Summary
这里描述的方法概述了用于在大鼠行为相关回路中以光遗传学逆转可卡因诱导的可塑性的程序。丘脑-杏仁核突触的持续低频光刺激可诱发长期抑郁（LTD）。在经历可卡因的大鼠中 体内光遗传 诱导的LTD导致随后的线索动机药物寻求减弱。
Abstract
该协议展示了使用光遗传学工具在丘脑 - 杏仁核回路中逆转可卡因诱导的可塑性以减少随后在大鼠中寻找可卡因行为所需的步骤。在我们的研究中，我们发现，当大鼠自我静脉注射可卡因与视听线索配对时，随着线索 - 可卡因关联的学习，丘脑内侧膝状核（MGN）输入到侧杏仁核（LA）主要神经元处形成的突触变得更强。我们假设在这些突触上逆转可卡因诱导的可塑性将减少线索动机的可卡因寻求行为。为了在 体内完成这种类型的神经调控，我们想诱导突触长期抑制（LTD），这会降低MGN-LA突触的强度。为此，我们使用了光遗传学，它允许使用光神经调控大脑回路。通过将含有oChiEF的AAV注入MGN在LA的突触前MGN末端表达兴奋性视蛋白oChiEF。然后将光纤植入LA，并以1 Hz的频率脉冲473nm激光15分钟，以诱导LTD和反向可卡因诱导的可塑性。这种操作导致与可卡因相关的线索诱导药物寻求行动的能力长期降低。
Introduction
药物滥用在美国和全世界都是一个非常严重的公共卫生问题。尽管进行了数十年的深入研究，但有效的治疗选择很少1，2。治疗的一个主要挫折是，长期使用药物在环境线索和药物本身之间产生了长期的联想记忆。再次暴露于与药物相关的线索会推动生理和行为反应，从而激发持续吸毒和复发3。一种新的治疗策略是制定基于记忆的治疗方法，旨在操纵调节药物线索关联的回路。最近，观察到外侧杏仁核 （LA） 中的突触，特别是丘脑内侧膝状核 （MGN） 产生的突触，通过重复提示相关的可卡因自我给药而得到加强，并且这种增强作用可以支持可卡因寻找行为4，5。因此，有人提出，提示诱导的恢复可以通过逆转MGN-LA突触的可塑性来减弱。
精确靶向特定大脑回路的突触可塑性的能力一直是该领域的一个主要挑战。传统的药理学工具在减少复发行为方面取得了一些成功，但由于无法操纵单个突触而受到限制。然而，体内光遗传学的最新发展提供了克服这些限制和以时间和空间精度控制神经通路所需的工具6，7，8。通过在特定的脑回路中表达光敏视蛋白，激光可用于激活或抑制回路。频率依赖性光刺激可用于特异性地操纵行为动物中电路的突触可塑性。
本手稿概述了使用 体内 光遗传学操纵行为相关的MGN-LA回路的程序。首先，兴奋性视蛋白oChIEF在MGN中表达，光纤在LA中双侧植入。然后训练动物以线索依赖的方式自我管理可卡因，这增强了MGN-LA途径。接下来，使用473nm激光的持续低频刺激来产生电路特定的LTD.逆转可卡因使用引起的可塑性导致线索触发与药物寻求行为相关的行动的能力长期降低。
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Protocol
该协议中描述的实验符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南规定的指南，并得到匹兹堡大学机构 动物护理和使用 委员会的批准。所有程序均使用成年幼稚的Sprague-Dawley大鼠进行，到达时重275-325克。
1. 光纤植入物和跳线的构造
- 按照先前发布的协议准备光纤植入物9.本协议中描述的实验使用200μm芯光纤（0.5 NA）和Ø1.25 mm多模LC / PC陶瓷套圈，Ø230μm孔尺寸。
- 使用 Dremel 工具对套圈的下三分之一（最靠近套圈的平端）进行评分。对套圈进行评分有助于它们与牙科水泥保持连接，从而增加它们在整个实验过程中保持安全的可能性。
- 使用线切割器切割~35毫米的光纤。使用光纤剥离工具剥离~25毫米的纤维，留下10毫米不暴露。
- 根据制造商的说明准备可热固化的环氧树脂。将1g树脂粉末溶解在100mg固化剂化合物中。将钝的 25 号针头连接到 1 mL 注射器上。用环氧树脂填充注射器并连接钝的 25 号针尖。
- 使用虎钳或夹子牢固地握住套圈，平坦的一面朝上，凸面朝下。使用环氧树脂填充注射器，在套圈的平坦侧添加一滴环氧树脂，小心擦拭套圈侧面多余的环氧树脂。
- 将剥离的光纤部分插入套圈，允许额外暴露 5 mm 的剥离光纤。在LA植入物的情况下，纤维将在腹侧到前膛植入7.9毫米，因此未剥离纤维的暴露长度应为~13毫米。
- 用热风枪固化环氧树脂约30-40秒，直到它变成黑色/琥珀色。
- 用金刚石刀直接在套圈凸端的界面处划伤光纤，然后用手指轻轻敲击光纤。
- 用止血器保持，确保施加均匀的压力，并在一系列抛光纸上分别旋转20次圆形，以抛光纸（从高级到低级;5，3，1，0.3μm）抛光套圈的凸端。
- 使用胶带将未剥离的光纤固定在桌面上，并在剥离的光纤上划痕，在腹侧坐标之外多留出 2 毫米（对于 LA 植入物，纤维的最终长度为 ~10 毫米）。使用止血器拉动套圈并均匀地折断纤维。划伤时注意不要完全切断光纤，否则会损坏光纤芯。
- 构建与光纤植入物兼容的跳线。购买了定制设计的跳线（见 材料表）。或者，可以按照先前发布的协议9构建跳线。
注意： 套圈光纤和跳线光纤的直径和数值孔径必须在耦合连接处匹配，以防止光过度损失，这可能导致无法充分刺激神经活动。 - 通过将跳线/光纤连接到适当的激光光源（473 nm，1 mW 输出）并使用光传感器测量输出，测量通过跳线和光纤植入物的光输出。成功构建的光纤将发出同心圆的光，并且光损失不超过30%。
2. 啮齿动物静脉导管插入术、病毒传递和光纤植入
- 准备动物进行手术。
- 根据机构指南，用选择的麻醉剂完全麻醉大鼠。一种选择是盐酸氯胺酮（87.5-100毫克/千克，即毫秒）和盐酸甲苯噻嗪（5毫克/千克，即中）。通过检查缺乏脚趾捏反射来确保大鼠完全麻醉。
注意：氯胺酮是一种受控物质，必须根据机构指南进行处理。
注意：本研究使用肌内注射麻醉剂，因为它比腹膜内注射产生更快速和可靠的麻醉诱导。持续监测大鼠的呼吸和反应能力，并在整个手术过程中提供热支持。 - 剃掉大鼠背部的大面积（从肩胛骨上方到背部中部的上背部）以及右前肢下方的颈部区域和头皮。
- 将大鼠放在手术区域，并将puralube（人工泪液）涂抹在眼睛上。通过上背部皮肤皮下注射体重体积的卡洛芬（镇痛药），然后通过下背部皮肤注射5mL乳酸林格氏溶液。
- 用倍他定润湿一块无菌纱布，然后用圆周运动擦拭剃光的手术区域，对所有手术部位进行消毒。然后用70%乙醇重复该过程。重复这个交替循环三次。
- 根据机构指南，用选择的麻醉剂完全麻醉大鼠。一种选择是盐酸氯胺酮（87.5-100毫克/千克，即毫秒）和盐酸甲苯噻嗪（5毫克/千克，即中）。通过检查缺乏脚趾捏反射来确保大鼠完全麻醉。
- 根据先前发布的方案4，10进行静脉导管植入。
注意：此手术期间不使用手术单，以避免在导管植入过程中产生刺激。使用前对所有仪器和设备进行消毒。使用无菌手套，如果接触任何非无菌表面，请更换手套。 - 在导管植入后，立即将大鼠固定在立体定位框架中进行AAV注射。
- 将 2% 利多卡因 （0.2-0.3 mL） 皮下 （s.c） 注射到头皮作为局部麻醉剂。
注意：在静脉导管植入期间不使用局部麻醉剂，以避免改变手术结果。 - 将 26 号不锈钢注射套管连接到装有 1 μL 浓缩 AAV 溶液的汉密尔顿注射器：AAV5-hSyn-tdTomato 或 AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
注意：oChIEF是蓝光敏感视蛋白通道视紫红质（ChR2）的变体，可以响应宽范围的频率8，11，因此对于本协议中讨论的低频LTD实验具有实用性，也适用于高频LTP实验（此处未讨论）。oChIEF构建体由Roger Tsien博士捐赠，并由杜克病毒载体核心进行包装和纯化处理。注射日和LTD诱导日之间至少需要3-4周，以便在MGN轴突末端实现最佳病毒表达。
注意：一般来说，AAV被视为生物安全1级（BSL-1）生物体，除非在其生产中使用辅助病毒，否则自我感染的风险较低。其使用需要IACUC批准，并且必须始终按照机构指南使用适当的PPE，以限制不必要的暴露。 - 使用手术刀，从颅骨的前部到后部做一个 0.5 毫米的切口，并去除覆盖的组织以露出颅骨表面。
- 将大鼠的头部平整在前/后轴上，并将零立体定位坐标调平到前膛。
- 使用配备小钻头的 Dremel 工具在头骨上钻三个小孔。使用螺丝刀将不锈钢螺钉 （M2x4 965-A2） 牢固地安装到位。
注意：螺钉对于正确粘合牙科水泥和创建坚固耐用的头盖是必要的。螺钉的位置应分布在颅骨的前-后轴上，并远离AAV注射部位。 - 根据大鼠脑图谱（Watson 和 Paxinos）12 的坐标为内侧膝状核 （MGN） 的内侧部分钻双侧孔以注射 AAV;来自布雷格玛的毫米，AP：-5.4;ML： ±3.0;DV： -6.6.缓慢降低注射插管（4 mm/min），直到定位在 MGN 中。以 0.1 μL/min 的速率注入浓缩的 AAV 溶液。
- 输注完成后将注射套管留在原位 5 分钟，以便从套管扩散开，然后慢慢从大脑中抽出套管。
- 将 2% 利多卡因 （0.2-0.3 mL） 皮下 （s.c） 注射到头皮作为局部麻醉剂。
- 注射病毒后，立即继续植入针对MGN-LA终端的光纤4，9 。
- 使用Dremel工具钻双侧孔，用于针对外侧杏仁核的光纤植入物（来自前侧的毫米，AP：-3.0;ML ±5.1）。
- 使用镊子抓住光纤植入物的套圈并将其固定在立体定位适配器上，以便将它们牢固地固定到位。
- 以 2 毫米/分钟的速度缓慢降低纤维，直到纤维尖端位于 LA 的背侧部分 （DV： -7.9 mm）。
- 首先使用一层薄薄的乐泰瞬干胶将套圈固定到颅骨上，然后使用直径为 1.25 mm 的套圈套筒和防尘罩覆盖牙科水泥和盖套。
注意：用于将套圈固定在头骨上的粘合剂的选择应得到当地或机构动物护理和使用委员会的批准。乐泰用于本研究，在用多种粘合剂反复试验后，可靠地将套圈固定在头骨上;但是，可以考虑可用的替代方案。
- 在外科手术后，单独饲养老鼠，并免费提供食物和水。提供符合机构指南的术后护理。每天用含有庆大霉素（5 mg/mL）和肝素（30 USP/mL）的生理盐水冲洗导管，以保持通畅。手术后至少5天和行为实验开始前24小时，食物限制大鼠自由摄食体重的~90%。
3. 啮齿动物可卡因自我给药和工具杠杆灭绝
注意：所有行为程序均在标准操作性调节室中进行，在一面墙上配备两个可伸缩杠杆，每个杠杆上方有一个刺激灯，一个音调发生器，一个室内灯和一个输液泵。
- 在FR1强化计划下，使大鼠每天接受1小时可卡因（2mg / mL）自我管理训练。
- 每天将大鼠放在操作室中，让大鼠按压。按压指定的“主动杠杆”（在左右杠杆上平衡）会导致可卡因输注（1.0 mg/kg/输注）和 10 秒呈现复合光和音调提示。按压指定的“非活动杠杆”没有程序效果。
- 继续自我给药实验至少10天，直到大鼠连续3天成功获得至少8次输注/天。在第 20 天之前未能达到采集标准会导致被排除在研究之外。
- 成功满足采集标准后，对大鼠进行1小时仪器消光6-10天。
- 将老鼠放在操作室中，让老鼠自由按压。但是，活动和非活动杠杆上的响应都没有程序化的后果。
- 让大鼠每天继续仪器性消退，直到连续两天平均发生<25次杠杆按压。
4. 体内 光遗传诱导有限公司
注意：光遗传学抑制实验在仪器灭绝的最后一天后24小时进行。
- 通过悬挂在干净的标准啮齿动物外壳笼上方的旋转接头将跳线连接到 473 nm 蓝色激光二极管，并取下盖子。这种设置允许啮齿动物在光遗传学刺激期间在笼子周围自由移动。
- 根据操作说明打开半导体激光管并连接到脉冲发生器。调整设置，以便在打开时，大鼠将以 1 Hz 接收 900 个 2 毫秒的光脉冲。
注意：操作激光时，必须始终使用适当的眼睛防护装置。 - 使用光传感器测量通过跳线的光强度。调整激光的强度，使通过跳线的光输出为~5-7 mW。
- 将老鼠放在干净的笼子里。拆下防尘罩和套圈套管，露出套圈。将跳线双向连接到光纤植入物。在LTD诱导之前，让大鼠探索环境3分钟。
- 打开脉冲发生器以启动光遗传学刺激。
注意：虽然不太可能，但如果大鼠对刺激有任何不良反应，实验将立即终止，并根据机构指南对大鼠实施适当的安乐死。 - LTD诱导后，将大鼠放在笼子里3分钟，然后放回它们的家笼子里。
- 对于对照实验，对表达AAV5-tdTomato对照病毒的大鼠使用相同的刺激程序。对于假实验，将跳线连接到表达AAV5-oChIEF病毒的大鼠的光纤上，但在15分钟的会话中没有提供刺激。
5. 测试光遗传学刺激对线索诱导的可卡因寻找的影响
- 体内光遗传学刺激后24小时，将大鼠放回操作性调节室。对大鼠进行1小时标准提示诱导的恢复会议，以评估可卡因寻求行为。
注意：在提示诱导的恢复期间，主动杠杆上的响应会产生可卡因相关提示的 10-s 呈现，但没有可卡因输注。 - 在第一次测试后至少 1 周进行第二次恢复试验，以确定光遗传学 LTD 诱导是否会导致可卡因寻求的长期抑制
6. 染色、荧光和成像，用于病毒表达和光纤放置的组织学验证
- 制作 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和 4% 多聚甲醛 （PFA）。将两种溶液储存在冰上。总体积将取决于研究中的大鼠数量（每只大鼠将使用~100mL的PBS和200mL的PFA）。
注意：PFA是一种有毒化学物质和已知的致癌物质。适当注意避免吸入和接触皮肤。其使用和处置应符合机构准则，包括使用适当的个人防护装备和化学流动罩。 - 以 20 mL/min 的流速设置蠕动泵。用 1x PBS 填充泵的管道。将钝的 20 号针连接到管子的末端。
- 用戊巴比妥钠（100mg / kg，ip）深度麻醉大鼠。在继续之前，确认对脚趾捏伤无反应的麻醉深度。
注意：使用戊巴比妥钠，因为灌注是终末程序。 - 使用手术剪刀切开大鼠横膈膜下方的腹腔。沿侧缘切开肋骨，露出老鼠的心脏。使用止血器将肋骨的喙部夹离心脏。切掉心脏周围的任何覆盖脂肪组织。
- 将钝针穿过左心室并向上插入主动脉。在右心房切一个小孔，以排出返回心脏的溶液。
- 用1x PBS灌注每只大鼠5分钟，然后用4%PFA，pH 7.4灌注10分钟。
- 将大鼠斩首，提取大脑，并将其后固定在4%PFA中24小时。然后将大脑转移到30%蔗糖溶液中2-3天。
- 使用低温恒温器在50μm处切片大脑。
- 将所有包含LA或MGN的切片安装到载玻片和盖玻片上。
- 使用落射荧光显微镜对切片进行成像，以验证MGN中的AAV-oChIEF-tdTomato表达及其对LA的投影，以及光纤在LA上方的位置。
7. 电生理学实验的灌注和急性脑切片制备
注意：对一部分动物进行电生理实验，以验证 体内 LTD的成功。
- 使用表1-34，13中列出的试剂制备电生理学溶液。用HCl将所有溶液的pH调节至7.4，并将渗透压调节至300-310 mOsm / kg H2O.在实验前使溶液新鲜并在4°C下储存长达1周。使用过程中始终用碳原（95%O 2/5%CO2）使所有溶液饱和。
- 根据当地或机构的动物护理和使用指南使用异氟醚，在封闭的安乐死室中深度麻醉大鼠。 通过捏脚趾反射确认动物已完全麻醉。
- 在一个小烧杯中填充 50 mL 冰冷切割溶液。用溶液填充蠕动泵的管路，并将流速调节为 20 mL/min。将钝的 20 号针连接到管子的末端。
- 打开腹腔（参见步骤6.4和6.5），并用切割溶液短暂灌注大鼠（最多1-2分钟）。
- 灌注后，立即斩首大鼠。取出大脑并将其放入装有4°C切割溶液的小烧杯中30秒-1分钟。
- 用刮刀转移大脑并迅速将它们固定在振动切片机的腔室上。用细镊子取出软脑膜。用4°C切割溶液填充腔室，并以0.37mm / sec的速度和70Hz的频率制备杏仁核的急性冠状切片（250μm厚）。
- 获得切片时，将每个切片放入充满切割溶液的保温室中，并在37°C下孵育10-12分钟。每只动物可以获得大约5-7片含有LA的切片。
- 将切片转移到室温（RT）保持溶液的烧杯中，并在实验前恢复>30分钟。
注意：切片在保持溶液中保持4-6小时时通常保持健康。由于AAV的荧光性质，切片保持在低光条件下。
8. 离体 电生理记录
- 使用 表4-5中列出的试剂制备细胞内溶液。
注意：细胞内溶液应在实验前制备，并且可以在-80°C下长期（3-12个月）或在-20°C下短期（1-2个月）储存。 将溶液的pH调节至7.3（使用CsOH用于基于Cs的细胞内溶液，使用KOH用于基于K的细胞内溶液）。调整至最终渗透压 290-300 mOsm/kg H2O。 - 制备溶解在二甲基亚砜（DMSO）中的500mM苦味毒素储备溶液。
注意：苦味毒素储备液等分并储存在-20°C。 使用当天，将等分试样解冻并加入记录溶液中至终浓度为100μM。
注意：苦味毒素是GABAA 受体的非竞争性拮抗剂，因此输注苦味毒素具有刺激作用。口服或皮肤吸收毒性严重。使用苦味毒素时，必须始终使用适当的个人防护装备。 - 将切片转移到专为电生理学实验设计的正置显微镜上。
- 在实验过程中，用加热至31-33°C的记录溶液连续浴灌注切片。
- 使用 4 倍物镜放大 LA。使用 40 倍水浸透镜通过形态识别主要神经元。
- 使用装有基于Cs的细胞内溶液（用于电压钳位实验）或基于K的细胞内溶液（用于电流钳位实验）的玻璃移液管（3-5 MΩ）获得全细胞膜片钳记录。
- 在荧光下识别AAV感染的MGN轴突投影（使用RFP过滤器）。使用连接到脉冲发生器的蓝光 （473 nm） DPSS 激光器刺激投影。
注意：为了限制激光曝光，准直激光耦合到显微镜上的荧光端口，并通过物镜聚焦到切片上。
注意：在电压钳模式下，兴奋性突触后电流（EPSC）以0.1 Hz的光学诱发。 从AAV感染的MGN神经元接收输入的神经元将表现出可靠的EPSC。 - 为了诱导 离体 LTD，在电流钳模式下，记录兴奋性突触后电位（EPSP）的稳定基线至少10分钟。接下来，以 1 Hz 的频率（总时间 = 15 分钟）提供 900 个 2 毫秒的 473 nm 光脉冲。然后以0.1 Hz连续记录EPSP，持续≥60分钟。
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Representative Results
概述实验顺序的时间线如图 1 所示。在整个行为实验中，可卡因输注的次数以及在主动杠杆上做出的反应数量可以衡量可卡因寻求行为的强度。在可卡因自我给药的最初几天，积极反应的数量应在每个采集日逐渐增加，然后在第二周稳定下来。相反，在整个实验过程中，非活动杠杆响应应保持较低水平（图2A）。在仪器性灭绝的第一天，主动杠杆反应的数量通常会增加，因为意外缺乏可卡因会导致寻求可卡因的行为升级。然而，随着大鼠学习新的意外情况，这种反应将随着随后的会话逐渐减少，导致6-10天内有效杠杆反应的数量低且稳定（图2B）。在实验的自我给药或仪器灭绝阶段未能达到指定获取标准的大鼠将从研究中删除，并且数据不包括在最终分析中。
在仪器灭绝后，再次暴露于可卡因相关线索会恢复可卡因寻找行为，导致主动杠杆反应的数量增加。在两组对照实验中都观察到这种增加：注射缺乏oChIEF的病毒的大鼠（AAV对照）和未接受激光刺激的大鼠（SHAM对照; 图3A）然而，MGN-LA末端的体内 光遗传学LTD导致随后线索诱导的可卡因寻找减少。光遗传学LTD诱导后24小时，相对于AAV对照和SHAM对照，主动杠杆压力机的数量显着减少（图3A）。在7天后的后续恢复测试中（在大鼠亚群中进行）（图3B）中保持了这种低水平的反应，表明在多次恢复测试中，线索动机的可卡因寻找持续减少。
暴露于光学刺激的动物的离体电生理记录证实，恢复的衰减确实至少部分是由于MGN-LA突触可塑性的调节。暴露于光学LTD后LA神经元中光学诱发EPSC振幅的降低证明了这一点（图4A）。EPSC振幅的这种衰减特定于接受视刺激的神经元，因为EPSC振幅在SHAM对照中保持不变。此外，LTD无法从已经接受体内光学刺激的大鼠切片中产生，但在接受SHAM刺激的大鼠的神经元中可靠地诱发，如EPSP上升斜率的持续降低所证明的那样（图4B）。因此，体内光刺激似乎进一步遮挡了切片中的LTD诱导。在记录时，重要的是在整个记录期间测量串联电阻，以确保保持补丁的健康。串联电阻变化超过20%的电池不接受进行数据分析。这对于持续>60分钟的LTD实验尤其重要，因为串联电阻的变化会影响受体和通道动力学。为了确保在电生理记录期间受到刺激的传入物起源于MGN，重要的是通过丘脑的范围收集切片。这验证了MGN的细胞体确实发出荧光表达AAV。除了目视确认外，功能验证也是必要的。在电流钳位条件下，AAV-oChIEF 感染的 MGN 神经元响应 473 nm 光刺激的高频和低频而发射动作电位（图 4C）。
在病毒表达和光纤植入物得到组织学验证并确认正确放置之前，所有行为结果都被认为是暂时的（图5）。在MGN或LA中缺乏AAV表达和/或光纤未正确定位在背侧LA中的那些被排除在实验分析之外，但在某些情况下可以作为阴性解剖对照包括在内。
图1：实验程序的时间表。 协议关键步骤的概述，包括每个实验阶段的顺序时间过程和持续时间。 请点击此处查看此图的大图。
图2：可卡因自我给药的获取和灭绝。（A） 动物在整个采集过程中表现出越来越多的可卡因输注和主动杠杆反应，以及低水平的非活动杠杆反应。 （B） 在灭绝的第1天杠杆按压最初增加后，动物对主动和非活动杠杆的反应下降到低而稳定的水平。误差线，平均值 ±SEM。此数字已修改自 Rich 等人 20194。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：体内光遗传学 LTD 减弱提示诱导的恢复。（A）与接受控制病毒或SHAM控制刺激的动物相比，光学有限公司在恢复期间显着减少主动杠杆压力。双向方差分析，组的主效应（F（2，27） = 7.04，P = . 004）和一天x组相互作用（F（2，27）= 8.08，P = .002）;邦弗朗尼的事后分析：***p < .001。（B）7天后，大鼠进行了第二次恢复测试，显示相对于SHAM对照，先前接受MGN-LA LTD的动物的主动杠杆按压显着减少。双向方差分析， 群的主效应 （F（1，32） = 5.04， P = . 032）， 显著交互作用 （F（1，32） = 7.69， P = .009）;邦弗朗尼的事后分析，**p < .01。误差条，平均值±SEM，n柱，大鼠数。此数字已修改自 Rich 等人 20194。请点击此处查看此图的大图。
图4：体内低频光遗传学刺激的功能验证（A） MGN-LA突触的体内双半球LTD相对于SHAM对照衰减EPSC振幅（未配对t检验，t（10）= 2.73，*P = .021）。插图：在 E rev-70 mV 下诱发的样本平均 EPSC 迹线。比例尺：50毫秒，200 pA，n以条为单位，大鼠（神经元）数量。（B）体内光学LTD诱导闭塞体外LTD诱导后24小时，制备杏仁核切片并应用相同的刺激方案。MGN-LA终端的EPSP上升斜率通过接受体内SHAM刺激的动物神经元的离体光刺激而降低，但在接受体内光学有限公司的动物的神经元中没有降低。 n（斜体），神经元数量。（C）来自AAV-oChIEF感染的MGN神经元的电流钳记录。通过蓝光刺激（5-100 Hz）引发动作电位。比例尺：100 ms，40 mV。误差线，平均值 ±SEM。此数字已修改自 Rich 等人 20194。请点击此处查看此图的大图。
图 5：病毒表达和光纤放置的组织学验证。（A） 代表性的显微图像显示DAPI和AAV-oChIEF-tdTomato在LA（左）和MGN（右）中的表达。比例尺：2毫米。 （ B ） 显示 AAV-oChIEF-tdTomato 注入以及整个 LA（左）和 MGN（右）的前后范围以及 LA 中的光纤位置的示意图。深红色阴影表示可接受的最小病毒传播，浅粉色阴影表示最大可接受传播。蓝色圆圈对应于两个半球中成功的光纤放置。黑色圆圈仅对应于在一个半球中成功放置光纤。黑色“X”对应于不成功的光纤放置。为了纳入最终分析，大鼠需要在LA中表达病毒双半球以及成功放置纤维。坐标以毫米为单位，距后方。此数字已修改自 Rich 等人 20194。 请点击此处查看此图的大图。
| 化学的 | 毫米 | 兆瓦 | 克/1000毫升 |
| N-甲基-D-葡糖胺 | 92 | 195.215 | 17.96 |
| 氯化钾 | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| 磷酸钠一元 | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| 碳酸氢钠 | 30 | 84.01 | 2.52 |
| 赫佩斯 | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-葡萄糖 | 25 | 180.16 | 4.5 |
| 抗坏血酸钠 | 5 | 198.11 | 0.99 |
| 硫脲 | 2 | 76.12 | 0.15 |
| 丙酮酸钠 | 3 | 110 | 0.33 |
| 硫酸镁 | 10 | 使用 5.0 mL 的 2.0 M 储备液 | |
| 氯化钙 | 0.5 | 使用 250 μL 2.0 M 原液 | |
| 1. 对于 1 L 溶液，按所列顺序加入盐至 850 mL ddH2O | |||
| 2. 盐酸浓盐酸至7.3-7.4的pH值（NMDG是碱性溶液） | |||
| 3. 含氧5-10分钟，然后加入MgSO4 和CaCl2 | |||
| 4. 用ddH2O将最终体积降至1 L，并仔细检查最终pH值 | |||
| 5.用渗透压计检查渗透压，并调整至300-310 mOsm/kg H2O | |||
表1：细胞外切割溶液的成分列表。 用于制备基于 NMDG 的细胞外切割溶液的成分和说明。
| 化学的 | 毫米 | 兆瓦 | 克/1000毫升 |
| N-甲基-D-葡糖胺 | 86 | 195.215 | 5.03 |
| 氯化钾 | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| 磷酸钠一元 | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| 碳酸氢钠 | 35 | 84.01 | 2.94 |
| 赫佩斯 | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-葡萄糖 | 25 | 180.16 | 4.5 |
| 抗坏血酸钠 | 5 | 198.11 | 0.99 |
| 硫脲 | 2 | 76.12 | 0.15 |
| 丙酮酸钠 | 3 | 110 | 0.33 |
| 硫酸镁 | 1 | 使用 500 μL 2.0 M 原液 | |
| 氯化钙 | 2 | 使用 1000 μL 2.0 M 原液 | |
| 1. 对于 1 L 溶液，按所列顺序加入盐至 850 mL ddH2O | |||
| 2. pH 值与 1 N HCl 或 KOH 至 7.3-7.4 | |||
| 3. 含氧5-10分钟，然后加入MgSO4 和CaCl2 | |||
| 4. 用ddH2O将最终体积降至1 L，并仔细检查最终pH值 | |||
| 5.用渗透压计检查渗透压，并调整至300-310 mOsm/kg H2O | |||
表2：细胞外保持溶液的成分列表。 用于制备细胞外保持溶液的成分和说明。
| 化学的 | 毫米 | 兆瓦 | 克/1000毫升 |
| N-甲基-D-葡糖胺 | 119 | 195.215 | 6.95 |
| 氯化钾 | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| 磷酸钠一元 | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| 碳酸氢钠 | 26 | 84.01 | 2.18 |
| 赫佩斯 | 5 | 238.301 | 1.19 |
| D-葡萄糖 | 12.5 | 180.16 | 2.25 |
| 硫酸镁 | 1 | 使用 500 μL 2.0 M 原液 | |
| 氯化钙 | 2 | 使用 1000 μL 2.0 M 原液 | |
| 1. 对于 1 L 溶液，按所列顺序加入盐至 850 mL ddH2O | |||
| 2. pH 值与 1 N HCl 或 KOH 至 7.3-7.4 | |||
| 3. 含氧5-10分钟，然后加入MgSO4 和CaCl2 | |||
| 4. 用ddH2O将最终体积降至1 L，并仔细检查最终pH值 | |||
| 5.用渗透压计检查渗透压，并调整至300-310 mOsm/kg H2O | |||
表3：细胞外记录溶液的成分列表。 用于制备细胞外记录溶液的成分和说明。
| 化学的 | 毫米 | 兆瓦 | 毫克/50毫升 |
| 甲磺酸铯 | 108 | 227.997 | 1231.3 |
| 氯化铯 | 15 | 168.36 | 126.3 |
| 铯-EGTA | 0.4 | 加入 80 μL 250 mM Cs-EGTA | |
| 氯化茶 | 5 | 165.705 | 41.4 |
| 赫佩斯 | 20 | 238.301 | 238.3 |
| QX-314-溴 | 1 | 343.31 | 17.2 |
| L-谷胱甘肽 | 1 | 307.323 | 15.4 |
| 磷酸肌酸钠 | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| 镁-丙胺酸 | 2.5 | 507.18 | 63.4 |
| 钠-GTP | 0.25 | 523.18 | 6.5 |
| 1. 从 40-45 mL HPLC 级 H2O 开始 | |||
| 2. 始终将磷酸肌酸、ATP 和 GTP 放在冰上。 | |||
| 3. 按表中列出的顺序添加成分 | |||
| 4. 用 CsOH 将 pH 值定为 7.3（约 200 μL 的 2 M CsOH） | |||
| 5.使用渗透压计检查渗透压。 | |||
| 6. 加入 HPLC 级 H 2 O 至最终渗透压浓度约 285-290 mOsm/kg H2O | |||
| 7. 制备 500-1000 μL 等分试样并储存在 -80 °C 或 -20 °C | |||
表4：甲磺酸铯细胞内电生理溶液的成分表。 用于制备甲磺酸铯细胞内溶液的成分和说明。
| 化学的 | 毫米 | 兆瓦 | 毫克/50毫升 |
| 葡萄糖酸钾 | 145 | 234.246 | 1698.2 |
| 氯化钾 | 2.5 | 74.56 | 9.3 |
| 氯化钠 | 2.5 | 58.44 | 7.3 |
| K-巴普塔 | 0.1 | 加入 80 μL K-BAPTA | |
| 赫佩斯 | 10 | 238.301 | 119.2 |
| L-谷胱甘肽 | 1 | 307.323 | 15.4 |
| 磷酸肌酸钠 | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| 镁-丙胺酸 | 2 | 507.18 | 63.4 |
| Tris-GTP | 0.25 | 886.59 | 11.1 |
| 1. 从 40-45 mL HPLC 级 H2O 开始 | |||
| 2. 始终将磷酸肌酸、ATP 和 GTP 放在冰上。 | |||
| 3. 按表中列出的顺序添加成分 | |||
| 4. 用 KOH 将 pH 值定为 7.3（约 200 μL 的 2 M KOH） | |||
| 5.使用渗透压计检查渗透压。 | |||
| 6. 加入 HPLC 级 H 2 O 至最终渗透压浓度约 285-290 mOsm/kg H2O | |||
| 7. 制备 500-1000 μL 等分试样并储存在 -80 °C 或 -20 °C | |||
表5：葡萄糖酸钾细胞内电生理溶液的成分列表。 用于制备葡萄糖酸钾细胞内溶液的成分和说明。
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Discussion
如上所述，有几个关键步骤对于获得适当的实验结果很重要。该方案可能只对正确获得可卡因自我给药的动物有效，迄今为止，它仅使用上述参数进行了测试。可卡因剂量、强化计划和提示参数可能会被修改，但对行为结果的影响可能很小，除了二阶强化方案可能导致杏仁核非依赖性可卡因的寻找，这可能会降低手术的有效性，尽管这尚未经过直接测试14.在整个协议中有几个要点，验证光纤的正确结构和功能将有助于确保成功的光刺激。有必要对套圈进行适当的评分，以防止头盖和抛光光纤的损失，并测试通过植入物的光输出损失不超过30%9。此外，激光刺激参数是重要的考虑因素。激光器应以相对较低的功率（5-7 mW）运行。持续的低频刺激用于诱导LTD，这可以通过用电生理记录测量MGN-LA突触强度来在功能上验证。最后，结果表明，每组最终n只10只动物时，提示诱导的恢复显着减少，但是，实验者应该预料到从更大的n开始，因为可能需要将某些动物排除在最终分析之外。验证病毒和光纤的正确解剖位置和表达至关重要，并且仅使用已验证组织学的动物的数据。
尽管该方案观察到对可卡因寻求的强烈行为影响，但必须考虑几个限制。首先，该方法仅在用单一视听线索与可卡因配对训练的大鼠身上进行了测试。目前尚不清楚在多种不同线索被制约的情况下会发生什么，这将是人类成瘾的更准确表示，其中多种环境刺激与吸毒高度相关15，16，17。我们实验室的证据表明，光遗传学有限公司减少药物寻求的能力是由于突触强度的降低削弱了药物线索相关的记忆。然而，目前尚不清楚中性或与可卡因自我管理无关的记忆可能在多大程度上受到该协议的影响。此外，虽然该方法仅影响一个回路的突触强度，但其他回路对于编码记忆和/或驱动可卡因搜索行为也很重要18，19，20。最后，应该注意的是，LTD只能在病毒充分表达的突触中诱导，可能使一些突触连接不受刺激方案的影响，这可能会限制行为影响。此外，有证据表明，只有小的神经元和突触集合参与特定记忆的编码，这证实了整个大脑区域内的LTD诱导并不是影响行为改变的最佳策略的观点，而存在其他专门针对线索或上下文活跃神经元群体的方法21，22.尽管如此，该方案在减弱线索动机的药物寻求方面是有效的，这可能是因为低频光刺激限制了LTD诱导到先前通过重复可卡因线索配对增强的突触4。
该协议为更常用的光遗传学行为研究提供了重大进展，其中神经元的活动在动物实时执行行为时被激活或抑制19，23。相反，光遗传学在这里被用作逆转可卡因诱导的可塑性的神经调节工具。该方法的一个优点是光遗传学操作独立于行为测试，使得光遗传学的潜在混杂效应（例如，局部电路效应，光刺激后的不应期，逆向刺激效应等）。24 不应影响结果，从而增加假设的神经机制正在介导行为变化的信心。因此，该方法可用于许多应用，研究突触可塑性，特别是LTP中突触强度的增加，与行为变化的关系。类似的方法也可能与神经刺激技术的临床应用有关，其中大脑中驱动功能失调行为的异常连接可以被下调。同样，由于oChIEF病毒构建体对低频和高频刺激都有反应，因此这些方法的潜在应用超出了所描述的实验范围。例如，光遗传学诱导的LTP可能有助于逆转在各种神经退行性和神经发育障碍中发现的可塑性缺陷25。此外，MGN-LA突触的双向可塑性也与与恐惧相关疾病相关行为的调节直接相关8。
调节支持药物动机行为的特定神经回路对于建立长期戒毒至关重要。该协议利用体内光遗传学的新进展来逆转精确神经回路的可塑性，该神经回路在存在环境线索的情况下通过重复可卡因自我给药而得到加强。这种特定神经调控的结果是随后的线索再次暴露引发可卡因寻求反应的可能性降低，这可能对未来物质使用障碍疗法的开发具有重要意义。
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Disclosures
没什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢USPHS拨款K01DA031745（MMT），R01DA042029（MMT），DA035805（YHH），F31DA039646（MTR），T32031111（MTR）和宾夕法尼亚州卫生部的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
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