Quantitative Mikrotubuli-Fraktionierungstechnik zur Trennung von stabilen Mikrotubuli, labilen Mikrotubuli und freiem Tubulin in Mausgewebe

Ayaka Hagita-Tatsumoto; Tomohiro Miyasaka

doi:10.3791/63358

Methodenartikel

Quantitative Mikrotubuli-Fraktionierungstechnik zur Trennung von stabilen Mikrotubuli, labilen Mikrotubuli und freiem Tubulin in Mausgewebe

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DOI:

10.3791/63358

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17. November 2023

Ayaka Hagita-Tatsumoto¹^,² , Tomohiro Miyasaka¹^,²^,³

¹Department of Neuropathology, Faculty of Life and Medical Sciences, Doshisha University, ²Center for Research in Neurodegenerative Diseases, Doshisha University, ³Laboratory of Physiology and Anatomy, School of Pharmacy, Nihon University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mikrotubuli, bei denen es sich um Tubulin-Polymere handelt, spielen eine entscheidende Rolle als Bestandteil des Zytoskeletts in eukaryotischen Zellen und sind für ihre dynamische Instabilität bekannt. In dieser Studie wurde eine Methode zur Fraktionierung von Mikrotubuli entwickelt, um sie in stabile Mikrotubuli, labile Mikrotubuli und freies Tubulin zu trennen, um die Stabilität von Mikrotubuli in verschiedenen Mausgeweben zu bewerten.

Zusammenfassung

Mikrotubuli, die aus α/β-Tubulin-Dimeren bestehen, sind ein entscheidender Bestandteil des Zytoskeletts in eukaryotischen Zellen. Diese röhrenförmigen Polymere weisen eine dynamische Instabilität auf, da Tubulin-Heterodimer-Untereinheiten einer repetitiven Polymerisation und Depolymerisation unterzogen werden. Die präzise Kontrolle der Stabilität und Dynamik der Mikrotubuli, die durch posttranslationale Tubulinmodifikationen und Mikrotubuli-assoziierte Proteine erreicht wird, ist für verschiedene zelluläre Funktionen unerlässlich. Funktionsstörungen in Mikrotubuli sind stark an der Pathogenese beteiligt, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen. Die laufende Forschung konzentriert sich auf auf Mikrotubuli-gerichtete Therapeutika, die die Stabilität modulieren und potenzielle Behandlungsoptionen für diese Krankheiten und Krebsarten bieten. Daher ist das Verständnis des dynamischen Zustands von Mikrotubuli entscheidend für die Beurteilung des Krankheitsverlaufs und der therapeutischen Effekte.

Traditionell wurde die Dynamik von Mikrotubuli in vitro oder in kultivierten Zellen durch grobe Fraktionierung oder Immunoassay untersucht, wobei Antikörper verwendet wurden, die auf posttranslationale Modifikationen von Tubulin abzielen. Die genaue Analyse des Tubulinstatus in Geweben mit solchen Verfahren stellt jedoch eine Herausforderung dar. In dieser Studie haben wir eine einfache und innovative Methode zur Fraktionierung von Mikrotubuli entwickelt, um stabile Mikrotubuli, labile Mikrotubuli und freies Tubulin in Mausgeweben zu trennen.

Das Verfahren beinhaltete die Homogenisierung von präpariertem Mausgewebe in einem Mikrotubuli-stabilisierenden Puffer in einem Volumenverhältnis von 19:1. Die Homogenate wurden dann durch einen zweistufigen Ultrazentrifugationsprozess nach anfänglicher langsamer Zentrifugation (2.400 × g) fraktioniert, um Ablagerungen zu entfernen. Der erste Ultrazentrifugationsschritt (100.000 × g) fiel stabile Mikrotubuli aus, während der resultierende Überstand einem zweiten Ultrazentrifugationsschritt (500.000 × g) unterzogen wurde, um labile Mikrotubuli und lösliche Tubulindimere zu fraktionieren. Mit dieser Methode wurden die Anteile von Tubulin, die stabile oder labile Mikrotubuli im Mäusegehirn bilden, bestimmt. Darüber hinaus wurden deutliche Gewebevariationen in der Mikrotubuli-Stabilität beobachtet, die mit der proliferativen Kapazität der konstituierenden Zellen korrelierten. Diese Ergebnisse unterstreichen das signifikante Potenzial dieser neuartigen Methode zur Analyse der Mikrotubuli-Stabilität unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.

Einleitung

Mikrotubuli (MTs) sind längliche röhrenförmige Strukturen, die aus Protofilamenten bestehen, die aus α/β-Tubulin-Heterodimer-Untereinheiten bestehen. Sie spielen eine wesentliche Rolle bei verschiedenen zellulären Prozessen wie Zellteilung, Motilität, Formerhaltung und intrazellulärem Transport und sind damit integrale Bestandteile des eukaryotischen Zytoskeletts¹. Das Minus-Ende von MTs, bei dem die α-Tubulin-Untereinheit exponiert ist, ist relativ stabil, während das Plus-Ende, bei dem die β-Tubulin-Untereinheit exponiert ist, eine dynamische Depolymerisation und Polymerisation erfährt². Dieser kontinuierliche Zyklus d....