Summary
El presente trabajo describe los pasos para producir qPCR lista para usar para la detección de ADN de T. cruzi que puede precargarse en el recipiente de reacción y almacenarse en el refrigerador durante varios meses.
Abstract
La PCR en tiempo real (qPCR) es una técnica notablemente sensible y precisa que permite amplificar cantidades diminutas de objetivos de ácido nucleico a partir de una multitud de muestras. Se ha utilizado ampliamente en muchas áreas de investigación y ha logrado una aplicación industrial en campos como el diagnóstico humano y la selección de rasgos en cultivos de organismos genéticamente modificados (OGM). Sin embargo, la qPCR no es una técnica a prueba de errores. La mezcla de todos los reactivos en una sola mezcla maestra distribuida posteriormente en 96 pocillos de una placa de qPCR regular podría dar lugar a errores del operador, como la mezcla incorrecta de reactivos o la dispensación inexacta en los pozos. Aquí, se presenta una técnica llamada gelificación, mediante la cual la mayor parte del agua presente en la mezcla maestra es sustituida por reactivos que forman una mezcla sol-gel cuando se somete al vacío. Como resultado, los reactivos de qPCR se conservan eficazmente durante algunas semanas a temperatura ambiente o unos pocos meses a 2-8 oC. Los detalles de la preparación de cada solución se muestran aquí junto con el aspecto esperado de una reacción gelificada diseñada para detectar ADN satélite de T. cruzi (satDNA). Se puede aplicar un procedimiento similar para detectar otros organismos. Iniciar una serie de qPCR gelificada es tan simple como sacar la placa del refrigerador, agregar las muestras a sus respectivos pocillos y comenzar la corrida, disminuyendo así el tiempo de configuración de una reacción de placa completa al tiempo que lleva cargar las muestras. Además, las reacciones de PCR gelificadas se pueden producir y controlar para determinar la calidad en lotes, ahorrando tiempo y evitando errores comunes del operador mientras se ejecutan las reacciones de PCR de rutina.
Introduction
La enfermedad de Chagas fue descubierta a principios delsiglo XX en las regiones rurales de Brasil, donde la pobreza era generalizada 1,2. Incluso hoy en día, la enfermedad sigue estando conectada a los determinantes sociales y económicos de la salud en las Américas. La enfermedad de Chagas es bifásica, comprendiendo una fase aguda y otra crónica. Es causada por infección por el parásito Trypanosoma cruzi, siendo transmitida por insectos vectores, transfusiones de sangre por vía congénita o ingestión oral de alimentos contaminados 3,4.
El diagnóstico de la enfermedad de Chagas puede realizarse mediante la observación de síntomas clínicos (especialmente el signo de Gaña), microscopía de frotis de sangre, serología y pruebas moleculares como PCR en tiempo real (qPCR) o amplificación isotérmica 4,5,6,7,8,9. Los síntomas clínicos y la microscopía de frotis de sangre se utilizan en casos sospechosos de infecciones agudas, mientras que la búsqueda de anticuerpos se utiliza como una herramienta de detección en pacientes asintomáticos. Debido a su sensibilidad y especificidad, se ha sugerido que la qPCR sea utilizada como una herramienta de monitoreo para pacientes crónicos, para pacientes agudos sometidos a tratamiento que mide la carga del parásito en la sangre y como un marcador sustituto de fracaso terapéutico 6,8,10,11,12 . Aunque más sensible y específica que las pruebas disponibles actualmente, la qPCR se evita efectivamente de ser conocida como herramientas de diagnóstico en regiones desfavorecidas de todo el mundo debido al requisito de temperaturas de congelación para el transporte y almacenamiento13,14,15.
Para sortear este obstáculo, se han explorado técnicas de conservación como la liofilización y la gelificación16,17. Mientras que la liofilización proporciona conservación durante años, requiere reactivos especialmente fabricados sin la presencia de glicerol, que es comúnmente utilizado para la estabilización/conservación de enzimas18. Si bien se ha demostrado que la gelificación proporciona conservación durante meses, permite el uso de reactivos regulares19. La solución de gelificación comprende cuatro componentes, cada uno con funciones específicas en el proceso: los azúcares trehalosa y melezitosa protegen las biomoléculas durante el proceso de desecación al reducir las moléculas de agua libre en la solución, el glucógeno produce una matriz protectora más amplia y el aminoácido lisina se utiliza como eliminador de radicales libres para inhibir las reacciones oxidantes entre el carboxilo de la biomolécula, grupos amino y fosfato. Estos componentes definen una mezcla sol-gel que evita la pérdida de la estructura terciaria o cuaternaria durante el proceso de desecación, ayudando así a mantener la actividad de las biomoléculas tras la rehidratación19. Una vez estabilizadas dentro de los tubos de reacción, las reacciones pueden almacenarse durante unos meses a 2-8 °C o unas semanas a 21-23 °C en lugar de los -20 °C habituales. Este enfoque ya ha sido incorporado en pruebas diseñadas para ayudar a diagnosticar enfermedades como la enfermedad de Chagas, la malaria, la leishmaniasis, la tuberculosis y la ciclosporiasis13,14,15,20.
El presente trabajo describe todos los pasos para preparar las soluciones requeridas para el procedimiento de gelificación, las trampas en el proceso y el aspecto final esperado de una qPCR gelificada lista para usar dentro de tiras de ocho tubos. El mismo protocolo se puede adaptar para tubos individuales o placas de 96 pocillos. Finalmente, la detección de ADN de T. cruzi se mostrará como una ejecución de control.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de soluciones madre y mezcla de gelificación
NOTA: Se prepararán cuatro soluciones madre (400 mg/ml de melezitosa, 400 mg/ml de trehalosa, 0,75 mg/ml de lisina y 200 mg/ml de glucógeno) y se mezclarán de acuerdo con la proporción mostrada en la Tabla 1 para producir la mezcla de gelificación. Aunque el protocolo describe 10 ml de producción de soluciones madre, se puede adaptar para volúmenes más bajos o más altos.
- Solución de melezitosa
- Pese 4 g de melezitosa en un tubo de plástico de 15 ml, agregue 6 ml de agua libre de nucleasa y vórtice a la velocidad máxima del instrumento hasta que el polvo esté solubilizado.
NOTA: Se puede agregar más agua para facilitar la solubilización, teniendo cuidado de no exceder el volumen final (ver más abajo). - Enrasar el volumen final a 10 ml con agua libre de nucleasas. Etiquetar y conservar a 2-8 °C durante un máximo de 6 meses.
- Pese 4 g de melezitosa en un tubo de plástico de 15 ml, agregue 6 ml de agua libre de nucleasa y vórtice a la velocidad máxima del instrumento hasta que el polvo esté solubilizado.
- Solución de trehalosa
- Pese 4 g de trehalosa en un tubo de plástico de 15 ml, agregue 6 ml de agua libre de nucleasa y vórtice a la velocidad máxima del instrumento hasta que el polvo esté solubilizado.
NOTA: Se puede agregar más agua para facilitar la solubilización, teniendo cuidado de no exceder el volumen final (ver más abajo). - Enrasar el volumen hasta 10 ml con agua libre de nucleasas y filtrar la solución a través de un filtro de 0,2 μm. Etiquetar y conservar a 2-8 °C durante un máximo de 6 meses.
- Pese 4 g de trehalosa en un tubo de plástico de 15 ml, agregue 6 ml de agua libre de nucleasa y vórtice a la velocidad máxima del instrumento hasta que el polvo esté solubilizado.
- Solución de glucógeno
- Pese 2 g de glucógeno en un tubo de plástico de 15 ml, agregue 6 ml de agua libre de nucleasa y haga vórtice a la velocidad máxima del instrumento hasta que el polvo esté solubilizado.
NOTA: Se puede agregar más agua para facilitar la solubilización, teniendo cuidado de no exceder el volumen final (ver más abajo). - Mantener la solución en reposo a 2-8 °C durante 8-12 h porque la solubilización del glucógeno produce muchas burbujas (Figura 1). Enrasar el volumen hasta 10 ml con agua libre de nucleasas. Etiquetar y conservar a 2-8 °C durante un máximo de 6 meses.
- Pese 2 g de glucógeno en un tubo de plástico de 15 ml, agregue 6 ml de agua libre de nucleasa y haga vórtice a la velocidad máxima del instrumento hasta que el polvo esté solubilizado.
- Solución de lisina
- Pese 7,5 mg de lisina en un tubo de plástico de 15 ml, agregue 6 ml de agua libre de nucleasa. Vórtice a la velocidad máxima del instrumento hasta que el polvo esté solubilizado.
NOTA: Se puede agregar más agua para facilitar la solubilización, teniendo cuidado de no exceder el volumen final (ver más abajo). - Enrasar el volumen hasta 10 ml con agua libre de nucleasas y filtrar la solución a través de un filtro de 0,2 μm. Transfiera la solución a un matraz de color ámbar o protéjala de la luz. Etiquete y guárdelo a 2-8 °C grados durante un máximo de 6 meses.
- Pese 7,5 mg de lisina en un tubo de plástico de 15 ml, agregue 6 ml de agua libre de nucleasa. Vórtice a la velocidad máxima del instrumento hasta que el polvo esté solubilizado.
- Mezcla de gelificación (GM)
- En un tubo de plástico de 50 ml, mezclar los volúmenes de soluciones madre de acuerdo con la Tabla 1.
- Mezclar los reactivos por diez inversiones de extremo a extremo del tubo.
NOTA: No hay necesidad de un paso de filtración si este paso se realiza en una campana de seguridad de flujo laminar. Si este paso no se realiza en un ambiente limpio, filtrar la solución a través de un filtro de 0,2 μm antes de transferirla a un matraz de color ámbar. - Transfiera la solución a un matraz de color ámbar o protéjala de la luz. Etiquetar y conservar a 2-8 °C durante un máximo de 3 meses.
NOTA: Como paso de control de calidad para preparar la mezcla de gelificación, asegúrese de que los valores de pH, conductividad y densidad medidos estén dentro de los siguientes rangos: pH 5.55-6.66; conductividad 0.630-0.757 mS/cm; y densidad 1.08-1.11 g/cm3. Todas las mediciones deben realizarse a 25 °C.
2. Preparación de la mezcla maestra de qPCR para gelificación
NOTA: En este paso, se prepara la mezcla maestra de qPCR para gelificación. Por lo tanto, no se agrega agua a la mezcla, sino que se agrega la mezcla de gelificación (Tabla 2).
- Descongele los reactivos en un recipiente refrigerado. Mezclar los reactivos en un tubo de 1,5 ml de acuerdo con la Tabla 2. Aquí se muestra un ejemplo de una reacción con un volumen final de 25 μL que contiene 5 μL de muestra de ADN.
NOTA: La muestra de ADN no se agrega a la mezcla en este paso; aquí se utiliza únicamente para calcular los volúmenes finales de cada reactivo de la mezcla maestra de qPCR. Las muestras de ADN deben agregarse justo antes de comenzar la ejecución (consulte el paso 4 a continuación).
3. Gelificación de los reactivos en los recipientes de reacción
- Multiplique adecuadamente los volúmenes que se muestran en la Tabla 2 para la preparación de una tira de ocho tubos o una placa de 96 pocillos.
- Pipet 18,5 μL de la mezcla maestra de gelificación que se muestra en la Tabla 2 en cada pocillo de reacción.
NOTA: Este volumen representa los volúmenes de mezcla de oligonucleótidos, tampón de PCR y mezcla de gelificación utilizados para una reacción (según la Tabla 2) y variará según la concentración de los reactivos y el volumen necesario para una reacción. El volumen final en la mezcla maestra de gelificación es diferente del volumen en una mezcla maestra regular porque no se agrega agua. - Coloque los tubos/placas en el soporte conductor del calor (por ejemplo, aluminio) dentro del horno de vacío.
NOTA: El soporte conductor de calor es opcional. El operador debe asegurarse de que la parte inferior de los tubos esté en contacto con el estante del horno de vacío para permitir un equilibrio térmico rápido. - Coloque una bolsa de arcilla de bentonita por cada dos platos de 96 pocillos.
NOTA: Las bolsas de arcilla de bentonita se utilizan para absorber el agua eliminada de la mezcla maestra de gelificación por la presión diferencial ejercida por el vacío. Se encontró que las bolsas de arcilla de bentonita eran innecesarias para menos de dos placas de 96 pocillos. - Someter los tubos/placa que contiene la mezcla maestra de gelificación a tres ciclos de vacío (30 ± 5 mBar) de 30 min cada uno, alternando con liberación de vacío hasta alcanzar la presión atmosférica (900-930 mBar), a temperatura controlada (30 °C ± 1 °C) (Figura 2).
NOTA: El instrumento utiliza software para controlar los parámetros, y un ejemplo del ciclo se muestra en la Figura 2. El usuario debe crear el perfil para la ejecución, indicando los parámetros elegidos. - Cuando se complete el ciclo, verifique que los tubos/placas estén bien gelificados de los reactivos, asegurándose de que el volumen se reduzca visiblemente (Figura 3) y de que los líquidos no se muevan al golpear los tubos/placas con los dedos.
NOTA: Si no se produce gelificación, la solución salpicaría las paredes del tubo cuando se golpean los tubos (Figura 3). - Sellar y conservar los tubos/placas a 2-8 °C durante 8-12 h antes de su uso.
4. Uso de una qPCR gelificada
- Retire la tira de tubo o la placa del refrigerador y ábrala en una estación de trabajo para la manipulación de muestras. Añadir 15 μL de agua libre de nucleasas a cada recipiente de reacción.
NOTA: Se considera que el volumen de reactivos gelificados es de aproximadamente 5 μL. Por lo tanto, junto con el volumen de la muestra de ADN (ver más abajo), el volumen de reacción final es de 25 μL. - Añadir 5 μL de muestra de ADN.
NOTA: Se puede utilizar cualquier plantilla de ADN con calidad de qPCR. En el presente trabajo, el ADN se extrajo de 10 epimastigotesde 8T. cruzi (cepa Dm28c) y se diluyó en serie en una proporción de 1:10 utilizando tampón TE. - Selle los tubos/placas y diríjase al equipo de su elección. Ejecute el experimento y proceda al análisis regular de datos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tres de los reactivos que forman la mezcla de gelificación se solubilizan fácilmente en vórtices vigorosos. Sin embargo, el glucógeno requiere un vórtice cuidadoso para garantizar que el polvo haya sido completamente solubilizado. Desafortunadamente, el vórtice vigoroso produce muchas burbujas, lo que dificulta determinar el volumen real de la solución (Figura 1A-B). Por lo tanto, es esencial dejar reposar la solución de glucógeno en el refrigerador hasta que la mayor parte de la solución atrapada dentro de las burbujas se haya movido hacia el cuerpo principal de la solución. Teniendo en cuenta los protocolos de producción y la rutina de laboratorio, las placas gelificadas se mantienen en el refrigerador durante la noche (o alrededor de 8-12 h), lo que resulta en el asentamiento de la mayoría de las burbujas, lo que facilita determinar el volumen correcto y ajustarse al volumen final deseado (Figura 1C). Nótese la diferencia en el volumen de burbujas entre los tubos de glucógeno en las Figuras 1B-C, respectivamente, justo después de la solubilización y después de la sedimentación nocturna.
Una vez que la mezcla de gelificación se agrega a la mezcla maestra de qPCR en sustitución del agua (Tabla 2), las tiras o placas de tubo están listas para ir al horno de vacío. Los estantes del horno de vacío contienen un elemento calefactor Peltier, lo que garantiza que los tubos que estén en contacto con él permanezcan a la misma temperatura. En el protocolo actual, la temperatura dentro de la cámara se mantiene constante a 30 °C, mientras que la presión varía entre 910-930 mBar (presión atmosférica) y 30 mBar (casi vacío). La Figura 2 muestra estas dos variables trazadas a lo largo del tiempo, mostrando la temperatura constante (línea verde, panel superior) y la variación de la presión (línea roja, panel inferior). Una vez finalizados los ciclos, la mezcla maestra dentro del pozo disminuye de volumen y se gelifica en el fondo, es decir, sin moverse ni salpicar cuando los tubos se golpean con los dedos (Figura 3). Los tubos ahora se pueden tapar y almacenar a 2-8 ° C. Las reacciones no se gelificarán si la mezcla de gelificación (Tabla 1) se prepara incorrectamente; el paso de control de calidad propuesto debe ver la falla antes de mezclar la mezcla de gelificación con reactivos de qPCR.
Para ser utilizados, los reactivos gelificados dentro de los tubos/placas deben resuspenderse en agua libre de nucleasas y la muestra de ADN diluida generalmente en agua o tampón TE. La resuspensión de los reactivos de la mezcla sol-gel se logra durante el primer paso de desnaturalización del protocolo térmico de qPCR (normalmente, 5-10 min a 95 °C), por lo que no se requiere ningún paso adicional. La Figura 4A muestra trazas representativas de la detección por qPCR del ADN de T. cruzi utilizando secuencias de oligonucleótidos publicadas15. Los resultados subóptimos incluyen pérdida de sensibilidad, que puede probarse con una curva de dilución de una solución con una concentración conocida de objetivos genómicos y pérdida de especificidad, que puede probarse con un panel de organismos tripanosomatidos relacionados. La figura 4B muestra la pérdida de sensibilidad que puede surgir cuando el proceso de gelificación no se ejecuta correctamente o cuando la reacción pierde su estabilidad después de haber sido almacenada a 2-8 °C durante más de 6 meses.
Figura 1: La solubilización del glucógeno produce muchas burbujas. Debido a que el glucógeno produce demasiadas burbujas durante la solubilización, la solución de glucógeno debe mantenerse en reposo antes de ajustarse al volumen final. (A) Burbujas formadas durante el vórtice. (B) Todo el polvo fue solubilizado, pero no es posible determinar el volumen final debido al exceso de burbujas. (C) Después de 12 h en el refrigerador (tubo en el medio), se reduce el volumen de burbujas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ciclo de vacío (panel inferior) y control de temperatura (panel superior). Se muestran trazas representativas de variación de temperatura (panel superior) y presión (panel inferior). Las líneas negras representan las variaciones programadas, mientras que las líneas verde y roja representan lecturas reales del instrumento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Aspectos de la mezcla maestra gelificada dentro de una tira de ocho tubos . (A) Mezclas maestras de qPCR antes de la exposición al vacío. (B) Salpicaduras de líquido en las paredes del tubo debido a una gelificación incompleta (solo un ciclo de vacío). (C) Reactivos qPCR gelificados con una clara reducción visible del volumen. El líquido no salpica las paredes cuando se golpean los tubos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Trazas representativas de mezclas maestras gelificadas que detectan ADN de epimastigotes de T. cruzi. El ADN extraído de epimastigotes de T. cruzi (108 células) se diluyó en serie en una proporción de 1:10, y las concentraciones de ADN que oscilaban entre 104 y 100 células se sometieron a detección mediante una qPCR gelificada. (A) El resultado esperado de la qPCR correctamente gelificada (B) Detección de las mismas muestras utilizando una placa donde la gelificación no se ejecutó correctamente, lo que resulta en pérdida de sensibilidad. Tenga en cuenta que las concentraciones más bajas se detectan con menos frecuencia en el panel B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Concentración de existencias | Volumen |
| Melecitosa | 400 mg/ml | 3 ml |
| Treahlose | 400 mg/ml | 6 ml |
| Lisina | 0,75 mg/ml | 3 ml |
| Glucógeno | 200 mg/ml | 3 ml |
| Agua libre de nucleasas | NA | c.s.p. 20 mL |
Tabla 1: Concentraciones madre y volúmenes de soluciones utilizadas para producir 20 ml de la mezcla de gelificación. El volumen de cada solución madre debe ajustarse proporcionalmente para producir volúmenes finales más bajos o más altos de la mezcla de gelificación.
| Reactivo de mezcla de reacción | Mastermix regular | Mezcla maestra de gelificación |
| Oligomix (25X) | 1 μL | 1 μL |
| Tampón de PCR (2X) | 12,5 μL | 12,5 μL |
| Mezcla de gelificación* | - | 5 μL |
| Agua libre de nucleasas | 6,5 μL | - |
| Muestra de ADN* | 5 μL | 5 μL |
| *máximo del 20% del volumen de reacción final | ||
Tabla 2: Volúmenes de reactivos para producir mezclas maestras de qPCR para reacciones regulares o gelificadas. La diferencia entre las dos mezclas maestras es que se agrega agua a la mezcla maestra regular, mientras que la mezcla de gelificación se agrega (es decir, en lugar de agua) a la mezcla maestra de gelificación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los últimos años han puesto de relieve la necesidad de encontrar tecnologías más sensibles y específicas para ayudar a diagnosticar enfermedades tropicales y desatendidas. Aunque son importantes para el control epidemiológico, las pruebas parasitológicas (microscopía óptica) y serológicas tienen limitaciones, especialmente con respecto a la sensibilidad y la aplicabilidad en el punto de atención. Las técnicas de amplificación de ADN como la PCR, la amplificación isotérmica y las variaciones respectivas se han utilizado durante mucho tiempo en entornos de laboratorio, pero los obstáculos tecnológicos impiden que se use en entornos de campo. Uno de los principales obstáculos es la necesidad de temperaturas de -20 °C para el transporte y almacenamiento de los reactivos. Para remediar esta situación, se han utilizado técnicas como la liofilización y la gelificación para almacenar las reacciones de PCR fuera del congelador16,18,19.
El presente trabajo muestra todos los pasos necesarios para gelificar una reacción de qPCR para detectar ADN de T. cruzi dentro del recipiente de reacción, ya sean tubos, tiras de tubos, chips microfluídicos o placas. Los estudios preliminares que utilizan una reacción RT-LAMP sugieren que la técnica de gelificación también se puede utilizar para preservar y proteger otras enzimas de amplificación y modificación de ácidos nucleicos, como lo describen Rosado et al. 19. Aunque relativamente sencillos, los dos pasos que causan la mayoría de los errores del operador en las rutinas de qPCR son (a) la preparación de soluciones de glucógeno y melezitosa y (b) el cálculo del volumen de la mezcla de reacción que se agregará a cada tubo de reacción antes del paso de vacío. Primero, la solución de glucógeno debe refrigerarse durante la noche antes del ajuste final del volumen, y la solución de melezitosa debe ser vigorosamente vortice (posiblemente con un calentamiento suave a 50 ° C) para una solubilización completa. En segundo lugar, el investigador que planifica el experimento debe ser consciente de que los volúmenes de los reactivos calculados antes del vacío pueden ser desiguales, ya que no se agrega agua para redondear al volumen de reacción. El volumen de reacción real se obtendrá cuando la reacción gelificada se resolubilice mediante la adición de muestra y agua, antes de ejecutar la PCR.
La mayor limitación del método es la estabilidad de las reacciones, que es de alrededor de 6-8 meses a 2-8 °C14,15; Es considerablemente más corto que las reacciones liofilizadas, que pueden permanecer estables durante los años18. Dependiendo de la especificidad de las secuencias de oligonucleótidos, puede ocurrir una unión y amplificación inespecíficas, que deben ser examinadas cuidadosamente por los investigadores. Por ejemplo, Costa y colaboradores relatan que la temperatura de recocido de la qPCR gelificada para la detección de C. cayetanensis tuvo que ser ajustada en +1 °C para evitar amplificaciones inespecíficas15,21. Del mismo modo, los investigadores deben evitar el uso de enzimas que podrían estar reguladas o utilizar los componentes de gelificación como sustratos.
La técnica de gelificación es particularmente útil debido a su facilidad de uso en la rutina de laboratorio, así como una introducción en una línea de producción16,19,22 que permite un control de calidad suave; Este último, a su vez, permite datos robustos y comparables entre múltiples operadores y elimina efectivamente los errores comunes del operador en pasos cruciales, con la ventaja de eliminar los requisitos de temperatura de congelación durante el transporte y el almacenamiento. Estudios preliminares sugieren que la eliminación de la cadena de frío resultaría en una reducción general del costo de hasta un 20% para una prueba qPCR14. La eliminación de la cadena de frío también viabiliza la implementación de la qPCR como prueba confirmatoria para enfermedades desatendidas como la enfermedad de Chagas en regiones subdesarrolladas, favoreciendo así su control epidemiológico23.
Finalmente, el protocolo de gelificación agiliza el uso de pruebas qPCR ya que solo requiere que el usuario agregue agua y el ADN de T. cruzi extraído, evitando errores durante el manejo del reactivo y disminuyendo el tiempo de configuración, así como la posibilidad de contaminación del reactivo. Tales características proporcionan eficiencia para un laboratorio de diagnóstico de rutina, acelerando la entrega de resultados a los pacientes y aumentando la confiabilidad del diagnóstico. Por último, debido a que dispensa la necesidad de una cadena de frío de -20 °C, es adecuado para el diagnóstico en entornos de bajos recursos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores desean expresar su agradecimiento a Aline Burda Farias por la asistencia técnica con el horno de vacío, así como a la administración del Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brasil) por permitir el acceso a dicho equipo. Este trabajo fue financiado parcialmente por la subvención CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas' disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al.
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A.
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G.
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
