Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantifisering av jerntransport over musemorkaken in vivo ved bruk av ikke-radioaktive jernisotoper

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63378
Automatic Translation
1, 1
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Denne artikkelen demonstrerer hvordan man tilbereder og administrerer transferrinbundet ikke-radioaktivt isotopjern for studier av jerntransport ved musegraviditet. Tilnærmingen for kvantifisering av isotopjern i fetoplacentale rom er også beskrevet.

Abstract

Jern er viktig for mors og fosterets helse under svangerskapet, med ca 1 g jern som trengs hos mennesker for å opprettholde en sunn graviditet. Fosterets jernbegavelse er helt avhengig av jernoverføring over morkaken, og forstyrrelser av denne overføringen kan føre til uønskede svangerskapsutfall. Hos mus var måling av jernflukser over morkaken tradisjonelt avhengig av radioaktive jernisotoper, en svært følsom, men belastende tilnærming. Stabile jernisotoper (57Fe og 58Fe) tilbyr et ikke-radioaktivt alternativ for bruk i humane graviditetsstudier.

Under fysiologiske forhold er transferrinbundet jern den dominerende formen for jern tatt opp av morkaken. Således ble 58Fe-transferrin fremstilt og injisert intravenøst i gravide dammer for direkte å vurdere placental jerntransport og omgå mors intestinal jernabsorpsjon som en forvirrende variabel. Isotopisk jern ble kvantifisert i placenta og mus embryonale vev ved induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS). Disse metodene kan også brukes i andre dyremodellsystemer av fysiologi eller sykdom for å kvantifisere in vivo jerndynamikk.

Introduction

Jern er kritisk for ulike metabolske prosesser, inkludert vekst og utvikling, energiproduksjon og oksygentransport1. Vedlikehold av jernhomeostase er en dynamisk, koordinert prosess. Jern tas opp fra mat i tolvfingertarmen og transporteres rundt i kroppen i sirkulasjonen som bindes til jerntransportproteintransferrinet (Tf). Den brukes av hver celle for enzymatiske prosesser, innlemmet i hemoglobin i begynnende erytrocytter, og resirkulert fra eldre erytrocytter av makrofager. Jern lagres i leveren når det er i overskudd og tapt fra kroppen gjennom blødning eller celle sloughing. Mengden jern i omløp er resultatet av balansen mellom forbruket og tilførselen av jern, sistnevnte er tett regulert av hepatisk hormon hepcidin (HAMP), den sentrale regulatoren av jernhomeostase1. Hepcidin fungerer for å begrense jernbiotilgjengeligheten i blod ved å okkludere eller indusere ubiquitination og nedbryte jerneksportøren ferroportin (FPN)2. Reduksjon i funksjonell FPN fører til redusert jernabsorpsjon, jernbinding i leveren og redusert jerngjenvinning fra makrofager1.

Hepcidin reguleres av jernstatus, betennelse, erytropoetisk kjøring og graviditet (vurdert i 3). Gitt at jernhomeostase er svært dynamisk, er det viktig å forstå og måle den totale jernpoolen og jernfordelingen og omsetningen. Dyrestudier var tradisjonelt avhengige av radioaktive jernisotoper, en svært følsom, men tyngende tilnærming for å måle jerndynamikk. Men i nyere studier, inkludert studien presentert her4, brukes ikke-radioaktive, stabile jernisotoper (58Fe) til å måle jerntransport under graviditet 5,6,7,8,9. Stabile isotoper er verdifulle verktøy for å studere næringsmetabolisme (gjennomgått i 10). Bruken av stabile jernisotoper i humane studier viste at i) jernabsorpsjonen øker mot slutten av svangerskapet5,6, ii) overføring av diettjern til fosteret er avhengig av mors jernstatus7, iii) maternalt inntatt hemejern er lettere innlemmet av fosteret enn nonheme jern 8, og iv) jernoverføring til fosteret er negativt korrelert med mors hepcidinnivå 8, 9. Disse eksperimentene målte jernisotoper i sera eller deres innlemmelse i RBC; måling av jern inkorporert i RBC alene kan imidlertid undervurdere sann jernabsorpsjon9. I den nåværende studien måles både heme og nonheme jern i vev.

Under graviditeten er det nødvendig med jern for å støtte utvidelsen av mors røde blodlegemer og for overføring over morkaken for å støtte veksten og utviklingen av fosteret11. Fosterets jernbegavelse er helt avhengig av jerntransport over morkaken. Under human12 og gnager 4,13 graviditet, reduseres hepcidinnivåene dramatisk, og øker plasmajerntilgjengeligheten for overføring til fosteret.

Grunnlaget for placental jerntransport ble opprinnelig karakterisert på 1950-70-tallet ved bruk av radioaktive sporstoffer (59Fe og 55Fe). Disse studiene fastslo at jerntransport over morkaken er ensrettet 14,15 og at diferrisk transferrin er en viktig kilde til jern for morkaken og fosteret 16,17. Den nåværende forståelsen av placental jerntransport er mer komplett, selv om noen viktige jerntransportører og reguleringsmekanismer forblir ukjente. Musemodeller har vært avgjørende for å forstå jernregulering og transport18 fordi nøkkeltransportørene og mekanismene er bemerkelsesverdig like. Både menneske og mus placentae er hemochorial, det vil si at mors blod er i direkte kontakt med fosterkorionen19. Det er imidlertid noen bemerkelsesverdige strukturelle forskjeller.

Syncytiotrophoblast er placentacellelaget som separerer mors og fosterets sirkulasjon og aktivt transporterer jern og andre næringsstoffer20. Hos mennesker er syncytiotrofobila et enkelt lag av smeltede celler. I motsetning til dette består musemorkaken av to syncytiotrofolastlag21, Syn-I og Syn-II. Imidlertid tillater gapkryss ved grensesnittet til Syn-I og Syn-II diffusjon av næringsstoffer mellom lag22,23. Dermed fungerer disse lagene som et enkelt syncytiallag som ligner på det humane syncytiotrofoblastet. Ytterligere likheter og forskjeller mellom menneske og mus placentae er gjennomgått av Rossant og Cross21. Placental jerntransport utløses ved binding av jern-Tf fra mors blod til transferrinreseptoren (TfR1) lokalisert på den apikale siden av syncytiotrofoblast24. Denne interaksjonen induserer jern-Tf/TfR1-internalisering via clathrinmediert endocytose25. Jern frigjøres deretter fra Tf i det sure endosomet26, reduseres til jernholdig jern av en ubestemt ferrireduktase, og eksporteres fra endosomet til cytoplasma av en ennå ikke bestemt transportør. Hvordan jern er chaperoned innenfor syncytiotrophoblast gjenstår også å bli beskrevet. Jern transporteres til slutt til fostersiden av jerneksportøren, FPN, lokalisert på den basale eller fostervendte overflaten av syncytiotrofoblast (gjennomgått i27).

For å forstå hvordan fysiologisk og patologisk regulering av TfR1, FPN og hepcidin påvirker placentajerntransport, ble stabile jernisotoper benyttet for å kvantifisere jerntransport fra mors sirkulasjon til morkaken og embryoet in vivo4. Dette papiret presenterer metodene for fremstilling og administrering av isotopisk jernoverføring til gravide mus, behandling av vev for ICP-MS og beregning av jernkonsentrasjoner i vev. Bruken av stabile jernisotoper in vivo kan tilpasses for å undersøke jernregulering og -fordeling i ulike dyremodeller for å undersøke fysiologisk og patologisk jernregulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreprotokoller og eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California Los Angeles.

1. Forberedelse av 58Fe-Tf

MERK: Protokollen bruker 58Fe; En identisk protokoll kan imidlertid brukes til 57Fe. Begge isotopene kan brukes og kastes som et standard jernkjemikalie uten ytterligere forholdsregler.

  1. Oppløs 58 Fe i 12 N HCl ved 50μL HCl / mg 58Fe.
    1. Tilsett HCl til metallet i hetteglasset som leveres av leverandøren, og sett hetten løst på plass. For å løse opp jernet varmes 58Fe/HCl-oppløsningen til 60 °C i 1 time. Hvis den fortsatt ikke er oppløst, la løsningen stå over natten ved romtemperatur i avtrekkshetten for å løse seg opp.
      MERK: Oppløst 58Fe / HCl-løsning er gulaktig oransje i fargen.
      Fe3O 4 (s) + 8HCl (aq) → Fe (II) Cl 2 (aq) + 2Fe (III) Cl3 (aq) +4H 2 O
  2. Oksider eventuelle gjenværende Fe (II) Cl2 for å generere Fe (III) Cl3-løsningen .
    1. Varm opp 58Fe/HCl-løsningen til 60 °C med hetten av for å lette oksidasjonen.
    2. Tilsett 1 μL på 35% H 2 O2per 50 μL 58Fe / HCl-løsning for ytterligere å lette oksidasjon.
      Fe(II)Cl2(aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2 O
  3. Klargjør jernkloridoppløsningen (58Fe (III) Cl3).
    1. La jernkloridoppløsningen ligge i hetten ved 60 °C med hetten av for å fordampe prøven.
      MERK: Fordampning kan ta mellom en og flere dager.
    2. Rekonstituer 58 Fe(III)Cl 3 til 100 mM med ultraren H 2 O, og beregn mengden ultraren H 2 O som kreves basert på den opprinnelige metallvekten som ble brukt i trinn 1.1 (molekylvekt på 58 Fe(III)Cl3 er 162,2).
  4. Forbered 58 Fe (III) -nitrilotriacetat (NTA) ved å inkubere 58Fe (III) Cl 3 med NTA i et 1: 5 molar forhold i nærvær av 20 mM NaHCO3.
    1. Forbered 500 mM NTA i 1 N NaOH.
    2. Forbered 5x transferrin-loading buffer (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl).
    3. Forbered 1 M NaHCO3 i ultraren H2O.
    4. Til et 15 ml konisk rør, tilsett 150 μL 100 mM 58 Fe (III) Cl 3-løsning (fra trinn 1.3.2), 150 μL 500 mM NTA fremstilt i 1 N NaOH, 480 μL ultraren H2O, 200 μL 5xtransferrinbelastningsbuffer og 20 μL 1 M NaHCO3-løsning.
    5. Inkuber blandingen i 5 minutter ved romtemperatur.
  5. Last apo-Tf med 58 Fe (III) -NTA for å danne 58Fe-Tf.
    MERK: Denne protokollen ble tilpasset fra McCarthy og Kosman28.
    1. Løs opp 500 mg apo-Tf i 4 ml 1x Tf-lastende buffer.
    2. Til det 15 ml koniske røret i trinn 1.4.4 som inneholder 1 ml av 58Fe (III) -NTA-løsningen, tilsett 4 ml apo-Tf-løsning.
      MERK: Dette er et 3: 1 molforhold på 58Fe-NTA med apo-Tf. Hver Tf inneholder 2 Fe bindingssteder; overskytende 58Fe-NTA ble lagt til for å sikre at Tf var fullastet.
    3. For å tillate maksimal belastning av 58Fe-NTA på apo-Tf, kontroller at løsningen er ved pH 7,5, og juster pH, om nødvendig, med NaHCO3 eller HCl.
    4. Inkuber i 2,5 timer ved romtemperatur.
  6. Fjern overflødig ubundet 58Fe (III) -NTA og utgitt NTA.
    1. Overfør 58Fe-Tf-løsningen til en molekylvekts avskjæringskolonne (30 kDa cutoff) og sentrifuge ved 2,500 × g i 15 minutter ved romtemperatur.
    2. Vask kolonnen med 10 ml 1x transferrin-loading buffer og sentrifuge ved 2,500 × g i 15 min ved romtemperatur. Gjenta vask og sentrifugering, utfør en saltvannsvask med 10 ml saltvann og sentrifuge ved 2.500 × g i 15 minutter ved romtemperatur.
  7. Beregn konsentrasjonen av 58Fe-Tf.
    MERK: På grunn av tillegg av overskytende 58Fe i trinn 1.5.2, antar at alle transferrin er diferrisk. Da 500 mg apo-Tf ble brukt, ble ~500 mg 58Fe-Tf produsert i trinn 1.5.4.
    1. Mål volumet som gjenvinnes fra sentrifugering etter saltvannsvask i trinn 1.6.2.
    2. Del 500 mg med gjenvunnet volum for å bestemme konsentrasjonen (i mg/ml) av 58Fe-Tf-oppløsningen.
  8. Steriliser 58Fe-Tf-løsningen ved hjelp av et 0,22 μm sprøytefilter; oppbevares ved 4 °C til den er klar til bruk.
    MERK: 58Fe-Tf oppløsning ble brukt mellom 1 til 4 uker etter tilberedning.

2. Sett opp tidsbestemte musegraviditeter

  1. Bruk 6- til 8 uker gamle kvinnelige mus. Plasser dyr på en lav-jern diett (4 ppm jern) eller standard chow (185 ppm jern) i 2 uker før parring og opprettholde dyr på de respektive dietter gjennom hele svangerskapet.
  2. Alternativ 01: Bekreft graviditet ved vektøkning ved E7.5.
    1. Sett opp flere avlsbur. For hvert bur, kombiner 2 kvinner med 1 mann over natten; dagen etter når dyr skilles regnes som embryonal dag (E)0,5. Vei kvinner på E7.5 for å avgjøre om de er gravide. Kompis hanner igjen med kvinner som ikke gikk opp i vekt.
      MERK: I WT C57BL / 6 er en vektøkning på 1 g ved E7.5 en god indikator på graviditet. Denne metoden sikrer at implantasjonen skjedde innenfor en bestemt tidsramme på 16 timer, noe som muliggjør synkron behandling av alle dyr som ble gravid i samme parringsperiode.
  3. Alternativ 02: Bekreft graviditet ved hjelp av pluggkontroller.
    1. Kombiner 2 hunner med 1 hann og utfør daglige pluggkontroller for å avgjøre om kopiering har skjedd.
      MERK: Denne metoden kan føre til forskjøvet graviditet, og tilstedeværelsen av en plugg garanterer ikke graviditet.

3. Administrer 58Fe-Tf intravenøst til E17.5 gravide mus

  1. Klargjør 58Fe-Tf fra trinn 1.8 til injeksjon.
    1. Klargjør 58Fe-Tf oppløsning ved 35 mg / ml i saltvann; injiser 100 μL per mus.
    2. Fyll en insulinsprøyte med 100 μL av 58Fe-Tf-oppløsningen.
      MERK: Hver dose inneholder 3,5 mg humant 58 Fe-Tf (5 μg 58Fe).
  2. Bedøv en gravid mus ved hjelp av isofluran.
    1. Bruk en isofluranregulator med et kammer.
    2. Bruk følgende innstillinger: 5 % isofluran, 2 l/mlO2, 2 min.
    3. Bekreft at musen er bedøvet ved å se etter manglende respons på en tåklype.
    4. Påfør øyesmøremiddel på overflaten av øyet og legg musen på en varmepute.
  3. Injiser sakte og forsiktig 58Fe-Tf-løsningen i retro-orbital sinus.
  4. La musen komme seg fra anestesi; Ikke la dyret være uten tilsyn før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
  5. Seks timer etter injeksjon, avlive E17.5 gravide kvinner ved overdosering av isofluran.
    1. Utfør en hjertepunksjon for å exsanguinate musen som en form for sekundær eutanasi.
    2. Fest føttene ned med nåler for stabilisering.
  6. Samle placentae og embryo lever.
    1. Bruk steril tang og disseksjonssaks, fjern livmoren forsiktig fra den gravide musen. Klipp av en placenta foster-placenta enhet, som består av et enkelt foster og morkake i fostervesken omgitt av en del av livmoren.
    2. Skjær forsiktig gjennom livmor og fosterveske uten å forstyrre fosteret og morkaken.
    3. Skrell av fostervesken og fjern fosteret og morkaken.
    4. Klipp navlestrengen.
    5. Tørk fosteret og morkaken på en ren oppgavetørke for å fjerne overflødig fostervann.
    6. Registrer vektene til hele morkaken.
    7. Skjær hver morkake i to med et barberblad, legg hver halvdel i et 2,0 ml rør og frys i flytende nitrogen.
      MERK: Fordi 58 Fe ikke krever spesielle håndteringsforanstaltninger og destruksjon, kan halvparten av morkaken brukes til 58Fe-måling og den andre halvparten til andre analyser, inkludert kvantifisering av transferrinreseptor (TFR1) og ferroportin (FPN) ekspresjon ved western blotting og qPCR.
    8. For å samle embryolever, ofre embryoet: bruk et barberblad for raskt å halshugge embryoet.
      MERK: Ved E17.5 må alle embryoer i livmoren avlives individuelt, selv om de ikke brukes i studien.
    9. Pin ned embryoet for stabilisering, slik at magen blir utsatt.
    10. Bruk disseksjonssaks, lag et lite snitt der navlestrengen var festet, sett den ene enden av disseksjonssaksen inn i snittet, og utfør et medianplan kuttet mot koronalplanet omtrent 1/4 tomme. Utfør deretter tverrgående plankutt for å eksponere fosterets lever.
    11. Bruk tang for å fjerne fosterets lever.
    12. Registrer vekten av hele embryoleveren.
    13. Plasser hele embryoleveren i 2 ml rør og frys dem i flytende nitrogen.
      MERK: Alternativt kan bare en del av embryoleveren brukes til 58Fe-måling hvis ytterligere analyser er ønskelig. Bruk av 2,0 ml rør muliggjør bedre vevshomogenisering enn 1,5 ml rør.
  7. Oppbevar vevet på ubestemt tid ved -80 °C.

4. Behandle vev for kvantitativ jernanalyse ved ICP-MS

  1. Behandle placentae og fosterlever for kvantifisering av nonheme jern.
    1. Tine placentahalvdeler og hele fosterlever, og veie placentahalvdeler (se trinn 3.6.12 for registrering av fosterets levervekter).
    2. Tilsett 400 μL proteinutfellingsløsning (0,53 N HCl, 5,3% TCA).
    3. Homogeniser vevet ved hjelp av en elektrisk homogenisator.
    4. Inkuber prøvene ved 100 °C i 1 time.
    5. Avkjøl prøvene i romtemperert vann i 2 minutter.
    6. Åpne hettene for å frigjøre trykk, og lukk deretter rørene igjen.
    7. Sentrifuge ved 17 000 × g i 10 minutter ved romtemperatur til pelletsvevsrester.
    8. Overfør supernatanten forsiktig til et nytt merket rør.
    9. Send prøver av for ICP-MS-analyse.
  2. Behandle morkaken og fosterets lever for kvantifisering av heme-jern.
    MERK: Etter ekstraksjon av nonheme jern i trinn 1, er jernet som er igjen i pelleten overveiende heme.
    1. Registrer vekten av hver pellet fra trinn 4.1.7.
    2. Fordøy pellets i 10 ml konsentrert 70% HNO3 supplert med 1 ml 30% H 2 O2
      MERK: Rådfør deg med ICP-MS-kjernen eller -senteret for å optimalisere volumet av HNO3 for spesifikke studier; Volumet vil blant annet være avhengig av utvalgsvekt.
    3. Varm prøvene til 200 °C i 15 min.
    4. Send prøvene av for ICP-MS-analyse.
      MERK: Hvis det ikke er nødvendig å skille mellom heme og nonheme jernkilder og bare totalt jern måles, kan hele vevet fordøyes i HNO3 som første trinn.

5. Analyse av data

MERK: Data fra ICP-MS er angitt som 56Fe og 58Fe konsentrasjoner i ng/ml eller mg, ppb (tabell 1). 56 Fe er den mest tallrike jernisotopen i naturen, og målingen gjenspeiler jernakkumulering i morkaken / embryoet over hele graviditeten, mens 58Fe-måling gjenspeiler jern som ble overført i løpet av 6 timer etter injeksjon.

  1. Trekk den naturlige overflod av 58 Fe (0,28% av total Fe) fra de målte 58Fe-verdiene.
  2. Beregn totalt nonheme 58Fe.
    1. Beregn embryolever totalt nonheme jern (ng) ved først å multiplisere jernkonsentrasjonen (ng / ml) beregnet i trinn 5.1 med volumet (ml) under innledende behandling i trinn 4.1.2 for å estimere totalt 58Fe.
    2. Beregn mengden jern i hele morkaken ved å ta totalvekten av morkaken målt i trinn 3.6.6 og dele den med vekten av morkaken behandlet i trinn 4.1.1. Multipliser denne verdien med total nonheme jern (ng) beregnet i trinn 5.2.1 for å oppnå det totale nonheme 58Fe-innholdet i morkaken.
  3. Beregn totalt heme 58Fe.
    1. Beregn total heme 58Fe ved først å multiplisere jernkonsentrasjonen (ng / mg) beregnet i trinn 5.1 med pelletens vekt (i mg) målt i trinn 4.2.1.
    2. Del deretter placentaens totale vekt målt i trinn 3.5.1 med vekten av morkakepelleten målt i trinn 4.2.1. Multipliser denne verdien med det totale hemejernet (ng) beregnet i trinn 5.3.1 for å oppnå totalt heme 58Fe-innhold i morkaken.
  4. Sum de beregnede nonheme- og heme-58 Fe-verdiene for å bestemme det totale jerninnholdet for hvert vev.

Figure 1
Figur 1: Visuell oppsummering av trinn i protokollen . (A) Tilberedning av 58Fe-transferrin. (B) In vivo administrering av 58Fe-transferrin. (C) Innsamling og lagring av vev. (D) Behandling av morkaken og embryoleveren for kvantifisering av metallarter ved ICP-MS. Forkortelser: Fe = jern; NTA = nitrilotrieddiksyre; Tf = transferrin; PPS = protein utfelling løsning; Sup = supernatant; TCA = trikloreddiksyre; ICP-MS = induktivt koblet plasmamassespektrometri. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En tidligere studie med stabile jernisotoper for å måle jerntransport viste at mors jernmangel resulterte i nedregulering av placentajerneksportøren, FPN4. FPN er den eneste kjente eksportøren av pattedyrjern, og fraværet av FPN under utvikling resulterer i embryonal død før E9.529. For å avgjøre om den observerte reduksjonen i FPN-uttrykk ble funksjonelt oversatt til redusert placentajerntransport, ble 58Fe-Tf injisert intravenøst i gravide dammer, og jern i morkaken og embryoet ble kvantifisert i nærvær av mors jernmangel.

For å forstå hvordan placental jerntransport påvirkes av mors jernstatus, ble jernmangel modellert hos mus4. Kvinnelige C57BL / 6 mus ble plassert på en lav-jern diett (4 ppm jern) eller standard chow (185 ppm jern) i 2 uker før og gjennom hele svangerskapet. Dette diettregimet resulterer i lavere mors lever nonheme jern og serumjern og hemoglobin ved E12.5, E15.5 og E18.5 sammenlignet med dyr på en standard diett4. Ved E18.5 hadde embryoer fra jernfattige mødre lavere leverjern og var hypoferremiske og anemiske enn embryoer fra jernfylte mødre. Tre drektige mus ble brukt i hver av de jernfylte og jernfattige gruppene, og 2-3 morkaker ble brukt fra hver drektige mus til analyse.

For å kvantifisere placentajerntransport ble 58 Fe-transferrin fremstilt og injisert intravenøst i drektige dammer og 58Fe målt i placenta og fosterlever ved ICP-MS, som beskrevet i protokollen og illustrert i figur 1. Før utsendelse av jernprøver for ICP-MS-analyse, ble totale nonheme jernnivåer uavhengig kvantifisert via en ferenmetode beskrevet tidligere30. Nonheme jernkonsentrasjoner målt ved feren versus ICP-MS-metodene var svært signifikant korrelert i alle vev målt (R2 = 0,94, P < 0,0001, n = 36). Representative resultater fra ICP-MS kvantifisering av jernisotoper er presentert i tabell 1. Totalt 58Fe ble beregnet som beskrevet i trinn 5 i protokollen. Data presenteres som total snarere enn heme eller nonheme jern (figur 2A-D) fordi målet var å kvantifisere totalt jern overført til morkaken og totalt jern overført til embryoet fra morkaken.

I gjennomsnitt ble 21 % av den administrerte dosen på 58Fe gjenfunnet i morkaken, embryoleveren og embryoserumet kombinert. 56Fe-målingen gir innsikt i den langsiktige jernoverføringen i morkaken og embryoleveren gjennom hele svangerskapet. Den totale placenta 56Fe var lik i de jernfattige og -fylte gruppene (figur 2A), mens det totale embryoleverjernet ble redusert i jernfattig gruppe (figur 2B). Dette var forventet basert på den observerte reduksjonen i placenta FPN i jernmangelgruppen4, noe som ville resultere i jernretensjon i morkaken på bekostning av embryoet. Totalt 58Fe gir et øyeblikksbilde av kortsiktig jerntransport. I denne studien, i likhet med 56Fe, var placental 58 Fe lik i både jernfattige og -replete grupper (figur 2C), og embryolever 58Fe ble redusert i jernmangelgruppen (figur 2D). Disse dataene indikerer at under jernfattig graviditet resulterer nedreguleringen av placenta FPN i redusert jerntransport til embryoet, noe som fører til kumulative forskjeller i jerninnhold i morkaken og embryoet.

Det er viktig å vurdere jerndosen som administreres, da det kan føre til utilsiktede endringer i hepcidinkonsentrasjon eller jerntransportøruttrykk31. Det ble vist at mors jernmangel forårsaket en reduksjon i placenta FPN4. For å avgjøre om Fe-Tf-injeksjon påvirket denne reguleringen, ble placenta FPN målt 6 timer etter injeksjon med western blot. Jerndosen på 5 μg var utilstrekkelig til å endre placenta FPN-regulering ved maternal jernmangel (figur 3).

Oppsummert ble denne metoden brukt til å demonstrere at fysiologisk regulering av placenta FPN under mors jernmangel resulterer i redusert jerntransport over morkaken in vivo. Stabile jernisotoper gir et følsomt og kvantifiserbart alternativ til radioaktivitet for måling av jerntransport og distribusjon, noe som muliggjør samtidig bruk av vev for ytterligere analyser.

Figure 2
Figur 2: 56Fe og 58Fe transporterer over morkaken i jernfattige eller jernfylte svangerskap. Totalt 56Fe i morkaken (A) og embryoleveren (B). Totalt 58Fe i morkaken (C) og fosterlever (D). Statistisk analyse ble utført med en 2-tailed Student t-test for normalfordelte verdier og ellers ved Mann-Whitney U rank-sum test (betegnet med en stjerne etter P-verdien). Antall dyr er angitt i boksens x-akser og whisker tomter. Den øvre delen av boksplottet indikerer 75-prosentilen, og bunnen indikerer 25-prosentilen; værhår over boksen indikerer 90-prosentilen, og de under boksen indikerer 10-prosentilen. Den heltrukne linjen i boksen angir medianen og den stiplede linjen gjennomsnittet. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av vitenskapelig grafering og dataanalyseprogramvare. Dette tallet er endret fra4. Forkortelse: Fe = jern. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Placental TFR1- og FPN-nivåer. (A) TFR1- og FPN-uttrykk ble vurdert av western blot i jernmangel og -fylt placentae 6 timer etter behandling av mødre med 58Fe-Tf. (B) Proteinuttrykk ble kvantifisert og presentert som proteinuttrykk i forhold til β-aktin. Statistisk analyse ble utført med 2-tailed Student t-test for normalfordelte verdier. Antall dyr er angitt i boksens x-akser og whisker tomter. Den øvre delen av boksplottet indikerer 75-prosentilen, og bunnen indikerer 25-prosentilen; værhår over boksen indikerer 90-prosentilen, og de under boksen indikerer 10-prosentilen. Den heltrukne linjen i boksen angir medianen og den stiplede linjen gjennomsnittet. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av vitenskapelig grafering og dataanalyseprogramvare. Dette tallet er endret fra4. Forkortelser: TFR1 = transferrinreseptor; FPN = ferroportin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Eksempel 56 Fe 58 Fe Totalt Fe
Konsentrasjon [ng/ml eller mg, ppb] Konsentrasjon [ng/ml eller mg, ppb] Summen av isotoper [ng/ml eller mg]
Gjennomsnitt* stdev Gjennomsnitt* stdev
Nonheme jern Morkake jernmangel 729.7 17.7 2.5 0.5 732.2
704.9 6.2 3.8 0.1 708.8
649.8 3.8 0.0 0.0 649.8
799.2 4.6 3.8 0.2 803.0
jernfylt 1919.1 5.3 11.0 0.2 1930.1
1610.0 26.8 11.7 0.6 1621.7
1925.5 39.0 14.0 0.3 1939.5
2551.6 16.1 8.3 0.4 2559.9
Heme Morkake jernmangel 253.8 1.8 1.1 0.0 254.9
32.9 0.4 0.3 0.0 33.2
337.7 5.1 1.4 0.0 339.1
402.3 5.3 1.7 0.0 404.0
jernfylt 123.5 1.3 0.6 0.0 124.0
75.7 1.3 0.4 0.0 76.1
441.9 3.0 1.9 0.0 443.8
250.4 1.1 1.1 0.0 251.5
Nonheme jern Embryo Lever jernmangel 361.6 8.3 31.9 1.0 393.5
652.4 3.4 61.7 0.3 714.1
411.9 10.7 43.1 0.8 455.0
631.1 7.5 62.8 0.2 693.9
jernfylt 7657.5 129.3 226.4 2.2 7883.8
3820.2 69.5 119.4 3.4 3939.6
5519.0 112.9 145.6 0.5 5664.6
4617.4 78.6 91.6 1.0 4709.0
Heme Embryo Lever jernmangel 44.5 0.3 1.6 0.0 46.0
31.0 0.4 2.9 0.0 34.0
11.8 0.2 1.1 0.0 12.9
42.3 0.1 3.2 0.0 45.5
jernfylt 54.3 1.4 2.1 0.0 56.4
31.9 0.8 1.3 0.1 33.2
59.4 0.6 2.2 0.0 61.6
66.7 0.6 2.1 0.0 68.8

Tabell 1: Representative resultater fra ICP-MS-kvantifisering av 56 Fe og 58Fe i placentae og embryolever. Forkortelser: ppb = deler per milliard; stdev = standardavvik; ICP-MS = induktivt koblet plasmamassespektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Jern er viktig for mange biologiske prosesser, og dets bevegelse og distribusjon i kroppen er svært dynamisk og regulert. Stabile jernisotoper gir et konsistent og praktisk alternativ til radioaktive isotoper for vurdering av dynamikken i jernhomeostase. Et kritisk trinn i protokollen er å holde oversikt over alle vevsvekter og volumer. Jern er et element og kan derfor ikke syntetiseres eller brytes ned. Således, hvis alle vekter og volumer er nøye logget, kan alt jern i systemet regnskapsføres ved beregning. Som beskrevet kan denne metoden brukes til å skille mellom heme og nonheme jernkilder. Men hvis dette skillet mellom jernformer ikke er nødvendig og bare totalt jern måles, kan protokollen forenkles ved å behandle vev bare med konsentrert HNO3 som beskrevet i protokoll trinn 4.2. Det er viktig å merke seg at hvis vev ikke er perfundert før analyse, spesielt høyt vaskulært vev som morkaken, kan tilstedeværelsen av blod føre til overestimering av vevshemejerninnhold.

Transferrinbundet jern ble valgt for studien, da det er den viktigste kilden til jern tatt opp av morkaken16,17. Global knockdown av TFR1 hos mus resulterte i embryonal dødelighet før E12.5, noe som tyder på at transferrinbundet jern er kritisk for utvikling. Det er mulig at andre jernarter, som ferritin og ikke-transferrinbundet jern (NTBI), også bidrar til fosterets jernbegavelse i mindre grad. Bidraget fra disse alternative jernartene ble imidlertid ikke vurdert. I fremtiden kan stabile isotoper brukes til å bestemme bidraget fra forskjellige jernkilder til utvikling og embryo jernbegavelse.

Målet med studien var å kartlegge effekten av endringer i mors jernstatus på placentajerntransport. Redusert hepcidin under jernmangel resulterer imidlertid i forhøyede enterocytt FPN-nivåer og økt jerntransport inn i sirkulasjonen1. Således, i jernfattige dammer, ville jernabsorpsjonen fra dietten ha blitt iboende økt og forvirret tolkning av resultater hvis 58Fe ble administrert oralt. Dermed ble intravenøs administrering av 58Fe-Tf valgt da det omgår jernregulering ved nivået av intestinal absorpsjon. En dose på 5 μg 58Fe/mus ble valgt basert på serumjernkonsentrasjoner av jernfylte E18,5 drektige dammer. I vilttype C57BL/6 E18.5 drektige dammer varierer serumjernkonsentrasjonene fra 10 til 50 μM4. En gravid E18.5-mus forventes å ha ca. 2 ml totalt blodvolum32. Dermed varierer den totale mengden jern i sirkulasjonen av jernfylte gravide dammer fra 1, 1 til 5, 6 μg. Dermed tilsvarer 5 μg 58Fe / mus fysiologiske konsentrasjoner observert i jernfylte dyr.

En begrensning av ICP-MS-deteksjon av 58 Fe er isobarisk interferens fra 58Ni. Endogene Ni-konsentrasjoner i musemorkaken er 0,04 ± 0,02 μg/g våtvekt33. En gjennomsnittlig E18.5 muse placenta veier 0,080 g; derfor er den totale mengden Ni ca. 3,2 ng. Den naturlige overflod av 58 Ni er 68%; Dermed er mengden 58Ni i musemorkaken ~ 2,2 ng, som er omtrent 10 ganger lavere enn de oppdagede 58Fe-nivåene. I embryoet er Ni-konsentrasjonene enda lavere ved 0,01 ± 0,01 μg/g våtvekt33. Det gjennomsnittlige E18.5 museembryoet veier 1 g; dermed er den totale mengden Ni i et normalt museembryo ca. 10 ng. Forutsatt at alt embryo Ni er funnet i embryoleveren, er disse nivåene fortsatt 10 ganger lavere enn de 58Fe-konsentrasjonene og nesten 1000 ganger lavere enn det totale embryoleverjerninnholdet. Gitt den lavere overflod av Ni i disse musevevene, ble 58Ni-interferens ikke tatt med i denne studien.

En ekstra vurdering er analysens deteksjonsgrense. Deteksjonsgrensen i denne studien var 250 pg/ml 58Fe. Denne grensen kan imidlertid endres for å oppdage enda lavere konsentrasjoner på 58Fe hvis fortynning av vev reduseres ved vevsbehandlingstrinnet (protokolltrinn 4.1.2 og figur 1D) eller via modifikasjoner på ICP-MS-kjerneanlegget. Når 58Fe ble målt i hele embryoet, var nivåene uoppdaget da 58Fe-konsentrasjonen var under deteksjonsgrensen. Imidlertid ble 58Fe påvist i embryoleveren, som er det primære jernlagringsorganet. Det er mulig at administrasjonen av en større dose på 58 Fe ville ha tillatt påvisning av 58Fe selv i hele embryoet. Imidlertid ble en relativt liten mengde 58Fe brukt for å unngå jernbelastning av morkaken, noe som kunne utløse tilbakemeldingsmekanismer og endre uttrykket av jerntransportører. I denne modellen, som benyttet villtype C57BL/6 mus, ble embryo lever jern målt som en refleksjon av total placental jerntransport, da embryo lever jernkonsentrasjon er proporsjonal med hele embryo jernkonsentrasjon4. Men i musemodeller der jernfordelingen er endret34, kan embryo lever jern alene ikke nøyaktig representerer total placental jerntransport. I slike tilfeller kan det være nødvendig å måle jern som er innlemmet i hele embryoet eller erytrocyttrommet. I tillegg vil variasjoner i eksperimentelle tidspunkter også kreve ytterligere optimalisering og måling av jern i forskjellige fosterrom. Denne stabile isotopsporingsmetoden ble brukt til å kvantifisere jerntransport under musegraviditet. Metodikken er lett å tilpasse for å studere jerntransport hos ikke-gravide mus og andre dyremodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

EN er en vitenskapelig medstifter av Intrinsic LifeSciences og Silarus Pharma og konsulent for Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics og Disc Medicine. VS erklærer ingen konflikter.

Acknowledgments

Forfatterne anerkjenner bruken av ICP-MS-anlegget i UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology i CNSI ved UCLA for deres hjelp med å optimalisere protokollen for 58Fe-målinger. Studien ble støttet av NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (K01DK127004, til VS) og NIH National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, til EN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
58Fe-iron metal Trace Sciences International Fe-58
Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff Millipore Sigma UFC903024
Centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Centrifuge tubes, 50 mL Millipore Sigma CLS430829
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Fisher Scientific 75002432
Centrifuge, Sorvall Legend RT
Delicate task wipers Fisher Scientific 06-666
Diet: iron-deficient (4 ppm iron) Envigo Teklad TD.80396
Diet: standard chow (185 ppm iron) PicoLab 5053
Dissecting scissor with 30 mm cutting edge VWR 25870-002
Forceps 4-1/2 inch length McKesson 157-469
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Homogenizer, Bio-Gen PRO200 PROScientific 01-01200
Human apo-transferrin (apo-Tf) Celliance 4452-01 no longer available, alternative: Millipore 616419
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water Cole-Parmer EW-88216-36
Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 Fisher Scientific 14-826-79
Isoflurane VETone 502017
Isoflurane vaporizor Summit Anesthesia Solutions
Metal heat block Fisher Scientific
Micro centrifuge tube with flat screw-cap VWR 16466-064
Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-320
Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-321
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized Millipore Sigma SLGP033RS
Nitrilotriacetic acid (NTA) Sigma 72560-100G
Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use Fisher Scientific 14-826AA
pH Strips, plastic pH5.0-9.0 Fisher Scientific 13-640-519
Razor blades 0.22 mm VWR 55411-050
Scale (g) Mettler Toledo PB1502-S
Scale (mg) Mettler Toledo Balance XS204
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761-500G
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS266-1
Sterile syringe, slip tip (1 mL) Fisher Scientific 309659
Trichloroacetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-500
Software
ImageLab Bio-Rad
SigmaPlot Systat

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
  2. Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
  3. Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
  4. Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
  5. Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
  6. Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
  7. O'Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
  8. Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
  9. Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
  10. Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
  11. Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, Suppl 6 1567-1574 (2017).
  12. van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
  13. Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
  14. Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
  15. Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
  16. Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
  17. Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
  18. Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
  19. Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
  20. Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport--a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
  21. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  22. Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
  23. Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
  24. Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
  25. Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
  26. Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
  27. Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
  28. McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
  29. Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
  30. Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
  31. Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
  32. Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
  33. Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
  34. Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).

Tags

Biologi utgave 183
Kvantifisering av jerntransport over musemorkaken <em>in vivo</em> ved bruk av ikke-radioaktive jernisotoper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sangkhae, V., Nemeth, E.… More

Sangkhae, V., Nemeth, E. Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes. J. Vis. Exp. (183), e63378, doi:10.3791/63378 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter