Laser-Mikrodissektions-basiertes Protokoll für die LC-MS/MS-Analyse des proteomischen Profils von Neuromelanin-Granulaten
December 16th, 2021
Hier wird ein robustes Protokoll zur Isolierung von Neuromelanin-Granulaten aus humanem postmortalem Substantia nigra pars compacta-Gewebe mittels Lasermikrodissektion vorgestellt. Dieses überarbeitete und optimierte Protokoll minimiert massiv die benötigte Zeit für die Probenentnahme, reduziert die erforderliche Probenmenge und verbessert die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen durch LC-MS/MS-Analyse.
Unsere Kombination aus Lasermikrodissektion und Massenspektrometrie ermöglicht die Untersuchung von räumlich aufgelösten Veränderungen auf proteomischer Ebene in jeder Art von Gewebe. In unserem Fall Neuromelanin-Granula. Unser Protokoll ermöglicht die proteomische Analyse basierend auf begrenztem Probenmaterial.
Das ist in der Regel eine große Herausforderung bei der Arbeit mit postmortalem Hirngewebe. Da einzelne Zellen isoliert werden können, um gesunde und Krankheitszustände auf proteomischer Ebene zu vergleichen. Dies kann unser Verständnis von Krankheitsmechanismen verbessern.
Legen Sie zunächst den Gewebemembranobjektträger mit dem Gewebe nach oben in den Objektträgerhalter auf der Robo-Bühne. Um einen Übersichtsscan des Gewebeschnitts zu erhalten. Verwenden Sie die Scan-Funktion, wählen Sie den Interessenbereich oben links und unten rechts aus.
Wählen Sie dann Alle ROIs scannen aus, um den Scan durchzuführen. Zur automatischen Auswahl von Neuromelanin-Granulaten im aktuellen Sichtfeld. Wählen Sie die Sichtfeldanalyse.
Wählen Sie dann Ergebnis umkehren und legen Sie den Schwellenwert für die RGB-Kanäle fest. So werden im Vorschaufenster nur Neuromelanin-Granulate rot hervorgehoben. Klicken Sie nun auf OK, um die angepassten Einstellungen für das Sichtfeld zu verwenden.
Passen Sie die Lasereinstellungen mit einem Bereich des Objektträgers an, der nur von der Membran bedeckt ist. Füllen Sie die Probenentnahmeröhrchenkappe mit 50 Mikrolitern Reinstwasser. Und stecken Sie die Kappe in den Kollektor des Robo Movers.
Positionieren Sie den Robo Mover über der zweiten Robo-Stufe, um die Probenentnahme zu starten. Starten Sie den Laser. Steuern Sie die Energie- und Fokuseinstellungen während des Laserprozesses und passen Sie die Einstellungen bei Bedarf an.
Stellen Sie sicher, dass die isolierten Objekte für mindestens die ersten 10 Objekte ordnungsgemäß isoliert und in die Probenentnahmeröhrchenkappe katapultiert werden. Wenn die Probenahme abgeschlossen ist, navigieren Sie den Robo Mover zu seiner Ausgangsposition und entfernen Sie das Probenentnahmeröhrchen. Nach dem Spinnen der Proben durch Zentrierung.
Trocknen Sie die Proben 1,5 Stunden lang in einem Vakuumkonzentrator. Nach Durchführung der triptischen Verdauung wie im Text beschrieben. Bereiten Sie die Probe für die HPLC-MS-Analyse vor, indem Sie 200 bis 400 Nanogramm Probenpeptide in einem definierten Volumen von 0,1% TFA auflösen.
In inerten massenspektrometrischen Glasfläschcheneinlässen. Wenn die Konzentrationsbestimmung aufgrund einer geringen Probenmenge nicht anwendbar ist. Überprüfen Sie die identische Probenbelastung durch Vergleich des gesamten Ionenstroms.
Um mit der proteomischen Rohdatenanalyse zu beginnen. Klicken Sie auf Laden, um die Rohdateien in die Software zu laden. Klicken Sie auf Set Experiment, um die Beispielnamen zuzuweisen.
Um gruppenspezifische Parameter zu definieren. Fügen Sie die Modifikationen hinzu, indem Sie Deamidierungs-NQ, Oxidation M und Carbamidomethylierungs-N-term als variable Modifikationen auswählen. und fügen Sie dann Carbamidomethylierung C als feste Modifikation hinzu.
Wählen Sie Trypsin als Verdauungsenzym in der Verdauungsregisterkarte. Fügen Sie auf der Registerkarte labelfreie Quantifizierung die Option LFQ hinzu, und wenn mehr als 10 Dateien verarbeitet werden sollen, wählen Sie die Option schnelle LFQ, um die Verarbeitungszeit zu verkürzen. Sicherstellen, dass alle anderen gruppenspezifischen Parameter in den Werkseinstellungen bleiben.
Fahren Sie mit der Registerkarte globale Parameter fort und fügen Sie die von uniprot abgeleitete FASTA-Datei hinzu. org auf der Registerkarte Sequenzen. Ändern Sie die Bezeichnerregel entsprechend.
Und fügen Sie die Taxonomie-ID 9606 für Homo sapiens hinzu. Für die Proteinquantifizierung wählen Sie einzigartige und Rasiermesserpeptide. Fügen Sie dann die iBAQ-Option als Maß für die Proteinquantifizierung auf der Registerkarte "Label-freie Quantifizierung" hinzu.
Stellen Sie sicher, dass alle anderen globalen Parameter in den Werkseinstellungen bleiben und klicken Sie auf Start. Nachdem die Analyse erfolgreich durchgeführt wurde, rufen Sie die Proteingruppen ab. TXT-Ausgabe.
Laden Sie die Proteingruppen. TXT-Datei in der Analysesoftware. Fügen Sie die iBAQ-Werte als Hauptspalten hinzu und sortieren Sie alle anderen Spalten nach ihrem Typ.
Filtern Sie Lockvögel und Verunreinigungen heraus, indem Sie Zeilen basierend auf der kategorialen Spalte filtern und Ergebnisse basierend auf gültigen Werten filtern. Exportieren Sie die Ausgabe zur weiteren Verarbeitung in das txt-Format. Und bewerten Sie die Ergebnisse bezüglich der Forschungsfrage.
In der vorliegenden Studie wurden 1.898 Proteingruppen in NMGs und 1.565 in umgebendem SN-Gewebe identifiziert, von denen 1.384 in beiden Gewebebereichen identifiziert wurden. So wurden 514 bzw. 181 Proteingruppen ausschließlich in NMGs bzw. SN-Gewebe identifiziert. In den repräsentativen DDA-Messungen.
Etwas höhere iBAQ-Werte in NMGs im Vergleich zu SN deuteten auf eine höhere Häufigkeit des Proteins zytoplasmatischen Dynien-1, der schweren Kette 1 in NMGs hin. Diese Beobachtung konnte in PRM-Experimenten für das Peptid ESPEVLLTLDILK bestätigt werden. In dem eine höhere Häufigkeit in NMGs nachgewiesen wurde.
Basierend auf der Spitzenfläche auf MS1- und MS2-Ebene. Der mit Abstand wichtigste Schritt ist die Isolierung der NMGs, da der Rest des Protokolls auf diesem Schritt basiert, um ordnungsgemäß durchgeführt zu werden. Nach dem LMD-Verfahren können die Proben für jede Art von Omics-Technik wie Genomik, Transkriptomik, Proteomik oder Lipidomik verwendet und weiterverarbeitet werden.
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Überblick
Diese Studie präsentiert ein robustes Protokoll zur Isolierung von Neuromelanin-Granula aus menschlichem postmortalem Substantia-nigra-pars-compacta-Gewebe mittels Lasermikrodissektion. Der optimierte Ansatz reduziert signifikant die erforderliche Probensammlungszeit und -menge und verbessert gleichzeitig die Proteinidentifizierung und -quantifizierung durch LC-MS/MS-Analyse.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Proteomik
- Postmortale Gehirnanalyse
Hintergrund
- Neuromelanin-Granula waren historisch gesehen schwierig zu isolieren und zu analysieren.
- Traditionelle Methoden erfordern größere Proben und längere Sammelzeiten.
- Lasermikrodissektion ermöglicht eine präzise Isolierung auf Einzelzellniveau.
- Dieses Protokoll zielt darauf ab, das Verständnis von Krankheitsmechanismen bei neurologischen Erkrankungen zu verbessern.
Zweck der Studie
- Optimierung der Isolierung von Neuromelanin-Granula für proteomische Analysen.
- Minimierung der Probenanforderungen und Reduzierung der Sammelzeit in postmortalem Gewebe.
- Verbesserung der Erkennung von Proteinen, die mit Gesundheits- und Krankheitszuständen in Verbindung stehen.
Verwendete Methoden
- Lasermikrodissektion wurde zur Isolierung von Neuromelanin-Granula aus menschlichem Hirngewebe verwendet.
- Das Modell umfasste postmortales Substantia-nigra-Gewebe.
- Ein detaillierter LC-MS/MS-Workflow wurde für die Proteinidentifizierung integriert.
- Die Einbeziehung kritischer Schritte wie automatisierte Auswahl und Anpassung der Lasereinstellungen wurde betont.
- Die proteomische Analyse umfasste eine Validierung gegen etablierte Proteinquantifizierungsmethoden.
Hauptergebnisse
- 1.898 Proteingruppen wurden in Neuromelanin-Granula identifiziert, mit unterschiedlichen Expressionsmustern im Vergleich zum umgebenden Gewebe.
- Bemerkenswerte Ergebnisse umfassen höhere iBAQ-Werte in Neuromelanin-Granula für bestimmte Proteine.
- Die Methode ermöglicht den Vergleich von gesunden und krankhaften Zuständen auf proteomischer Ebene.
- Diese Studie hebt wichtige Erkenntnisse zur Proteinzusammensetzung in der Gehirngesundheit und -pathologie hervor.
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert einen optimierten Ansatz zur Isolierung von Neuromelanin-Granula und verbessert proteomische Analysen.
- Die optimierte Methode hat bedeutende Auswirkungen auf das Verständnis von Krankheitsmechanismen bei neurologischen Störungen.
- Weitere Anwendungen könnten zu Fortschritten in klinischen und Forschungsumgebungen führen, die sich auf Neuromelanin-verwandte Pathologien konzentrieren.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables spatially resolved proteomic analysis of neuromelanin granules from limited post-mortem human brain tissue, addressing a key bottleneck in neurodegenerative disease research. This approach supports target validation and mechanistic de-risking by providing disease-relevant proteomic data from dopaminergic neurons affected in Parkinson's disease. The method enhances predictive confidence in early discovery by allowing direct comparison of healthy and diseased states at the protein level.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating neuromelanin granules for proteomic profiling in Parkinson's disease-relevant tissue.
- Operational Value: Reduces tissue requirements through unbiased, automated collection of granules, facilitating analysis of precious post-mortem samples.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by identifying proteins exclusively enriched in neuromelanin granules versus surrounding substantia nigra tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream omics workflows by yielding high-purity granule isolates compatible with LC-MS/MS.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through automated selection thresholds and consistent laser settings for granule isolation.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by providing quantitative proteomic outputs (iBAQ, LFQ) from disease-relevant neuronal compartments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking neuromelanin granule proteomics to neurodegenerative conditions like Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling proteomic comparison of healthy versus disease conditions.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking value by identifying differentially abundant proteins (e.g., cytoplasmic dynein-1 heavy chain 1) as potential translational biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation to preclinical research by providing spatially resolved proteomic data from disease-affected neuronal populations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling proteomic comparison of neuromelanin granules and surrounding substantia nigra tissue.
- Screening: Describes assay readiness through automated granule selection and reproducible sample collection for downstream LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Highlights label-free quantification (LFQ) and iBAQ measurements that allow teams to compare protein abundance between conditions.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling proteomic profiling of human tissue relevant to Parkinson's disease pathology.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for omics applications (genomics, transcriptomics, lipidomics) beyond proteomics.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in neurodegeneration research.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through automated laser microdissection workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in CNS target programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on disease-relevant proteomic signatures.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in laser microdissection operation and mass spectrometry-based proteomics.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include UV laser microdissection systems and LC-MS/MS platforms.
- Cross-team standardization requirements for granule selection thresholds and sample preparation protocols.
- Adaptation considerations across model systems, including optimization of laser settings for different tissue types.
- Practical limitations include dependency on post-mortem tissue availability and potential protein degradation effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Laser Microdissection and Pressure Catapulting
2:46
Sample Preparation for HPLC-MS and Proteomic Raw Data Analysis
5:10
Statistical Analysis
5:50
Results: Protein Identification in Neuromelanin Granules (NMGs) and Substantia nigra (SN)
7:00
Conclusion
