Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

שימוש באופטוגנטיקה כדי להפוך גמישות מוחית ולעכב חיפוש קוקאין בחולדות

Published: October 5, 2021 doi: 10.3791/63185
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Psychiatry, University of Pittsburgh, 2Department of Psychiatry, Rutgers University

Summary

השיטות המתוארות כאן מתארות הליך המשמש להיפוך אופטוגנטי של פלסטיות הנגרמת על ידי קוקאין במעגל רלוונטי התנהגותית בחולדות. גירוי אופטי מתמשך בתדר נמוך של סינפסות תלמו-אמיגדלה גורם לדיכאון ארוך טווח (LTD). In vivo המושרה אופטיגנטית LTD בחולדות שחוו קוקאין הביאה לאחר מכן להחלשה של חיפוש סמים המונע על ידי רמזים.

Abstract

פרוטוקול זה מדגים את הצעדים הדרושים לשימוש בכלים אופטוגנטיים כדי להפוך את הפלסטיות הנגרמת על ידי קוקאין במעגלי תלמו-אמיגדלה כדי להפחית התנהגויות חיפוש קוקאין עוקבות בחולדה. במחקר שלנו, מצאנו שכאשר חולדות מנהלות בעצמן קוקאין תוך ורידי בשילוב עם רמז אורקולי, סינפסות הנוצרות בקלט מגרעין הגניקולאט המדיאלי של התלמוס (MGN) אל תאי העצב העיקריים של האמיגדלה הצידית (LA) מתחזקות ככל שנלמד הקשר בין רמז לקוקאין. שיערנו כי היפוך הפלסטיות הנגרמת על ידי קוקאין בסינפסות אלה יפחית התנהגות המונעת על ידי קוקאין המונעת על ידי רמזים. על מנת להשיג סוג זה של נוירומודולציה in vivo, רצינו לגרום לדיכאון סינפטי לטווח ארוך (LTD), אשר מקטין את כוחן של סינפסות MGN-LA. לשם כך השתמשנו באופטוגנטיקה, המאפשרת נוירומודולציה של מעגלים מוחיים באמצעות אור. אופסין oChiEF מעורר בא לידי ביטוי על מסופי MGN presynaptic בלוס אנג'לס על ידי החדרת AAV המכיל oChiEF לתוך MGN. סיבים אופטיים הושתלו אז בלוס אנג'לס ואור לייזר 473 ננומטר פועם בתדר של 1 הרץ למשך 15 דקות כדי לגרום לפלסטיות המושרה על ידי קוקאין ולהפוך אותו. מניפולציה זו מייצרת הפחתה ארוכת טווח ביכולתם של רמזים הקשורים לקוקאין לגרום לפעולות חיפוש סמים.

Introduction

שימוש בסמים הוא נושא רציני מאוד לבריאות הציבור בארה"ב וברחבי העולם. למרות עשרות שנים של מחקר אינטנסיבי, יש מעט מאוד אפשרויות טיפוליות יעילות 1,2. מכשול עיקרי בטיפול הוא העובדה ששימוש כרוני בסמים יוצר זיכרונות אסוציאטיביים ארוכי טווח בין רמזים סביבתיים לבין התרופה עצמה. חשיפה חוזרת לרמזים הקשורים לסמים מניעה תגובות פיזיולוגיות והתנהגותיות המניעות את המשך השימוש בסמים והישנות3. אסטרטגיה טיפולית חדשנית היא ליישם טיפולים מבוססי זיכרון שמטרתם לתמרן את המעגלים המעורבים בוויסות אסוציאציות של רמזי סמים. לאחרונה, נצפה כי סינפסות באמיגדלה הצידית (LA), במיוחד אלה הנובעות מגרעין הגניקולאט המדיאלי (MGN) של התלמוס, מחוזקות על ידי מתן עצמי חוזר ונשנה של קוקאין הקשור לרמזים, וכי הגברה זו יכולה לתמוך בהתנהגות המחפשת קוקאין 4,5. לכן, הוצע כי ניתן להחליש את ההחזרה הנגרמת על ידי רמזים על ידי היפוך הפלסטיות בסינפסות MGN-LA.

היכולת לכוון במדויק לפלסטיות הסינפטית של מעגל מוחי מסוים היוותה אתגר גדול לתחום. כלים פרמקולוגיים מסורתיים נחלו הצלחה מסוימת בהפחתת התנהגויות הישנות, אך הם מוגבלים על ידי חוסר היכולת לתפעל סינפסות בודדות. עם זאת, הפיתוח האחרון של אופטוגנטיקה in vivo סיפק את הכלים הדרושים כדי להתגבר על מגבלות אלה ולשלוט במסלולים עצביים בדיוק זמני ומרחבי 6,7,8. על ידי ביטוי אופסינים רגישים לאור במעגל מוחי מסוים, אור לייזר יכול לשמש כדי להפעיל או לעכב את המעגל. ניתן להשתמש בגירוי אופטי תלוי תדר כדי לתפעל באופן ספציפי את הפלסטיות הסינפטית של המעגל בחיה מתנהגת.

כתב יד זה מתאר את ההליך שננקט כדי לתפעל את מעגל MGN-LA הרלוונטי מבחינה התנהגותית באמצעות אופטוגנטיקה in vivo . ראשית, האופסין המעורר oChIEF בא לידי ביטוי ב-MGN וסיבים אופטיים הושתלו באופן דו-צדדי בלוס אנג'לס. בעלי חיים אומנו אז לתת קוקאין באופן עצמאי באופן תלוי רמז, אשר מחזק את מסלול MGN-LA. לאחר מכן, גירוי מתמשך בתדר נמוך עם אור לייזר 473 ננומטר שימש לייצור LTD ספציפי למעגל. היפוך הפלסטיות הנגרמת על ידי שימוש בקוקאין יצר ירידה ארוכת טווח ביכולתם של רמזים להפעיל פעולות הקשורות להתנהגות חיפוש סמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה עלו בקנה אחד עם ההנחיות שנקבעו על ידי מדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פיטסבורג. כל ההליכים בוצעו באמצעות חולדות בוגרות ותמימות של ספראג-דולי ששקלו 275-325 גרם עם הגעתן.

1. בניית שתלי סיבים אופטיים וכבלי טלאי

  1. הכינו שתלי סיבים אופטיים בהתאם לפרוטוקולים שפורסמו בעבר9. ניסויים המתוארים בפרוטוקול זה השתמשו בסיבי ליבה של 200 מיקרומטר (0.5 NA) ו-Ø1.25 מ"מ Multimode LC/PC Ceramic ferrule, בגודל חור Ø230 מיקרומטר.
    1. השתמש בכלי Dremel כדי להבקיע את השליש התחתון של ferrule (הקרוב ביותר לקצה השטוח של ferrule). ניקוד הפרולים עוזר להם להישאר מחוברים לצמנט דנטלי, ומגדיל את הסיכוי שהם יישארו בטוחים לאורך כל תקופת הניסויים.
    2. השתמש חותכי חוט לחתוך ~ 35 מ"מ של סיבים. השתמש בכלי הפשטת סיבים כדי להסיר ~ 25 מ"מ של סיבים, ולהשאיר 10 מ"מ לא חשופים.
    3. הכינו אפוקסי הניתן לריפוי בחום בהתאם להוראות היצרן. יש להמיס 1 גרם אבקת שרף ב-100 מ"ג של תרכובת מקשה. חבר מחט קהה של 25 מד למזרק 1 מ"ל. ממלאים את המזרק באפוקסי ומחברים קצה מחט קהה בעל 25 מד.
    4. השתמש בסגן או מהדק כדי להחזיק היטב את המוט כאשר הצד השטוח פונה כלפי מעלה והצד הקמור פונה כלפי מטה. בעזרת המזרק המלא אפוקסי, מוסיפים טיפה אחת של אפוקסי לצד השטוח של הפרול, תוך זהירות כדי לנגב עודפי אפוקסי מדפנות הפרול.
    5. הכניסו את החלק המופשט של הסיב דרך הפרול ואפשרו חשיפת 5 מ"מ נוספים של סיב מופשט. במקרה של שתלי LA, הסיב יושתל 7.9 מ"מ גחון לברגמה, כך שהאורך החשוף של סיבים לא מופשטים צריך להיות ~ 13 מ"מ.
    6. מרפאים את האפוקסי עם אקדח חום למשך כ-30-40 שניות עד שהוא הופך לשחור/ענברי.
    7. הניחו את הסיב ישירות בממשק של הקצה הקמור של הסיב בעזרת סכין יהלום והשתמשו באצבע כדי להקיש בעדינות על הסיב.
    8. לטש את הקצה הקמור של הפרול על ידי אחיזה עם המוסטט, להקפיד להפעיל לחץ אחיד, וביצוע 20 סיבובים מעגליים כל אחד על סדרה של נייר ליטוש (מדרגה גבוהה לדרגה נמוכה; 5, 3, 1, 0.3 מיקרומטר).
    9. הצמידו סיב לא מופשט לשולחן באמצעות סרט הדבקה וסיב מופשט, והותירו 2 מ"מ נוספים מעבר לקואורדינטה הגחונית (עבור שתלי LA, אורך הסיב הסופי הוא ~10 מ"מ). השתמש hemostat כדי למשוך את ferrule ולשבור באופן שווה את הסיב שבו הוא כבר הבקיע. היזהרו לא לחתוך את הסיבים לחלוטין בעת הניקוד, אחרת ליבת הסיב תיפגע.
  2. בנה כבלי תיקון התואמים לשתלי סיבים אופטיים. נרכשו כבלי תיקון בעיצוב אישי (ראה טבלת חומרים). לחלופין, ניתן לבנות כבלי תיקון בהתאם לפרוטוקולים שפורסמו בעבר9.
    הערה: הקוטר וה-NA של סיב הפרול וסיב כבל התיקון חייבים להתאים בצומת הצימוד כדי למנוע אובדן עודף של אור, מה שעלול לגרום לכשל לעורר מספיק פעילות עצבית.
  3. מדוד את תפוקת האור באמצעות כבל התיקון ושתלי הסיב האופטי על-ידי חיבור כבל טלאי/סיב אופטי למקור אור לייזר מתאים (473 ננומטר, פלט של 1 mW) ומדידת פלט באמצעות חיישן אור. סיב שנבנה בהצלחה יפלוט מעגל קונצנטרי של אור ויהיה לו לא יותר מ-30% אובדן אור.

2. צנתור תוך ורידי מכרסמים, העברת וירוסים והשתלת סיבים אופטיים

  1. הכינו את בעל החיים לניתוח.
    1. הרדמה מלאה של חולדות בחומר הרדמה לפי בחירה בהתאם להנחיות המוסדיות. אפשרות אחת היא קטמין הידרוכלוריד (87.5-100 מ"ג/ק"ג, i.m.) וקסילזין הידרוכלוריד (5 מ"ג/ק"ג, i.m). ודאו שהחולדה מורדמת לחלוטין על ידי בדיקת היעדר רפלקס צביטת בוהן.
      אזהרה: קטמין הוא חומר מבוקר שיש לטפל בו בהתאם להנחיות המוסדיות.
      הערה: הזרקה תוך שרירית של חומרי הרדמה משמשת במחקר זה מכיוון שהיא הפיקה השראת הרדמה מהירה ואמינה יותר מאשר הזרקה תוך צפקית. יש לעקוב באופן רציף אחר הנשימה וההיענות של החולדה ולספק תמיכה תרמית לאורך כל הניתוח.
    2. יש לגלח שטח גדול מגבה של החולדה (גב עליון ממש מעל השכמות ועד אמצע הגב) וכן את אזור הצוואר מתחת לגפה הקדמית הימנית, ואת הקרקפת.
    3. הניחו את החולדה באזור הניתוח ומרחו puralube (דמעות מלאכותיות) על העיניים. יש להזריק נפח משקל גוף של קרפרופן (משכך כאבים) תת עורית (s.c.) דרך עור הגב העליון, ולאחר מכן להזריק 5 מ"ל של תמיסת Lactated Ringer s.c. דרך עור הגב התחתון.
    4. יש לחטא את כל אתרי הניתוח על ידי הרטבת חתיכת גזה סטרילית עם בטדין וניגוב האזור הכירורגי המגולח בתנועה מעגלית. לאחר מכן חזור על התהליך עם אתנול 70%. חזור על מחזור חילופין זה שלוש פעמים.
  2. ביצוע השתלת קטטר תוך ורידי על פי פרוטוקולים 4,10 שפורסמו בעבר.
    הערה: לא נעשה שימוש בוילון כירורגי במהלך ניתוח זה כדי למנוע גירוי במהלך השתלת קטטר. יש לעקר את כל המכשירים והציוד לפני השימוש. השתמשו בכפפות סטריליות והחליפו את הכפפות אם נוצר מגע עם משטח לא סטרילי.
  3. מיד לאחר השתלת הצנתר, אבטחו את החולדה במסגרת סטריאוטקסית לביצוע זריקות AAV.
    1. יש לבצע הזרקה תת-עורית (s.c) של 2% לידוקאין (0.2-0.3 מ"ל) לקרקפת כהרדמה מקומית.
      הערה: לא נעשה שימוש בהרדמה מקומית במהלך השתלת הצנתר תוך ורידי כדי למנוע שינויים בתוצאות הניתוח.
    2. חבר צינורית הזרקת נירוסטה 26 מד למזרק המילטון מלא 1 μL של תמיסת AAV מרוכזת: AAV5-hSyn-tdTomato או AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      הערה: oChIEF הוא גרסה של אופסין צ'נלרודופסין הרגיש לאור כחול (ChR2), שיכול להגיב לטווח רחב של תדרים 8,11, ולכן יש לו תועלת לניסויי LTD בתדר נמוך הנדונים בפרוטוקול זה, אך גם לניסויי LTP בתדר גבוה (שלא נדון כאן). מבנה oChIEF נתרם על ידי ד"ר רוג'ר טסיין ועובד לאריזה וטיהור על ידי ליבת הווקטור הנגיפי של דיוק. נדרשים לפחות 3-4 שבועות בין יום ההזרקה ליום הזירוז על מנת לאפשר ביטוי אופטימלי של הנגיף במסופי אקסון MGN.
      זהירות: באופן כללי, AAV נחשב לאורגניזם ברמת בטיחות ביולוגית 1 (BSL-1), עם סיכון נמוך להדבקה עצמית, אלא אם כן נעשה שימוש בנגיף מסייע בייצורו. השימוש בו דורש אישור IACUC ויש להשתמש בציוד הגנה אישי נאות בכל עת בהתאם להנחיות המוסדיות כדי להגביל חשיפה מיותרת.
    3. בעזרת אזמל, בצע חתך של 0.5 מ"מ מהחלק הקדמי לחלק האחורי של הגולגולת, והסר את הרקמה שמעליו כדי לחשוף את פני הגולגולת.
    4. יישור ראש החולדה בציר הקדמי/אחורי ואפס קואורדינטות סטריאוטקסיות לברגמה.
    5. קדח שלושה חורים קטנים דרך הגולגולת באמצעות כלי Dremel מצויד מקדח קטן. השתמש במברג כדי להרכיב היטב ברגי נירוסטה (M2x4 965-A2) במקומם.
      הערה: ברגים נחוצים לקשירה נכונה של מלט דנטלי וליצירת כיסויי ראש חזקים ועמידים לאורך זמן. מיקום הברגים צריך להיות מפוזר על פני הציר הקדמי-אחורי של הגולגולת, והרחק מאתר הזרקת AAV.
    6. קידוח חורים דו-צדדיים להזרקת AAV בהתבסס על הקואורדינטות מאטלס מוח החולדות (ווטסון ופקסינוס)12 עבור החלק המדיאלי של גרעין הגניקולאט המדיאלי (MGN); במ"מ מברגמה, AP: -5.4; מ"ל: ±3.0; DV: -6.6. מורידים לאט את צינורית ההזרקה (4 מ"מ/דקה) עד למיקום ב-MGN. הזרקת תמיסת AAV מרוכזת בקצב של 0.1 מיקרוליטר/דקה.
    7. השאירו את צינורית ההזרקה במקומה למשך 5 דקות לאחר השלמת העירויים כדי לאפשר דיפוזיה הרחק מהצינורית ולאחר מכן משכו לאט את הצינורית מהמוח.
  4. מיד לאחר הזרקות הנגיף, המשך להשתיל סיבים אופטיים 4,9 המכוונים למסופי MGN-LA.
    1. השתמש בכלי Dremel כדי לקדוח חורים דו-צדדיים עבור שתלי סיבים אופטיים המכוונים לאמיגדלה הצידית (במ"מ מברגמה, AP: -3.0; ML ±5.1).
    2. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את המוט של שתל הסיב האופטי ולקבע אותו למתאמים הסטריאוטקסיים כך שהם מוחזקים היטב במקומם.
    3. מורידים לאט את הסיבים בקצב של 2 מ"מ/דקה, עד שקצה הסיב יושב בחלק הגבי של ה-LA (DV: -7.9 מ"מ).
    4. הצמידו את המוט לגולגולת תחילה באמצעות שכבה דקה של דבק אינסטנט Loctite, ולאחר מכן צמנט דנטלי וכסו את הפרולים בשרוולים וכיסויי אבק בקוטר 1.25 מ"מ.
      הערה: בחירת הדבק להבטחת הדבק לגולגולת צריכה להיות מאושרת על ידי הוועדה המקומית או המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. לוקטיט משמש במחקר זה כדי לאבטח באופן אמין את הפרולים לגולגולת לאחר ניסוי וטעייה עם דבקים מרובים; עם זאת, ניתן לשקול חלופות זמינות.
  5. לאחר הליכים כירורגיים, חולדות הבית בנפרד, ולספק גישה חופשית למזון ומים. מתן טיפול לאחר הניתוח בהתאם להנחיות המוסדיים. יש לשטוף צנתרים מדי יום במי מלח המכילים גנטמיצין (5 מ"ג/מ"ל) והפרין (30 USP/מ"ל) לשמירה על הפטנטות. לפחות 5 ימים לאחר הניתוח ו-24 שעות לפני תחילת הניסויים ההתנהגותיים, המזון מגביל את החולדות ל~90% ממשקל ההזנה החופשית שלהן.

3. מכרסם קוקאין ניהול עצמי והכחדת מנוף אינסטרומנטלי

הערה: כל ההליכים ההתנהגותיים מתבצעים בתאי מיזוג אופרנטיים סטנדרטיים, המצוידים בשני מנופים נשלפים על קיר אחד, אור גירוי מעל כל מנוף, מחולל צלילים, תאורת בית ומשאבת עירוי.

  1. העבירו חולדות לאימונים יומיים של 1-h קוקאין (2 מ"ג/מ"ל) תחת לוח זמנים של חיזוק FR1.
    1. הניחו חולדות בתא ניתוח בכל יום ואפשרו לחולדות ללחוץ. לחיצה על 'המנוף האקטיבי' הייעודי (מאוזן על פני המנוף השמאלי והימני) גורמת לעירוי קוקאין (1.0 מ"ג/ק"ג/עירוי) ולהצגה של 10 שניות של רמז מורכב של אור וטון. ללחיצה על 'המנוף הלא פעיל' הייעודי אין אפקטים מתוכנתים.
    2. המשיכו בניסויים בניהול עצמי במשך 10 ד' לפחות ועד שהחולדות יצליחו לקבל לפחות 8 עירויים ביום במשך 3 ימים רצופים. אי הגעה לקריטריוני רכישה עד היום ה-20 גורמת להרחקה מהמחקר.
  2. לאחר עמידה מוצלחת בקריטריוני הרכישה, העבירו החולדות מפגשי הכחדה אינסטרומנטלית של שעה אחת במשך 6-10 ד'.
    1. הניחו חולדות בתאי ניתוח ואפשרו לחולדות ללחוץ בחופשיות. עם זאת, לתגובות הן במנופים הפעילים והן במנופים הלא פעילים אין השלכות מתוכנתות.
    2. האם החולדות ממשיכות בהכחדה אינסטרומנטלית מדי יום עד לממוצע של < 25 לחיצות מנוף במשך יומיים רצופים.

4. אינדוקציה אופטוגנטית In vivo של LTD

הערה: ניסויי עיכוב אופטוגנטי מתקיימים 24 שעות לאחר היום האחרון של ההכחדה האינסטרומנטלית.

  1. חבר כבלי תיקון לדיודת לייזר כחולה בגודל 473 ננומטר באמצעות מפרק סיבובי התלוי מעל כלוב בית מכרסמים נקי וסטנדרטי עם הסרת הכיסוי. מערך זה מאפשר למכרסמים לנוע בחופשיות בכלוב במהלך הגירוי האופטוגנטי.
  2. הפעל דיודת לייזר בהתאם להוראות ההפעלה והתחבר למחולל פולסים. התאם הגדרות, כך שכאשר מופעל החולדה תקבל 900 פולסים של 2-ms של אור ב 1 הרץ.
    התראה: יש להשתמש בהגנה נאותה על העיניים בכל עת בעת הפעלת לייזר.
  3. מדוד את עוצמת האור באמצעות כבל התיקון באמצעות חיישן אור. התאם את עוצמת הלייזר כך שתפוקת האור דרך כבל התיקון תהיה ~ 5-7 mW.
  4. הניחו חולדות בכלוב דיור נקי. הסירו את כיסויי האבק ואת שרוולי הפרול, וחשפו את הפרולים. חבר את כבלי התיקון באופן דו-צדדי לשתלי הסיב האופטי. לאפשר לחולדות לחקור את הסביבה במשך 3 דקות לפני השראת LTD.
  5. הפעל את מחולל הדופק כדי ליזום גירוי אופטוגנטי.
    הערה: למרות שזה לא סביר, אם חולדות חוות תגובות שליליות כלשהן לגירוי, הניסוי מופסק מיד, וחולדות מורדמות כראוי בהתבסס על הנחיות מוסדיות.
  6. לאחר זירוז בע"מ, יש להחזיק חולדות בכלוב למשך 3 דקות, ולאחר מכן להחזיר אותן לכלובים הביתיים שלהן.
  7. עבור ניסויי בקרה, השתמש באותו הליך גירוי על חולדות המבטאות את וירוס הבקרה AAV5-tdTomato. עבור ניסויים דמה, חבר כבל תיקון לסיב האופטי של חולדות המבטאות את נגיף AAV5-oChIEF, אך שום גירוי אינו מועבר במהלך פגישה של 15 דקות.

5. בדקו את ההשפעה של גירוי אופטוגנטי על חיפוש קוקאין הנגרם על ידי רמזים

  1. 24 שעות לאחר גירוי אופטוגנטי in vivo, החזירו את החולדות לתאי התניה אופרנטיים. חולדות עוברות סשן החזרה סטנדרטי של שעה אחת כדי להעריך התנהגות של חיפוש קוקאין.
    הערה: במהלך החזרה הנגרמת על ידי רמז, תגובה על המנוף הפעיל מניבה הצגה של 10 שניות של הרמז הקשור לקוקאין, אך ללא עירויי קוקאין.
  2. תן בדיקת השבה שנייה לפחות שבוע לאחר הבדיקה הראשונה כדי לקבוע אם השראת LTD אופטוגנטית גורמת לדיכוי ארוך טווח של חיפוש קוקאין

6. צביעה, פלואורסצנטיות והדמיה לאימות היסטולוגי של ביטוי נגיפים ומיקום סיבים אופטיים

  1. לייצר 1x פוספט buffered מלוחים (PBS) ו 4% paraformaldehyde (PFA). אחסנו את שני הפתרונות על קרח. הנפח הכולל יהיה תלוי במספר החולדות במחקר (~ 100 מ"ל של PBS ו 200 מ"ל של PFA ישמשו לכל חולדה).
    זהירות: PFA הוא כימיקל רעיל ומסרטן ידוע. יש להקפיד כראוי על מנת למנוע שאיפה, כמו גם מגע עם העור. השימוש בו וסילוקו, צריכים להיות בהתאם להנחיות מוסדיות, לרבות שימוש בציוד הגנה אישי מתאים ובמכסה מנוע לזרימה כימית.
  2. התקנת משאבה פריסטלטית בקצב זרימה של 20 מ"ל/דקה. מלא צינורות של משאבה עם 1x PBS. חבר מחט קהה של 20 מד לקצה הצינור.
  3. הרדימו חולדות עמוקות עם נתרן פנטוברביטל (100 מ"ג/ק"ג, כלומר). ודא את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן לפני שתמשיך הלאה.
    הערה: נתרן pentobarbital משמש מאז זילוח הוא הליך סופני.
  4. השתמש מספריים כירורגיים כדי לחתוך את חלל הבטן של החולדה מתחת לסרעפת. חתכו דרך כלוב הצלעות לאורך הקצוות הרוחביים כדי לחשוף את לב החולדה. השתמש hemostat כדי להדק את החלק rostral של כלוב הצלעות הרחק מהלב. חתכו כל רקמת שומן שמקיפה את הלב.
  5. הכנס את המחט הקהה דרך החדר השמאלי ומעלה לתוך אבי העורקים. חתכו חור קטן באטריום הימני כדי לנקז את התמיסה כשהיא חוזרת ללב.
  6. ערבבו כל חולדה עם PBS אחד למשך 5 דקות ואחריו 4% PFA, pH 7.4 למשך 10 דקות.
  7. ערפו את ראשה של החולדה, חלצו את המוח ודחפו אותו ל-4% PFA למשך 24 שעות. לאחר מכן להעביר את המוח לתמיסת סוכרוז 30% עבור 2-3 d.
  8. חותך את המוח ב 50 מיקרומטר באמצעות cryostat.
  9. הרכיבו את כל הפרוסות המכילות את LA או MGN על מגלשות זכוכית וכיסוי.
  10. תמונות פרוסות באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי כדי לאמת את ביטוי AAV-oChIEF-tdTomato ב- MGN והקרנות שלו ללוס אנג'לס, כמו גם מיקום הסיב האופטי מעל לוס אנג'לס.

7. זילוח והכנת פרוסת מוח חריפה לניסויים אלקטרופיזיולוגיים

הערה: ניסויים אלקטרופיזיולוגיים מבוצעים על תת-קבוצה של בעלי חיים כדי לאמת את ההצלחה של in vivo LTD.

  1. הכינו תמיסות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות הריאגנטים המפורטים בטבלאות 1-3 4,13. כוונן את רמת החומציות של כל התמיסות ל-7.4 עם HCl וכוונן את האוסמולריות ל-300-310 mOsm/kg H2O. הפוך את התמיסות לטריות לפני ניסויים ואחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע אחד. יש להרוות את כל התמיסות בקרבוגן (95% O 2/5% CO2) בכל עת במהלך השימוש.
  2. שימוש באיזופלורן בהתאם להנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים המקומיים או המוסדיים, מרדימים את החולדה עמוק בתא המתת חסד סגור.  ודא כי בעל החיים מורדם לחלוטין באמצעות רפלקס צביטת הבוהן.
  3. מלאו קטנה ב-50 מ"ל של תמיסת חיתוך קרה כקרח. מלא את צינורות המשאבה הפריסטלטית בתמיסה והתאם את קצב הזרימה ל-20 מ"ל/דקה. חבר מחט קהה של 20 מד לקצה הצינור.
  4. פתחו את חלל הבטן (ראו שלבים 6.4 ו-6.5) ונקבו לזמן קצר את החולדה בתמיסת חיתוך (מקסימום 1-2 דקות).
  5. לאחר הזילוח, ערפו מיד את ראשו של החולדה. מוציאים את המוח ומניחים אותו בכוס קטנה מלאה בתמיסת חיתוך של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 s-1 min.
  6. להעביר מוחות עם מרית במהירות לתקן אותם לחדר של ויברטום. מוציאים את הפייה בעזרת מלקחיים עדינים. ממלאים את התא בתמיסת חיתוך בטמפרטורה של 4°C ומכינים פרוסות קורונליות חריפות (בעובי 250 מיקרומטר) של האמיגדלה במהירות של 0.37 מ"מ לשנייה ובתדירות של 70 הרץ.
  7. עם קבלת הפרוסות, הניחו כל אחת מהן בתא אחיזה מלא בתמיסת חיתוך ודגרו בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-12 דקות. ניתן להשיג כ 5-7 פרוסות המכילות את LA לכל חיה.
  8. העבירו את הפרוסות לתמיסת החזקה של בטמפרטורת החדר (RT) והניחו להן להתאושש במשך >30 דקות לפני הניסוי.
    הערה: פרוסות בדרך כלל נשארות בריאות בזמן שהן נשמרות בתמיסה למשך 4-6 שעות. בשל האופי הפלואורסצנטי של AAV, פרוסות נשמרות בתנאי תאורה חלשה.

8. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות Ex vivo

  1. הכינו תמיסות תוך-תאיות באמצעות הריאגנטים המפורטים בטבלאות 4-5.
    הערה: תמיסות תוך תאיות צריכות להתבצע לפני ניסויים וניתן לאחסן אותן לטווח ארוך (3-12 חודשים) ב -80 ° C או לטווח קצר (1-2 חודשים) ב -20 ° C. הפתרונות מותאמים ל-pH של 7.3 (עם CsOH עבור תמיסה תוך-תאית מבוססת Cs ועם KOH עבור תמיסה תוך-תאית מבוססת K). התאמה לאוסמולריות סופית של 290-300 mOsm/kg H2O.
  2. הכינו 500 mM picrotoxin תמיסת מלאי מומס dimethylsulfoxide (DMSO).
    הערה: מניות Picrotoxin הם aliquoted ומאוחסנים ב -20 °C. ביום השימוש, aliquots מופשרים ומתווספים לתמיסת הקלטה לריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
    זהירות: Picrotoxin הוא אנטגוניסט לא תחרותי של קולטני GABAA , ולכן עירוי של picrotoxin יש השפעה מגרה. זה רעיל מאוד על ידי בליעה דרך הפה או ספיגת העור. יש להשתמש ב- PPE תקין בכל עת בעת עבודה עם picrotoxin.
  3. מעבירים פרוסות למיקרוסקופ זקוף המיועד לניסויים אלקטרופיזיולוגיים.
  4. במהלך הניסויים, יש לשטוף ברציפות פרוסות עם תמיסת הקלטה המחוממת ל 31-33 מעלות צלזיוס.
  5. הגדל את לוס אנג'לס באמצעות מטרה פי 4. זהה נוירונים עיקריים לפי מורפולוגיה עם עדשת טבילה במים 40x.
  6. השתמש בפיפטה מזכוכית (3-5 MΩ) מלאה בתמיסה תוך-תאית מבוססת C (לניסויי מהדק מתח) או בתמיסה תוך-תאית מבוססת K (לניסויי מהדק נוכחיים) כדי להשיג הקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים.
  7. זהה תחזיות אקסונליות MGN נגועות ב- AAV תחת פלואורסצנטיות (באמצעות מסנן RFP). עורר הקרנות באמצעות לייזר DPSS של אור כחול (473 ננומטר) המחובר למחולל פולסים.
    התראה: כדי להגביל את החשיפה ללייזר, אור לייזר משולב ליציאת פלורסנט במיקרוסקופ וממוקד על הפרוסה דרך המטרה.
    הערה: במצב מהדק מתח, זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים (EPSC) מעוררים אופטית ב-0.1 הרץ. תאי עצב שמקבלים קלט מנוירוני MGN נגועים ב-AAV יציגו EPSC אמין.
  8. כדי לגרום ל- ex vivo LTD, במצב מהדק נוכחי, רשום קו בסיס יציב של פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים (EPSPs) למשך 10 דקות לפחות. לאחר מכן, ספק 900 פולסים של 2-ms של אור 473-ננומטר בתדר של 1 הרץ (זמן כולל = 15 דקות). לאחר מכן הקלט ברציפות EPSPs ב 0.1 הרץ במשך ≥60 דקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ציר זמן המתאר את סדר הניסויים מוצג באיור 1. במהלך ניסויים התנהגותיים, מספר עירויי הקוקאין, כמו גם מספר התגובות המבוצעות על המנוף הפעיל, משמשים כמדד לעוצמת ההתנהגות המחפשת קוקאין. במהלך הימים הראשונים של מתן עצמי של קוקאין, מספר התגובות הפעילות אמור לגדול בהדרגה בכל יום רכישה, לפני שהוא מתייצב במהלך השבוע השני. לעומת זאת, תגובות מנוף לא פעילות צריכות להישאר נמוכות לאורך כל הניסוי (איור 2A). ביום הראשון של ההכחדה האינסטרומנטלית, יש בדרך כלל עלייה במספר תגובות המנוף הפעילות, כמו היעדר בלתי צפוי של קוקאין גורם להסלמה של התנהגות מחפשת קוקאין. אולם התגובה הזו תפחת בהדרגה במפגשים הבאים כשהחולדות ילמדו את המקרה החדש, מה שיוביל למספר נמוך ויציב של תגובות מנוף פעילות בטווח של 6-10 ד' (איור 2B). חולדות שאינן מצליחות להגיע לקריטריוני הרכישה שצוינו בשלב הניהול העצמי או בשלב ההכחדה האינסטרומנטלית של הניסוי מוסרות מהמחקר, והנתונים אינם נכללים בניתוח הסופי.

בעקבות הכחדה אינסטרומנטלית, חשיפה חוזרת לרמזים הקשורים לקוקאין מחזירה התנהגות של חיפוש קוקאין, וכתוצאה מכך עלייה במספר תגובות המנוף הפעילות. עלייה זו נצפתה בשתי קבוצות ניסויי הביקורת: חולדות שקיבלו וירוס חסר oChIEF (בקרת AAV) וחולדות שלא קיבלו גירוי לייזר (בקרת SHAM; איור 3A) עם זאת, in vivo optogenetic LTD של מסופי MGN-LA גרם לירידה בחיפוש קוקאין לאחר מכן. 24 שעות לאחר השראת אופטוגנטיקה, מספר לחיצות המנוף הפעילות הופחת משמעותית ביחס לבקרות AAV ובקרות SHAM (איור 3A). רמה נמוכה זו של תגובה נשמרה במהלך בדיקת החזרה עוקבת 7 ימים לאחר מכן (שנערכה בתת-קבוצה של חולדות) (איור 3B), מה שמצביע על ירידה מתמשכת בחיפוש קוקאין המונע על ידי רמזים במבחני החזרה מרובים.

רישומים אלקטרופיזיולוגיים Ex vivo מבעלי חיים שנחשפו לגירוי אופטי אישרו כי ההנחתה בהשבה אכן נבעה לפחות בחלקה מאפנון של פלסטיות סינפטית MGN-LA. עדות לכך הייתה ירידה באמפליטודת EPSC המעוררת אופטית בתאי עצב בלוס אנג'לס בעקבות חשיפה לאופטיקה בע"מ (איור 4A). הנחתה זו באמפליטודת EPSC הייתה ספציפית לנוירונים שקיבלו גירוי אופטי, שכן משרעת EPSC נותרה ללא שינוי בבקרות SHAM. נוסף על כך, LTD לא יכול היה להיווצר בפרוסות מחולדות שכבר קיבלו גירוי אופטי in vivo, אלא התעורר באופן אמין בתאי עצב מחולדות שעברו גירוי SHAM, כפי שמעידה ירידה מתמשכת בשיפוע עליית EPSP (איור 4B). לפיכך, נראה כי גירוי אופטי in vivo מסתיר אינדוקציה נוספת של LTD בפרוסה. בזמן ההקלטה, חשוב למדוד את התנגדות הסדרה לאורך משך ההקלטה כדי להבטיח את תקינות המדבקה. תאים עם שינוי בהתנגדות הסדרה מעבר ל-20% אינם מתקבלים לניתוח נתונים. זה חשוב במיוחד עבור ניסויים LTD שנמשכים >60 דקות, כמו שינויים בהתנגדות סדרה יכול להשפיע על הקולטן ואת דינמיקת הערוץ. כדי להבטיח כי afferents להיות מגורה במהלך רישומים אלקטרופיזיולוגיים מקורם MGN, חשוב לאסוף פרוסות דרך היקף התלמוס. זה משמש אימות לכך שגופי התא של MGN אכן מבטאים AAV באופן פלואורסצנטי. בנוסף לאישור חזותי, יש צורך גם באימות פונקציונלי. בתנאי מהדק זרם, נוירוני MGN הנגועים ב-AAV-oChIEF יורים פוטנציאלי פעולה בתגובה לתדרים גבוהים ונמוכים של גירוי אור של 473 ננומטר (איור 4C).

כל התוצאות ההתנהגותיות נחשבו זמניות עד שהביטוי הנגיפי ושתלי הסיבים האופטיים אומתו היסטולוגית והמיקום הנכון אושר (איור 5). חוסר ביטוי AAV ב- MGN או LA ו / או אלה שבהם הסיבים האופטיים לא היו ממוקמים כראוי בתוך LA הגבי הוצאו מניתוח הניסוי, אך במקרים מסוימים עשויים להיכלל כבקרה אנטומית שלילית.

Figure 1
איור 1: ציר הזמן של הליך הניסוי. מתווה של השלבים הקריטיים של הפרוטוקול, כולל מסלול הזמן הרציף ומשך הזמן של כל שלב ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: רכישה והכחדה של ניהול עצמי של קוקאין. (A) בעלי חיים מפגינים מספר גדל והולך של חליטות קוקאין ותגובות מנוף אקטיביות במהלך הרכישה, ורמה נמוכה של תגובות מנוף לא פעילות. (B) בעקבות דחיפה ראשונית בלחיצת המנוף ביום הראשון להכחדה, בעלי חיים מפחיתים את תגובתם במנופים פעילים ולא פעילים לרמה נמוכה ויציבה. קווי שגיאה, פירושו ±SEM. נתון זה שונה מ Rich et al. 20194. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: In vivo optogenetic LTD מחליש את ההשבה הנגרמת על ידי רמז. (א) אופטיקל בע"מ גורמת להפחתה משמעותית בלחיצות המנוף הפעילות במהלך ההשבה ביחס לבעלי חיים שקיבלו וירוס בקרה או גירוי בקרת SHAM. ANOVA דו-כיוונית, ההשפעה העיקרית של קבוצה (F(2,27) = 7.04 , P = .004) ויום x אינטראקציה קבוצתית (F(2,27) = 8.08, P = .002); ניתוח פוסט הוק של Bonferroni: ***p < .001. (B) 7 ימים לאחר מכן, חולדות עברו בדיקת השבה שנייה, שגילתה ירידה משמעותית בלחיצת מנוף אקטיבית בבעלי חיים שעברו בעבר MGN-LA LTD ביחס לבקרות SHAM. ANOVA דו-כיוונית, ההשפעה העיקרית של הקבוצה (F(1,32) = 5.04 , P = .032), אינטראקציה משמעותית (F(1,32) = 7.69, P = .009); ניתוח פוסט-הוק של בונפרוני, **p < .01. פסי שגיאה, ממוצע ±SEM, n בברים, מספר חולדות. נתון זה שונה מ Rich et al. 20194. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אימות פונקציונלי של גירוי אופטוגנטי בתדר נמוך in vivo (A) In vivo dual hemisphere LTD של סינפסות MGN-LA מחליש את משרעת EPSC ביחס לבקרות SHAM (מבחן t לא מזווג, t(10) = 2.73, *P = .021). כניסה: עקבות EPSC ממוצעים לדוגמה המתעוררים ב- Erev-70 mV. פסי קנה מידה: 50 מילישניות, 200 pA, n בברים, מספר חולדות (נוירונים). (ב) אינדוקציה In vivo optical LTD occludes ex vivo LTD. 24 שעות לאחר אינדוקציה in vivo LTD, הוכנו פרוסות אמיגדלה והוחל אותו פרוטוקול גירוי. שיפוע עליית EPSP במסופי MGN-LA הופחת על ידי גירוי אופטי ex vivo בתאי עצב מבעלי חיים שקיבלו גירוי ב-vivo SHAM, אך לא בתאי עצב מבעלי חיים שקיבלו in vivo optical LTD. n בכתב נטוי, מספר תאי עצב. (C) דגימת רישומי מהדק זרם מנוירוני MGN נגועים ב-AAV-oChIEF. פוטנציאלי פעולה נוצרו על ידי גירוי אור כחול (5-100 הרץ). פסי קנה מידה: 100 מטר/שניה, 40 mV. קווי שגיאה, פירושו ±SEM. נתון זה שונה מ Rich et al. 20194. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: אימות היסטולוגי של ביטוי נגיפים ומיקומי סיבים אופטיים. (A) תמונות מיקרוסקופיות מייצגות המציגות ביטוי DAPI ו-AAV-oChIEF-tdTomato בלוס אנג'לס (משמאל) וב-MGN (מימין). סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. (B) סכמטי המראה הזרקה של AAV-oChIEF-tdTomato ולאורך כל ההיקף הקדמי-אחורי של LA (שמאל) ו- MGN (ימין), ומיקומי סיבים אופטיים בלוס אנג'לס. הצללה אדומה כהה מציגה ייצוג של התפשטות הנגיף המקובלת הקטנה ביותר, והצללה ורודה בהירה מציגה ייצוג של ההתפשטות המקובלת הגדולה ביותר. עיגולים כחולים מתאימים למיקום מוצלח של סיבים אופטיים בשתי ההמיספרות. עיגולים שחורים מתאימים למיקום מוצלח של סיבים אופטיים בחצי כדור אחד בלבד. שחור "X" מתאים מיקום סיבים לא מוצלח. כדי להיכלל בניתוח הסופי, חולדות דרשו ביטוי של חצי כדור כפול נגיפי בלוס אנג'לס, כמו גם מיקום מוצלח של סיבים. הקואורדינטות הן במ"מ, אחוריות מברגמה. נתון זה שונה מ Rich et al. 20194. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כימי מ"מ מ"ו גרם/1000 מ"ל
N-מתיל-D-גלוקמין 92 195.215 17.96
אשלגן כלורי 2.5 74.551 0.19
נתרן פוספט מונובייסיק 1.25 119.98 0.15
סודיום ביקרבונט 30 84.01 2.52
HEPES 20 238.301 4.77
D-גלוקוז 25 180.16 4.5
נתרן אסקורבט 5 198.11 0.99
טיוראה 2 76.12 0.15
נתרן פירובט 3 110 0.33
מגנזיום סולפט 10 השתמש 5.0 מ"ל של 2.0 M מלאי
סידן כלורי 0.5 השתמש 250 μL של 2.0 M מלאי
1. עבור 1 ליטר של תמיסה, להוסיף מלחים בסדר המפורט 850 מ"ל ddH2O
2. pH עם HCl מרוכז עד 7.3-7.4 (NMDG מהווה פתרון בסיסי)
3. יש לחמצן למשך 5-10 דקות ואז להוסיף MgSO4 ו-CaCl2
4. הביאו את הנפח הסופי ל-1 ליטר עם ddH2O ובדקו שוב את ה-pH הסופי
5. בדוק אוסמולריות עם אוסמומטר והתאם ל 300-310 mOsm/kg H2O

טבלה 1: רשימת מרכיבים לתמיסת חיתוך חוץ-תאית. מרכיבים והוראות המשמשים להכנת תמיסת חיתוך חוץ-תאית מבוססת NMDG.

כימי מ"מ מ"ו גרם/1000 מ"ל
N-מתיל-D-גלוקמין 86 195.215 5.03
אשלגן כלורי 2.5 74.551 0.19
נתרן פוספט מונובייסיק 1.25 119.98 0.15
סודיום ביקרבונט 35 84.01 2.94
HEPES 20 238.301 4.77
D-גלוקוז 25 180.16 4.5
נתרן אסקורבט 5 198.11 0.99
טיוראה 2 76.12 0.15
נתרן פירובט 3 110 0.33
מגנזיום סולפט 1 השתמש 500 μL של 2.0 M מלאי
סידן כלורי 2 השתמש 1000 μL של 2.0 M מלאי
1. עבור 1 ליטר של תמיסה, להוסיף מלחים בסדר המפורט 850 מ"ל ddH2O
2. pH עם 1 N HCl או KOH עד 7.3-7.4
3. יש לחמצן למשך 5-10 דקות ואז להוסיף MgSO4 ו-CaCl2
4. הביאו את הנפח הסופי ל-1 ליטר עם ddH2O ובדקו שוב את ה-pH הסופי
5. בדוק אוסמולריות עם אוסמומטר והתאם ל 300-310 mOsm/kg H2O

טבלה 2: רשימת המרכיבים לתמיסת החזקה חוץ-תאית. מרכיבים והוראות המשמשים להכנת תמיסת החזקה חוץ-תאית.

כימי מ"מ מ"ו גרם/1000 מ"ל
N-מתיל-D-גלוקמין 119 195.215 6.95
אשלגן כלורי 2.5 74.551 0.19
נתרן פוספט מונובייסיק 1.25 119.98 0.15
סודיום ביקרבונט 26 84.01 2.18
HEPES 5 238.301 1.19
D-גלוקוז 12.5 180.16 2.25
מגנזיום סולפט 1 השתמש 500 μL של 2.0 M מלאי
סידן כלורי 2 השתמש 1000 μL של 2.0 M מלאי
1. עבור 1 ליטר של תמיסה, להוסיף מלחים בסדר המפורט 850 מ"ל ddH2O
2. pH עם 1 N HCl או KOH עד 7.3-7.4
3. יש לחמצן למשך 5-10 דקות ואז להוסיף MgSO4 ו-CaCl2
4. הביאו את הנפח הסופי ל-1 ליטר עם ddH2O ובדקו שוב את ה-pH הסופי
5. בדוק אוסמולריות עם אוסמומטר והתאם ל 300-310 mOsm/kg H2O

טבלה 3: רשימת המרכיבים לתמיסת הקלטה חוץ-תאית. מרכיבים והוראות המשמשים להכנת תמיסת ההקלטה החוץ תאית.

כימי מ"מ מ"ו מ"ג/50 מ"ל
צזיום מתאן-סולפונט 108 227.997 1231.3
צסיום כלוריד 15 168.36 126.3
צזיום-EGTA 0.4 הוסף 80 μL של 250 mM Cs-EGTA
תה-כלוריד 5 165.705 41.4
HEPES 20 238.301 238.3
QX-314-BR 1 343.31 17.2
ל-גלוטתיון 1 307.323 15.4
נתרן פוספוקריאטין 7.5 255.1 95.7
MG-ATP 2.5 507.18 63.4
נא-GTP 0.25 523.18 6.5
1. התחל עם 40-45 מ"ל HPLC כיתה H2O
2. שמרו על פוספוקריאטין, ATP ו-GTP על הקרח בכל עת.
3. הוסיפו מרכיבים לפי הסדר המופיע בטבלה
4. pH עד 7.3 עם CsOH (כ-200 מיקרוליטר של 2 M CsOH)
5. השתמש באוסמומטר כדי לבדוק אוסמולריות.
6. הוסף H2O בדרגת HPLC לאוסמולריות סופית של כ- 285-290 mOsm/kg H2O
7. להכין 500-1000 μL aliquots ולאחסן ב -80 ° C או -20 ° C

טבלה 4: רשימת המרכיבים לתמיסת אלקטרופיזיולוגיה תוך-תאית של צזיום מתאן-סולפונט. מרכיבים והוראות המשמשים להכנת תמיסה תאית צזיום מתאן-סולפונט.

כימי מ"מ מ"ו מ"ג/50 מ"ל
אשלגן גלוקונאט 145 234.246 1698.2
אשלגן כלורי 2.5 74.56 9.3
נתרן כלורי 2.5 58.44 7.3
קיי-באפטה. 0.1 הוסף 80 μL של K-BAPTA
HEPES 10 238.301 119.2
ל-גלוטתיון 1 307.323 15.4
נתרן פוספוקריאטין 7.5 255.1 95.7
MG-ATP 2 507.18 63.4
טריס-GTP 0.25 886.59 11.1
1. התחל עם 40-45 מ"ל HPLC כיתה H2O
2. שמרו על פוספוקריאטין, ATP ו-GTP על הקרח בכל עת.
3. הוסיפו מרכיבים לפי הסדר המופיע בטבלה
4. pH עד 7.3 עם KOH (כ-200 מיקרוליטר של 2 M KOH)
5. השתמש באוסמומטר כדי לבדוק אוסמולריות.
6. הוסף H2O בדרגת HPLC לאוסמולריות סופית של כ- 285-290 mOsm/kg H2O
7. להכין 500-1000 μL aliquots ולאחסן ב -80 ° C או -20 ° C

טבלה 5: רשימת המרכיבים לתמיסת אלקטרופיזיולוגיה תוך-תאית של אשלגן גלוקונאט. מרכיבים והוראות המשמשים להכנת אשלגן gluconate פתרון תאי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כפי שתואר לעיל, ישנם מספר שלבים קריטיים החשובים להשגת תוצאות הניסוי הנכונות. סביר להניח שהפרוטוקול יהיה יעיל רק בבעלי חיים שרוכשים כראוי קוקאין בניהול עצמי, ועד כה הוא נבדק רק באמצעות הפרמטרים שפורטו לעיל. ייתכן שניתן לשנות את מינון הקוקאין, לוח הזמנים של החיזוק ופרמטרים של רמזים עם השפעה מועטה ככל הנראה על התוצאות ההתנהגותיות, למעט העובדה שלוח זמנים של חיזוק מסדר שני עלול להוביל לחיפוש קוקאין שאינו תלוי באמיגדלה שיכול להפחית את יעילות ההליך, אם כי זה לא נבדק ישירות14 . ישנן מספר נקודות לאורך הפרוטוקול בהן אימות בנייה ותפקוד תקין של סיבים אופטיים, יסייע להבטיח גירוי אופטי מוצלח. יש צורך בניקוד נכון כדי למנוע אובדן מפיקת הראש, וללטש סיבים אופטיים, ולבדוק כי אובדן תפוקת האור דרך השתלים אינו עולה על 30%9. בנוסף, הפרמטרים לגירוי לייזר הם שיקולים חשובים. הלייזר צריך להיות מופעל בהספק נמוך יחסית (5-7 mW). גירוי מתמשך בתדר נמוך משמש להשראת LTD, וניתן לאמת זאת פונקציונלית על ידי מדידת הכוח הסינפטי MGN-LA עם רישומים אלקטרופיזיולוגיים. לבסוף, התוצאות הצביעו על ירידה משמעותית בהחזרה הנגרמת על ידי רמזים עם n סופי של 10 בעלי חיים לקבוצה, עם זאת, הנסיינים צריכים לצפות להתחיל עם n גדול יותר, שכן סביר להניח כי חלק מבעלי החיים יצטרכו להיות מחוץ לניתוח הסופי. חיוני לוודא את המיקום והביטוי האנטומיים הנכונים של וירוסים וסיבים אופטיים, ולהשתמש רק בנתונים מבעלי חיים שבהם אומתה היסטולוגיה.

למרות ההשפעה ההתנהגותית החזקה על חיפוש קוקאין שנצפתה בפרוטוקול זה, ישנן מספר מגבלות שיש לקחת בחשבון. ראשית, השיטה נבדקה רק בחולדות שאומנו עם רמז אורקולי יחיד בשילוב עם קוקאין. לא ברור מה יקרה בתרחיש שבו יותנו רמזים רבים ושונים, מה שיהווה ייצוג מדויק יותר של התמכרות אנושית, שבו גירויים סביבתיים מרובים יהיו קשורים מאוד לשימוש בסמים15,16,17. עדויות מהמעבדה שלנו מצביעות על כך שהיכולת של אופטוגנטיקה LTD להפחית חיפוש תרופות נובעת מירידה בחוזק הסינפטי שמחלישה זיכרונות הקשורים לרמזים תרופתיים. עם זאת, לא ברור באיזו מידה ניטרלי, או זיכרונות שאינם קשורים לניהול עצמי של קוקאין עשויים להיות מושפעים מפרוטוקול זה. יתר על כן, בעוד השיטה משפיעה רק על חוזק סינפטי במעגל אחד, מעגלים אחרים עשויים להיות חשובים גם לקידוד זיכרון ו / או נהיגה בהתנהגות חיפוש קוקאין18,19,20. לבסוף, יש לציין כי LTD יכול להיות מושרה רק בסינפסות שבהן הנגיף מבוטא מספיק, ככל הנראה משאיר כמה קשרים סינפטיים שאינם מושפעים על ידי פרוטוקול גירוי, אשר עשוי להגביל את ההשפעה ההתנהגותית. יתר על כן, ראיות מצביעות על כך שרק הרכבים קטנים של נוירונים וסינפסות מעורבים בקידוד של זיכרון מסוים, מה שנותן אמינות לרעיון שאינדוקציה LTD בתוך אזור שלם במוח אינה האסטרטגיה הטובה ביותר לחולל שינוי התנהגותי, בעוד שקיימות גישות אחרות המכוונות באופן ספציפי לאוכלוסיות פעילות רמז או הקשר של נוירונים21, 22. למרות זאת, הפרוטוקול יעיל בהחלשת חיפוש סמים המונעים על ידי רמזים, ככל הנראה משום שהגירוי האופטי בתדר נמוך מגביל את האינדוקציה לסינפסות שהועצמו בעבר על ידי זיווגים חוזרים ונשנים של רמזי קוקאין4.

פרוטוקול זה מספק התקדמות משמעותית למחקרים התנהגותיים אופטוגנטיים נפוצים יותר, שבהם פעילות תאי העצב מופעלת או מעוכבת בזמן שהחיה מבצעת את ההתנהגות בזמן אמת19,23. במקום זאת, אופטוגנטיקה משמשת כאן ככלי נוירומודולטורי כדי להפוך פלסטיות הנגרמת על ידי קוקאין. היתרון של שיטה זו הוא שהמניפולציה האופטוגנטית אינה תלויה במבחן ההתנהגותי, כך שהשפעות פוטנציאליות מבלבלות של אופטוגנטיקה (למשל, השפעות מעגל מקומי, תקופה עקשנית לאחר גירוי אור, השפעות גירוי אנטידרומי וכו '). 24 לא אמור להשפיע על התוצאות, ובכך להגביר את הביטחון כי המנגנון העצבי המשוער מתווך שינויים בהתנהגות. לפיכך, ניתן להשתמש בשיטה זו במספר יישומים החוקרים כיצד גמישות סינפטית, במיוחד עלייה בחוזק הסינפטי כפי שקורה עם LTP, קשורה לשינויים בהתנהגות. גישות דומות עשויות להיות רלוונטיות גם ליישום קליני של טכנולוגיות גירוי עצבי שבהן קשרים חריגים במוח המניעים התנהגות לא מתפקדת יכולים להיות מופחתים. כמו כן, מאחר שהמבנה הנגיפי של oChIEF מגיב לגירויים בתדירות נמוכה וגבוהה כאחד, ישנם יישומים פוטנציאליים לשיטות אלה מעבר להיקף הניסויים המתוארים. לדוגמה, LTP המושרה באופן אופטוגני עשוי להועיל להיפוך ליקויים בפלסטיות הנמצאים במגוון רחב של הפרעות נוירודגנרטיביות ונוירו-התפתחותיות25. יתר על כן, פלסטיות דו-כיוונית בסינפסות MGN-LA נקשרה ישירות גם לוויסות התנהגויות הרלוונטיות להפרעות הקשורות לפחד8.

ויסות המעגלים העצביים הספציפיים התומכים בהתנהגויות המונעות על ידי סמים חיוני לביסוס התנזרות ארוכת טווח משימוש בסמים. פרוטוקול זה משתמש בחידושים חדשניים בתחום האופטוגנטיקה in vivo כדי להפוך את הפלסטיות של מעגל עצבי מדויק המתחזק על ידי מתן עצמי חוזר ונשנה של קוקאין בנוכחות רמזים סביבתיים. התוצאה של נוירומודולציה ספציפית זו היא ירידה בסבירות לחשיפות חוזרות לאחר מכן לעורר תגובה לחיפוש קוקאין, שעשויות להיות לה השלכות חשובות על פיתוח טיפולים עתידיים להפרעות שימוש בחומרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להכיר בתמיכה ממענקי USPHS K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) ומשרד הבריאות של פנסילבניה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Saline Fisher Scientific NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) #268 See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control) Duke Viral Vector Core Control See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment) Covetrus 70349
ATP Magnesium Salt Fisher Scientific A9187
Betadine Butler Schein 38250
Calcium chloride Fisher Scientific C1016
Cesium chloride Fisher Scientific 289329
Cesium hydroxide Fisher Scientific 516988
Cesium methanesulfonate Fisher Scientific C1426
Cocaine HCl NIDA Drug Supply Center 9041-001
Cryostat Leica CM1950
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
DMSO Fisher Scientific BP231-1
Dual-Channel Temperature Controller Warner Instruments TC-344C
EGTA Fisher Scientific E3889
Ethanol University of Pittsburgh Chemistry Stockroom 200C5000
Ferrule Dust Caps Thor Labs CAPL White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules
Ferrule Mating Sleeves Doric Lenses F210-3011 Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID
Ferrules Precision Fiber Products MM-FER2007C-2300 Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size
Fiber Optic Thor Labs FP200URT 200 μm core multimode fiber (0.5 NA)
Fiber Optic Rotary Joint Prizmatix (Ordered from Amazon) 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber
Fiber Stripping Tool Thor Labs T12S21
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057
Gentamicin Henry Schein 6913
GTP Sodium Salt Fisher Scientific G8877
Hamilton syringe Hamilton 80085 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3
Heat Gun Allied Electronics 972-6966 250 V, 750-800 °F
Heat-Curable Epoxy Precision Fiber Products PFP-353ND-8OZ
Heparin Henry Schein 55737
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrochloric Acid Fisher Scientific 219405490
Isoflurane Henry Schein 29405
Ketamine HCl Henry Schein 55853 Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines
Lactated Ringer’s Henry Schein 9846
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler OEM Laser Systems BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option)
L-glutathione Fisher Scientific G4251
Lidocaine Butler Schein 14583
Light Sensor Thor Labs PM100D Compact energy meter console with digital display
Loctite instant adhesive Grainger 5E207
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 203726
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition Molecular Devices MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Microinjector pump Harvard Apparatus 70-4501 Dual syringe
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-200/ROE-200
Microscope Olympus BX51WI Upright microscope for electrophysiology
Microscope Olympus BX61VS Epifluorescent slide-scanning microscope
N-methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004
Orthojet dental cement, liquid Lang Dental 1504BLK black
Orthojet dental cement, powder Lang Dental 1530BLK Contemporary powder, black
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Patch Cables Thor Labs FP200ERT Multimode, FT030 Tubing
Picrotoxin Fisher Scientific AC131210010
Polishing Disc Thor Labs D50FC
Polishing Pad Thor Labs NRS913 9" x 13"
Polishing Paper Thor Labs LFG5P 5 μm grit
Polishing Paper Thor Labs LFG3P 3 μm grit
Polishing Paper Thor Labs LFG1P 1 μm grit
Polishing Paper Thor Labs LFG03P 0.3 μm grit
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium hydroxide Fisher Scientific P5958
Potassium methanesulfonate Fisher Scientific 83000
QX-314-Cl Alomone Labs Q-150
Rimadyl (Carprofen) Henry Schein 24751
Self-Administration Chambers/Software Med Associates MED-NP5L-D1
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 1064980500
Sodium L-Ascorbate Sigma-Aldrich A7631
Sodium Pentobarbital Henry Schein 24352
Sodium phosphate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphocreatine Fisher Scientific P7936
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
Stainless steel machine screws WW Grainger  6GB25 M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length
Stereotaxic adapter for ferrules Thor Labs XCL
Stereotaxic Frame Stoelting 51603
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Suture Thread Fine Science Tools 18020-50 Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm
TEA-Chloride Fisher Scientific T2265
Thiourea Sigma-Aldrich T8656
Vetbond Tissue Adhesive Covetrus 001505
Vibratome Leica VT1200S
Xylazine Butler Schein 33198

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
  2. Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
  3. Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
  4. Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
  5. Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
  6. Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  7. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  8. Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
  9. Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
  10. Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
  11. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  12. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
  13. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
  14. Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
  15. Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
  16. Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
  17. Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
  18. Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
  19. Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
  20. Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
  21. Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
  22. Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
  23. Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
  24. McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
  25. Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).

Tags

מדעי המוח גיליון 176 דיכאון ארוך טווח החזרה אמיגדלה אופטוגנטיקה נוירומודולציה
שימוש באופטוגנטיקה כדי להפוך גמישות מוחית ולעכב חיפוש קוקאין בחולדות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rich, M. T., Huang, Y. H.,… More

Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Using Optogenetics to Reverse Neuroplasticity and Inhibit Cocaine Seeking in Rats. J. Vis. Exp. (176), e63185, doi:10.3791/63185 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter