, onde conexões anormais no cérebro que conduzem o comportamento disfuncional podem ser desreguladas. Da mesma forma, como o construto viral oChIEF é responsivo a estímulos de baixa e alta frequência, existem aplicações potenciais para esses métodos além do escopo dos experimentos descritos. Por exemplo, a LTP induzida optogeneticamente pode ser benéfica para reverter déficits de plasticidade encontrados em uma ampla gama de distúrbios neurodegenerativos e do neurodesenvolvimento25. Além disso, a plasticidade bidirecional nas sinapses MGN-LA também tem sido diretamente associada à regulação de comportamentos relevantes para transtornos associados ao medo8.
Modular os circuitos neurais específicos que suportam comportamentos motivados por drogas é essencial para estabelecer a abstinência a longo prazo do uso de drogas. Este protocolo utiliza novos avanços na optogenética in vivo para reverter a plasticidade de um circuito neural preciso que é fortalecido pela autoadministração repetida de cocaína na presença de pistas ambientais. O resultado dessa neuromodulação específica é uma diminuição da probabilidade de reexposições subsequentes de sinais desencadearem uma resposta de busca de cocaína, o que pode ter implicações importantes para o desenvolvimento de futuras terapias para transtornos por uso de substâncias.
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Disclosures
Nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores desejam reconhecer o apoio dos subsídios da USPHS K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) e do Departamento de Saúde da Pensilvânia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
- Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
- Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
- Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
- Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
- Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
- Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
- Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
- Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
- Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
- Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
- Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
- McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
- Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).
