Summary
En robust protokol præsenteres her til isolering af neuromelaningranulat fra humant post mortem substantia nigra pars compacta-væv via lasermikrodissektion. Denne reviderede og optimerede protokol minimerer massivt den krævede tid til prøveindsamling, reducerer den krævede prøvemængde og forbedrer identifikationen og kvantificeringen af proteiner ved LC-MS / MS-analyse.
Abstract
Neuromelanin er et sortbrunt pigment, der findes i såkaldte neuromelaningranulater (NMG'er) i dopaminerge neuroner i substantia nigra pars compacta. Udover neuromelanin indeholder NMG'er en række proteiner, lipider og metaller. Selvom NMG-holdige dopaminerge neuroner fortrinsvis går tabt i neurodegenerative sygdomme som Parkinsons sygdom og demens med Lewy-kroppe, er der kun lidt kendt om mekanismen for NMG-dannelse og NMG'ernes rolle i sundhed og sygdom. Således er yderligere forskning i molekylær karakterisering af NMG'er afgørende. Desværre er standardprotokoller til isolering af proteiner baseret på densitetsgradient ultracentrifugering og kræver derfor store mængder humant væv. Således etableres en automatiseret lasermikrodissektion (LMD) -baseret protokol her, som tillader indsamling af NMG'er og omgivende substantia nigra (SN) væv ved hjælp af minimale mængder væv på en upartisk, automatiseret måde. Udskårne prøver analyseres efterfølgende ved massespektrometri for at dechiffrere deres proteomiske sammensætning. Med denne arbejdsgang blev der identificeret 2.079 proteiner, hvoraf 514 proteiner udelukkende blev identificeret i NMG'er og 181 i SN. De nuværende resultater er blevet sammenlignet med en tidligere undersøgelse ved hjælp af en lignende LMD-baseret tilgang, der nåede en overlapning på 87,6% for begge proteomer, hvilket verificerer anvendeligheden af den reviderede og optimerede protokol, der præsenteres her. For at validere aktuelle fund blev proteiner af interesse analyseret ved målrettet massespektrometri, fx parallel reaktionsovervågning (PRM)-eksperimenter.
Introduction
Hvert væv består af en heterogen blanding af forskellige celletyper, men den specifikke isolering af en celletype er ofte uundværlig for en mere præcis karakterisering. Lasermikrodissektion (LMD), der forbinder et mikroskop med en laserapplikation, er et kraftfuldt værktøj til specifik isolering af vævsområder, enkeltceller eller cellulære understrukturer ud af en kompleks komposit. Anvendelsen af LMD i kombination med massespektrometri (LMD-MS) er allerede blevet implementeret med succes for flere forskningsspørgsmål, herunder isolering af DNA1, RNA2 og proteiner 3,4,5. I denne protokol beskrives en revideret og optimeret LMD-MS-protokol til proteomisk analyse af humant post mortem hjernevæv og subcellulære komponenter til at dechiffrere nye patomekanismer af Parkinsons sygdom.
Neuromelanin er et sort, næsten uopløseligt pigment, der findes i de katekolaminerge, dopaminproducerende neuroner i substantia nigra pars compacta6. Sammen med proteiner og lipider akkumuleres det i organellelignende granulater omgivet af en dobbeltmembran, kaldet neuromelaningranulat (NMG'er)7,8,9. NMG'er kan observeres fra en alder af tre år hos mennesker, der stiger i mængde og tæthed under aldringsprocessen10,11. Til dato er der ingen bestemt hypotese om neuromelanindannelse, men en antagelse er, at neuromelanin dannes gennem oxidation af dopamin12. Andre hypoteser er baseret på enzymatisk produktion af neuromelanin (fx tyrosinase)13. Neuromelanin selv viste sig at have en høj bindingsaffinitet til lipider, toksiner, metalioner og pesticider. Baseret på disse fund antages dannelsen af NMG'er at beskytte cellen mod ophobning af giftige og oxidative stoffer og mod miljøgifte14,15. Udover denne neurobeskyttende funktion er der tegn på, at neuromelanin kan forårsage neurodegenerative virkninger, fx ved jernmætning og den efterfølgende katalyse af frie radikaler16,17. Desuden kan neuromelanin frigivet under neurodegenerative processer nedbrydes af hydrogenperoxid, hvilket kan fremskynde nekrose ved reaktive metaller og andre giftige forbindelser, der tidligere var bundet til neuromelanin og kan bidrage til neuroinflammation og cellulær skade18. Men indtil nu er NMG'ernes nøjagtige rolle i neurodegenerative processer som i løbet af Parkinsons sygdom ikke klart forstået. Alligevel synes NMG'er at være involveret i patogenesen af Parkinsons sygdom, og deres specifikke analyse er af største betydning for at optrævle deres rolle i neurodegeneration. Desværre mangler almindelige forsøgsdyr (f.eks. mus og rotter) og cellelinjer NMG'er19. Derfor er forskere især afhængige af post mortem hjernevæv til deres analyse. Tidligere var NMG-isolering ved densitetsgradientcentrifugering afhængig af tilgængeligheden af store mængder substantia nigravæv 20,21. I dag præsenterer LMD et alsidigt værktøj til specifikt at isolere NMG'er fra menneskelige hjerneprøver for derefter at analysere dem ved hjælp af LC-MS / MS.
I denne protokol præsenteres en forbedret og automatiseret version af en tidligere protokol22 til isolering af NMG'er og omgivende væv (SN), hvilket muliggør en hurtigere prøvegenerering, et højere antal identificerede og kvantificerede proteiner og en alvorlig reduktion af krævede vævsmængder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brugen af humant hjernevæv blev godkendt af den etiske komité ved Ruhr-Universitetet Bochum, Tyskland (filnummer 4760-13) i henhold til tyske regler og retningslinjer. Denne protokol er blevet anvendt på kommercielt opnåede substantia nigra pars compacta vævsskiver. En grafisk oversigt over den præsenterede protokol er vist i figur 1.
1. Væv sektionering
- Forkøl kryostatkammeret.
BEMÆRK: Hvert væv kræver forskellige kryostattemperaturer, som findes i den respektive leverandørprotokol. - Rengør kniven i rustfrit stål med 70% ethanol og installer den i knivholderen.
- Overfør vævet fra -80 °C fryseren til kryostaten ved hjælp af en isboks, og lad det tilpasse sig kryostatkammerets temperatur i 15 minutter.
- Mærk entydigt membranglider ved hjælp af en blyant.
BEMÆRK: PET/PEN-membrandias er nødvendige til den LMD-baserede prøvesamling. Håndter PET/PEN-membranrutsjebanerne med omhu, da de er ekstremt skrøbelige. - Påfør en dråbe kommercielt frosset sektionsmedium på vævsholderen. Før det er helt frosset, skal du placere vævet på det frosne sektionsmedium og lade det hærde, så vævet er forbundet med vævsholderen.
- Installer vævsholderen i kryostatkammeret, og juster dens orientering, før du begynder at sektionere. Optimal holderorientering afhænger af vævets orientering.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at trimme vævet, indtil det sektionsplan, der er nødvendigt for skiverne, er nået. - Før vævsområdet af interesse er nået, skal du justere skæreindstillingen til den ønskede vævstykkelse.
BEMÆRK: 5 eller 10 μm er den foreslåede tykkelse for denne protokol, da 20 μm tykke sektioner viste sig at være uforenelige med den LMD-baserede prøvesamling22. - Skær to sektioner og kassér dem.
- Læg anti-rullepladen fra dig.
- Skær en del af vævet, åbn anti-rullepladen forsigtigt, tag et membranglas, og forhindre vævsfoldning, mens du placerer vævssektionen på membranrutsjebanen.
BEMÆRK: Opbevaring af membrangliderne ved stuetemperatur før vedhæftning muliggør nøjagtig prøvefastgørelse. Flere sektioner kan placeres på samme membranglas, men vævsoverlapning skal forhindres. - Opbevar vævssektioner placeret på membranglider i kryotet, indtil sektionering er afsluttet.
- Det kryosekterede væv opbevares ved -20 °C indtil videre behandling, eller proceduren nedenfor behandles direkte. De snittede vævsglas opbevares ved -80 °C indtil videre brug.
2. Lasermikrodissektion og trykkatapultering
BEMÆRK: Da neuromelaningranulat er synlige uden farvning på grund af deres sortbrune farve, er der ikke behov for farvning til denne protokol. Ikke desto mindre kan forskellige farvningsprocedurer kombineres med denne protokol, hvis det kræves. Husk, at brugen af blokerende opløsninger eller antistoffer vil påvirke LC-MS/MS-analyserne.
- Tænd for MicroBeam-systemet, og åbn den tilknyttede software på computeren (se Materialetabel).
- Placer vævsmembranen i SlideHolder på RoboStage med vævet opad.
BEMÆRK: Afhængigt af LMD-enheden kan det være nødvendigt at placere membranglideren, så vævet vender nedad. Generelt udføres prøveindsamling i et temperaturkontrolleret miljø for at sikre optimale og reproducerbare forhold. - Indstil mikroskopet til den ønskede forstørrelse (50 gange bruges her) til oversigtsscanningerne.
- Brug scanningsfunktionen, som findes i Navigator-vinduet i softwaregrænsefladen, til at få en oversigtsscanning af vævsafsnittet. Søg efter øverste venstre hjørne og nederste højre hjørne af interesseområdet, og vælg dem i softwaregrænsefladen. Vælg derefter Scan alle investeringsafkast for at udføre scanningerne.
BEMÆRK: Oversigtsscanninger er ikke obligatoriske, men de muliggør bedre orientering i diaset og kan gemmes til senere brug. - Juster forstørrelsen af mikroskopet for det relevante væv, hvilket er 400 gange i det foreliggende tilfælde af neuromelaningranulat.
- Søg efter et område med neuromelaningranulat. Vælg Field of View Analysis i softwaregrænsefladen, vælg Inverter resultat, og indstil tærsklen for RGB-kanalerne, så kun neuromelaningranulater fremhæves med rødt i eksempelvinduet. Klik på OK for at bruge de justerede indstillinger for synsfeltet.
BEMÆRK: Det kan forekomme, at mindre objekter med en mørk farve også vælges. For at tage højde for det skal du kassere alle genstande, der dækker et område mindre end 100 μm2 , før neuromelaningranulat isoleres. For at gøre dette skal du åbne elementlisten ved at klikke på ikonet på værktøjslinjen, vælge diaset under overvejelse og bestille elementer efter område. Vælg dem med områder mindre end 100 μm2 , og slet dem. - Juster laserindstillingerne ved hjælp af et område af diaset, der kun er dækket af membranen.
BEMÆRK: Det foreslås at bruge guiden Cut Laser Adjustment og følge instruktionerne i softwaren. Nødvendige laserindstillinger kan variere mellem forskellige dias. For 5 μm sektioner med 400 gange forstørrelse er typiske indstillinger 32 energi og 51 fokus til skæring og 28 energi og -1 fokus til laserpulskatapultering (LPC). - Juster hastighedsindstillingerne for positionering og skæring for at sikre korrekt isolering.
BEMÆRK: 30% hastighed viste sig at være optimal til NMG-isolering. - Fyld prøveopsamlingsrørhætten med 50 μL ultrarent vand, og indsæt hætten i RoboMovers opsamler.
BEMÆRK: Rørsamleren, der bruges til nuværende eksperimenter, kan bære et prøveindsamlingsrør ad gangen. - Placer RoboMover over RoboStage II ved hjælp af softwaregrænsefladen for at starte prøveindsamling.
BEMÆRK: For at gøre dette skal du åbne RoboMover-vinduet, som viser samleren. Klik på prøveopsamlingsrørhætten, der vises i RoboMover-vinduet, for at flytte hætten til arbejdsområdet. Juster den optimale bevægelses- og arbejdshøjde i RoboMover-vinduet. Ellers kan vandet i hætten falde ned på rutsjebanen, eller de katapulterede genstande når ikke hætten. - Start laseren. Kontroller energi- og fokusindstillinger under laserprocessen, og juster indstillingerne om nødvendigt. Sørg for korrekt isolering og katapultering af de isolerede genstande ind i prøveopsamlingsrørhætten for mindst de første ti genstande.
BEMÆRK: Korrekt isolering og katapultering skal kontrolleres visuelt. Begge dele skal resultere i et vævsfrit område på størrelse med det forudvalgte objekt i vævsskiven (se figur 2C,D). Juster laserindstillingerne, hvis objektet forbliver fastgjort til vævsskiven efter skæring og katapultering. Til katapultering viser CenterRoboLPC-indstillingen sig at være velegnet til NMG-isolering. Katapulteringsindstillingerne kan justeres for hvert valgt objekt på elementlisten. - Når prøveudtagningen er afsluttet, skal du navigere RoboMover til dens startposition. Fjern prøveopsamlingsrøret.
BEMÆRK: Når antallet af indsamlede genstande er ret lavt, og genstandene er store nok, kan prøveindsamlingen sikres ved at klikke på Cap Check, som placerer prøveopsamlingsrørhætten under mikroskopet, så antallet af genstande inde i vandet i hætten kan tælles (se figur 2H). - Drej prøven ned ved hjælp af en centrifuge. Korte spins på 5 s med stigende centrifugalkraft på grund af acceleration af centrifugen viste sig at være tilstrækkelige. På dette tidspunkt opbevares prøver ved -80 °C, da alle prøver skal behandles yderligere sammen.
BEMÆRK: Til sammenligning af den proteomiske profil blev vævet omkring NMG'erne også isoleret efter deres excision. Isoleringen af det omgivende væv blev udført ved 50 gange forstørrelse. - Tør prøverne i en vakuumkoncentrator. 1,5 timer viste sig at være tilstrækkeligt til 50 μL vand.
- Opløseligt og lys vævet i 40 μL myresyre i 20 min (stuetemperatur).
- Forbedre vævslysis ved sonikering ved 45 kHz (kilohertz) i 5 minutter i et sonikeringsbad. Fyld sonikeringsbadet med is for at forhindre rør i at smelte. Prøverne opbevares ved -80 °C indtil videre behandling.
3. Tryptisk fordøjelse
- Affrys prøver på is.
- Tør prøverne helt i en vakuumkoncentrator.
- Prøven fyldes op med 50 μL af en passende fordøjelsesbuffer, f.eks. 50 mM ammoniumbicarbonat.
- Efter tilsætning af 1,25 μL 200 mM 1,4-dithiothreitol inkuberes prøverne i 30 minutter ved 60 °C og 300 o/min ved hjælp af en termomixer og afkøles til stuetemperatur (RT) bagefter.
- Derefter inkuberes prøver ved RT i 30 minutter i mørke efter tilsætning af 1,36 μL 0,55 M iodoacetamid.
- Der tilsættes en passende mængde trypsin til prøverne, og prøverne inkuberes natten over (~16 timer) ved 37 °C.
BEMÆRK: For 1.000.000 μm2 blev 0,1 μg trypsin fundet tilstrækkelig. - Tilsæt 2,6 μL 10% trifluoreddikesyre (TFA) til prøverne for at stoppe fordøjelsen (slutkoncentration på 0,5% TFA).
- Tør prøverne helt ved hjælp af en vakuumkoncentrator. Fyld derefter prøver op til et defineret slutvolumen med 0,1% TFA. NMG-prøver blev fyldt op til 20 μL, hvoraf 5 μL blev brugt til et massespektrometrisk (MS) eksperiment.
- Prøverne opbevares ved -80 °C indtil yderligere brug. Peptidkoncentrationen bestemmes ved hjælp af aminosyreanalyse eller en anden egnet kvantificeringsmetode (f.eks. Direct Detect).
BEMÆRK: Lave prøvemængder kan muligvis ikke kvantificeres ved hjælp af de nævnte teknikker. For at sikre identisk prøvebelastning skal hver prøve indeholde den samme mængde isoleret væv, og hver prøve skal behandles ens.
4. Højtydende væskekromatografi og massespektrometri
BEMÆRK: Følgende højtydende væskekromatografi (HPLC) massespektrometrisk (MS) analyse er optimeret til det specifikke LC-system med en fangstkolonneenhed og massespektrometer, der anvendes her (se Materialetabel). For andre LC- og MS-systemer anbefales tilpasning af parametre.
- Brug softwaren Xcalibur til at justere HPLC-indstillingerne som følger.
- Fældekolonne: Indstil temperaturen til 60 °C, strømningshastigheden til 30 μL/min, løbende buffer til 0,1 % trifluoreddikesyre.
- Analytisk C18 omvendt fasekolonne: Indstil temperaturen til 60 °C, strømningshastighed til 30 μL/min, løbende buffer A til 0,1% trifluoreddikesyre, løbende buffer B til 84% acetonitril og gradient til 5%-30% løbende buffer B over 98 min.
BEMÆRK: Tilpasning af gradienten kan være uundgåelig og anbefales kraftigt, når du bruger forskellige væv eller celler. Den samlede gradienttid kan variere på grund af prøvebelastning i begyndelsen af gradienten og prøvevask i slutningen af gradienten. Den samlede gradient i denne protokol består af 7 minutters prøvebelastning og yderligere kolonnevask i 15 minutter, hvilket resulterer i en samlet gradienttid på 120 min.
- Opret en dataafhængig anskaffelsesmetode (DDA) ved hjælp af XCalibur Instrument Setup, som findes i HPLC-softwarekøreplanmenuen.
- Under fanen Globale parametre skal du definere infusionstilstanden Væskekromatografi, den forventede LC-spidsbredde (30 s) og standardopladningstilstanden (2).
- Fortsæt til fanen Scanningsparametre , og tilføj følgende scanninger og filtre i den nævnte rækkefølge: MS OT, MIPS, Intensitet, Opladningstilstand, Dynamisk ekskludering og ddMS2 OT HCD.
BEMÆRK: De detaljerede parameterindstillinger for hver scanning og hvert filter findes i supplerende tabel 1. Optimale MS- og DDA-indstillinger kan variere for det specifikke massespektrometer, der anvendes, samt prøvetypen og bør derfor tilpasses. - Prøverne forberedes ved at opløse 200-400 ng prøvepeptider i et defineret volumen på 0,1 % TFA i inerte massespektrometriske hætteglasindløb. Hvis koncentrationsbestemmelse ikke kan anvendes på grund af den lave prøvemængde, kontrolleres identisk prøvebelastning ved at sammenligne den samlede ionstrøm (TIC).
BEMÆRK: For at gøre dette skal du åbne den resulterende fil med massespektrometrisk måling i en passende software, f.eks. FreeStyle, og kontrollere kromatogrammet. Intensiteterne bør være sammenlignelige for alle prøver. Et repræsentativt TIC er vist i figur 3. - Analyser de rå data, der er opnået ved hjælp af en proteomisk egnet software, f.eks. MaxQuant23, Progenesis QI for Proteomics eller Proteome Discoverer, og udfør en statistisk dataanalyse baseret på forskningsspørgsmålet.
5. Analyse af proteomiske rådata ved hjælp af MaxQuant
BEMÆRK: En detaljeret information om MaxQuant-parametre findes i supplerende tabel 2. De er kort beskrevet nedenfor.
- Indlæs raw-filer i MaxQuant-softwaren i rådataoverskriften ved at klikke på Indlæs.
- Tildel eksempelnavne ved at klikke på Indstil eksperiment.
- Definer gruppespecifikke parametre. Først skal du tilføje ændringer. På grund af prøvebehandling skal du vælge Deamidation (NQ), Oxidation (M) og Carbamidomethylation (N-term) som variable modifikationer og tilføje Carbamidomethylation (C) som fast modifikation.
- Vælg Trypsin som fordøjelsesenzym under fanen Fordøjelse .
- Tilføj etiketfri kvantificeringsmulighed LFQ under fanen Etiketfri kvantificering . Hvis mere end 10 filer skal behandles, skal du vælge Hurtig LFQ mulighed for at forkorte behandlingstiden. Tilføj iBAQ-indstillingen som et mål for proteinkvantificering24.
- Sørg for, at alle andre gruppespecifikke parametre forbliver i fabriksindstillingerne.
- Fortsæt til fanen Globale parametre , og tilføj FASTA-filen, der er afledt af uniprot.org, under fanen Sekvenser . Rediger identifikatorreglen i overensstemmelse hermed, og tilføj taksonomi-id'et, i dette tilfælde 9606 for homo sapiens.
- Til proteinkvantificering skal du vælge unikke og barberpeptider .
- Sørg for, at alle andre globale parametre forbliver i fabriksindstillingerne.
- Klik på Start og hent proteingrupperne.txt output efter MaxQuant analyse for yderligere analyse i Perseus.
6. Statistisk analyse ved hjælp af Perseus
- Indlæs proteingrupperne.txt filen i Perseus, tilføj iBAQ-værdierne som hovedkolonner, og sorter alle andre kolonner efter deres type.
- Filtrer lokkefugle og forurenende stoffer ud ved at filtrere rækker baseret på den kategoriske kolonne.
- Filtrer resultater baseret på gyldige værdier. I det foreliggende tilfælde, hvor kun to stikprøver indgik i analysen, blev der valgt et minimumsantal på én gyldig værdi.
- Eksporter Perseus-output i .txt format til videre behandling, for eksempel i Excel, og evaluer resultaterne vedrørende forskningsspørgsmålet.
7. Validering af udvalgte proteiner
BEMÆRK: Almindeligt anvendte metoder til validering af MS-data er for eksempel immunologisk farvning eller Western Blot. På grund af den mørke farve og autofluorescensen af neuromelanin er immunologisk farvning af proteiner inde i neuromelaningranuler enten med peberrodperoxidase- eller fluorophorekonjugerede antistoffer ikke anvendelige. Til Western Blot-analyse ville meget store mængder post mortem-væv være nødvendigt. Derfor valideres udvalgte proteiner ved målrettet massespektrometri, og i det foreliggende tilfælde blev der oprettet parallelle reaktionsovervågningsforsøg (PRM).
- Vælg proteiner til validering. Vælg peptider af disse proteiner, der allerede er påvist i DDA-eksperimenter. Peptider bør ikke indeholde ubesvarede spaltninger eller ændringer for at sikre en pålidelig kvantificering.
BEMÆRK: Der kan være flere grunde til validering af et specifikt protein, for eksempel differentielle overflod under de undersøgte forhold. Til de repræsentative resultater er der valgt cytoplasmatisk dynein 1 tung kæde 1, som viste sig at være ækvivalent rigelig i NMG- og SN-prøver og derfor kunne bruges som reference for at sikre lige prøvebelastning. - Brug de valgte peptider til at opsætte den første version af en PRM-metode ved hjælp af HPLC-softwaren. Hold alle kromatografi- og globale parameterindstillinger fra DDA-metoden.
- Tilføj MS OT og tMS2 OT HCD som scanningstyper. Sørg for, at indstillingerne for MS OT er de samme som for DDA-metoden. Detaljerede indstillinger for metoden til bevægelseshæmmede findes i supplerende tabel 1.
- For tMS2 OT HCD skal du tilføje udvalgte peptider som en inklusionsliste. Tilføj derfor aminosyresekvensen og den m / z-værdi, der observeres i DDA-målingerne. For det første PRM-eksperiment må du ikke tilføje opbevaringstidsvinduer eller indstille t start til 0 og t stop til 120 (for en 120 minutters gradient).
- Evaluer PRM-metoden efter målingen ved hjælp af passende software, for eksempel Skyline, og få retentionstiden for de peptider, der er føjet til inklusionslisten. For inkluderede peptider skal det kontrolleres, at sammenlignelige toppe kan observeres for mindst tre forløberioner i MS1-scanninger og fem fragmentioner i MS2-scanninger med lav massefejl (±5 ppm).
- Forfin PRM-metoden, f.eks. ved at øge opløsningen for tMS2 OT HCD-scanningen og tilføje opbevaringstidsvinduer til inklusionslisten.
BEMÆRK: Retentionstidsvinduer på 3 minutter viste sig at være velegnede i nuværende forsøg (observeret retentionstid i første PRM-eksperiment ± 1,5 min). - Med den raffinerede PRM-metode udføres kvantificering af peptider og proteiner af interesse baseret på topområdet både på MS1- og MS2-niveauer med passende software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den specifikke isolering af NMG'er og SN-væv er det vigtigste skridt for en vellykket anvendelse af denne protokol. Ved hjælp af funktionen Field of View Analysis i LMD's leverandørleverede software kan NMG'er automatisk vælges på en farveafhængig måde. Derfor skal vævsområder, der indeholder NMG'er (figur 2A), identificeres, og der skal udføres en synsfeltanalyse med justerede farvetærskler, hvilket resulterer i mærkning af NMG'er (figur 2B). Efter filtrering af genstande, der dækker et område under 100 μm², bør kun NMG'er forblive mærket til isolering (figur 2C). Præcis isolering af de mærkede NMG'er opnås efter justering af laserindstillinger (figur 2D). Efter isolering af NMG'er (figur 2E) kan SN-væv vælges med 50 gange forstørrelse (figur 2F) og isoleret (figur 2G) til sammenligning af den proteomiske profil. For SN-væv kan isolerede objekter visualiseres ved hjælp af funktionen Cap Check (figur 2H). For begge prøvetyper, NMG og SN, viste isolering af 500.000 μm2 hjernevæv sig at være tilstrækkelig til denne protokol, hvilket muliggjorde mindst tre MS-kørsler pr. Prøve.
Et repræsentativt eksempel på et 120 minutters DDA-eksperiment er vist i figur 3 (da hovedkolonnen vaskes i de sidste 15 minutter af målingen, beskæres kromatogrammet lige før 105 min). Den anvendte metode bør muliggøre en eluering af prøver over hele gradienten, hvilket skaber skarpe og koncise toppe, og intensiteten af den samlede ionstrøm (TIC) bør være sammenlignelig på tværs af alle prøver.
Anvendelse af den præsenterede protokol på en prøve på 500.000 μm² NMG og en prøve på 1.000.000 μm² SN-væv med justerede volumener til MS-prøver (5 μL for NMG og 2,5 μL for SN) for at sikre identisk peptidbelastning resulterede i identifikation af 1.898 proteingrupper (PG'er) i NMG-prøven og 1.565 PG'er i SN-prøven. Yderligere sammenligning viste, at der skulle identificeres 1.384 PG'er i begge prøver, mens 514 PG'er udelukkende blev identificeret i NMG og 181 PG'er i SN-væv (figur 4). I alt blev 2.079 PG'er identificeret i dette repræsentative eksperiment. Sammenligning med et referencedatasæt fra en tidligere undersøgelse22 viste, at 87,6% af de PG'er, der blev rapporteret i denne undersøgelse, også kunne identificeres ved hjælp af den nuværende reviderede og automatiserede protokol, hvilket beviste dens anvendelighed. Desuden kan antallet af identificerede PG'er forbedres med 1.143.
Da minimale prøvemængder ikke tillader anvendelse af klassiske valideringsmetoder såsom Western Blots, kan validering af proteiner af interesse opnås ved målrettede massespektrometriske tilgange, f.eks. PRM. Repræsentative resultater for peptidet ESPEVLLTLDILK af proteinet cytoplasmatisk dynein 1 tung kæde 1 er vist i figur 5. IBAQ-værdien af dette protein viste sig at være lidt højere i NMG'er sammenlignet med SN i DDA-målingerne, som kunne verificeres ved PRM-eksperimenter baseret på topområdet på MS1- (figur 5A, B, E) og MS2-niveau (figur 5C, D, F).
Figur 1: Arbejdsgang for proteomisk karakterisering af neuromelaningranulat (NMG'er) og omgivende væv (SN). NMG- og SN-prøver blev isoleret fra vævsskiver via lasermikrodissektion (LMD). Proteiner blev isoleret, og tryptisk fordøjelse i opløsning blev udført. De resulterende peptider blev analyseret via LC-MS/MS-målinger i dataafhængig erhvervelsestilstand (DDA). Dataanalyse blev udført ved hjælp af MaxQuant og Perseus software. Validering af udvalgte proteiner blev udført med parallelle reaktionsovervågningsforsøg (PRM). PRM-data blev analyseret ved hjælp af Skyline-software. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Udvælgelse og LMD-baseret isolering af NMG- og SN-prøver. Først placeres et område indeholdende NMG'er, der er synligt uden yderligere farvning ved 400 gange forstørrelse, under mikroskopet (A). Efter udførelse af en synsfeltanalyse vælges NMG'er og andre mørke områder (B). Kun NMG'er forbliver valgt efter filtrering (C) og isoleres, når laserindstillingerne er justeret (D). Når alle NMG'er er isoleret (E), vælges SN-væv med 50 gange forstørrelse (F) og isoleret (G). Da objekter isoleret til SN-prøver er ret store, kan de observeres i prøveindsamlingshætten ved hjælp af Cap Check-funktionen (H). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Samlet ionstrøm (TIC) for en 120 minutters DDA-måling. Kromatogrammet viser den relative overflod af ionerne svarende til elueringspeptiderne over retentionstidsintervallet fra 0 til ~ 105 min. Da hovedsøjlen vaskes mellem 105. og 120. min., beskæres kromatogrammet ved det 105. min. Intensiteten af den højeste top er 2,86 x 108. Tal over toppe angiver retentionstiden og den mest rigelige ion af den specifikke top (BP = base peak). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Venn-diagram, der viser korrespondancen mellem proteingrupper (PG'er) identificeret i NMG'er og SN-væv. I alt blev 1.898 PG'er identificeret i NMG'er og 1.565 PG'er i SN-væv, hvoraf 1.384 PG'er blev identificeret i begge vævsområder. 514 PG'er blev udelukkende identificeret i NMG-væv, mens 181 PG'er udelukkende blev identificeret i SN-væv. Diagrammet blev oprettet ved hjælp af onlineværktøjet Venny25. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Resultater af PRM-forsøg for peptidet ESPEVLLTLDILK (cytoplasmatisk dynein 1 tung kæde 1, ++). Kromatogrammer på MS1- (A,B) og MS2-niveau (C,D) samt topområder på MS1- (E) og MS2-niveau (F) er vist for en eksemplarisk prøve af NMG'er og SN-væv. Forskellige farver bruges til at betegne forskellige prækursorer (på MS1-niveau) eller produktioner (på MS2-niveau). Kramatogrammer vises efter Savitzky-Golay Smoothing blev udført. Intensiteter og spidsbelastningsområder var sammenlignelige på MS1-niveau (A, B, E) og MS2-niveau (C, D, F). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Parametre for massespektrometriforsøgene. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 2: Parametre for MaxQuant-analysen. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LMD er en bredt anvendelig teknik til isolering af specifikke vævsområder, enkeltceller eller subcellulære strukturer. I den reviderede og automatiserede protokol, der præsenteres her, anvendes denne teknik til specifik isolering af neuromelaningranuler (NMG'er) og NMG-omgivende væv (SN). Indtil nu er to forskellige tilgange til isolering af NMG'er ud af humant post mortem hjernevæv blevet offentliggjort og udbredt i vid udstrækning:
a) En diskontinuerlig saccharosegradient, der indtager 1 g substantia nigravæv 20. Da humant post mortem substantia nigravæv er sjældent og af stor interesse for flere forskningsspørgsmål, er det desværre ret udfordrende at oprette en stor kohorteundersøgelse, hvis der kræves store mængder væv pr. Patient. Derfor blev denne tilgang yderligere forbedret ved at reducere den krævede vævsmængde til 0,15 g for tilstrækkelig isolering af NMG'er26. Der var dog stadig behov for mindst halvdelen af en komplet substantia nigra pars compacta .
b) Excision af NMG'er ved hjælp af LMD. I 2016 etablerede Plum et al en ny protokol baseret på den præcise udskæring af NMG'er via LMD. Med denne protokol kunne den krævede prøvemængde reduceres til ti 10 μm vævssektioner, hvilket resulterede i en imponerende reduktion af den krævede vævsprøve fra 150 mg til 16,6 mg22.
Den optimerede og automatiserede LMD-baserede protokol, der præsenteres her, kræver endnu lavere prøvemængder, da tyndere (5 μm sammenlignet med 10 μm) og færre vævssektioner (maksimalt 7 sammenlignet med 8) skulle bruges og kræver mindre tid til prøvegenerering (4 timer pr. prøve sammenlignet med 1-2 dage) ved hjælp af automatiseret NMG-detektion. Således blev den krævede prøveindsamlingstid forkortet massivt, og antallet af identificerede PG'er kunne forbedres drastisk ved at anvende en optimeret LC-MS-metode og avanceret instrumentering. Denne protokol kan let tilpasses andre forskningsspørgsmål og væv.
Med henblik på tilpasning af den fremlagte protokol vedrørende brugerdefinerede forskningsspørgsmål fremhæves følgende aspekter på grundlag af erfaringerne:
a) Isolering af sammenlignelige prøvemængder: Da det forventede peptidudbytte af denne protokol er ret lavt sammenlignet med for eksempel cellekultur eller vævslamsater, er bestemmelse af peptidkoncentration muligvis ikke mulig. Det er således afgørende, at lige store mængder væv isoleres via LMD, som kan estimeres ud fra vævsarealet af de udvalgte objekter. I den nuværende opsætning er vævsområder på 500.000 μm² tilstrækkelige til generering af peptider til mindst tre MS-målinger.
b) Trypsin-fordøjelse: Varigheden af fordøjelsen og trypsinkoncentrationen skal være sammenlignelig på tværs af prøver.
c) Tilpasning af parametre til forskellige væv: Afhængigt af vævet, der skal analyseres, skal den indsamlede vævsmængde justeres, hvilket gør det nødvendigt også at justere mængden af tilsat trypsin. Forholdet mellem trypsin og protein bør ikke være lavere end 1:40.
d) Begrænsning af LMD-processen: For LMD-baseret isolering af objekter af interesse er der begrænsninger, når det kommer til størrelsen på udvalgte objekter og tykkelsen af skiver. På grund af vævstab under laserbaseret skæring af vævet blev genstande mindre end 100 μm² betragtet som for små til isolering.
e) Tilpasning af LC- og MS-parametre: Afhængigt af de anvendte LC- og MS-systemer skal mængden af isoleret væv øges (f.eks. når der arbejdes med et mikroflowsystem), og MS-parametre skal tilpasses (f.eks. når der arbejdes med et ionfældebaseret detektorsystem).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af de. NBI, et projekt fra det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (BMBF) (bevillingsnummer FKZ 031 A 534A) og P.U.R.E. (Protein Research Unit Ruhr i Europa) og Center for Protein Diagnostics (ProDi) tilskud, begge fra ministeriet for innovation, videnskab og forskning i Nordrhein-Westfalen, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol | AppliChem | A1101 | |
| Acetonitrile | Merck | 1.00029.2500 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| Iodoacetamide | AppliChem | A1666,0100 | |
| Micro Tube 500 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM MicroBeam | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN Membrane slide | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta tissue slices | Navarrabiomed Biobank (Pamplona, Spain) | ||
| Trifluoroacetic acid | Merck | 91707 | |
| Trypsin sequencing grade | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano LC system | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Name of Software | Weblink/Company | Version | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
References
- Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316 (2011).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Eggers, B., et al. Advanced fiber type-specific protein profiles derived from adult murine skeletal muscle. Proteomes. 9 (2), 28 (2021).
- Kley, R. A., et al. A combined laser microdissection and mass spectrometry approach reveals new disease relevant proteins accumulating in aggregates of filaminopathy patients. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 12 (1), 215-227 (2013).
- Güttsches, A. -K., et al. Proteomics of rimmed vacuoles define new risk allele in inclusion body myositis. Annals of Neurology. 81 (2), 227-239 (2017).
- Bogerts, B. A brainstem atlas of catecholaminergic neurons in man, using melanin as a natural marker. The Journal of Comparative Neurology. 197 (1), 63-80 (1981).
- Engelen, M., et al. Neuromelanins of human brain have soluble and insoluble components with dolichols attached to the melanic structure. PloS One. 7 (11), 48490 (2012).
- Duffy, P. E., Tennyson, V. M. Phase and electron microscopic observations of lewy bodies and melanin granules in the substantia nigra and locus caeruleus in parkinsonʼs disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 24 (3), 398-414 (1965).
- Zecca, L., et al. Interaction of human substantia nigra neuromelanin with lipids and peptides. Journal of Neurochemistry. 74 (4), 1758-1765 (2000).
- Fenichel, G. M., Bazelon, M. Studies on neuromelanin. II. Melanin in the brainstems of infants and children. Neurology. 18 (8), 817-820 (1968).
- Halliday, G. M., et al. Evidence for specific phases in the development of human neuromelanin. Journal of Neural Transmission. 113 (6), Vienna, Austria. 721-728 (2006).
- Zucca, F. A., et al. Interactions of iron, dopamine and neuromelanin pathways in brain aging and Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 155, 96-119 (2017).
- Carballo-Carbajal, I., et al. Brain tyrosinase overexpression implicates age-dependent neuromelanin production in Parkinson's disease pathogenesis. Nature Communications. 10 (1), 973 (2019).
- Zecca, L., Zucca, F. A., Wilms, H., Sulzer, D. Neuromelanin of the substantia nigra: a neuronal black hole with protective and toxic characteristics. Trends in Neurosciences. 26 (11), 578-580 (2003).
- Paris, I., Lozano, J., Perez-Pastene, C., Muñoz, P., Segura-Aguilar, J. Molecular and neurochemical mechanisms in PD pathogenesis. Neurotoxicity Research. 16 (3), 271-279 (2009).
- Zecca, L., et al. Neuromelanin can protect against iron-mediated oxidative damage in system modeling iron overload of brain aging and Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry. 106 (4), 1866-1875 (2008).
- Zarȩba, M., Bober, A., Korytowski, W., Zecca, L., Sarna, T. The effect of a synthetic neuromelanin on yield of free hydroxyl radicals generated in model systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1271 (2-3), 343-348 (1995).
- Karlsson, O., Lindquist, N. G. Melanin affinity and its possible role in neurodegeneration. Journal of neural transmission. 120 (12), Vienna, Austria. 1623-1630 (2013).
- Marsden, C. D. Pigmentation in the nucleus substantiae nigrae of mammals. Journal of Anatomy. 95, 256-261 (1961).
- Tribl, F., et al. 34;Subcellular proteomics" of neuromelanin granules isolated from the human brain. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 4 (7), 945-957 (2005).
- Zucca, F. A., et al. Neuromelanin organelles are specialized autolysosomes that accumulate undegraded proteins and lipids in aging human brain and are likely involved in Parkinson's disease. NPJ Parkinson's Disease. 4, 17 (2018).
- Plum, S., et al. Proteomic characterization of neuromelanin granules isolated from human substantia nigra by laser-microdissection. Scientific Reports. 6, 37139 (2016).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Krey, J. F., et al. Mass spectrometry quantitation of proteins from small pools of developing auditory and vestibular cells. Scientific Data. 5, 180128 (2018).
- Oliveros, J. C. Venny: An interactive tool for comparing lists with Venn's diagrams. , Available from: https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html (2007).
- Plum, S., et al. Combined enrichment of neuromelanin granules and synaptosomes from human substantia nigra pars compacta tissue for proteomic analysis. Journal of Proteomics. 94, 202-206 (2013).
