Her foreslår vi en systematisert, tilgjengelig og reproduserbar protokoll for å oppdage cellulære reaktive oksygenarter (ROS) ved hjelp av 2′,7′-diklorfluorescein diacetat sonde (DCFH-DA) i Müller glialceller (MGCs). Denne metoden kvantifiserer totale cellulære ROS-nivåer med et strømningscytometer. Denne protokollen er veldig enkel å bruke, egnet og reproduserbar.
Redoksbalansen har en viktig rolle i å opprettholde cellulær homeostase. Den økte generasjonen reaktive oksygenarter (ROS) fremmer modifikasjon av proteiner, lipider og DNA, noe som til slutt kan føre til endring i cellulær funksjon og celledød. Derfor er det gunstig for celler å øke sitt antioksidantforsvar som svar på skadelige fornærmelser, enten ved å aktivere en antioksidantvei som Keap1 / Nrf2 eller ved å forbedre redoks scavengers (vitamin A, C og E, β-karoten og polyfenoler, blant andre). Betennelse og oksidativt stress er involvert i patogenese og progresjon av retinopatier, som diabetisk retinopati (DR) og retinopati av prematuritet (ROP). Siden Müller glialceller (MGCer) spiller en nøkkelrolle i homeostase av nevralt netthinnevev, anses de som en ideell modell for å studere disse cellulære beskyttelsesmekanismene. I denne forstand er kvantifisering av ROS-nivåer med en reproduserbar og enkel metode viktig for å vurdere bidraget av veier eller molekyler som deltar i antioksidantcelleforsvarsmekanismen. I denne artikkelen gir vi en fullstendig beskrivelse av prosedyrene som kreves for måling av ROS med DCFH-DA-sonde og strømningscytometri i MGCer. Viktige trinn for strømningscytometridatabehandling med programvaren er gitt her, slik at leserne vil kunne måle ROS-nivåer (geometriske midler til FITC) og analysere fluorescens histogrammer. Disse verktøyene er svært nyttige for å evaluere ikke bare økningen i ROS etter en cellulær fornærmelse, men også for å studere antioksidanteffekten av visse molekyler som kan gi en beskyttende effekt på cellene.
Den nevrale netthinnen er et veldig organisert vev som presenterer veldefinerte nevronale lag. I disse er nevroner (ganglion, amacrine, bipolare, horisontale og fotoreseptorceller) koblet sammen med hverandre og også med Müller glialceller (MGCer) og astrocytter, noe som fører til tilstrekkelig fototransduksjon og behandling av visuell informasjon 1,2. MGCer er kjent for å ha en viktig rolle i vedlikehold av retinal homeostase fordi de krysser hele netthinnedelen, og dermed kan de samhandle med alle celletyper som modulerer flere beskyttende prosesser. Det har blitt rapportert at MGCer har flere viktige funksjoner for vedlikehold og overlevelse av retinal nevroner, inkludert glykolyse for å gi energi til nevroner, fjerning av nevronalt avfall, resirkulering av nevrotransmittere og frigjøring av nevrotrofiske faktorer, blant annet 3,4,5.
På den annen side er betennelse, oksidativt og nitrosativt stress involvert i patogenese og progresjon av mange menneskelige sykdommer, inkludert retinopatier 6,7,8,9,10,11. Redoksbalansen i celler avhenger av stram regulering av ROS-nivåer. ROS genereres stadig under fysiologiske forhold som følge av aerob åndedrett hovedsakelig. De viktigste medlemmene av ROS-familien inkluderer reaktive frie radikaler som superoksid-anionen (O2͘͘͘͘•−), hydroksylradikaler (•OH), ulike peroksider (ROOR′), hydroperoksider (ROOH) og ingen radikal hydrogenperoksid (H2O2)12,13. De siste årene har det blitt tydelig at ROS spiller en viktig signalrolle i cellene ved å kontrollere viktige prosesser. MGC har et sterkt antioksidantforsvar ved aktivering av transkripsjonell kjernefysisk faktor erythroid-2-relatert faktor 2 (Nrf2) og det påfølgende uttrykket av antioksidantproteiner for å eliminere overdreven produksjon av ROS under patologiske forhold 14,15,16. Når cellene mister sin redoksbalanse på grunn av en overdrevet produksjon av ROS eller en defekt evne til å fjerne ROS, fremmer opphopning av oksidativt stress skadelige modifikasjoner i proteiner, lipider og DNA, noe som fører til cellulær stress eller død. Økningen av retinal antioksidantforsvaret forbedrer oppløsningen og forebyggingen av retinopatier, som ROP og RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Derfor er måling av ROS-produksjon i sanntid et kraftig og nyttig verktøy.
Det finnes flere metoder for måling av ROS-produksjon eller oksidativt stress i celler. Blant disse er 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) sonde en av de mest brukte teknikkene for direkte kvantifisering av redokstilstanden til en celle 25,26,27,28. Denne sonden er lipofil og ikke-fluorescerende. Diffusjon av denne sonden over cellemembranen tillater spalting av intracellulære esteraser ved de to esterbindingene, og produserer et relativt polart og cellemembran-ugjennomtrengelig produkt, 2′,7′-dichlorofluorescein (H2DCF). Dette ikke-fluorescerende molekylet akkumuleres intracellulært, og etterfølgende oksidasjon av ROS gir det svært fluorescerende produktet DCF. Oksidasjonen av sonden er produktet av virkningen av flere typer ROS (peroksynitritt, hydroksylradikaler, nitrogenoksid eller peroksider), som kan påvises ved strømningscytometri eller konfokal mikroskopi (utslipp ved 530 nm og eksitasjon ved 485 nm). Begrensningen av denne teknikken er at superoksid og hydrogenperoksid ikke reagerer sterkt med H2DCF25,29. I denne artikkelen bruker vi DCFH-DA-sonde for å måle og kvantifisere ROS ved strømningscytometri. Av den grunn induserer vi ROS-produksjon ved å stimulere MGCer med ROS-induser, A eller B, før vi laster cellene med fluorescerende sonde. I tillegg bruker vi en antioksidantforbindelse. Til slutt viser vi representative og pålitelige data innhentet ved hjelp av denne protokollen.
Flere patologiske tilstander, som kreft, inflammatoriske sykdommer, iskemi/reperfusjon, iskemisk hjertesykdom, diabetes og retinopatier, og også fysiologiske situasjoner som aldring, fører til ROS-overproduksjon 6,7,8,9,10,11. Derfor er deteksjon, måling og forståelse av banen som er involvert i modulering av ROS viktige …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke María Pilar Crespo og Paula Alejandra Abadie fra CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) for hjelp i flytcytometri og Gabriela Furlan og Noelia Maldonado for hjelp til cellekultur. Vi takker også Victor Diaz (pro-sekretær for institusjonell kommunikasjon av FCQ) for videoproduksjon og redigering.
Denne artikkelen ble finansiert av tilskudd fra Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) og Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alle til M.C.S.).
2′,7′-DCFH-DA | Sigma | 35845-1G | |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco by life technologies | 15630-080 | |
BD FACSCanto II flow cytometer | BD Biosciences | FACSCanto | |
BD FACSDiva software | BD Biosciences | ||
Cell Culture Dishes 100×20 mm | Cell Star- Greiner Bio-One | 664 160 | |
Centrifuge | Thermo | Sorvall legend micro 17 R | |
Centrifuge Tubes (15 ml) | BIOFIL | CFT011150 | |
Centrifuge Tubes (50 ml) | BIOFIL | CFT011500 | |
Cryovial | CRYO.S – Greiner Bio-One | 126263 | |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | W387520-1KG | |
Disodium-hydrogen-phosphate heptahydrate | Merck | 106575 | |
DMEM without phenol red | Gibco by life technologies | 31053-028 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 11995065 | |
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA), Disodium Salt, Dihydrate | Merck | 324503 | |
Fetal Bovine Serum | Internegocios | ||
FlowJo v10 Software | BD Biosciences | ||
Glucose | Merck | 108337 | |
hemocytometer, Neubauer chamber | BOECO,Germany | ||
Laminar flow hood | ESCO | AC2-6E8 | |
L-glutamine (GlutaMAX) | Gibco by life technologies | A12860-01 | |
MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco by life technologies | 15140-122 | |
Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
Potassium-dihydrogen phosphate | Merck | 4878 | |
Round polystyrene tubes 5 ml (flow cytometry tubes) | Falcon – Corning | BD-352008 | |
Sodium Azide | Merck | 822335 | |
Sodium Chloride | Merck | 106404 | |
Sodium Hydroxide | Merck | 106462 | |
SPINWIN Micro Centrifuge Tube 1.5 ml | Tarson | 500010-N | |
Tissue Culture Plate 6 well | BIOFIL | TCP011006 | |
Trypan Blue | Merck | 111732 | |
Trypsin-EDTA 0.5% 10X | Gibco by life technologies | 15400-054 | |
Vortex Mixer | Labnet International, Inc. |