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Biology

Quantificando o transporte de ferro através da placenta de camundongo in vivo usando isótopos de ferro não radioativos

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63378
Automatic Translation
1, 1
1Center for Iron Disorders, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Este artigo demonstra como preparar e administrar ferro isotópico não radioativo ligado à transferrina para estudos de transporte de ferro na gravidez de camundongos. A abordagem para quantificar o ferro isotópico em compartimentos fetoplacentários também é descrita.

Abstract

O ferro é essencial para a saúde materna e fetal durante a gravidez, com aproximadamente 1 g de ferro necessário em humanos para sustentar uma gravidez saudável. A dotação fetal de ferro é totalmente dependente da transferência de ferro através da placenta, e as perturbações dessa transferência podem levar a resultados adversos na gravidez. Em camundongos, a medição dos fluxos de ferro através da placenta tradicionalmente dependia de isótopos de ferro radioativos, uma abordagem altamente sensível, mas onerosa. Os isótopos estáveis de ferro (57Fe e 58Fe) oferecem uma alternativa não radioativa para uso em estudos de gravidez em humanos.

Sob condições fisiológicas, o ferro ligado à transferrina é a forma predominante de ferro absorvida pela placenta. Assim, 58Fe-transferrina foram preparados e injetados por via intravenosa em mães grávidas para avaliar diretamente o transporte placentário de ferro e contornar a absorção intestinal materna de ferro como uma variável de confusão. O ferro isotópico foi quantificado na placenta e nos tecidos embrionários de camundongos por espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada (ICP-MS). Esses métodos também podem ser empregados em outros sistemas de fisiologia ou doença de modelos animais para quantificar a dinâmica do ferro in vivo.

Introduction

O ferro é fundamental para vários processos metabólicos, incluindo crescimento e desenvolvimento, produção de energia e transporte de oxigênio1. A manutenção da homeostase do ferro é um processo dinâmico e coordenado. O ferro é absorvido dos alimentos no duodeno e transportado ao redor do corpo na circulação ligada à transferrina da proteína de transporte de ferro (Tf). É utilizado por todas as células para processos enzimáticos, incorporado à hemoglobina em eritrócitos nascentes e reciclado de eritrócitos envelhecidos por macrófagos. O ferro é armazenado no fígado quando em excesso e perdido do corpo através de hemorragia ou descamação celular. A quantidade de ferro em circulação é o resultado do equilíbrio entre o consumo e o fornecimento de ferro, sendo este último rigidamente regulado pelo hormônio hepcidina (HAMP), regulador central da homeostase do ferro1. A hepcidina funciona para limitar a biodisponibilidade de ferro no sangue, ocluindo ou induzindo ubiquitinação e degradando a ferroportina exportadora de ferro (FPN)2. A redução da NPF funcional leva à diminuição da absorção dietética de ferro, sequestro de ferro no fígado e diminuição da reciclagem de ferro dos macrófagos1.

A hepcidina é regulada pelo estado de ferro, inflamação, impulso eritropoiético e gravidez (revisada em 3). Dado que a homeostase do ferro é altamente dinâmica, é importante entender e medir o pool total de ferro e a distribuição e rotatividade de ferro. Estudos em animais tradicionalmente se baseavam em isótopos de ferro radioativos, uma abordagem altamente sensível, mas onerosa, para medir a dinâmica do ferro. Entretanto, em estudos mais recentes, incluindo o estudo aquiapresentado4, isótopos de ferro estáveis não radioativos (58Fe) são utilizados para medir o transporte de ferro durante a gestação 5,6,7,8,9. Isótopos estáveis são ferramentas valiosas para estudar o metabolismo de nutrientes (revisado em 10). O uso de isótopos estáveis de ferro em estudos em humanos demonstrou que i) a absorção de ferro aumenta no final da gestação5,6, ii) a transferência de ferro dietético para o feto é dependente do status de ferro materno7, iii) o ferro heme ingerido maternalmente é mais prontamente incorporado pelo feto do que o ferro não-heme 8, e iv) a transferência de ferro para o feto está negativamente correlacionada com os níveis maternos de hepcidina 8, 9. Esses experimentos mediram isótopos de ferro em soros ou sua incorporação em hemácias; no entanto, a medida do ferro incorporado isoladamente nas hemácias pode subestimar a verdadeira absorção de ferro9. No presente estudo, tanto o ferro heme quanto o ferro não heme são medidos nos tecidos.

Durante a gravidez, o ferro é necessário para suportar a expansão do volume de glóbulos vermelhos maternos e para a transferência através da placenta para apoiar o crescimento e desenvolvimento do feto11. A dotação fetal de ferro é totalmente dependente do transporte de ferro através da placenta. Durante a gravidez humana 12 e roedor 4,13, os níveis de hepcidina diminuem drasticamente, aumentando a disponibilidade de ferro plasmático para transferência para o feto.

Os fundamentos do transporte placentário de ferro foram inicialmente caracterizados nas décadas de 1950-70 usando traçadores radioativos (59Fe e 55Fe). Esses estudos determinaram que o transporte de ferro através da placenta é unidirecional 14,15 e que a transferrina diférrica é uma importante fonte de ferro para a placenta e o feto 16,17. A compreensão atual do transporte placentário de ferro é mais completa, embora alguns dos principais transportadores de ferro e mecanismos regulatórios permaneçam desconhecidos. Os modelos de camundongos têm sido essenciais para a compreensão da regulação e do transporte de ferro18 porque os principais transportadores e mecanismos são notavelmente semelhantes. Tanto a placenta humana quanto a de camundongo são hemocoriais, ou seja, o sangue materno está em contato direto com o córion fetal19. No entanto, existem algumas diferenças estruturais notáveis.

O sincitiotrofoblasto é a camada celular placentária que separa a circulação materna e fetal e transporta ativamente ferro e outros nutrientes20. Em humanos, o sincitiotrofoblasto é uma única camada de células fundidas. Em contraste, a placenta do rato consiste em duas camadas21 do sinciciotrofoblasto, Syn-I e Syn-II. No entanto, as junções gap na interface do Syn-I e do Syn-II permitem a difusão de nutrientes entre as camadas22,23. Assim, essas camadas funcionam como uma única camada sincicial semelhante ao sinciciotrofoblasto humano. Semelhanças e diferenças adicionais entre placentas humanas e de camundongos são revisadas por Rossant e Cross21. O transporte placentário de ferro é desencadeado pela ligação do ferro-Tf do sangue materno ao receptor de transferrina (TfR1) localizado no lado apical do sincitiotrofoblasto24. Essa interação induz a internalização ferro-Tf/TfR1 via endocitose mediada por clatrina25. O ferro é então liberado da Tf no endossomo ácido26, reduzido a ferro ferroso por uma ferrirredutase indeterminada e exportado do endossomo para o citoplasma por um transportador ainda a ser determinado. Como o ferro é acompanhado dentro do sincitiotrofoblasto também continua a ser descrito. O ferro é eventualmente transportado para o lado fetal pelo exportador de ferro, FPN, localizado na superfície basal ou voltada para o fecho do sincitiotrofoblasto (revisado em27).

Para compreender como a regulação fisiológica e patológica da TfR1, FPN e hepcidina afeta o transporte placentário de ferro, isótopos estáveis de ferro foram utilizados para quantificar o transporte de ferro da circulação materna para a placenta e embrião in vivo4. Este trabalho apresenta os métodos de preparação e administração de transferrina isotópica de ferro em ratas prenhes, processamento de tecidos para ICP-MS e cálculo das concentrações de ferro em tecidos. O uso de isótopos estáveis de ferro in vivo pode ser adaptado para investigar a regulação e distribuição de ferro em diferentes modelos animais para investigar a regulação fisiológica e patológica do ferro.

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Protocol

Todos os protocolos e procedimentos experimentais em animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade da Califórnia em Los Angeles.

1. Preparação de 58Fe-Tf

NOTA: O protocolo usa 58Fe; no entanto, um protocolo idêntico pode ser usado para 57Fe. Qualquer isótopo pode ser usado e descartado como um produto químico de ferro padrão sem precauções adicionais.

  1. Dissolver58 Fe em 12 N HCl a 50 μL de HCl/mg de 58Fe.
    1. Adicione HCl ao metal no frasco para injetáveis de vidro fornecido pelo vendedor e substitua a tampa frouxamente. Para dissolver o ferro, aquecer a solução de 58Fe/HCl a 60 °C durante 1 h. Se ainda não estiver dissolvido, deixe a solução durante a noite à temperatura ambiente no exaustor para se dissolver.
      NOTA: A solução dissolvida de 58Fe/HCl é de cor laranja-amarelada.
      Fe 3 O 4(s) + 8HCl(aq) → Fe(II)Cl 2(aq) + 2Fe(III)Cl3(aq) + 4H 2 O
  2. Oxidar qualquer Fe(II)Cl2 restante para gerar a solução de Fe(III)Cl3 .
    1. Aqueça a solução de 58Fe/HCl a 60 °C com a tampa desligada para facilitar a oxidação.
    2. Adicionar 1 μL de 35% H 2 O2por 50 μL de solução de 58Fe/HCl para facilitar ainda mais a oxidação.
      Fe(II)Cl2(aq) + O 2 + 4HCl → 4Fe(III)Cl3(aq) + 2H2 O
  3. Preparar a solução de cloreto férrico (58Fe(III)Cl3).
    1. Deixar a solução de cloreto férrico no exaustor a 60 °C com a tampa afastada para evaporar a amostra.
      NOTA: A evaporação pode demorar entre um e vários dias.
    2. Reconstituir 58 Fe(III)Cl 3 a 100 mM com H 2 O ultrapuro e calcular a quantidade de H 2 O ultrapuro necessária com base no peso inicial do metal utilizado no passo 1.1 (o peso molecular de 58 Fe(III)Cl3 é 162.2).
  4. Preparar 58 Fe(III)-nitrilotriacetato (NTA) incubando 58Fe(III)Cl 3 com NTA numa proporção molar de 1:5 na presença de 20 mM de NaHCO3.
    1. Prepare NTA de 500 mM em 1 N NaOH.
    2. Prepare 5x tampão de carregamento de transferrina (0,5 M HEPES, pH 7,5; 0,75 M NaCl).
    3. Preparar 1 M NaHCO3 em ultrapuro H2O.
    4. A um tubo cónico de 15 ml, adicionar 150 μL de 100 mM 58 Fe(III)Cl 3 solução (a partir do passo 1.3.2), 150 μL de 500 mM NTA preparados em 1 N NaOH, 480 μL de ultrapuro H2O, 200 μL de 5xtampão de carregamento de transferrina e 20 μL de 1 M de NaHCO3 solução.
    5. Incubar a mistura durante 5 min à temperatura ambiente.
  5. Carregue apo-Tf com 58 Fe(III)-NTA para formar 58Fe-Tf.
    NOTA: Este protocolo foi adaptado de McCarthy e Kosman28.
    1. Dissolver 500 mg de apo-Tf em 4 mL de tampão de carga de 1x Tf.
    2. Ao tubo cónico de 15 ml no passo 1.4.4 contendo 1 ml da solução de 58Fe(III)-NTA, adicionar 4 ml de solução de apo-Tf.
      NOTA: Esta é uma proporção molar de 3:1 de 58Fe-NTA com apo-Tf. Cada Tf contém 2 sítios de ligação Fe; O excesso de 58Fe-NTA foi adicionado para garantir que o Tf estivesse totalmente carregado.
    3. Para permitir a carga máxima de 58Fe-NTA na apo-Tf, verifique se a solução está em pH 7,5 e ajuste o pH, se necessário, com NaHCO3 ou HCl.
    4. Incubar durante 2,5 h à temperatura ambiente.
  6. Remova o excesso não acoplado 58Fe(III)-NTA e liberado NTA.
    1. Transferir a solução de 58 Fe-Tf para uma coluna de corte de peso molecular (corte de 30 kDa) e centrifugar a 2.500× g durante 15 min à temperatura ambiente.
    2. Lavar a coluna com 10 mL de tampão de carga de transferrina 1x e centrifugar a 2.500 × g por 15 min à temperatura ambiente. Repetir a lavagem e centrifugação, realizar uma lavagem salina com 10 mL de solução salina e centrifugar a 2.500 × g por 15 min à temperatura ambiente.
  7. Calcular a concentração de 58Fe-Tf.
    NOTA: Devido à adição do excesso de 58Fe no passo 1.5.2, suponha que toda a transferrina é diférrica. Como 500 mg de apo-Tf foi usado, ~ 500 mg 58Fe-Tf foi produzido na etapa 1.5.4.
    1. Medir o volume recuperado da centrifugação após a lavagem com solução salina na etapa 1.6.2.
    2. Divida 500 mg pelo volume recuperado para determinar a concentração (em mg/mL) da solução de 58Fe-Tf.
  8. Esterilizar a solução de 58Fe-Tf utilizando um filtro de seringa de 0,22 μm; conservar a 4 °C até estarem prontas a utilizar.
    NOTA: 58Fe-Tf solução foi utilizada entre 1 a 4 semanas após o preparo.

2. Configure gestações de camundongos cronometrados

  1. Use camundongos fêmeas de 6 a 8 semanas de idade. Coloque os animais em uma dieta pobre em ferro (4 ppm de ferro) ou ração padrão (185 ppm de ferro) por 2 semanas antes do acasalamento e mantenha os animais nas respectivas dietas durante a gravidez.
  2. Opção 01: Confirmar a gravidez por ganho de peso em E7.5.
    1. Configure várias gaiolas de reprodução. Para cada gaiola, combine 2 fêmeas com 1 macho durante a noite; o dia seguinte, quando os animais são separados, é considerado dia embrionário (E)0.5. Pesar as fêmeas em E7.5 para determinar se estão grávidas. Acasalar machos novamente com fêmeas que não ganharam peso.
      NOTA: No WT C57BL/6, um ganho de peso de 1 g em E7.5 é um bom indicador de gravidez. Este método garante que a implantação ocorreu dentro de um prazo específico de 16 horas, permitindo o tratamento síncrono de todos os animais que engravidaram durante o mesmo período de acasalamento.
  3. Opção 02: Confirmar a gravidez por verificações de plugue.
    1. Combine 2 fêmeas com 1 macho e realize verificações diárias de plugue para determinar se a cópula ocorreu.
      NOTA: Este método pode resultar em gravidezes escalonadas, e a presença de um plugue não garante a gravidez.

3. Administrar 58Fe-Tf por via intravenosa a ratas grávidas E17.5

  1. Prepare 58Fe-Tf da etapa 1.8 para injeção.
    1. Preparar solução de 58Fe-Tf a 35 mg/mL em solução salina; injetar 100 μL por rato.
    2. Encha uma seringa de insulina com 100 μL da solução de 58Fe-Tf.
      NOTA: Cada dose contém 3,5 mg de 58 Fe-Tf humanos (5 μg de 58Fe).
  2. Anestesiar uma rata grávida usando isoflurano.
    1. Use um regulador de isoflurano com uma câmara.
    2. Use as seguintes configurações: 5% de isoflurano, 2 L/mL de O 2,2 min.
    3. Confirme se o rato está anestesiado procurando falta de resposta a uma beliscão do dedo do pé.
    4. Aplique o lubrificante ocular na superfície do olho e coloque o rato numa almofada de aquecimento.
  3. Injete lenta e cuidadosamente a solução de 58Fe-Tf no seio retroorbital.
  4. Permitir que o rato se recupere da anestesia; não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a retração esternal.
  5. Seis horas após a injeção, eutanasiar E17.5 fêmeas grávidas por overdose de isoflurano.
    1. Realizar uma punção cardíaca para exsanguinar o rato como uma forma de eutanásia secundária.
    2. Prenda os pés para baixo com agulhas para estabilização.
  6. Colete os fígados da placenta e do embrião.
    1. Usando pinça estéril e tesoura de dissecação, remova cuidadosamente o útero da rata grávida. Corte uma unidade fetal-placentária placentária, que compreende um único feto e placenta no saco amniótico cercado por uma porção do útero.
    2. Corte cuidadosamente o útero e o saco amniótico sem perturbar o feto e a placenta.
    3. Descasque o saco amniótico e remova o feto e a placenta.
    4. Corte o cordão umbilical.
    5. Limpe o feto e a placenta em uma limpeza de tarefas limpas para remover o excesso de líquido amniótico.
    6. Registre os pesos de toda a placenta.
    7. Corte cada placenta ao meio com uma lâmina de barbear, coloque cada metade em um tubo de 2,0 mL e congele rapidamente em nitrogênio líquido.
      NOTA: Como o58 Fe não requer precauções especiais de manuseio e descarte, metade da placenta pode ser usada para a medição do 58Fe e a outra metade para quaisquer outras análises, incluindo a quantificação da expressão do receptor de transferrina (TFR1) e ferroportina (FPN) por western blotting e qPCR.
    8. Para coletar fígados embrionários, sacrifique o embrião: use uma lâmina de barbear para decapitar rapidamente o embrião.
      NOTA: No E17.5, todos os embriões no útero devem ser eutanasiados individualmente, mesmo que não sejam utilizados no estudo.
    9. Prenda o embrião para estabilização, deixando o abdômen exposto.
    10. Usando uma tesoura de dissecção, faça uma pequena incisão onde o cordão umbilical foi anexado, insira uma extremidade da tesoura de dissecção na incisão e realize um corte plano mediano em direção ao plano coronal de cerca de 1/4 de polegada. Em seguida, realize cortes planos transversais para expor o fígado fetal.
    11. Use fórceps para remover o fígado fetal.
    12. Registre os pesos de todo o fígado embrionário.
    13. Coloque os fígados embrionários inteiros em tubos de 2 mL e congele-os em nitrogênio líquido.
      NOTA: Alternativamente, apenas uma parte do fígado embrionário pode ser usada para a medição de 58Fe, se análises adicionais forem desejadas. O uso de tubos de 2,0 mL permite uma melhor homogeneização tecidual do que tubos de 1,5 mL.
  7. Conservar os tecidos indefinidamente a -80 °C.

4. Tecidos de processo para análise quantitativa de ferro por ICP-MS

  1. Processe a placenta e os fígados fetais para a quantificação do ferro não-heme.
    1. Descongele as metades placentárias e fígados fetais inteiros e pese as metades placentárias (ver passo 3.6.12 para registar os pesos hepáticos fetais).
    2. Adicionar 400 μL de solução de precipitação proteica (HCl 0,53 N, TCA a 5,3%).
    3. Homogeneize o tecido usando um homogeneizador elétrico.
    4. Incubar as amostras a 100 °C durante 1 h.
    5. Arrefecer as amostras em água à temperatura ambiente durante 2 min.
    6. Abra as tampas para liberar a pressão e, em seguida, feche os tubos novamente.
    7. Centrífuga a 17.000 × g por 10 min à temperatura ambiente para detritos de tecido de pellets.
    8. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo rotulado.
    9. Envie amostras para análise ICP-MS.
  2. Processar a placenta e os fígados fetais para a quantificação do ferro heme.
    NOTA: Após a extração de ferro não heme na etapa 1, o ferro restante no pellet é predominantemente heme.
    1. Registar o peso de cada pellet a partir da etapa 4.1.7.
    2. Digerir os pellets em 10 mL de HNO3 concentrado a 70% suplementado com 1 mL de 30% H 2 O2
      NOTA: Consulte o núcleo ou centro da ICP-MS para otimizar o volume de HNO3 para estudos específicos; o volume dependerá, em parte, do peso da amostra.
    3. Aquecer as amostras a 200 °C durante 15 minutos.
    4. Envie as amostras para análise ICP-MS.
      NOTA: Se a distinção entre fontes de ferro heme e não-heme não for necessária e apenas o ferro total for medido, o tecido inteiro pode ser digerido no HNO3 como o primeiro passo.

5. Análise dos dados

NOTA: Os dados da ICP-MS foram fornecidos como concentrações de 56Fe e 58Fe em ng/mL ou mg, ppb (Tabela 1). 56 anos Fe é o isótopo de ferro mais abundante na natureza, e sua medição reflete o acúmulo de ferro na placenta / embrião durante toda a gravidez, enquanto a medição de 58Fe reflete o ferro que foi transferido durante 6 h após a injeção.

  1. Subtraia a abundância natural de 58 Fe (0,28% do Fe) dos valores medidos de 58Fe.
  2. Calcule o total de não-heme 58Fe.
    1. Calcular o fígado embrionário total de ferro não-heme (ng) multiplicando primeiro a concentração de ferro (ng/mL) calculada na etapa 5.1 pelo volume (mL) durante o processamento inicial na etapa 4.1.2 para estimar o total de 58Fe.
    2. Calcular a quantidade de ferro em toda a placenta tomando o peso total da placenta medido no passo 3.6.6 e dividindo-o pelo peso da placenta processada no passo 4.1.1. Multiplique este valor pelo ferro não-heme total (ng) calculado no passo 5.2.1 para obter o teor total de nonheme 58Fe da placenta.
  3. Calcule o total de heme 58Fe.
    1. Calcular o heme total 58Fe multiplicando primeiro a concentração de ferro (ng/mg) calculada na etapa 5.1 pelo peso do pellet (em mg) medido na etapa 4.2.1.
    2. Em seguida, dividir o peso total da placenta medido na etapa 3.5.1 pelo peso do pellet de placenta medido na etapa 4.2.1. Multiplique este valor pelo ferro heme total (ng) calculado no passo 5.3.1 para obter o teor total de heme 58Fe da placenta.
  4. Somar os valores calculados de não-heme e heme 58Fe para determinar o teor total de ferro para cada tecido.

Figure 1
Figura 1: Resumo visual das etapas do protocolo . (A) Preparação de 58Fe-transferrina. (B) Administração in vivo de 58Fe-transferrina. (C) Coleta e armazenamento de tecidos. (D) Processamento da placenta e do fígado embrionário para quantificação de espécies metálicas por ICP-MS. Abreviaturas: Fe = ferro; NTA = ácido nitrilotriacético; Tf = transferrina; PPS = solução de precipitação proteica; Sup = sobrenadante; TCA = ácido tricloroacético; ICP-MS = espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Representative Results

Um estudo anterior usando isótopos de ferro estáveis para medir o transporte de ferro demonstrou que a deficiência materna de ferro resultou na regulação negativa do exportador de ferro da placenta, FPN4. O FPN é o único exportador de ferro de mamíferos conhecido, e a ausência de FPN durante o desenvolvimento resulta em morte embrionária antes de E9,529. Para determinar se a diminuição observada na expressão de NPF se traduziu funcionalmente em diminuição do transporte placentário de ferro, 58Fe-Tf foram injetados por via intravenosa em mães grávidas, e ferro na placenta e no embrião foram quantificados na presença de deficiência materna de ferro.

Para entender como o transporte placentário de ferro é afetado pelo estado de ferro materno, a deficiência de ferro foi modelada em camundongos4. Camundongos fêmeas C57BL/6 foram colocados em uma dieta pobre em ferro (4 ppm de ferro) ou ração padrão (185 ppm de ferro) por 2 semanas antes e durante toda a gravidez. Esse regime alimentar resulta em ferro não-heme do fígado materno inferior e ferro sérico e hemoglobina em E12,5, E15,5 e E18,5 em comparação com animais em dieta padrão4. Em E18.5, embriões de mães deficientes em ferro tinham ferro no fígado mais baixo e eram hipoferrêmicos e anêmicos do que embriões de mães repletas de ferro. Três camundongos prenhes foram utilizados em cada um dos grupos recheio de ferro e deficiente em ferro, e 2-3 placentas foram usadas de cada rato prenhe para análise.

Para quantificar o transporte placentário de ferro, 58 Fe-transferrina foram preparados e injetados por via intravenosa em mães grávidas e 58Fe medidos na placenta e fígado fetal por ICP-MS, conforme descrito no protocolo e ilustrado na Figura 1. Antes do envio de amostras de ferro não-heme para análise de ICP-MS, os níveis totais de ferro não-heme foram quantificados independentemente através de um método de fereno descrito anteriormente30. As concentrações de ferro não-heme medidas pelos métodos féreno versus ICP-MS foram altamente correlacionadas significativamente em todos os tecidos medidos (R2 = 0,94, P < 0,0001, n = 36). Os resultados representativos da quantificação de isótopos de ferro ICP-MS são apresentados na Tabela 1. O total de 58Fe foi calculado conforme descrito na etapa 5 do protocolo. Os dados são apresentados como ferro total e não heme ou não-heme (Figura 2A-D), pois o objetivo era quantificar o ferro total transferido para a placenta e o ferro total transferido para o embrião a partir da placenta.

Em média, 21% da dose de 58Fe administrada foi recuperada na placenta, fígado embrionário e soro embrionário combinados. A medição de 56Fe fornece informações sobre a transferência de ferro a longo prazo na placenta e no fígado embrionário durante a gravidez. O 56Fe placentário total foi semelhante nos grupos deficiente em ferro e -proplete (Figura 2A), enquanto o ferro hepático embrionário total foi diminuído no grupo deficiente em ferro (Figura 2B). Isso era esperado com base na diminuição observada na FPN placentária no grupo4 deficiente em ferro, o que resultaria em retenção de ferro na placenta às custas do embrião. O total de 58Fe fornece um instantâneo do transporte de ferro a curto prazo. Neste estudo, semelhante a 56Fe, o 58 Fe placentário foi semelhante nos grupos deficiente em ferro e -proplete (Figura 2C), e o fígado embrionário 58Fe foi diminuído no grupo deficiente em ferro (Figura 2D). Esses dados indicam que, durante a gravidez deficiente em ferro, a regulação negativa da FPN placentária resulta em diminuição do transporte de ferro para o embrião, levando a diferenças cumulativas no teor de ferro na placenta e no embrião.

É importante considerar a dose de ferro administrada, pois pode levar a alterações não intencionais na concentração de hepcidina ou na expressão do transportador de ferro31. Demonstrou-se que a deficiência materna de ferro causou uma diminuição da FPN4 placentária. Para determinar se a injeção de Fe-Tf afetou essa regulação, a placenta FPN foi medida 6 h após a injeção por western blot. A dose de ferro de 5 μg foi insuficiente para alterar a regulação placentária da NPF por deficiência materna de ferro (Figura 3).

Em resumo, este método foi usado para demonstrar que a regulação fisiológica da NPF placentária durante a deficiência materna de ferro resulta em diminuição do transporte de ferro através da placenta in vivo. Os isótopos estáveis de ferro fornecem uma alternativa sensível e quantificável à radioatividade para a medição do transporte e distribuição de ferro, permitindo o uso simultâneo de tecidos para análises adicionais.

Figure 2
Figura 2: Transporte de 56Fe e 58Fe através da placenta em gestações deficientes em ferro ou repletas de ferro. Total de 56Fe na placenta (A) e fígado embrionário (B). Total de 58Fe na placenta (C) e fígado fetal (D). A análise estatística foi realizada por meio do teste t de Student de 2 caudas para valores normalmente distribuídos e, de outra forma, pelo teste de soma de postos U de Mann-Whitney (denotado por um asterisco após o valor de P). O número de animais é indicado nos eixos x das parcelas de caixa e bigode. A parte superior do gráfico de caixa indica o percentil 75 e a parte inferior indica opercentil 25; Bigodes acima da caixa indicam opercentil 90, e os abaixo da caixa indicam opercentil 10. A linha sólida dentro da caixa indica a mediana e a linha tracejada a média. A análise estatística foi realizada por meio de um software científico de gráficos e análise dos dados. Este valor foi modificado de4. Abreviação: Fe = ferro. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Níveis placentários de TFR1 e FPN. (A) A expressão de TFR1 e FPN foi avaliada por western blot em placenta deficiente em ferro e reclusa 6 h após o tratamento de mães com 58Fe-Tf. (B) A expressão proteica foi quantificada e apresentada como expressão proteica em relação à β-actina. A análise estatística foi realizada por meio do teste t de Student de 2 caudas para valores de distribuição normal. O número de animais é indicado nos eixos x das parcelas de caixa e bigode. A parte superior do gráfico de caixa indica o percentil 75 e a parte inferior indica opercentil 25; Bigodes acima da caixa indicam opercentil 90, e os abaixo da caixa indicam opercentil 10. A linha sólida dentro da caixa indica a mediana e a linha tracejada a média. A análise estatística foi realizada por meio de um software científico de gráficos e análise dos dados. Este valor foi modificado de4. Abreviaturas: TFR1 = receptor de transferrina; FPN = ferroportina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amostra 56 anos Fe 58 anos Fe Total Fe
Concentração [ng/mL ou mg, ppb] Concentração [ng/mL ou mg, ppb] Soma dos isótopos [ng/mL ou mg]
Média* stdev Média* stdev
Ferro não-heme Placenta deficiente em ferro 729.7 17.7 2.5 0.5 732.2
704.9 6.2 3.8 0.1 708.8
649.8 3.8 0.0 0.0 649.8
799.2 4.6 3.8 0.2 803.0
ferro repleto 1919.1 5.3 11.0 0.2 1930.1
1610.0 26.8 11.7 0.6 1621.7
1925.5 39.0 14.0 0.3 1939.5
2551.6 16.1 8.3 0.4 2559.9
Heme Placenta deficiente em ferro 253.8 1.8 1.1 0.0 254.9
32.9 0.4 0.3 0.0 33.2
337.7 5.1 1.4 0.0 339.1
402.3 5.3 1.7 0.0 404.0
ferro repleto 123.5 1.3 0.6 0.0 124.0
75.7 1.3 0.4 0.0 76.1
441.9 3.0 1.9 0.0 443.8
250.4 1.1 1.1 0.0 251.5
Ferro não-heme Fígado embrionário deficiente em ferro 361.6 8.3 31.9 1.0 393.5
652.4 3.4 61.7 0.3 714.1
411.9 10.7 43.1 0.8 455.0
631.1 7.5 62.8 0.2 693.9
ferro repleto 7657.5 129.3 226.4 2.2 7883.8
3820.2 69.5 119.4 3.4 3939.6
5519.0 112.9 145.6 0.5 5664.6
4617.4 78.6 91.6 1.0 4709.0
Heme Fígado embrionário deficiente em ferro 44.5 0.3 1.6 0.0 46.0
31.0 0.4 2.9 0.0 34.0
11.8 0.2 1.1 0.0 12.9
42.3 0.1 3.2 0.0 45.5
ferro repleto 54.3 1.4 2.1 0.0 56.4
31.9 0.8 1.3 0.1 33.2
59.4 0.6 2.2 0.0 61.6
66.7 0.6 2.1 0.0 68.8

Tabela 1: Resultados representativos da quantificação de ICP-MS de 56 Fe e 58Fe em fígados de placentas e embriões. Abreviaturas: ppb = partes por bilhão; stdev = desvio padrão; ICP-MS = espectrometria de massa de plasma indutivamente acoplado.

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Discussion

O ferro é importante para muitos processos biológicos, e seu movimento e distribuição dentro do corpo são altamente dinâmicos e regulados. Os isótopos estáveis de ferro fornecem uma alternativa consistente e conveniente aos isótopos radioativos para a avaliação da dinâmica da homeostase do ferro. Um passo crítico no protocolo é manter o controle de todos os pesos e volumes de tecido. O ferro é um elemento e, portanto, não pode ser sintetizado nem quebrado. Assim, se todos os pesos e volumes forem cuidadosamente registrados, todo o ferro dentro do sistema pode ser contabilizado por cálculo. Como descrito, este método pode ser usado para distinguir entre fontes de ferro heme e não-heme. No entanto, se essa distinção entre as formas de ferro não for necessária e apenas o ferro total for medido, o protocolo pode ser simplificado tratando o tecido apenas com HNO3 concentrado, conforme descrito na etapa 4.2 do protocolo. É importante notar que, se os tecidos não forem perfundidos antes da análise, especialmente tecidos altamente vasculares, como a placenta, a presença de sangue pode resultar na superestimação do conteúdo de ferro heme tecidual.

O ferro ligado à transferrina foi selecionado para o estudo por ser a principal fonte de ferro absorvida pela placenta16,17. O knockdown global do TFR1 em camundongos resultou em letalidade embrionária antes do E12.5, sugerindo que o ferro ligado à transferrina é crítico para o desenvolvimento. É possível que outras espécies de ferro, como ferritina e ferro ligado à não transferrina (NTBI), também contribuam para a dotação fetal de ferro em menor grau. No entanto, a contribuição dessas espécies alternativas de ferro não foi avaliada. No futuro, isótopos estáveis poderiam ser usados para determinar a contribuição de diferentes fontes de ferro para o desenvolvimento e a dotação de ferro embrionário.

O objetivo do estudo foi determinar os efeitos das alterações no estado de ferro materno sobre o transporte de ferro placentário. No entanto, a diminuição da hepcidina durante a deficiência de ferro resulta em níveis elevados de NPF de enterócitos e aumento do transporte de ferro para a circulação1. Assim, em barragens deficientes em ferro, a absorção de ferro da dieta teria sido inerentemente aumentada e confundido a interpretação dos resultados se 58Fe fosse administrado por via oral. Assim, a administração intravenosa de 58Fe-Tf foi selecionada, pois ignora a regulação do ferro ao nível da absorção intestinal. Uma dose de 5 μg de 58Fe/rato foi selecionada com base nas concentrações séricas de ferro de fêmeas grávidas E18.5 repletas de ferro. Em barragens grásticas C57BL/6 E18.5 selvagens, as concentrações séricas de ferro variam de 10 a 50 μM4. Espera-se que uma rata E18.5 grávida tenha aproximadamente 2 ml de volume sanguíneo total32. Assim, a quantidade total de ferro na circulação de barragens grávidas repletas de ferro varia de 1,1 a 5,6 μg. Assim, 5 μg de 58Fe/rato é equivalente às concentrações fisiológicas observadas em animais repletos de ferro.

Uma limitação da detecção de ICP-MS de 58 Fe é a interferência isobárica de 58Ni. As concentrações endógenas de Ni na placenta do rato são de 0,04 ± peso húmido de 0,02 μg/g33. Uma placenta média de camundongo E18.5 pesa 0,080 g; portanto, a quantidade total de Ni é de aproximadamente 3,2 ng. A abundância natural de 58 Ni é de 68%; assim, a quantidade de 58 Ni na placenta do rato é de ~2,2 ng, o que é aproximadamente 10 vezes menor do que os níveis detectados de 58Fe. No embrião, as concentrações de Ni são ainda menores em 0,01 ± peso úmido de 0,01 μg/g33. O embrião médio de camundongo E18.5 pesa 1 g; assim, a quantidade total de Ni em um embrião de camundongo normal é de aproximadamente 10 ng. Supondo que todo o embrião Ni seja encontrado no fígado embrionário, esses níveis ainda são 10 vezes menores do que as concentrações de 58Fe e quase 1.000 vezes menores do que o teor total de ferro no fígado embrionário. Dada a menor abundância de Ni nesses tecidos de camundongos, a interferência de 58Ni não foi levada em conta neste estudo.

Uma consideração adicional é o limite de detecção do ensaio. O limite de detecção neste estudo foi de 250 pg/mL 58Fe. No entanto, este limite pode ser alterado para detectar concentrações ainda mais baixas de 58Fe se a diluição dos tecidos for reduzida na etapa de processamento tecidual (etapa do protocolo 4.1.2 e Figura 1D) ou por meio de modificações na instalação central do ICP-MS. Quando 58 Fe foi medido em todo o embrião, seus níveis não foram detectados, pois a concentração de 58Fe estava abaixo do limite de detecção. No entanto, 58Fe foi detectado no fígado embrionário, que é o principal órgão de armazenamento de ferro. É possível que a administração de uma dose maior de 58 Fe teria permitido a detecção de 58Fe mesmo em todo o embrião. No entanto, uma quantidade relativamente pequena de 58Fe foi usada para evitar a carga de ferro da placenta, o que poderia desencadear mecanismos de feedback e alterar a expressão dos transportadores de ferro. Neste modelo, que utilizou camundongos C57BL/6 do tipo selvagem, o ferro hepático embrionário foi medido como reflexo do transporte total de ferro placentário, uma vez que a concentração de ferro no fígado embrionário é proporcional à concentração de ferro no embrião inteiro4. No entanto, em modelos de camundongos onde a distribuição de ferro é alterada34, o ferro do fígado embrionário sozinho pode não representar com precisão o transporte total de ferro placentário. Nesses casos, pode ser necessário medir o ferro incorporado em todo o embrião ou no compartimento dos eritrócitos. Além disso, variações nos pontos de tempo experimentais também exigirão otimização e medição adicionais do ferro em vários compartimentos fetais. Esta abordagem de traçado de isótopos estáveis foi utilizada para quantificar o transporte de ferro durante a gravidez em rata. A metodologia é facilmente adaptável para estudar o transporte de ferro em camundongos não prenhes e outros modelos animais.

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Disclosures

EN é co-fundador científico da Intrinsic LifeSciences e da Silarus Pharma e consultor da Protagonist, Vifor, RallyBio, Ionis, Shield Therapeutics e Disc Medicine. VS declara não conflitos.

Acknowledgments

Os autores reconhecem o uso da instalação ICP-MS dentro do Centro de Implicações Ambientais da Nanotecnologia da UC no CNSI da UCLA por sua assistência na otimização do protocolo para medições de 58Fe. O estudo foi apoiado pelo NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (K01DK127004, to VS) e pelo NIH National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, to EN).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
58Fe-iron metal Trace Sciences International Fe-58
Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff Millipore Sigma UFC903024
Centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-49B
Centrifuge tubes, 50 mL Millipore Sigma CLS430829
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Fisher Scientific 75002432
Centrifuge, Sorvall Legend RT
Delicate task wipers Fisher Scientific 06-666
Diet: iron-deficient (4 ppm iron) Envigo Teklad TD.80396
Diet: standard chow (185 ppm iron) PicoLab 5053
Dissecting scissor with 30 mm cutting edge VWR 25870-002
Forceps 4-1/2 inch length McKesson 157-469
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Homogenizer, Bio-Gen PRO200 PROScientific 01-01200
Human apo-transferrin (apo-Tf) Celliance 4452-01 no longer available, alternative: Millipore 616419
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water Cole-Parmer EW-88216-36
Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 Fisher Scientific 14-826-79
Isoflurane VETone 502017
Isoflurane vaporizor Summit Anesthesia Solutions
Metal heat block Fisher Scientific
Micro centrifuge tube with flat screw-cap VWR 16466-064
Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-320
Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention Fisher Scientific 02-681-321
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized Millipore Sigma SLGP033RS
Nitrilotriacetic acid (NTA) Sigma 72560-100G
Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use Fisher Scientific 14-826AA
pH Strips, plastic pH5.0-9.0 Fisher Scientific 13-640-519
Razor blades 0.22 mm VWR 55411-050
Scale (g) Mettler Toledo PB1502-S
Scale (mg) Mettler Toledo Balance XS204
Sodium bicarbonate (NaHCO3) Sigma S5761-500G
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S671-3
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS266-1
Sterile syringe, slip tip (1 mL) Fisher Scientific 309659
Trichloroacetic acid (TCA) Fisher Scientific A322-500
Software
ImageLab Bio-Rad
SigmaPlot Systat

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References

  1. Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
  2. Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
  3. Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
  4. Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
  5. Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
  6. Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
  7. O'Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
  8. Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
  9. Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
  10. Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
  11. Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, Suppl 6 1567-1574 (2017).
  12. van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
  13. Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
  14. Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
  15. Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
  16. Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
  17. Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
  18. Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
  19. Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
  20. Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport--a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
  21. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  22. Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
  23. Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
  24. Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
  25. Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
  26. Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
  27. Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
  28. McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
  29. Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
  30. Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
  31. Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
  32. Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
  33. Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
  34. Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).

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Biologia Edição 183
Quantificando o transporte de ferro através da placenta de camundongo <em>in vivo</em> usando isótopos de ferro não radioativos
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Sangkhae, V., Nemeth, E.… More

Sangkhae, V., Nemeth, E. Quantitating Iron Transport Across the Mouse Placenta In Vivo Using Nonradioactive Iron Isotopes. J. Vis. Exp. (183), e63378, doi:10.3791/63378 (2022).

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