Summary
Qui, proponiamo un protocollo sistematizzato, accessibile e riproducibile per rilevare le specie reattive dell'ossigeno cellulare (ROS) utilizzando la sonda di diacetato 2′,7′-diclorofluoresceina (DCFH-DA) nelle cellule gliali di Müller (MMC). Questo metodo quantifica i livelli totali di ROS cellulare con un citometro a flusso. Questo protocollo è molto facile da usare, adatto e riproducibile.
Abstract
L'equilibrio redox ha un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi cellulare. L'aumento della generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) promuove la modificazione di proteine, lipidi e DNA, che alla fine può portare ad alterazione della funzione cellulare e alla morte cellulare. Pertanto, è utile per le cellule aumentare la loro difesa antiossidante in risposta a insulti dannosi, attivando un percorso antiossidante come Keap1 / Nrf2 o migliorando gli spazzini redox (vitamine A, C ed E, β-carotene e polifenoli, tra gli altri). L'infiammazione e lo stress ossidativo sono coinvolti nella patogenesi e nella progressione delle retinopatie, come la retinopatia diabetica (DR) e la retinopatia della prematurità (ROP). Poiché le cellule gliali di Müller (MMC) svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi del tessuto retinico neurale, sono considerate un modello ideale per studiare questi meccanismi di protezione cellulare. In questo senso, quantificare i livelli di ROS con un metodo riproducibile e semplice è essenziale per valutare il contributo di percorsi o molecole che partecipano al meccanismo di difesa cellulare antiossidante. In questo articolo, forniamo una descrizione completa delle procedure necessarie per la misurazione di ROS con sonda DCFH-DA e citometria a flusso in MMC. I passaggi chiave per l'elaborazione dei dati di citometria a flusso con il software sono forniti qui, in modo che i lettori saranno in grado di misurare i livelli di ROS (mezzi geometrici di FITC) e analizzare gli istogrammi di fluorescenza. Questi strumenti sono molto utili per valutare non solo l'aumento dei ROS dopo un insulto cellulare, ma anche per studiare l'effetto antiossidante di alcune molecole che possono fornire un effetto protettivo sulle cellule.
Introduction
La retina neurale è un tessuto molto organizzato che presenta strati neuronali ben definiti. In questi, i neuroni (cellule gangliari, amacrine, bipolari, orizzontali e fotorecettori) sono interconnessi tra loro e anche con cellule gliali di Müller (MMC) e astrociti, portando a un'adeguata fototrasduzione ed elaborazione delle informazioni visive 1,2. Le MGC sono note per avere un ruolo importante nel mantenimento dell'omeostasi retinica perché attraversano l'intera sezione retinica e, quindi, possono interagire con tutti i tipi di cellule che modulano molteplici processi protettivi. È stato riportato che le MGC hanno diverse funzioni importanti per il mantenimento e la sopravvivenza dei neuroni retinici, tra cui la glicolisi per fornire energia ai neuroni, la rimozione dei rifiuti neuronali, il riciclaggio dei neurotrasmettitori e il rilascio di fattori neurotrofici, tra gli altri 3,4,5.
D'altra parte, l'infiammazione, lo stress ossidativo e nitrosativo sono coinvolti nella patogenesi e nella progressione di molte malattie umane, comprese le retinopatie 6,7,8,9,10,11. L'equilibrio redox nelle cellule dipende da una stretta regolazione dei livelli di ROS. I ROS sono costantemente generati in condizioni fisiologiche come risultato della respirazione aerobica principalmente. I principali membri della famiglia ROS includono radicali liberi reattivi come l'anione superossido (O2͘͘͘͘•−), radicali idrossilici (•OH), vari perossidi (ROOR′), idroperossidi (ROOH) e il perossido di idrogeno senza radicali (H2O2)12,13. Negli ultimi anni, è diventato evidente che i ROS svolgono un importante ruolo di segnalazione nelle cellule controllando i processi essenziali. Le MGC hanno una forte difesa antiossidante mediante l'attivazione del fattore nucleare trascrizionale eritroide-2-correlato al fattore 2 (Nrf2) e la successiva espressione di proteine antiossidanti per eliminare l'eccessiva produzione di ROS in condizioni patologiche 14,15,16. Quando le cellule perdono il loro equilibrio redox a causa di una produzione esagerata di ROS o di una capacità difettosa di rimuovere ROS, l'accumulo di stress ossidativo promuove modifiche dannose in proteine, lipidi e DNA, portando a stress cellulare o morte. L'aumento del sistema di difesa antiossidante retinico migliora la risoluzione e la prevenzione delle retinopatie, come ROP e RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Pertanto, la misurazione della produzione ros in tempo reale è uno strumento potente e utile.
Esistono diversi metodi per misurare la produzione di ROS o lo stress ossidativo nelle cellule. Tra queste, la sonda 2′,7′-diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA) è una delle tecniche più utilizzate per quantificare direttamente lo stato redox di una cellula 25,26,27,28. Questa sonda è lipofila e non fluorescente. La diffusione di questa sonda attraverso la membrana cellulare consente la sua scissione da parte delle esterasi intracellulari ai due legami estere, producendo un prodotto relativamente polare e impermeabile alla membrana cellulare, la 2′,7′-diclorofluoresceina (H2DCF). Questa molecola non fluorescente si accumula intracellulare e la successiva ossidazione da parte di ROS produce il prodotto altamente fluorescente DCF. L'ossidazione della sonda è il prodotto dell'azione di più tipi di ROS (perossinitrito, radicali idrossilici, ossido nitrico o perossidi), che possono essere rilevati mediante citometria a flusso o microscopia confocale (emissione a 530 nm ed eccitazione a 485 nm). Il limite di questa tecnica è che il superossido e il perossido di idrogeno non reagiscono fortemente con H2DCF25,29. In questo articolo, utilizziamo la sonda DCFH-DA per misurare e quantificare i ROS mediante citometria a flusso. Per questo motivo, induciamo la produzione di ROS stimolando mgC con induttore ROS, A o B, prima di caricare le cellule con la sonda fluorescente. Inoltre, utilizziamo un composto antiossidante. Infine, mostriamo dati rappresentativi e affidabili ottenuti utilizzando questo protocollo.
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Protocol
NOTA: per le composizioni tampone vedere tabella 1.
1. Preparazione della coltura cellulare
NOTA: Qui è descritta la preparazione della coltura delle cellule MIO-M1, una linea cellulare gliale umana Müller spontaneamente immortalata (Moorfield's/Institute of Ophthalmology- Müller 1). Utilizzare sempre una tecnica asettica adeguata e lavorare in una cappa a flusso laminare.
- Prepara il mezzo completo dell'Eagle (DMEM) modificato di Dulbecco. Per DMEM contenente 4,5 g/L di D-glucosio e 110 mg/L di piruvato di sodio, aggiungere il 10% di FBS inattivato dal calore, 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES), 2 mM di L-glutammina e 50 U/mL di penicillina/streptomicina. Preparare il mezzo fresco, il giorno in cui le cellule MIO-M1 saranno scongelate.
- Scongelare le cellule MIO-M1 congelate il giorno 1.
- Per fare ciò, rimuovere la crioviale contenente 5 x 105 cellule MIO-M1 in FBS con il 10% di DMSO dallo stoccaggio di azoto liquido e posizionarla immediatamente in un bagno d'acqua a 37 °C.
NOTA: Indossare sempre una mascherina o occhiali di sicurezza, poiché i crioceroli conservati in azoto liquido presentano un rischio di esplosione quando vengono scongelati. - Scongelare rapidamente le cellule MIO-M1 (in meno di 1 minuto) riscaldando il flaconcino nel bagno d'acqua a 37 °C fino a quando non rimane solo un po' di ghiaccio nel flaconcino.
- Pulire l'esterno del flaconcino con etanolo al 70% e trasferirlo in una cappa a flusso laminare.
- Trasferire le cellule scongelate dal flaconcino a un tubo sterile da 15 mL e quindi aggiungere 6 mL di mezzo DMEM completo preriscaldato a goccia.
- Centrifugare la sospensione cellulare a circa 600 x g per 5 min. Dopo la centrifugazione, verranno visualizzati un surnatante trasparente e un pellet completo. Scartare il surnatante con una pipetta senza disturbare il pellet cellulare.
- Dissociare delicatamente il pellet e risospese le celle in 10 ml di mezzo DMEM completo. Trasferire questa sospensione cellulare in una piastra di coltura tissutale di 100 mm di diametro e incubare la piastra per circa 2 giorni a 37 °C, 5% CO2.
- Per fare ciò, rimuovere la crioviale contenente 5 x 105 cellule MIO-M1 in FBS con il 10% di DMSO dallo stoccaggio di azoto liquido e posizionarla immediatamente in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Quando le cellule MIO-M1 diventano confluenti all'80%-90% il giorno 4, eseguire i seguenti passaggi.
- Trasferire la piastra in una cappa a flusso laminare dall'incubatore. Rimuovere con cura il surnatante e lavare 2x con 5 ml di PBS sterile e preriscaldato. Aspirare il PBS.
- Erogare 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,5% e incubare a 37 °C nell'incubatore a CO2 per 3-5 minuti per staccare le cellule.
- Aggiungere 7 mL del mezzo DMEM completo per inibire l'azione della tripsina. Disaggregare mgC tripsinificate raggruppate lentamente tubando su e giù (P1000). Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml.
- Centrifuga a 600 x g per 5 min. Scartare il surnatante. Risospenare delicatamente il pellet cellulare in 2 ml di supporto DMEM completo. Trasferire 1 mL di questa sospensione cellulare in una piastra da 100 mm contenente 9 mL di mezzo DMEM completo preriscaldato.
- Ripeti l'azione con un'altra piastra da 100 mm. Incubare la piastra per circa 1 giorno a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5%.
- Quando entrambe le piastre diventano confluenti all'80% -90% (il giorno 6), trasferire la piastra in una cappa a flusso laminare. Seguire il passaggio 1.3. per ottenere un pellet cellulare.
- Dissociare delicatamente il pellet e risospese le celle in 5 mL di mezzo DMEM completo. Contare le cellule MIO-M1 utilizzando un emocitometro (camera neubauer) e una soluzione blu di tripano seguendo i passaggi seguenti.
- Posizionare il coperchio di vetro sulla zona centrale della camera Neubauer. Posizionare la camera su una superficie piana (ad esempio, un tavolo o un banco da lavoro).
- Mescolare un volume uguale di tripano blu macchia con le cellule. Ad esempio, mescolare 60 μL di tripano blu con 60 μL di cellule per una diluizione 1:2.
- Da questa miscela, caricare 10 μL con una micropipetta in una camera Neubauer.
- Posizionare la camera Neubauer caricata sul palco del microscopio. Quindi, accendi la luce e regola la luminosità.
- Spostare lo stadio del microscopio in una posizione ottimale e regolare la messa a fuoco fino a ottenere un'immagine nitida delle cellule.
- Contare le celle all'interno dei quattro quadrati (suddivisi in 16) situati all'angolo dell'emocitometro (volume: 0,1 mm3 ciascuno).
- Calcola la concentrazione cellulare usando le equazioni seguenti.
Concentrazione = (Numero di cellule x 10.000)/Numero di quadrati
Concentrazione = (Numero di cellule x 10.000)/4
Concentrazione = Numero di cellule x 2500
NOTA: Se viene eseguita la diluizione cellulare, la concentrazione ottenuta deve essere convertita nella concentrazione originale prima della diluizione.
Concentrazione = (Numero di cellule x 2500 x 2) = (Numero di cellule x 5000 cellule/mL) - Regolare la sospensione cellulare a 1 x 105 celle/mL in mezzo DMEM completo e piastra 2 mL di questa sospensione cellulare in una piastra a 6 pozzetti (2 x 105 celle/pozzetto). Agitare delicatamente il piatto per distribuire le cellule in modo omogeneo. Incubare la piastra a 6 pozzetti durante la notte a 37 °C in un incubatore a CO2 al 5%.
2. Condizioni e controlli del saggio
- Includere i seguenti controlli sperimentali per ogni esperimento:
- Controllo dell'autofluorescenza (cellule senza sonda DCFH-DA, controllo per l'impostazione dei parametri del citometro a flusso).
- Controllo basale (cellule non stimolate).
- Controllo positivo (cellule trattate con un induttore ROS, A o B).
- Controllo negativo (cellule trattate con composti antiossidanti)
- Campione (cellule trattate con composto antiossidante e induttore ROS, A o B).
3. Esecuzione del test
NOTA: Il test viene eseguito il giorno 7. Utilizzare sempre la tecnica asettica appropriata e lavorare in una cappa a flusso laminare se non diversamente indicato.
- Preparare dmEM sierico basso. Supplemento DMEM contenente 4,5 g / L D-glucosio e 110 mg / L piruvato di sodio con FBS inattivato dal calore allo 0,5%, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutammina e 50 U / mL penicillina / streptomicina. Preparare il mezzo fresco il giorno in cui verrà trattato il MIO-M1.
- Trasferire la piastra a 6 pozzetti (confluenza 60%-70%) in una cappa a flusso laminare dall'incubatore. Aspirare il surnatante e lavare le cellule 1x con PBS. Aggiungere 2 ml di DMEM sierico basso per pozzetto e incubare la piastra a 6 pozzetti per 2 ore a 37 °C, 5% CO2. Questo è fatto per affamare le cellule.
- Dopo la fame di siero, trattare le cellule con il composto antiossidante per 6 ore.
- Aspirare il surnatante e aggiungere 2 ml di brodo diluito alle seguenti condizioni: controllo negativo (cellule trattate con composto antiossidante) e campione (cellule trattate con composto antiossidante e induttore ROS, A o B).
- Incubare la piastra a 6 pozzetti per 6 ore a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: Se si utilizza un altro composto antiossidante o inibitore ROS, standardizzare il tempo e la concentrazione ottimali per gli stimoli.
- Dopo 6 ore di incubazione, trattare le cellule con induttore ROS, A o B, per 30 minuti.
- Aggiungere gli stimoli alle seguenti condizioni: controllo positivo (cellule trattate con un induttore ROS, A o B) e pozzetti campione (cellule trattate con composto antiossidante e induttore ROS, A o B).
NOTA: Mantenere le soluzioni stock su ghiaccio. - Incubare la piastra a 6 pozzetti per 30 minuti a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: Se si utilizza un altro induttore ROS, standardizzare correttamente il tempo e la concentrazione ottimali per gli stimoli.
- Aggiungere gli stimoli alle seguenti condizioni: controllo positivo (cellule trattate con un induttore ROS, A o B) e pozzetti campione (cellule trattate con composto antiossidante e induttore ROS, A o B).
- Caricare le celle con la sonda DCFH-DA.
- Aspirare il surnatante e lavare le cellule nella piastra a 6 pozzetti 3x con PBS per rimuovere tutti gli stimoli.
- Spegni la luce della cappa a flusso laminare e lavora al buio. Preparare una diluizione di 1:1000 della soluzione madre della sonda DCFH-DA da 5 mM per ottenere una concentrazione finale di 5 μM DCFH-DA in DMEM senza rosso fenolo in un tubo da 15 mL.
- Mescolare delicatamente usando un vortice e aggiungere 1 mL di questa soluzione ai seguenti pozzetti: controllo basale (cellule non stimolate), controllo positivo (cellule trattate con un induttore ROS), controllo negativo (cellule trattate con composto antiossidante) e pozzetti campione (cellule trattate con composto antiossidante e induttore ROS, A o B).
- Aggiungere 1 mL di DMEM senza rosso fenolo alle cellule di controllo dell'autofluorescenza.
- Incubare la piastra a 6 pozzetti per 30 minuti a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: la sonda è sensibile alla luce. Scartare tutta la soluzione di sonda inutilizzata.
4. Preparazione cellulare per citometria a flusso
- Dopo 6 ore, tenere la piastra sul ghiaccio. Da questo passaggio in poi, non è necessario utilizzare una tecnica asettica adeguata e lavorare in una cappa a flusso laminare.
- Lavare le celle 3 volte con 2 ml di PBS freddo per pozzetto. Aggiungere 0,5 ml di tampone di distacco a freddo a ciascun pozzetto. Raccogliere le cellule tubando delicatamente su e giù usando una pipetta P1000.
- Raccoglierli in tubi da 1,5 mL etichettati e centrifugare a 600 x g per 5 minuti a 4 °C.
NOTA: durante la raccolta delle cellule, evitare la formazione di bolle impostando la pipetta P1000 su 0,4 ml. Da questo passo in poi, lavora velocemente. - Al termine della centrifugazione, mettere tubi da 1,5 ml etichettati con le cellule sul ghiaccio. Scartare il surnatante con attenzione e dissociare delicatamente il pellet cellulare con la maschiatura.
- Aggiungere 1 mL di tampone FACS a ciascun tubo da 1,5 mL etichettato per lavare le celle. Se necessario, utilizzare un vortice alla sua intensità più bassa per la completa dissociazione del pellet cellulare. Centrifugarli a 600 x g per 5 min a 4 °C. Ripeti questi passaggi 2 volte di più. (Eseguire tre lavaggi in totale).
- Al termine dell'ultimo lavaggio, etichettare 5 mL di tubi di polistirene a fondo tondo (provette citometriche a flusso) per tutte le condizioni sperimentali (vedere punto 2).
- Al termine della centrifugazione, risospescere i pellet di cella in 200 μL di tampone FACS. Dissociare delicatamente il pellet in ogni tubo da 1,5 ml utilizzando un vortice. Trasferire su tubi a fondo tondo da 5 mL etichettati. Tenere i tubi sul ghiaccio fino a quando non vengono analizzati sul citometro a flusso.
5. Acquisizione dati in un citometro a flusso
- Utilizzando il software di citometria a flusso, creare un nuovo esperimento. Per fare ciò, nella barra dei menu vai su Esperimento e fai clic su Nuovo esperimento (Ctrl + E).
- Inoltre, nella barra dei menu, vai a Visualizza e fai clic sulle seguenti opzioni: Barra degli strumenti, Barra di stato, Browser, Citometro, Inspector, Foglio di lavoro, Dashboard di acquisizione ed Editor biesponenziale per visualizzare queste finestre nell'area di lavoro.
- A sinistra del software, fai clic sul Specimen_001 . Si aprirà un elenco di tubi (Tube_001, Tube_002, ecc.). Per etichettare i tubi per i controlli e le diverse condizioni sperimentali, fare doppio clic su Tube_001, Tube_002, ecc. E rinominarli (vedere il passaggio 2).
- Selezionare i canali/parametri da analizzare (FSC, SSC, FITC e APC o qualsiasi altro fluorocromo per vedere il quadrante) nella prima provetta dalle impostazioni del citometro dell'esperimento.
- Fare clic sull'icona Puntatore tubo corrente per selezionare il tubo e l'icona diventerà verde. Posizionare il tubo "controllo autofluorescenza" sul braccio dell'aspiratore, spostando attentamente la base solo a sinistra.
- Per eseguire l'esempio "controllo autofluorescenza", accedere alla finestra Dashboard di acquisizione e fare clic su Acquisisci dati. Aprire un dot plot per FSC (sull'asse x) rispetto a SSC (sull'asse y).
- Regolare rapidamente la tensione di dispersione in avanti e laterale per assicurarsi che gli eventi vengano visualizzati sul grafico. Nella finestra Dashboard acquisizione fare clic su Interrompi acquisizione. In questo esperimento sono state utilizzate le seguenti impostazioni di tensione: FSC - 200 V, SSC - 423 V.
- Per impostare la tensione FITC, eseguire il "controllo positivo (cellule trattate con un induttore ROS, A o B)". Regolare la tensione in modo che tutti gli eventi appaiano su un istogramma di FITC. In questo caso, utilizzare una tensione di 280 V. Nella finestra Dashboard acquisizione, fare clic su Interrompi acquisizione.
- Posizionare nuovamente il tubo "controllo autofluorescenza" sul braccio dell'aspiratore. Nella finestra Dashboard di acquisizione, fare clic su Acquisisci dati, quindi su Registra dati e selezionare le condizioni di arresto desiderate (ad esempio, 50.000 eventi). Disegna un cancello attorno alle celle di interesse, escludendo cellule morte e detriti.
NOTA: Questi sono osservati come eventi molto più piccoli rispetto alla popolazione cellulare principale e appaiono in basso a sinistra della trama. - Al termine dell'acquisizione, rimuovere il tubo dal braccio dell'aspiratore. L'attrezzatura si laverà da sola. Nella finestra Dashboard di acquisizione, fare clic su Tubo successivo ed eseguire il controllo Basal (celle non stimolate). Fare clic su Acquisisci dati e quindi su Registra dati.
- Dal gate iniziale (gate che esclude le cellule morte e i detriti), creare un altro dot plot di FITC (sull'asse x) rispetto ad APC (sull'asse y). Disegnate un cancello quadrante e regolate le coordinate per visualizzare gli eventi nel quadrante in basso a sinistra del grafico FITC rispetto a APC.
- Per registrare i campioni successivi, rimuovere il tubo e fare clic su Tubo successivo > Acquisisci dati > Registra dati.
NOTA: Il citometro a flusso qui utilizzato (vedi Tabella dei materiali) registra un massimo di 1 x 106 eventi per tubo. - Al termine della registrazione di tutti i tubi, esportare i dati sul disco D. A tale scopo, fare clic su File > Esporta > file FCS > seleziona la versione 3.0 o 3.1.
NOTA: Sebbene l'acquisizione dei dati utilizzando un software (vedere Tabella dei materiali) sia descritta in dettaglio in questo protocollo, è possibile utilizzare qualsiasi altro software di citometria a flusso. I parametri di acquisizione (FSC, SSC e FITC) possono essere impostati allo stesso modo per ottenere i risultati.
6. Analisi dei dati acquisiti
- Aprire il software e aggiungere i campioni utilizzando il pulsante di azione Aggiungi campioni ; si trova sulla barra delle applicazioni o nella banda di navigazione.
- Fare clic su Aggiungi campioni.
- Utilizzando il browser dei file, passare alla cartella Sperimentale.
- Selezionare la cartella Sperimentale e fare clic su Scegli.
NOTA: i file di esempio vengono caricati come parte del gruppo "Tutti gli esempi" nell'area di lavoro.
- Fare doppio clic sul primo esempio nell'area di lavoro: Controllo autofluorescenza.
NOTA: questa azione apre una finestra Grafico che traccia gli eventi lungo i parametri di dispersione in avanti (FSC-A sull'asse x) rispetto allo scatter laterale (SSC-A sull'asse y). - Disegna un cancello poligonale per isolare le celle di interesse, escludendo cellule morte e detriti.
- Fate clic sullo strumento Porta poligonale ( Polygon Gate ).
- Fate clic all'interno del plottaggio per creare il cancello poligonale. Crea tutti i lati necessari.
- Fate doppio clic sull'ultimo punto per chiudere il poligono e creare il cancello desiderato.
- Specificare un nome per il gate, ad esempio "Celle MIO-M1", e premere OK.
NOTA: viene visualizzata una nuova finestra di grafico che visualizza solo gli eventi MIO-M1 senza celle morte e detriti. - Ripetere con tutti i campioni da analizzare.
- Modificare la trama in un istogramma. A tale scopo, fate clic sull'etichetta del parametro dell'asse X e selezionate FITC-A. Fate clic sull'etichetta del parametro dell'asse Y e selezionate Istogramma (Histogram). Questo cambia la trama in un istogramma unidimensionale.
- Aggiungere statistiche utilizzando la finestra Aggiungi statistica.
- Sotto il grafico dell'istogramma, fai clic su Aggiungi statistiche. Il programma aprirà una nuova finestra statistica.
- A sinistra della nuova finestra selezionare le statistiche Media geometrica.
- Selezionare le celle Popolazione MIO-M 1.
- Dall'elenco dei parametri disponibili, selezionare FIT-C.
- Fare clic sul pulsante Aggiungi per applicarli all'analisi.
NOTA: in questo modo vengono create le nuove statistiche "media geometrica: FITC" nell'albero di gating di esempio e i relativi valori vengono visualizzati nell'area di lavoro.
- Inserisci questi valori medi geometrici in un programma di statistica e analizzali.
- Fare clic sull'icona L per aprire l'Editor layout; questa icona si trova nella scheda Menu nell'area di lavoro. Posizionate la finestra area di lavoro e l'Editor layout affiancati.
NOTA: l'Editor layout è una finestra di lavoro separata con strumenti per la visualizzazione di più grafici e statistiche in un semplice report grafico. Questo può essere esportato con il file di estensione che preferisci, come PDF o JPG, tra gli altri.- Dall'albero di gating di un esempio nella finestra Area di lavoro, trascinare la popolazione di celle MIO-M 1 nell'Editor layout.
- Assicurarsi che nell'Editor layout venga visualizzato un grafico dell'istogramma contenente gli eventi nel gate. Ulteriori informazioni di base saranno dettagliate in una casella di testo qui sotto.
- Trascina tutti i campioni per confrontarli nello stesso grafico. Il programma si sovrapporrà a loro.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico dell'istogramma e selezionare Proprietà. Il programma aprirà una nuova finestra Definizione grafico. Questa finestra ha quattro schede (Annota, Font, Legenda e Specifica). Fate clic sulla scheda Specifica (Specify ) e modificate l'asse y da Auto a Modal. Fare clic su Applica.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'esempio e modificare Colorazione, Stile linea, Spessore linea, ecc. Per personalizzare il grafico.
- Per esportare l'immagine, fare clic sulla scheda File e, subito dopo, selezionare Salva immagine nella banda documento. Scegli il tipo di file immagine preferito (ad esempio, PDF).
NOTA: viene visualizzata una finestra di dialogo salva in cui viene richiesto di selezionare un percorso di salvataggio. Fai clic su Salva.
- Salvare l'analisi come file dell'area di lavoro (con estensione wsp).
- Nell'angolo in alto a sinistra, fai clic sull'icona Analisi citometria e seleziona Salva con nome.
- Scegliere Salva come area di lavoro (WSP) per salvare il documento con dati e analisi.
- Immettere un nome per il file dell'area di lavoro.
- Fai clic su Salva.
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Representative Results
Come descritto nella sezione protocollo, abbiamo mostrato dati rappresentativi e quantitativi che dimostrano la rilevazione della citometria a flusso della produzione di ROS con la sonda di fluorescenza DCFH-DA da cellule MIO-M1 stimolate con induttore ROS, A o B. Come previsto, abbiamo osservato cambiamenti nella fluorescenza FITC in cellule non stimolate al di sopra dei livelli di autofluorescenza (Figura 1A, confronta "controllo basale" vs "controllo autofluorescenza", grafico a punti). Ciò si è verificato a causa di una produzione basale di ROS nelle cellule MIO-M1. (Figura 1B, confronta "controllo basale" vs." "controllo autofluorescenza", grafico a istogramma).
È interessante notare che un aumento significativo della fluorescenza FITC è stato osservato quando le cellule sono state stimolate con induttore ROS, A o B (Figura 1B, confronta i campioni "induttore ROS A" vs campioni "controllo basale" e "induttore ROS B" vs "controllo basale", grafico istogramma). Inoltre, quando le cellule sono state trattate con il composto antiossidante prima dell'induttore ROS, A o B, il livello di fluorescenza è diminuito vicino ai livelli basali (Figura 1B, confronta "induttore ROS A" vs. "pretrattamento con composto antiossidante 6 h + induttore ROS A 30 min" e "induttore ROS B" vs. "pretrattamento con composto antiossidante 6 h + induttore ROS B 30 min", rispettivamente, grafico dell'istogramma). Da notare, non sono state osservate differenze nel segnale di fluorescenza nelle cellule trattate con composto antiossidante (6 h) rispetto al controllo basale. (Figura 1B, confronta "6h composto antiossidante" vs. "controllo basale").
Questi risultati sono stati chiaramente evidenti anche quando i dati sono stati presentati come la media geometrica del FITC (Figura 1C). Come si può vedere nel grafico, sono indicati i valori medi e il corrispondente errore standard della media (SEM).
Un vantaggio chiave di questo protocollo è la sua applicazione per seguire i cambiamenti in ROS nel tempo. A questo proposito, siamo stati in grado di osservare un aumento significativo e dipendente dal tempo dei ROS quando abbiamo trattato le cellule MIO-M1 con induttore ROS C per 2 h, 4 h e 6 h (Figura 2).
Per l'ottimizzazione di questo protocollo, abbiamo tentato tre diverse strategie per raccogliere le cellule (0,5% di tripsina-EDTA, soluzione di distacco cellulare accutase e tampone di distacco) con risultati comparabili (dati non mostrati).
Figura 1: Misurazione di ROS in risposta all'induttore ROS, A o B, utilizzando la sonda DCFH-DA in celle MIO-M1: (A) Confronto tra condizioni di "controllo basale" e "controllo di autofluorescenza", dot plot rappresentativo FL1 (519 nm) vs FL2 (660 nm). (B) Istogrammi rappresentativi per la fluorescenza indotta dalla sonda DCFH-DA dopo stimolazione di cellule MIO-M1 con induttore ROS, A o B, per 30 minuti, o pretrattati con composto antiossidante per 6 ore e 30 minuti di induttore ROS A, B o veicolo. (C) Media geometrica della fluorescenza FITC per tutti gli stimoli nelle cellule MIO-M1. I dati sono presentati come ± SEM e analizzati da ANOVA unidirezionale seguito dal post-test di Dunnett; **p < 0,01, ***p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Misurazione del ros straordinario in risposta al trattamento con induttore ROS C utilizzando la sonda DCFH-DA nelle cellule MIO-M1: cellule MIO-M1 trattate con induttore ROS C per 2 ore, 4 ore e 6 ore e caricate con sonda DCFH-DA per determinare i livelli di ROS. Istogramma rappresentativo per l'intensità di fluorescenza indotta dalla sonda DCFH-DA dopo stimolazione di cellule MIO-M1 con induttore ROS C per 2 h, 4 h e 6 h. Media geometrica della fluorescenza FITC per gli stimoli sopra descritti. I dati sono presentati come ± SEM e analizzati da ANOVA unidirezionale seguito dal post-test di Dunnett; ns, non significativo, **p < 0,01, ***p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione | Condizioni di conservazione | Nota | |||||
| Idrossido di sodio (NaOH) 10 m, 1 L | 400 g di pellet NaOH | acqua distillata a 1 L | RT | "ATTENZIONE": La preparazione di una soluzione concentrata di NaOH provoca una reazione esotermica. È necessario prestare estrema attenzione per evitare ustioni chimiche e rotture dei bicchieri di vetro. Se possibile, utilizzare pesanti bicchieri di plastica. | |||
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 10 x, 1 L | 80 g di NaCl | acqua distillata a 1 L | RT | Regolare il pH a 7,4 e filtrare la soluzione. | |||
| 2 g KCl | |||||||
| 11,5 g Na2HPO4· 7H2O | |||||||
| 2 g KH2PO4 | |||||||
| Acido tetraacetico etilendiammina (EDTA), 0,5 M pH 8,0, 1 L | 186,1 g Na2EDTA· 2H2O | acqua distillata a 1 L | RT | Il sale disodico di EDTA non è solubile in acqua neutra o soluzione fino a quando il pH della soluzione non viene regolato a circa 8,0 con l'aggiunta di NaOH. Regolare il pH a 8,0 e sterilizzare la soluzione. | |||
| 10% p/v Sodio Azide (NaN3), 100 mL | 10 g di NaN3 | acqua distillata a 100 ml | RT | ||||
| Tampone di stacco, 100 mL | 180 mg di glucosio | PBS da 1X a 100 ml | 4 °C | ||||
| 0,6 mL 0,5 M pH 8,0 EDTA | |||||||
| Tampone di colorazione per citometria a flusso (tampone FACS), 100 mL | 2 ml di siero bovino fetale (FBS) | PBS da 1X a 100 ml | 4 °C | NaN3 viene aggiunto come conservante. | |||
| 1 mL 0,5 M pH 8,0 EDTA | |||||||
| 1 mL 10% p/v di azide di sodio | |||||||
| 5 mM 2′,7′-DCFH-DA, 1 mL | 2,4 mg di DCFH-DA | dimetil solfossido a 1 mL | -20 °C protetto dalla luce | Miscelare delicatamente e aliquota 20 μL in tubi da 1,5 mL. Evitare cicli multipli di disgelo/congelamento. La nostra raccomandazione è di scartare tutte le soluzioni di sonda inutilizzate dal giorno sperimentale. | |||
| 0,4% p/v tripano blu 10 X, 50 mL | 0,2 g di tripano blu | PBS da 1X a 50 mL | 4 °C | ||||
Tabella 1: Ricette tampone
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Discussion
Diverse condizioni patologiche, come il cancro, le malattie infiammatorie, l'ischemia / riperfusione, la cardiopatia ischemica, il diabete e le retinopatie, e anche situazioni fisiologiche come l'invecchiamento, portano alla sovrapproduzione di ROS 6,7,8,9,10,11. Pertanto, il rilevamento, la misurazione e la comprensione del percorso coinvolto nella modulazione dei ROS sono obiettivi importanti per molte malattie. L'uso di sonde per misurare i livelli di ROS, come DCFH-DA, è accessibile, ampiamente descritto e accettato nella letteratura scientifica 26,27,28. In questo articolo, descriviamo un protocollo dettagliato e riproducibile per misurare e quantificare i livelli di ROS mediante citometria a flusso nelle MGC.
Un vantaggio dell'uso di questo metodo è che, una volta che la sonda DCFH-DA viene ossidata da ROS e genera un prodotto DCF fluorescente; questo può essere misurato in un lettore di piastre, microscopio confocale o citometro a flusso. Lo svantaggio del lettore di piastre è che misura la fluorescenza totale. Di conseguenza, il lettore di piastre non distingue la fluorescenza intracellulare da quella extracellulare generata da reazioni chimiche nel terreno di coltura. La microscopia confocale è uno strumento utile perché le cellule possono essere caricate con sonda DCFH-DA e visualizzate in tempo reale in camere di coltura a 37°C. La morfologia e la posizione dei ROS nella cellula possono essere rilevate con questa metodologia, ma i livelli di ROS mancano di una misurazione quantitativa. La forza della citometria a flusso risiede nella sua capacità di misurare la fluorescenza intracellulare nelle cellule vive. I dati quantitativi sul numero di cellule che emettono fluorescenza, così come i mezzi geometrici di fluorescenza, possono essere ottenuti25.
È importante tenere conto di ciò che viene effettivamente misurato quando si utilizza la sonda DCFH-DA. Come accennato in precedenza, DCFH-DA misura più specie ros e quindi la fluorescenza risultante dalla sonda verde non può essere utilizzata per discriminare tra i tipi di specie ROS29. A questo proposito, è noto che diverse sonde possono discernere il tipo di ROS. Ad esempio, la sonda di diidroetidio (DHE) viene ossidata dal superossido per produrre il prodotto fluorescente 2-idrossietidio (eccitazione a 518 nm ed emissione a 605 nm), ma questo prodotto non può essere distinto senza l'uso di tecniche più dispendiose in termini di tempo, come HPLC30,31. Un'altra sonda è un indicatore di superossido mitocondriale (vedi Tabella dei materiali), che è una nuova sonda fluorogenica per il rilevamento altamente selettivo di superossido nei mitocondri delle cellule viventi31,32. Tuttavia, ai fini della misurazione dei livelli totali di ROS e degli aumenti dei ROS dopo un insulto o la valutazione della capacità antiossidante di diversi prodotti, l'uso della sonda DCFH-DA insieme ai controlli appropriati è conveniente e accettabile 25,28,29.
Una questione molto importante è la selezione e l'uso di adeguati controlli sperimentali: controllo dell'autofluorescenza (cellule senza sonda DCFH-DA), controllo basale (cellule non stimolate), controllo positivo (cellule trattate con un induttore ROS), controllo negativo (cellule trattate con composto antiossidante) e problema del campione (cellule trattate con composto antiossidante e induttore ROS). Un consiglio utile è quello di utilizzare il mezzo senza rosso fenolo per ridurre le interferenze con le sonde fluorescenti.
Raccomandiamo inoltre di caricare le celle con la sonda DCFH-DA 30 minuti prima di terminare il trattamento sperimentale. La standardizzazione della concentrazione di DCFH-DA, nel nostro caso 5 μM, è conveniente e potrebbe differire a seconda del tipo di cellula e dello stato di attivazione cellulare. Il nostro consiglio è quello di impostare le concentrazioni della sonda, a partire da 5μM e 10 μM, e verificare l'efficacia della colorazione negli esperimenti.
In sintesi, l'analisi dell'equilibrio redox in salute o malattia è fondamentale per stabilire metodi affidabili per misurare la risposta allo stress ossidativo. Pertanto, questo protocollo è uno strumento semplice, veloce e potente per quantificare i livelli di ROS nelle MGC vive mediante citometria a flusso.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano María Pilar Crespo e Paula Alejandra Abadie del CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) per l'assistenza nella citometria a flusso e Gabriela Furlan e Noelia Maldonado per l'assistenza alle colture cellulari. Ringraziamo anche Victor Diaz (Pro-Segretario della Comunicazione Istituzionale di FCQ) per la produzione e il montaggio video.
Questo articolo è stato finanziato da sovvenzioni di Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) e Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (all to M.C.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
| BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
| BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
| Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
| Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
| Cryovial | CRYO.S - Greiner Bio-One | 126263 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
| Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
| DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
| Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
| FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
| Glucose | Merck | 108337 | |
| hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
| Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
| L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
| Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon - Corning | BD-352008 | |
| Sodium Azide | Merck | 822335 | |
| Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
| Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
| SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
| Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
| Trypan Blue | Merck | 111732 | |
| Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
| Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |
References
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