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Quantification du transport du fer à travers le placenta de la souris in vivo à l’aide d’isotopes de fer non radioactifs

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63378
Automatic Translation
1, 1
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Cet article montre comment préparer et administrer du fer isotopique non radioactif lié à la transferrine pour des études sur le transport du fer chez la souris gravide. L’approche de quantification du fer isotopique dans les compartiments fœtoplacentaires est également décrite.

Abstract

Le fer est essentiel pour la santé maternelle et fœtale pendant la grossesse, avec environ 1 g de fer nécessaire chez les humains pour maintenir une grossesse en santé. La dotation en fer fœtal dépend entièrement du transfert de fer à travers le placenta, et les perturbations de ce transfert peuvent entraîner des issues défavorables de la grossesse. Chez la souris, la mesure des flux de fer à travers le placenta reposait traditionnellement sur des isotopes de fer radioactifs, une approche très sensible mais lourde. Les isotopes stables du fer (57Fe et 58Fe) offrent une alternative non radioactive pour les études sur la grossesse humaine.

Dans des conditions physiologiques, le fer lié à la transferrine est la forme prédominante de fer absorbée par le placenta. Ainsi, la 58Fe-transferrine a été préparée et injectée par voie intraveineuse chez des mères gravides afin d’évaluer directement le transport du fer placentaire et de contourner l’absorption intestinale du fer maternel en tant que variable confondante. Le fer isotopique a été quantifié dans le placenta et les tissus embryonnaires de souris par spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS). Ces méthodes peuvent également être utilisées dans d’autres systèmes de physiologie ou de maladie de modèles animaux pour quantifier la dynamique du fer in vivo .

Introduction

Le fer est essentiel à divers processus métaboliques, notamment la croissance et le développement, la production d’énergie et le transport de l’oxygène1. Le maintien de l’homéostasie du fer est un processus dynamique et coordonné. Le fer est absorbé par les aliments dans le duodénum et transporté dans tout le corps dans la circulation liée à la protéine de transport du fer transferrine (Tf). Il est utilisé par chaque cellule pour les processus enzymatiques, incorporé dans l’hémoglobine dans les érythrocytes naissants et recyclé à partir d’érythrocytes âgés par les macrophages. Le fer est stocké dans le foie lorsqu’il est en excès et perdu du corps par hémorragie ou desquamation cellulaire. La quantité de fer en circulation est le résultat de l’équilibre entre la consommation et l’apport de fer, ce dernier étant étroitement régulé par l’hormone hépatique hepcidine (HAMP), le régulateur central de l’homéostasie du fer1. L’hepcidine a pour fonction de limiter la biodisponibilité du fer dans le sang en occlusant ou en induisant une ubiquitination et en dégradant la ferroportine exportatrice de fer (FPN)2. La réduction de la NPF fonctionnelle entraîne une diminution de l’absorption alimentaire du fer, une séquestration du fer dans le foie et une diminution du recyclage du fer des macrophages1.

L’hepcidine est régulée par le statut en fer, l’inflammation, la pulsion érythropoïétique et la grossesse (revue dans 3). Étant donné que l’homéostasie du fer est très dynamique, il est important de comprendre et de mesurer le pool total de fer et la distribution et le renouvellement du fer. Les études animales reposaient traditionnellement sur des isotopes de fer radioactifs, une approche très sensible mais lourde pour mesurer la dynamique du fer. Cependant, dans des études plus récentes, y compris l’étude présentée ici4, des isotopes de fer stables non radioactifs (58Fe) sont utilisés pour mesurer le transport du fer pendant la grossesse 5,6,7,8,9. Les isotopes stables sont des outils précieux pour étudier le métabolisme des nutriments (examiné dans 10). L’utilisation d’isotopes stables du fer dans les études humaines a démontré que i) l’absorption du fer augmente vers la fin de la gestation5,6, ii) le transfert de fer alimentaire au fœtus dépend du statut en fer de la mère7, iii) le fer hémique ingéré par la mère est plus facilement incorporé par le fœtus que le fer non hémique 8, et iv) le transfert de fer au fœtus est négativement corrélé avec les taux d’hepcidine maternelle 8, 9. Ces expériences ont mesuré les isotopes du fer dans les sérums ou leur incorporation dans les globules rouges; cependant, la mesure du fer incorporé dans les globules rouges peut à elle seule sous-estimer l’absorption réelledu fer 9. Dans la présente étude, le fer hémique et non hémique est mesuré dans les tissus.

Pendant la grossesse, le fer est nécessaire pour soutenir l’expansion du volume de globules rouges maternels et pour le transfert à travers le placenta pour soutenir la croissance et le développement du fœtus11. La dotation en fer fœtal dépend entièrement du transport du fer à travers le placenta. Au cours de la grossesse chez l’homme 12 et le rongeur 4,13, les taux d’hepcidine diminuent considérablement, augmentant la disponibilité plasmatique du fer pour le transfert au fœtus.

Les principes fondamentaux du transport placentaire du fer ont été initialement caractérisés dans les années 1950-70 à l’aide de traceurs radioactifs (59Fe et 55Fe). Ces études ont déterminé que le transport du fer à travers le placenta est unidirectionnel 14,15 et que la transferrine diferrique est une source majeure de fer pour le placenta et le fœtus 16,17. La compréhension actuelle du transport du fer placentaire est plus complète, bien que certains transporteurs de fer clés et mécanismes de régulation restent inconnus. Les modèles murins ont été essentiels pour comprendre la régulation et le transportdu fer 18 parce que les principaux transporteurs et mécanismes sont remarquablement similaires. Les placentas humains et murins sont hémochorials, c’est-à-dire que le sang maternel est en contact direct avec le chorion fœtal19. Cependant, il existe des différences structurelles notables.

Le syncytiotrophoblaste est la couche cellulaire placentaire qui sépare la circulation maternelle et fœtale et transporte activement le fer et d’autres nutriments20. Chez l’homme, le syncytiotrophoblaste est une seule couche de cellules fusionnées. En revanche, le placenta de souris est constitué de deux couches syncytiotrophoblastiques21, Syn-I et Syn-II. Cependant, des jonctions lacunaires à l’interface de Syn-I et Syn-II permettent la diffusion des nutriments entre les couches22,23. Ainsi, ces couches fonctionnent comme une seule couche syncytiale similaire au syncytiotrophoblaste humain. D’autres similitudes et différences entre les placentas humains et murins sont examinées par Rossant et Cross21. Le transport placentaire du fer est déclenché par la liaison du fer-Tf du sang maternel au récepteur de la transferrine (TfR1) localisé sur la face apicale du syncytiotrophoblaste24. Cette interaction induit l’internalisation du fer-Tf/TfR1 via l’endocytose médiée par la clathrine25. Le fer est ensuite libéré de Tf dans l’endosomeacide 26, réduit en fer ferreux par une ferrireductase indéterminée, et exporté de l’endosome vers le cytoplasme par un transporteur qui reste à déterminer. Comment le fer est chaperonné dans le syncytiotrophoblaste reste également à décrire. Le fer est finalement transporté du côté fœtal par l’exportateur de fer, FPN, localisé sur la surface basale ou fœtale du syncytiotrophoblaste (examiné dans27).

Pour comprendre comment la régulation physiologique et pathologique de TfR1, FPN et hepcidine affecte le transport placentaire du fer, des isotopes stables du fer ont été utilisés pour quantifier le transport du fer de la circulation maternelle au placenta et à l’embryon in vivo4. Cet article présente les méthodes de préparation et d’administration de la transférrine de fer isotopique à des souris gravides, le traitement des tissus pour la PCI-MS et le calcul des concentrations de fer dans les tissus. L’utilisation d’isotopes stables du fer in vivo peut être adaptée pour étudier la régulation et la distribution du fer dans différents modèles animaux afin d’étudier la régulation physiologique et pathologique du fer.

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Protocol

Tous les protocoles et procédures expérimentales sur les animaux ont été approuvés par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie à Los Angeles.

1. Préparation du 58Fe-Tf

REMARQUE: Le protocole utilise 58Fe; cependant, un protocole identique peut être utilisé pour 57Fe. L’un ou l’autre isotope peut être utilisé et éliminé comme produit chimique de fer standard sans précautions supplémentaires.

  1. Dissoudre 58 Fe dans 12 N HCl à 50 μL de HCl/mg de 58Fe.
    1. Ajouter du HCl au métal dans le flacon en verre fourni par le vendeur et remplacez le bouchon lâchement. Pour dissoudre le fer, chauffer la solution 58Fe/HCl à 60 °C pendant 1 h. Si elle n’est toujours pas dissoute, laisser la solution toute la nuit à température ambiante dans la hotte pour la dissoudre.
      NOTE: La solution dissoute de 58Fe / HCl est de couleur orange jaunâtre.
      Fe3O 4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) + 4H2O
  2. Oxyder tout Fe(II)Cl2restant pour générer la solution de Fe(III)Cl3.
    1. Réchauffer la solution de 58Fe/HCl à 60 °C avec le bouchon enlevé pour faciliter l’oxydation.
    2. Ajouter 1 μL de solution à 35 %H2O2par 50 μL de solution 58Fe/HCl pour faciliter davantage l’oxydation.
      Fe(II)Cl2(aq) + O2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) +2H2O
  3. Préparer la solution de chlorure ferrique (58Fe(III)Cl3).
    1. Laisser la solution de chlorure ferrique dans la hotte à 60 °C avec le bouchon enlevé pour évaporer l’échantillon.
      NOTE: L’évaporation peut prendre entre un et plusieurs jours.
    2. Reconstituer 58 Fe(III)Cl3 à 100 mM avec du H2O ultrapur, et calculer la quantité de H2O ultrapure requise en fonction du poids initial du métal utilisé à l’étape 1.1 (poids moléculaire de 58Fe(III)Cl3 est de 162,2).
  4. Préparer le 58 Fe(III)-nitrilotriacétate (NTA) en incubant le 58Fe(III)Cl3 avec du NTA à un rapport molaire de 1:5 en présence de 20 mM de NaHCO3.
    1. Préparer 500 mM NTA dans 1 N NaOH.
    2. Préparer 5x tampon de chargement de transferrine (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl).
    3. Préparer 1 M deNaHCO3 enH2Oultrapur.
    4. Dans un tube conique de 15 mL, ajouter 150 μL de solution de 100 mM de 58 Fe(III)Cl3 (à partir de l’étape 1.3.2), 150 μL de NTA 500 mM préparé dans 1 N NaOH, 480 μL deH2Oultrapur, 200 μL de tampon de charge de transferrine 5xet 20 μL de solution de NaHCO3 1 M.
    5. Incuber le mélange pendant 5 min à température ambiante.
  5. Charger apo-Tf avec 58 Fe(III)-NTA pour former 58Fe-Tf.
    NOTE: Ce protocole a été adapté de McCarthy et Kosman28.
    1. Dissoudre 500 mg d’apo-Tf dans 4 mL de 1x tampon de chargement Tf.
    2. Dans le tube conique de 15 mL de l’étape 1.4.4 contenant 1 mL de la solution de 58Fe(III)-NTA, ajouter 4 mL de solution d’apo-Tf.
      NOTE: Il s’agit d’un rapport molaire 3: 1 de 58Fe-NTA avec apo-Tf. Chaque Tf contient 2 sites de liaison Fe; l’excédent de 58Fe-NTA a été ajouté pour s’assurer que le Tf était complètement chargé.
    3. Pour permettre une charge maximale de 58Fe-NTA sur apo-Tf, vérifier que la solution est à pH 7,5 et ajuster le pH, si nécessaire, avec NaHCO3 ou HCl.
    4. Incuber pendant 2,5 h à température ambiante.
  6. Retirer l’excès de 58Fe(III)-NTA non consolidé et le NTA libéré.
    1. Transférer la solution 58Fe-Tf dans une colonne de coupure de poids moléculaire (coupure de 30 kDa) et centrifuger à 2 500 × g pendant 15 min à température ambiante.
    2. Laver la colonne avec 10 mL de 1x tampon de chargement de transferrine et centrifuger à 2 500 × g pendant 15 min à température ambiante. Répéter le lavage et la centrifugation, effectuer un lavage au sérum physiologique avec 10 ml de solution saline et centrifuger à 2 500 × g pendant 15 minutes à température ambiante.
  7. Calculer la concentration de 58Fe-Tf.
    NOTE: En raison de l’ajout de l’excès de 58Fe à l’étape 1.5.2, supposons que toute la transferrine est diferrique. Comme 500 mg d’apo-Tf ont été utilisés, ~500 mg 58Fe-Tf ont été produits à l’étape 1.5.4.
    1. Mesurer le volume récupéré par centrifugation après le lavage au sérum physiologique à l’étape 1.6.2.
    2. Diviser 500 mg par le volume récupéré pour déterminer la concentration (en mg/mL) de la solution de 58Fe-Tf.
  8. Stériliser la solution 58Fe-Tf à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm; conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé.
    NOTE: La solution de 58Fe-Tf a été utilisée entre 1 et 4 semaines après la préparation.

2. Configurez des grossesses de souris chronométrées

  1. Utilisez des souris femelles âgées de 6 à 8 semaines. Placez les animaux sur un régime pauvre en fer (4 ppm de fer) ou un chow standard (185 ppm de fer) pendant 2 semaines avant l’accouplement et maintenez les animaux sur les régimes respectifs tout au long de la grossesse.
  2. Option 01: Confirmer la grossesse par prise de poids à E7.5.
    1. Installez plusieurs cages d’élevage. Pour chaque cage, combiner 2 femelles avec 1 mâle pendant la nuit; le jour suivant, lorsque les animaux sont séparés, est considéré comme un jour embryonnaire (E)0,5. Peser les femelles à E7.5 pour déterminer si elles sont enceintes. Accouplez à nouveau les mâles avec les femelles qui n’ont pas pris de poids.
      REMARQUE: Dans WT C57BL / 6, un gain de poids de 1 g à E7.5 est un bon indicateur de grossesse. Cette méthode garantit que l’implantation a eu lieu dans un délai spécifique de 16 heures, permettant un traitement synchrone de tous les animaux qui sont devenus gravides au cours de la même période d’accouplement.
  3. Option 02: Confirmer la grossesse par des vérifications de bouchon.
    1. Combinez 2 femelles avec 1 mâle et effectuez des vérifications quotidiennes du bouchon pour déterminer si la copulation a eu lieu.
      REMARQUE: Cette méthode peut entraîner des grossesses décalées et la présence d’un bouchon ne garantit pas la grossesse.

3. Administrer 58Fe-Tf par voie intraveineuse à des souris gravides E17.5

  1. Préparer 58Fe-Tf de l’étape 1.8 pour injection.
    1. Préparer une solution de 58Fe-Tf à 35 mg/mL dans une solution saline; injecter 100 μL par souris.
    2. Remplir une seringue à insuline avec 100 μL de la solution de 58Fe-Tf.
      REMARQUE : Chaque dose contient 3,5 mg de 58 Fe-Tf humain (5 μg de 58Fe).
  2. Anesthésier une souris enceinte à l’aide d’isoflurane.
    1. Utilisez un régulateur d’isoflurane avec une chambre.
    2. Utilisez les paramètres suivants : isoflurane à 5 %, 2 L/mL d’O2, 2 min.
    3. Confirmez que la souris est anesthésiée en recherchant l’absence de réponse à un pincement d’orteil.
    4. Appliquez du lubrifiant pour les yeux à la surface de l’œil et placez la souris sur un coussin chauffant.
  3. Injectez lentement et prudemment la solution de 58Fe-Tf dans le sinus rétro-orbitaire.
  4. Permettre à la souris de récupérer de l’anesthésie; Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment conscience pour maintenir une position couchée sternale.
  5. Six heures après l’injection, euthanasier les femelles enceintes E17.5 par surdose d’isoflurane.
    1. Effectuer une ponction cardiaque pour exsanguiner la souris comme une forme d’euthanasie secondaire.
    2. Épinglez les pieds avec des aiguilles pour la stabilisation.
  6. Recueillir les placentas et les foies d’embryons.
    1. À l’aide de forceps stériles et de ciseaux à dissection, retirez soigneusement l’utérus de la souris enceinte. Coupez une unité placentaire fœtale-placentaire, qui comprend un seul fœtus et placenta dans le sac amniotique entouré d’une partie de l’utérus.
    2. Coupez soigneusement à travers l’utérus et le sac amniotique sans déranger le fœtus et le placenta.
    3. Décollez le sac amniotique et retirez le fœtus et le placenta.
    4. Coupez le cordon ombilical.
    5. Épongez le fœtus et le placenta sur une lingette propre pour éliminer l’excès de liquide amniotique.
    6. Notez les poids de l’ensemble du placentae.
    7. Couper chaque placenta en deux avec une lame de rasoir, placer chaque moitié dans un tube de 2,0 ml et congeler dans de l’azote liquide.
      REMARQUE : Étant donné que le 58 Fe ne nécessite pas de précautions particulières de manipulation et d’élimination, la moitié du placenta peut être utilisée pour la mesure du 58Fe et l’autre moitié pour toute autre analyse, y compris la quantification de l’expression du récepteur de la transferrine (TFR1) et de la ferroportine (FPN) par transfert Western et qPCR.
    8. Pour prélever des foies d’embryons, sacrifiez l’embryon : utilisez une lame de rasoir pour décapiter rapidement l’embryon.
      REMARQUE : À E17.5, tous les embryons de l’utérus doivent être euthanasiés individuellement, même s’ils ne sont pas utilisés dans l’étude.
    9. Épinglez l’embryon pour la stabilisation, laissant l’abdomen exposé.
    10. À l’aide de ciseaux à dissection, faites une petite incision à l’endroit où le cordon ombilical était attaché, insérez une extrémité des ciseaux de dissection dans l’incision et effectuez une coupe du plan médian vers le plan coronal d’environ 1/4 de pouce. Ensuite, effectuez des coupes transversales planes pour exposer le foie fœtal.
    11. Utilisez une pince pour enlever le foie du fœtus.
    12. Enregistrer le poids du foie embryonnaire entier.
    13. Placez les foies entiers de l’embryon dans des tubes de 2 ml et congelez-les dans de l’azote liquide.
      NOTE: Alternativement, seule une partie du foie de l’embryon peut être utilisée pour la mesure de 58Fe si des analyses supplémentaires sont souhaitées. L’utilisation de tubes de 2,0 mL permet une meilleure homogénéisation des tissus que les tubes de 1,5 mL.
  7. Conservez les tissus indéfiniment à -80 °C.

4. Tissus de traitement pour l’analyse quantitative du fer par ICP-MS

  1. Traiter les placentas et les foies fœtaux pour la quantification du fer non hémique.
    1. Décongeler les moitiés placentaires et le foie fœtal entier, et peser les moitiés placentaires (voir l’étape 3.6.12 pour l’enregistrement du poids du foie du fœtus).
    2. Ajouter 400 μL de solution de précipitation protéique (0,53 N HCl, 5,3% TCA).
    3. Homogénéiser le tissu à l’aide d’un homogénéisateur électrique.
    4. Incuber les échantillons à 100 °C pendant 1 h.
    5. Refroidir les échantillons dans de l’eau à température ambiante pendant 2 min.
    6. Ouvrez les bouchons pour relâcher la pression, puis refermez les tubes.
    7. Centrifuger à 17 000 × g pendant 10 min à température ambiante pour pelleter les débris tissulaires.
    8. Transférer délicatement le surnageant dans un nouveau tube étiqueté.
    9. Envoyez des échantillons pour analyse ICP-MS.
  2. Traiter les placentas et les foies fœtaux pour la quantification de l’hème-fer.
    NOTE: Après extraction du fer non hémique à l’étape 1, le fer restant dans la pastille est principalement de l’hème.
    1. Noter le poids de chaque pastille à partir de l’étape 4.1.7.
    2. Digérer les granulés dans 10 mL de HNO3 concentré à 70 % complété par 1 mL de 30 %H2O2
      NOTE: Consulter le noyau ou le centre ICP-MS pour optimiser le volume de HNO3 pour des études spécifiques; Le volume dépendra en partie du poids de l’échantillon.
    3. Chauffer les échantillons à 200 °C pendant 15 min.
    4. Envoyez les échantillons pour analyse ICP-MS.
      REMARQUE: Si la distinction entre les sources de fer hémique et non hémique n’est pas nécessaire et que seul le fer total est mesuré, le tissu entier peut être digéré dans HNO3 comme première étape.

5. Analyse des données

NOTA: Les données de la PIC-SM ont été fournies à des concentrations de 56Fe et 58Fe en ng/mL ou en mg, ppb (tableau 1). 56 Fe est l’isotope de fer le plus abondant dans la nature, et sa mesure reflète l’accumulation de fer dans le placenta / embryon pendant toute la grossesse, tandis que la mesure 58Fe reflète le fer qui a été transféré pendant 6 heures après l’injection.

  1. Soustrayez l’abondance naturelle de 58 Fe (0,28 % du Fe total) des valeurs mesurées de 58Fe.
  2. Calculer le nonhème total 58Fe.
    1. Calculer le fer non hémique (ng) total du foie embryonnaire en multipliant d’abord la concentration en fer (ng/mL) calculée à l’étape 5.1 par le volume (mL) lors du traitement initial à l’étape 4.1.2 pour estimer le total 58Fe.
    2. Calculer la quantité de fer dans l’ensemble du placenta en prenant le poids total du placenta mesuré à l’étape 3.6.6 et en le divisant par le poids du placenta traité à l’étape 4.1.1. Multiplier cette valeur par le fer non hémique total (ng) calculé à l’étape 5.2.1 pour obtenir la teneur totale en 58Fe non hémique du placenta.
  3. Calculer l’hème total 58Fe.
    1. Calculer l’hème total 58Fe en multipliant d’abord la concentration en fer (ng/mg) calculée à l’étape 5.1 par le poids de la pastille (en mg) mesurée à l’étape 4.2.1.
    2. Ensuite, divisez le poids total du placenta mesuré à l’étape 3.5.1 par le poids de la pastille de placenta mesurée à l’étape 4.2.1. Multiplier cette valeur par le fer hémique total (ng) calculé à l’étape 5.3.1 pour obtenir la teneur totale en hème 58Fe du placenta.
  4. Additionner les valeurs calculées de nonhème et d’hème 58Fe pour déterminer la teneur totale en fer de chaque tissu.

Figure 1
Figure 1 : Résumé visuel des étapes du protocole. (A) Préparation de 58Fe-transferrin. (B) Administration in vivo de 58Fe-transferrine. C) Collecte et stockage des tissus. D) Traitement du placenta et du foie embryonnaire pour la quantification des espèces métalliques par ICP-MS. Abréviations : Fe = fer; NTA = acide nitrilotriacétique; Tf = transferrine; PPS = solution de précipitation protéique; Sup = surnageant; TCA = acide trichloracétique; ICP-MS = spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

Une étude antérieure utilisant des isotopes de fer stables pour mesurer le transport du fer a démontré que la carence en fer maternelle entraînait la régulation négative de l’exportateur de fer placenta, FPN4. FPN est le seul exportateur de fer de mammifères connu, et l’absence de FPN pendant le développement entraîne la mort embryonnaire avant E9.529. Pour déterminer si la diminution observée de l’expression de FPN se traduisait fonctionnellement par une diminution du transport placentaire du fer, le 58Fe-Tf a été injecté par voie intraveineuse à des mères gravides, et le fer dans le placenta et l’embryon a été quantifié en présence d’une carence en fer maternelle.

Pour comprendre comment le transport du fer placentaire est affecté par le statut en fer maternel, la carence en fer a été modélisée chez la souris4. Les souris C57BL/6 femelles ont été soumises à un régime pauvre en fer (4 ppm de fer) ou standard (185 ppm de fer) pendant 2 semaines avant et pendant toute la grossesse. Ce régime alimentaire entraîne une baisse du fer non hémique hépatique maternel et du fer sérique et de l’hémoglobine à E12,5, E15,5 et E18,5 par rapport aux animaux suivant un régime standard4. À E18.5, les embryons de mères déficientes en fer avaient moins de fer dans le foie et étaient hypoferrémiques et anémiques que les embryons de mères remplies de fer. Trois souris gravides ont été utilisées dans chacun des groupes riches en fer et déficients en fer, et 2-3 placentas ont été utilisés sur chaque souris gravide pour l’analyse.

Pour quantifier le transport du fer placentaire, la 58 Fe-transferrine a été préparée et injectée par voie intraveineuse chez des mères gravides et 58Fe mesurée dans le placenta et le foie du fœtus par ICP-MS, comme décrit dans le protocole et illustré à la figure 1. Avant l’envoi d’échantillons de fer non hémique pour analyse ICP-MS, les niveaux de fer non hémique total ont été quantifiés indépendamment par une méthode de ferène décrite précédemment30. Les concentrations de fer non hémique mesurées par les méthodes ferène versus ICP-MS étaient fortement corrélées de manière significative dans tous les tissus mesurés (R2 = 0,94, P < 0,0001, n = 36). Les résultats représentatifs de la quantification ICP-MS des isotopes du fer sont présentés dans le tableau 1. Le total de 58Fe a été calculé comme décrit à l’étape 5 du protocole. Les données sont présentées comme du fer total plutôt que du fer hémique ou non hémique (Figure 2A-D) car l’objectif était de quantifier le fer total transféré dans le placenta et le fer total transféré à l’embryon à partir du placenta.

En moyenne, 21% de la dose administrée de 58Fe a été récupérée dans le placenta, le foie embryonnaire et le sérum embryonnaire combinés. La mesure de 56Fe donne un aperçu du transfert de fer à long terme dans le placenta et le foie embryonnaire tout au long de la grossesse. Le 56Fe placentaire total était similaire dans les groupes déficients en fer et répléthoriques (Figure 2A), tandis que le fer total du foie embryonnaire était diminué dans le groupe déficient en fer (Figure 2B). Cela était attendu sur la base de la diminution observée de la NPF placentaire dans le groupe4 déficient en fer, ce qui entraînerait une rétention de fer dans le placenta au détriment de l’embryon. Total 58Fe donne un aperçu du transport du fer à court terme. Dans cette étude, semblable à 56Fe, le 58 Fe placentaire était similaire dans les groupes déficients en fer et -remplis (Figure 2C), et le foie embryonnaire 58Fe a diminué dans le groupe déficient en fer (Figure 2D). Ces données indiquent que pendant la grossesse déficiente en fer, la régulation négative de la NPF placentaire entraîne une diminution du transport du fer vers l’embryon, ce qui entraîne des différences cumulatives dans la teneur en fer du placenta et de l’embryon.

Il est important de tenir compte de la dose de fer administrée, car elle pourrait entraîner des changements involontaires de la concentration d’hepcidine ou de l’expression du transporteur de fer31. Il a été démontré que la carence en fer maternelle entraînait une diminution du FPN4 placentaire. Pour déterminer si l’injection de Fe-Tf affectait cette régulation, le FPN placenta a été mesuré 6 h après l’injection par transfert Western. La dose de fer de 5 μg était insuffisante pour modifier la régulation placentaire de la NPF par carence en fer maternelle (Figure 3).

En résumé, cette méthode a été utilisée pour démontrer que la régulation physiologique de la NPF placentaire pendant la carence en fer maternelle entraîne une diminution du transport du fer à travers le placenta in vivo. Les isotopes stables du fer offrent une alternative sensible et quantifiable à la radioactivité pour la mesure du transport et de la distribution du fer, permettant l’utilisation simultanée de tissus pour des analyses supplémentaires.

Figure 2
Figure 2 : Transport de 56Fe et 58Fe à travers le placenta dans les grossesses déficientes en fer ou remplies de fer. Total 56Fe dans le placenta (A) et le foie embryonnaire (B). Total 58Fe dans le placenta (C) et le foie fœtal (D). L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un test t de Student à 2 queues pour les valeurs normalement distribuées et autrement par le test de somme de rang U de Mann-Whitney (indiqué par un astérisque après la valeur P). Le nombre d’animaux est indiqué dans les axes x des diagrammes de boîtes et de moustaches. La partie supérieure du diagramme en boîte indique le 75e centile et le bas indique le 25ecentile; Les moustaches au-dessus de la case indiquent le 90e percentile, et celles sous la case indiquent le 10epercentile. La ligne continue à l’intérieur de la boîte indique la médiane et la ligne pointillée la moyenne. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un logiciel de représentation graphique scientifique et d’analyse de données. Ce chiffre a été modifié par rapport à4. Abréviation : Fe = fer. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Concentrations placentaires de TFR1 et de FPN. (A) L’expression de TFR1 et de FPN a été évaluée par transfert Western dans des placentas déficients en fer et remplis 6 h après le traitement des mères avec 58Fe-Tf. (B) L’expression protéique a été quantifiée et présentée sous forme d’expression protéique par rapport à la β-actine. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un test t de Student à 2 queues pour les valeurs normalement distribuées. Le nombre d’animaux est indiqué dans les axes x des diagrammes de boîtes et de moustaches. La partie supérieure du diagramme en boîte indique le 75e centile et le bas indique le 25ecentile; Les moustaches au-dessus de la case indiquent le 90e percentile, et celles sous la case indiquent le 10epercentile. La ligne continue à l’intérieur de la boîte indique la médiane et la ligne pointillée la moyenne. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un logiciel de représentation graphique scientifique et d’analyse de données. Ce chiffre a été modifié par rapport à4. Abréviations : TFR1 = récepteur de la transferrine; FPN = ferroportine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Échantillon 56 Fe 58 Fe Total Fe
Concentration [ng/mL ou mg, ppb] Concentration [ng/mL ou mg, ppb] Somme des isotopes [ng/mL ou mg]
Moyenne* stdev Moyenne* stdev
Fer non hémique Placenta déficient en fer 729.7 17.7 2.5 0.5 732.2
704.9 6.2 3.8 0.1 708.8
649.8 3.8 0.0 0.0 649.8
799.2 4.6 3.8 0.2 803.0
Rempli de fer 1919.1 5.3 11.0 0.2 1930.1
1610.0 26.8 11.7 0.6 1621.7
1925.5 39.0 14.0 0.3 1939.5
2551.6 16.1 8.3 0.4 2559.9
Hème Placenta déficient en fer 253.8 1.8 1.1 0.0 254.9
32.9 0.4 0.3 0.0 33.2
337.7 5.1 1.4 0.0 339.1
402.3 5.3 1.7 0.0 404.0
Rempli de fer 123.5 1.3 0.6 0.0 124.0
75.7 1.3 0.4 0.0 76.1
441.9 3.0 1.9 0.0 443.8
250.4 1.1 1.1 0.0 251.5
Fer non hémique Foie embryonnaire déficient en fer 361.6 8.3 31.9 1.0 393.5
652.4 3.4 61.7 0.3 714.1
411.9 10.7 43.1 0.8 455.0
631.1 7.5 62.8 0.2 693.9
Rempli de fer 7657.5 129.3 226.4 2.2 7883.8
3820.2 69.5 119.4 3.4 3939.6
5519.0 112.9 145.6 0.5 5664.6
4617.4 78.6 91.6 1.0 4709.0
Hème Foie embryonnaire déficient en fer 44.5 0.3 1.6 0.0 46.0
31.0 0.4 2.9 0.0 34.0
11.8 0.2 1.1 0.0 12.9
42.3 0.1 3.2 0.0 45.5
Rempli de fer 54.3 1.4 2.1 0.0 56.4
31.9 0.8 1.3 0.1 33.2
59.4 0.6 2.2 0.0 61.6
66.7 0.6 2.1 0.0 68.8

Tableau 1 : Résultats représentatifs de la quantification ICP-MS de 56 Fe et 58Fe dans les placentas et les foies d’embryons. Abréviations : ppb = parties par milliard; stdev = écart type; ICP-MS = spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif.

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Discussion

Le fer est important pour de nombreux processus biologiques, et son mouvement et sa distribution dans le corps sont très dynamiques et régulés. Les isotopes stables du fer offrent une alternative cohérente et pratique aux isotopes radioactifs pour l’évaluation de la dynamique de l’homéostasie du fer. Une étape critique du protocole consiste à garder une trace de tous les poids et volumes des tissus. Le fer est un élément et ne peut donc pas être synthétisé ni décomposé. Ainsi, si tous les poids et volumes sont soigneusement enregistrés, tout le fer dans le système peut être pris en compte par calcul. Comme décrit, cette méthode peut être utilisée pour distinguer les sources de fer hémique et non hémique. Cependant, si cette distinction entre les formes de fer n’est pas nécessaire et que seul le fer total est mesuré, le protocole peut être simplifié en traitant uniquement les tissus avec HNO3 concentré comme décrit à l’étape 4.2 du protocole. Il est important de noter que si les tissus ne sont pas perfusés avant l’analyse, en particulier les tissus hautement vasculaires tels que le placenta, la présence de sang peut entraîner une surestimation de la teneur en fer hémique des tissus.

Le fer lié à la transferrine a été sélectionné pour l’étude car il s’agit de la principale source de fer absorbée par le placenta16,17. L’élimination globale de TFR1 chez la souris a entraîné une létalité embryonnaire avant E12.5, ce qui suggère que le fer lié à la transferrine est essentiel au développement. Il est possible que d’autres espèces de fer, telles que la ferritine et le fer non lié à la transferrine (NTBI), contribuent également à la dotation en fer fœtal dans une moindre mesure. Cependant, la contribution de ces espèces de fer alternatives n’a pas été évaluée. À l’avenir, les isotopes stables pourraient être utilisés pour déterminer la contribution de différentes sources de fer au développement et à la dotation en fer embryonnaire.

Le but de l’étude était de déterminer les effets des changements dans le statut en fer maternel sur le transport placentaire du fer. Cependant, une diminution de l’hepcidine pendant la carence en fer entraîne des taux élevés de FPN entérocytaire et une amélioration du transport du fer dans la circulation1. Ainsi, chez les mères déficientes en fer, l’absorption du fer provenant de l’alimentation aurait été intrinsèquement augmentée et aurait confondu l’interprétation des résultats si le 58Fe avait été administré par voie orale. Ainsi, l’administration intraveineuse de 58Fe-Tf a été sélectionnée car elle contourne la régulation du fer au niveau de l’absorption intestinale. Une dose de 5 μg de 58Fe/souris a été choisie en fonction des concentrations sériques de fer des mères gravides E18,5 riches en fer. Chez les mères gravides C57BL/6 E18.5 de type sauvage, les concentrations sériques de fer varient de 10 à 50μM4. Une souris E18.5 gravide devrait avoir environ 2 mL de volume sanguin total32. Ainsi, la quantité totale de fer dans la circulation des mères gravides remplies de fer varie de 1,1 à 5,6 μg. Ainsi, 5 μg de 58Fe/souris équivalent aux concentrations physiologiques observées chez les animaux riches en fer.

Une limitation de la détection ICP-MS de 58 Fe est l’interférence isobare de 58Ni. Les concentrations endogènes de Ni dans le placenta de souris sont de 0,04 ± 0,02 μg/g de poids humide33. Un placenta de souris E18,5 moyen pèse 0,080 g; par conséquent, la quantité totale de Ni est d’environ 3,2 ng. L’abondance naturelle de 58 Ni est de 68%; ainsi, la quantité de 58 Ni dans le placenta de la souris est de ~2,2 ng, ce qui est environ 10 fois inférieur aux niveaux de 58Fe détectés. Chez l’embryon, les concentrations de Ni sont encore plus faibles à 0,01 ± 0,01 μg/g de poids humide33. L’embryon de souris E18.5 moyen pèse 1 g; ainsi, la quantité totale de Ni dans un embryon de souris normal est d’environ 10 ng. En supposant que tout l’embryon Ni se trouve dans le foie de l’embryon, ces niveaux sont encore 10 fois inférieurs aux concentrations de 58Fe et près de 1 000 fois inférieurs à la teneur totale en fer du foie embryonnaire. Compte tenu de la plus faible abondance de Ni dans ces tissus murins, l’interférence de 58Ni n’a pas été prise en compte dans cette étude.

Une considération supplémentaire est la limite de détection du test. La limite de détection dans cette étude était de 250 pg/mL 58Fe. Cependant, cette limite peut être modifiée pour détecter des concentrations encore plus faibles de 58Fe si la dilution des tissus est réduite à l’étape de traitement des tissus (étape du protocole 4.1.2 et figure 1D) ou par des modifications à l’installation centrale ICP-MS. Lorsque 58 Fe a été mesuré dans l’embryon entier, ses niveaux n’ont pas été détectés car la concentration de 58Fe était inférieure à la limite de détection. Cependant, 58Fe a été détecté dans le foie de l’embryon, qui est le principal organe de stockage du fer. Il est possible que l’administration d’une dose plus importante de 58 Fe aurait permis la détection de 58Fe même dans l’embryon entier. Cependant, une quantité relativement faible de 58Fe a été utilisée pour éviter la charge en fer du placenta, ce qui pourrait déclencher des mécanismes de rétroaction et modifier l’expression des transporteurs de fer. Dans ce modèle, qui utilisait des souris C57BL/6 de type sauvage, le fer du foie embryonnaire a été mesuré comme reflet du transport total du fer placentaire, car la concentration de fer dans le foie embryonnaire est proportionnelle à la concentration de fer de l’embryonentier 4. Cependant, dans les modèles murins où la distribution du fer est modifiée34, le fer du foie embryonnaire seul peut ne pas représenter avec précision le transport total du fer placentaire. Dans de tels cas, il peut être nécessaire de mesurer le fer incorporé dans l’embryon entier ou le compartiment érythrocytes. En outre, les variations dans les points temporels expérimentaux nécessiteront également une optimisation et une mesure supplémentaires du fer dans divers compartiments fœtaux. Cette approche de traçage des isotopes stables a été utilisée pour quantifier le transport du fer pendant la grossesse chez la souris. La méthodologie est facilement adaptable pour étudier le transport du fer chez des souris non gravides et d’autres modèles animaux.

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Disclosures

EN est co-fondateur scientifique d’Intrinsic LifeSciences et de Silarus Pharma et consultant pour Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics et Disc Medicine. VS ne déclare aucun conflit.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent l’utilisation de l’installation ICP-MS au sein du UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology au CNSI de l’UCLA pour leur aide à optimiser le protocole pour les mesures de 58Fe. L’étude a été soutenue par l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK) (K01DK127004, à VS) et l’Institut national de la santé infantile et du développement humain (NICHD) des NIH (R01HD096863, à EN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
58Fe-iron metal Trace Sciences International Fe-58
Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff Millipore Sigma UFC903024
Centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Centrifuge tubes, 50 mL Millipore Sigma CLS430829
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Fisher Scientific 75002432
Centrifuge, Sorvall Legend RT
Delicate task wipers Fisher Scientific 06-666
Diet: iron-deficient (4 ppm iron) Envigo Teklad TD.80396
Diet: standard chow (185 ppm iron) PicoLab 5053
Dissecting scissor with 30 mm cutting edge VWR 25870-002
Forceps 4-1/2 inch length McKesson 157-469
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Homogenizer, Bio-Gen PRO200 PROScientific 01-01200
Human apo-transferrin (apo-Tf) Celliance 4452-01 no longer available, alternative: Millipore 616419
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water Cole-Parmer EW-88216-36
Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 Fisher Scientific 14-826-79
Isoflurane VETone 502017
Isoflurane vaporizor Summit Anesthesia Solutions
Metal heat block Fisher Scientific
Micro centrifuge tube with flat screw-cap VWR 16466-064
Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-320
Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-321
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized Millipore Sigma SLGP033RS
Nitrilotriacetic acid (NTA) Sigma 72560-100G
Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use Fisher Scientific 14-826AA
pH Strips, plastic pH5.0-9.0 Fisher Scientific 13-640-519
Razor blades 0.22 mm VWR 55411-050
Scale (g) Mettler Toledo PB1502-S
Scale (mg) Mettler Toledo Balance XS204
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761-500G
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS266-1
Sterile syringe, slip tip (1 mL) Fisher Scientific 309659
Trichloroacetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-500
Software
ImageLab Bio-Rad
SigmaPlot Systat

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References

  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
  2. Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
  3. Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
  4. Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
  5. Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
  6. Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
  7. O'Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
  8. Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
  9. Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
  10. Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
  11. Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, Suppl 6 1567-1574 (2017).
  12. van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
  13. Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
  14. Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
  15. Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
  16. Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
  17. Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
  18. Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
  19. Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
  20. Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport--a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
  21. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  22. Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
  23. Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
  24. Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
  25. Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
  26. Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
  27. Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
  28. McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
  29. Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
  30. Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
  31. Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
  32. Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
  33. Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
  34. Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).

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Biologie numéro 183
Quantification du transport du fer à travers le placenta de la souris <em>in vivo</em> à l’aide d’isotopes de fer non radioactifs
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Sangkhae, V., Nemeth, E.… More

Sangkhae, V., Nemeth, E. Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes. J. Vis. Exp. (183), e63378, doi:10.3791/63378 (2022).

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