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Bioengineering

体内 使用双光子荧光和受激拉曼散射显微镜对生物组织进行成像

Published: December 20, 2021 doi: 10.3791/63411
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4, 5
1Department of Electronic and Computer Engineering, The Hong Kong University of Science and Technology, 2State Key Laboratory of Molecular Neuroscience, The Hong Kong University of Science and Technology, 3Center of Systems Biology and Human Health, The Hong Kong University of Science and Technology, 4Molecular Neuroscience Center, The Hong Kong University of Science and Technology, 5Department of Biology, School of Life Sciences, Southern University of Science and Technology

Summary

受激拉曼散射（SRS）显微镜允许根据特定化学键的固有振动对生物分子进行无标记成像。在该协议中，描述了集成SRS和双光子荧光显微镜的仪器设置，以可视化活小鼠脊髓中的细胞结构。

Abstract

受激拉曼散射（SRS）显微镜能够基于内在分子振动对自然微环境中的生物组织进行无标记成像，从而为亚细胞分辨率下生物过程的 体内 研究提供了完美的工具。通过将双光子激发荧光（TPEF）成像集成到SRS显微镜中，组织的双模态 体内 成像可以从多个角度获取关键的生化和生物物理信息，这有助于了解细胞代谢，免疫反应和组织重塑等所涉及的动态过程。在该视频协议中，介绍了TPEF-SRS显微镜系统的设置以及动物脊髓的 体内 成像方法。脊髓作为中枢神经系统的一部分，在大脑和周围神经系统之间的通信中起着至关重要的作用。髓鞘富含磷脂，包围并隔离轴突，以允许作用电位的盐传导。脊髓髓中髓鞘的 体内 成像对于研究神经退行性疾病和脊髓损伤的进展非常重要。该协议还描述了动物制备和 体内 TPEF-SRS成像方法，以获取高分辨率的生物图像。

Introduction

拉曼显微镜1，2正在成为一种强大的无标记方法，可以根据生物分子中各种化学键的特征频率对生物组织进行成像。由于其非侵入性和适应性强的成像能力，拉曼显微镜已被广泛用于成像生物组织中富含脂质的成分，如髓鞘3，4，5，脂肪细胞6，7和脂滴8，9，10.受激拉曼散射（SRS）信号作为受激拉曼增益（SRG）或受激拉曼损耗（SRL）获得的受激拉曼散射（SRS）信号是无背景的，显示出与自发拉曼散射的完美光谱相似性11，12。此外，SRL和SRG线性依赖于分析物浓度，允许对生化组分进行定量分析9，11，13。双光子激发荧光显微镜（TPEF）由于其固有的光学切片能力，深度渗透深度和低光毒性，已被广泛用于体内生物成像14，15，16。然而，TPEF成像的性能取决于荧光标签的特性，并且由于宽带荧光光谱8，17，18，19，可分辨颜色的数量受到限制。无标记SRS成像和基于荧光的TPEF成像是两种互补的成像方式，它们的组合可以提供丰富的组织生物物理和生化信息。这两种成像模式都基于非线性光学（NLO）过程，允许简单地集成到一个显微镜系统中。SRS和TPEF成像的结合，即所谓的双模态成像，可以对细胞和组织进行高维成像和分析，从而促进对复杂生物系统的全面理解。具体而言，与飞秒（fs）SRS技术相比，皮秒（ps）SRS显微镜可以实现具有高光谱分辨率的化学键成像11，从而可以区分生物组织中的多种生化成分，特别是在拥挤的指纹区域20，21。此外，与另一种集成了相干反斯托克斯散射（CARS）显微镜的常用双模态NLO显微镜系统相比，SRS在光谱和图像解释以及检测灵敏度方面表现出优于CARS的性能11。SRS-TPEF显微镜已被用作研究各种生物系统的有力工具，例如秀丽隐杆线虫9，22，非洲爪蟾蝌蚪脑5，小鼠脑23，24，脊髓25，26，周围神经27和脂肪组织7等。

脊髓与大脑一起构成了中枢神经系统（CNS）。在生理和病理条件下，可视化CNS体内的细胞活动对于理解CNS疾病的机制28，29，30和开发相应的疗法至关重要31，32，33。髓鞘包裹和绝缘轴突以实现高速动作电位传导，在CNS的发展中起着重要作用。脱髓鞘被认为是白质疾病的标志，如多发性硬化症34。此外，脊髓损伤后35，髓鞘碎片可以调节巨噬细胞活化，导致慢性炎症和继发性损伤36。因此，活体小鼠模型中髓鞘与神经元和神经胶质细胞的体内成像对了解CNS疾病的动态过程有很大帮助。

在该协议中，描述了自制TPEF-SRS显微镜的基本设置程序，并介绍了小鼠脊髓的双模态 体内 成像方法。

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Protocol

本工作所进行的所有动物程序均按照香港科技大学（科大）实验动物设施的指引进行，并已获科大动物伦理委员会批准。设置和操作TPEF-SRS显微镜需要激光处理的安全培训。处理激光时，始终佩戴波长范围合适的激光安全护目镜。

1. TPEF-SRS显微镜的设置（设置原理图见 图1）

  1. 使用与锁模镱光纤激光器连接的集成光学参数振荡器 （OPO） 作为 SRS 成像的 ps 激光源。
    注：OPO 输出斯托克斯光束 （1031 nm） 和泵浦光束（可在 780 nm 至 960 nm 范围内调节），脉冲持续时间为 2 ps，重复频率为 80 MHz。斯托克斯光束由内置电光调制器（EOM）调制至20 MHz，用于MHz级的高频相敏SRS检测。
  2. 使用fs钛（Ti）：蓝宝石激光器作为TPEF成像的激光源。
  3. 使用一对透镜（L1 和 L2）准直并将 fs 光束的大小调整为 3 mm。
  4. 使用一对透镜（L3 和 L4）对准 ps 激光束并将其直径扩展到 3 mm。
  5. 使用半波板将fs激光束的偏振从p偏振更改为s偏振。
  6. 将两束激光束与偏振分束器 （PBS） 组合使用。
  7. 在 PBS 后面添加一对 3 mm XY 扫描振镜，用于光束扫描。
  8. 使用远心扫描透镜（L5）和无限远校正镜筒透镜（L6）使扫描镜和25倍物镜的后瞳共轭。通过扫描透镜和管透镜扩展激光束，以填充物镜的后孔径。
  9. 在管透镜和物镜之间放置PBS或二向色镜（D2），用于SRS或荧光信号采集。使用电动脚蹼在 PBS 和 D2 之间切换。
    注：部分背散射SRS信号在通过PBS时会丢失，这是由于其随机偏移。
  10. 使用一对透镜（L7 和 L9）缩小检测光束，并将 25 倍物镜的后瞳与光电二极管传感器共轭。
  11. 使用一对透镜（L8和L10）缩小检测光束，并将25倍物镜的后瞳与光电倍增管（PMT）的检测表面共轭。
  12. 使用二向色镜（D3）分离荧光和SRS信号的检测路径。
  13. 在光电二极管探测器前放置一个滤光片组（Fs1），以阻挡斯托克斯激光并仅通过泵浦光束。
  14. 在PMT检测器前放置一个滤光片组（Fs2），以仅传递目标荧光信号。
  15. 将 PMT 连接到电流放大器以进行信号放大。
  16. 将光电二极管连接到锁相放大器。
  17. 将同步信号从内置EOM输出连接到锁相放大器的参考输入，以进行SRS信号解调。
  18. 将PMT放大器和锁相放大器输出连接到数据采集模块。

2. TPEF-SRS显微镜系统校准

  1. 激光器的启动
    1. 将钥匙开关从 待机 位置切换到 “开” 位置以打开Ti：蓝宝石激光器，并等待30分钟，让激光器预热。
    2. 通过单击 OPO 控制面板上的“ 开始 ”按钮打开 OPO，然后等待 20 分钟让激光预热。
    3. ps激光预热后，使用高速光电探测器检查斯托克斯光束的调制深度。打开斯托克斯光束的激光快门。单击“ 设置 OPO 电源 ”框并输入 20。将高速光电探测器放在OPO输出端以检测光束。使用带有卡口尼尔-康塞尔曼（BNC）连接器的同轴电缆将光电探测器的输出端口连接到示波器的输入端口，以监视激光脉冲。
    4. 在 OPO 控制 软件中打开 EOM 控制窗口。根据示波器上显示的脉冲强度图调整 EOM 功率和相位，以在 20 MHz 时实现最大调制深度。
      注意：EOM 性能通常稳定，只有在发现 SRS 信号显著降低时才需要检查。
  2. 组合TPEF-SRS显微镜的光学对准
    1. 执行光学对准以共定位ps和fs光束，如步骤2.2.2至2.2.13中所述。
    2. 打开泵浦激光快门，同时停止 OPO 控制软件中的 Stokes 输出。使用 OPO 控制软件，单击“ 设置信号 ”框并输入波长值 796，将泵浦光束的波长设置为 796 nm。单击“ 设置 OPO 电源”框并输入 20 以将其功率设置为最小值 （~20 mW） 以进行光学对准。
    3. 打开显微镜计算机和所有相关电子元件，包括扫描仪、物镜执行器、光电二极管、PMT、电流放大器、锁相放大器和电动翻转器。启动显微镜控制软件。
      注：显微镜控制软件为自制界面。
    4. 在光路上放置两个对准板（ 图1中的P1和P2）。将 P1 放在 PBS 后面约 10 厘米的距离，将 P2 放在 P1 后面约 30 厘米的距离。
      注：ps和fs光束使用PBS组合（图1）。两个对准板用于检查两个激光束的对准和共定位。
    5. 打开ps激光束的显微镜快门。
    6. 调整反射镜 M1 以将 ps 激光束中心定位在 P1 的通孔处。在调整反射镜 M1 时，使用红外 （IR） 示波器观察 P1 处的光束点的位置。
    7. 调整反射镜 M2，将 ps 激光束中心定位在 P2 的通孔处。使用红外示波器观察光束点在调整反射镜M2时在P2的位置。
    8. 重复步骤2.2.6和2.2.7，直到ps光束中心位于两个对准板的通孔处。在显微镜控制软件中关闭ps光束的快门。
    9. 将fs Ti：蓝宝石激光的波长设置为740nm，然后打开激光快门。将激光功率设置为5 mW（在显微镜系统的输入端口测量）以进行光学对准。
    10. 打开显微镜快门，用于fs激光束。
    11. 调整反射镜 M3 以将 fs 激光束光斑中心定位在 P1 的通孔处。
    12. 调整反射镜M4，将激光束光斑中心定位在P2的通孔处。
    13. 重复步骤2.2.11和2.2.12，直到fs激光束中心位于两个对准板的通孔处。关闭显微镜快门以显示fs光束。
    14. 执行泵和斯托克斯梁的空间重叠，如步骤 2.2.15 至 2.2.18 中所述。
      注意：虽然泵浦束和斯托克斯光束在ps激光器内部大致重叠，但需要对两个激光束的位置进行微调，以实现最佳的SRS性能。由于泵梁首先如前所述对齐，因此接下来将调整斯托克斯梁以与泵梁共定位。
    15. 将相机放置在物镜的位置，以可视化两个光束点的位置。在相机屏幕上标记泵束的位置作为参考。
    16. 将对齐板P0放在L3之前（图1）。使用十六进制键调整光学反射镜 1 （OM1），以便 Stokes 光束中心通过对准板的通孔，并与激光输出端口处的泵浦光束共定位。在调整过程中，使用红外示波器确认光束光斑在P0的位置。
      注：OM1和OM2是OPO头中的两个反射镜，用于调整1031 nm Stokes光束的位置。
    17. 取下对齐板 P0 并使用十六进制键调整 OM2，以便 Stokes 光束的中心与相机上泵波光束的参考标记共定位。
    18. 重复步骤 2.2.16 和 2.2.17，直到 Stokes 光束在 P0 和相机平面上与泵浦光束严格重叠。
      注：在相机上可视化光束点时，应从光路中取出所有对准板。
  3. 优化成像条件
    1. 按照步骤2.3.2中所述对锁相放大器进行相位调整。到 2.3.7。
      注：SRS检测基于高频鉴相方案。对于SRL检测，Stokes光束的强度调制为20 MHz，并使用锁相放大器对信号进行解调。需要调整锁相放大器的相位和偏移，以实现最佳的图像对比度。
    2. 打开锁相放大器控制软件。
    3. 将泵浦激光器的波长设置为796 nm，泵浦和斯托克斯光束的功率分别设置为样品上的15 mW和25 mW。
      注意：这里使用橄榄油进行SRS成像优化和校准。碳氢区橄榄油的拉曼峰为2863.5 cm-1，对应于796nm处的泵束波长。
    4. 将橄榄油密封在载玻片中，并将折叠的薄纸贴在载玻片的底部，以增强信号反向散射，以进行Epi-SRS检测。将橄榄油样品放在载物台上，并将25倍物镜的焦点调整到样品上。
    5. 使用显微镜控制软件按如下方式设置成像参数：500 μm x 500 μm视场（FOV）为512 x 512像素，像素停留时间为6.4 μs。使用锁相放大器控制软件将时间常数值设置为10 μs，接近像素停留时间。
    6. 扫描样品上的激光束。使用锁相放大器控制软件以22.5°的步长调整相位（0-180°），直到SRS信号强度达到最大值。
      注：在这款全模拟锁相放大器中，信号输出是同相分量，这取决于参考信号的相位。锁相放大器控制软件可调节相位，分辨率为11°，可将检测到的信号最大化至~2%12以内。一旦同步信号中断，锁相放大器就会失相。每次重新建立同步信号时，都需要重新调整相位。
    7. 关闭激光快门扫描样品。使用锁相放大器控制软件以1 mV的步长调整失调值，直到平均SRS信号接近零。
      注：平均SRS信号估计为SRS图像中所有像素的平均强度，由显微镜控制软件自动计算。失调对于消除不需要的相位相干信号非常有用。
    8. 执行时间同步优化，如步骤 2.3.9 至 2.3.14 中所述。
    9. 在OPO控制软件中打开 “延迟管理器 ”对话框（图2）。
    10. 扫描橄榄油并调整延迟阶段，直到橄榄油SRS信号达到最大值。
      注：这是SRS成像的第一次，当锁相放大器的相位尚未优化时，首先粗略调整时间同步以可视化样品的SRS信号，然后再优化锁相放大器的相位。
    11. 停止扫描并单击延迟管理器对话框中的 添加数据 按钮以记录当前的延迟数据。
    12. 重复步骤 2.3。10 和 2.3.11 适用于不同波长的不同化学样品。
      注：聚苯乙烯珠、重水、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷、甘油用于测量不同振动带的延迟数据。
    13. 在延迟管理器对话框中选择 “数据拟合 ”和“ 5 阶 ”，以将当前数据点与五阶多项式函数拟合。通过单击“ 用作自定义” 按钮并选中复选框来应用拟合的数据。延迟级将根据拟合的延迟曲线在不同波长下自动调整。
    14. 将所有延迟数据保存在文本文件中，可以加载以供将来使用。

3 . 小鼠体内 荧光和SRS成像的手术制备

  1. 消毒所有必需的工具，包括手术刀、弹簧剪刀、镊子、盖玻片和纱布垫。
  2. 消毒所有表面，在手术过程中用70%乙醇接触。用无菌窗帘覆盖工作台的工作区域。在悬垂物下放一个加热垫。
  3. 使用Thy1-YFP-H（Tg（Thy1-YFP）HJrs/J）37 只在背根神经节传入神经元中表达增强型黄色荧光蛋白（EYFP）的转基因小鼠进行 体内 脊髓成像。称量小鼠并通过腹膜内注射氯胺酮 - 木肼嗪混合物（87.5mg kg-1 和12.5mg kg-1）诱导麻醉。
  4. 捏住鼠标的脚趾以确保深度麻醉。如果需要，补充一半的原始剂量的麻醉剂。将软膏涂抹在小鼠眼睛上，以防止角膜干燥。
  5. 剃掉胸椎上方背部的头发，然后使用脱毛膏完全去除头发。用碘溶液消毒剃须区域。
  6. 用手术刀在T11-T13椎骨上做一个小的中线切口（约1.5厘米）。
  7. 用弹簧剪刀和镊子切开T11-T13椎骨顶部和侧面的肌肉和肌腱。暴露三个相邻的椎骨。使用无菌纱布垫和无菌盐水来控制出血并清洁手术部位。
  8. 在定制设计的稳定台上，借助两个不锈钢侧杆稳定脊柱（图2B）。
  9. 使用#2镊子在T12处进行椎板切除术。小心地使用镊子逐块打破层，直到T12椎骨的整个层被移除。
  10. 用无菌盐水冲洗掉覆盖脊髓的血液，并使用纱布垫吸收过多的液体。用纱布垫对出血部位施加压力以控制出血。
  11. 将盖玻片（22 x 22 mm）放在夹紧杆上，并用生理盐水填充盖玻片和脊髓之间的间隙。

4. 小鼠脊髓 的体内 TPEF-SRS成像

  1. 将稳定台安装在TPEF-SRS显微镜下方的五轴台上。
    注：五轴平台允许三轴平移和±5°俯仰和滚动弯曲运动。
  2. 用两根头杆固定鼠标头，并降低固定板，以便在呼吸过程中为胸部运动提供足够的空间，从而减轻运动伪影。
  3. 在鼠标下方插入加热垫，以便在成像过程中保持鼠标温暖。
  4. 调整z平移阶段以调整焦点，直到在10倍物镜下可以观察到脊髓脉管系统的明场图像。
  5. 通过调整五轴阶段的两轴平移阶段，将脊髓背静脉定位在FOV的中心。
  6. 调整五轴载物台的滚动和俯仰角度，以根据明场图像调整垂直于物镜轴的脊髓背表面。
  7. 将10x替换为25x水浸物镜，用于TPEF-SRS成像。
  8. 将fs光束的波长设置为920 nm。将样品上的fs光束功率调整为10 mW。
  9. 将泵浦光束的波长设置为 796 nm。将泵和斯托克斯光束的功率分别调整为样品上的60 mW和75 mW。
    注：脊髓SRS成像在2863.5 cm-1的波数下进行，这对应于基于测量的SRS光谱的碳氢区域髓鞘的拉曼峰7，9。确定激光功率以确保脊髓的高分辨率TPEF-SRS成像。在当前的成像条件下，未观察到组织损伤。
  10. 对于SRS成像，通过按下连接到电动脚蹼的 开关 按钮，使用电动脚蹼选择物镜上方的PBS。
  11. 按如下方式设置成像参数：512 x 512 像素，150 μm x 150 μm FOV，3.2 μs 像素停留时间，2 μs 时间常数。
  12. 开始扫描样本并将焦点放在脊髓的背表面上。
  13. 通过OPO控制软件微调延迟阶段，直到达到最大的脊髓SRS信号。
    注：生物样品可诱导额外的色度分散，可能需要调整延迟阶段以优化时间同步。然而，当在组织顶面附近进行SRS成像时，由生物组织和成像窗口引入的两个激光脉冲的时间差通常很小（小于几百fs）。
  14. 对于TPEF成像，通过按下连接到电动脚蹼的 开关 按钮，使用电动脚蹼选择物镜上方的二向色镜D2。
  15. 设置成像参数并开始扫描样品。要捕获 TPEF-SRS 图像堆栈，请在进入下一个深度之前，以 1 s 的间隔以相同的深度顺序获取 TPEF 和 SRS 图像。TPEF成像的成像参数为512 x 512像素，150 μm x 150 μm FOV，3.2 μs像素停留时间。
  16. 收集完所有图像后，将动物从稳定阶段移开。
  17. 通过冲洗生理盐水清洁暴露的组织，并使用纱布垫吸收多余的液体。将硅胶涂在暴露的脊髓上，等待约5分钟，直到固化。
  18. 用#6-0手术缝合线缝合皮肤以闭合伤口。在手术部位的皮肤上涂抹烧伤霜以防止感染。皮下给予镇痛治疗（0.1mg / kg丁丙诺啡）。
  19. 将动物放在干净的笼子中，并将笼子放在加热垫上，直到小鼠从麻醉中完全恢复。
  20. 术后每12小时重复一次镇痛药，持续3天。
  21. 关闭OPO和fs激光的快门。将泵和斯托克斯光束的功率设置为最大。
    注：在关闭激光器之前设置最大功率有利于激光器维护。
  22. 将泵浦光束和fs激光的波长设置为800 nm。
  23. 将两台激光器设置为待机状态，关闭所有电子控制软件并关闭所有相关设备。

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Representative Results

使用Thy1-YFPH转基因小鼠进行脊髓轴突和髓鞘的体内双模态成像，其在背根神经节传入神经元中表达EYFP（图3）。这些标记的传入神经元将感觉信息从周围神经传递到脊髓，中央分支位于脊髓背柱中。使用TPEF-SRS显微镜，可以使用无标记SRS成像清晰地观察密集分布的髓鞘，并且可以使用TPEF成像观察稀疏标记的YFP轴突。通过双模型成像显示，轴突被一层厚厚的髓鞘紧密包裹（图3C）。Ranvier（NR）的节点，其中轴突是髓鞘的裸露，在动作电位的快速盐渍传播中起着至关重要的作用。从TPEF-SRS脊髓图像（图3C）中可以看出，NR显示轴突直径减小，轴突直接暴露于细胞外基质。必须将轴突与周围的髓鞘一起成像，以确认NR的存在和位置。因此，TPEF-SRS显微镜检查使我们能够观察轴突和髓鞘在脊髓疾病发展中的动态变化，这对于了解细胞动力学的机制具有重要意义。

Figure 1
图1：TPEF-SRS显微镜系统的示意图。 泵浦和斯托克斯光束与皮秒（ps）激光中的二向色镜（D1）组合。ps光束和飞秒（fs）光束通过一对透镜（分别为L3，L4和L1，L2）进行准直和扩展/缩小，以匹配3 mm XY扫描振镜。fs光束通过半波板（HWP）从水平偏振旋转到垂直偏振，然后通过偏振分束器（PBS）与ps光束组合。扫描镜和物镜的后瞳由远心扫描透镜L5和无限远校正管透镜L6共轭。激光束通过扫描和管透镜扩展，以填充25倍物镜的后孔径。对于受激拉曼散射（SRS）成像，物镜收集的反向散射泵束被PBS反射并定向到大面积（10 mm x 10 mm）硅光电二极管（PD）。对于双光子成像，双光子激发荧光（TPEF）信号通过二向色分束器D2反射到光检测单元。电流光电倍增管（PMT）模块用于检测TPEF信号。缩写-L1-L10：镜头;OL：物镜;D1-D3： 二向色镜;Fs1， Fs2： 过滤器组;M：镜子;OM1， OM2： 光学反射镜;P0-P2：对准板。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 2
图 2：OPO 控制软件上的延迟管理器界面。 红色箭头表示用于应用校准延迟数据的复选框。 请点击此处查看此图的放大版本。

Figure 3
图3：小鼠脊髓的 体内 TPEF-SRS成像。 （A）小鼠脊髓手术准备示意图和脊髓明场图像。（B）用于脊髓 体内 成像的小鼠安装方案。（C）小鼠脊髓轴突和髓鞘的最大z投影图像。白色箭头表示 Ranvier 节点的位置。髓鞘的SRS图像是在2863.5 cm-1的拉曼位移下拍摄的。 图A 是使用BioRender创建的（https://biorender.com/）。 请点击此处查看此图的放大版本。

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Discussion

在该协议中，详细描述了TPEF-SRS显微镜的基本设置。对于SRS成像，泵浦和斯托克斯光束在OPO内部在时间和空间上重叠。然而，这种重叠在通过显微镜系统后可能会被破坏。因此，泵和斯托克斯光束共定位的空间和时间优化对于实现最佳SRS成像是必要的，也是至关重要的。泵浦和斯托克斯光束之间的时间延迟与两束光束的光路差有关，这取决于光学元件在显微镜系统中的色散38。当泵浦光束的波长针对不同拉曼偏移下的SRS成像进行调整时，泵浦光束的光程长度会相应地变化，因为光学透镜的折射率取决于波长38。因此，泵浦和斯托克斯激光脉冲之间的时间延迟随泵浦束的波长而变化，因此需要校准。OPO配备了软件控制的延迟线，用于泵和斯托克斯光束的时间同步。对于相同的光学设置，延迟数据保持稳定，只需要校准一次。因此，泵束不同波长的延迟数据可以在第一次测量时保存，以备将来使用。当泵浦光束的波长发生变化时，OPO控制软件可以自动应用校准的延迟数据，这便于在不同拉曼偏移或高光谱SRS成像下进行SRS成像。对于TPEF-SRS成像，组合后ps和fs光束的严格空间重叠是避免两个成像模型之间任何FOV偏移的关键步骤。首先，ps泵浦光束和fs光束对齐，以确保它们都位于显微镜系统的光轴上，这对于在切换两个成像模型时避免任何FOV偏移至关重要。然后，以泵梁为参考，相应地调整斯托克斯梁位置，以实现严格的空间共定位。每个对齐过程都需要多次试验才能达到最佳效果。

如果SRS信号明显减小，应首先检查锁相放大器的相位值和延时数据。由于锁相放大器在同步信号中断后异相，因此每次电源或EOM同步信号中断后都需要重新调整相位值。通过稍微调整OPO内部的延迟线，可以快速检查泵和斯托克斯光束的时间同步。如果校准的时间延迟数据远离最佳值，则应执行零扫描以通过单击延迟管理器对话框中的 零扫描 按钮来重新校准延迟偏移。整个零扫描过程大约需要10分钟。如果SRS信号在优化相位和延时值后无法恢复，则应按照步骤2.1.3-2.1.4中所述检查斯托克斯光束的EOM调制。如果在斯托克斯脉冲序列的关闭位置观察到小脉冲峰，消光比远小于10 dB，则应重新启动EOM，并重新调整调制功率和相位，以实现最大的调制深度。通常，调制问题可以通过重置EOM来解决。如果没有，则应要求制造商提供技术支持。

对于 体内 厚组织成像，必须使用 epi-SRS 检测模式。在该协议中，PBS用于通过激发激光并将背散射SRS信号反射到探测器。检测到的SRL信号取决于组织对前向泵束的反向散射。激发激光器具有线性偏振，可以完全穿过PBS，而反向散射光束具有偏振移位，因此只能被PBS部分反射。因此，与直接将环形光电探测器放置在Objective12前面的策略相比，当前的信号采集方案显示出较低的效率。然而，由于富脂组织的强散射39，脊髓的高信噪比SRS图像（512 x 512像素）可以在1-2 s的整合时间内获得，这使得这种基于PBS的收集方案成为脊髓成像的合适方法。然而，另一方面，强组织散射限制了光的穿透深度。对于SRS和TPEF成像，脊髓的成像深度限制为约50μm。

SRS和TPEF成像的顺序成像程序是当前双模态成像方法的主要限制。在协议中，TPEF和SRS成像通过自动切换电动脚蹼，以1秒的间隔在同一位置依次进行。运动伪影可能导致TPEF和SRS图像的不完美合并，这限制了这种方法对高度动态过程或组织进行成像的能力，这些过程或组织在很大程度上受到动物的呼吸和心跳的影响。一种可能的解决方案是在SRS成像期间同时收集ps激光激发的双光子荧光9。然而，这种方法仅适用于具有强荧光信号的生物结构，因为与fs脉冲相比，ps脉冲具有低得多的荧光激发效率14。或者，可以使用fs-SRS系统22，40来解决这个问题，其中fs激光源允许同时激发SRS和TPEF信号，但代价是SRS成像的光谱分辨率较低。另一种解决方案是使用在SRS成像期间获得的ps激光激发荧光作为参考来记录fs荧光图像。如图 3所示，如果在SRS和荧光成像期间没有发生显着的运动，则该配准策略效果良好。

SRS在生物成像方面具有独特的优势，因为它基于其特定的无标记造影机制提供生物分子的化学信息41。与同时与TPEF结合进行多模态NLO成像的CARS相比，SRS显示出更好的光谱和图像解释能力11。因此，它已被广泛用于成像脂质9，11，蛋白质42，43，DNA44以及含有炔烃（C ≡C）13，45，碳氘（C−D）9，46 和氧氘（O-D）键的生物正交组分47，48 在生物组织中。在该协议中，我们使用ps激光源进行SRS成像，使用fs激光源进行TPEF成像，它结合了高效荧光激发和高拉曼光谱分辨率的优点，可以有效区分各种生物分子42，44。在脊髓中，涉及神经胶质细胞、神经元和募集免疫细胞的复杂细胞-微环境相互作用有助于损伤49 和疾病的进展50。结合各种荧光和SRS成像探针，TPEF-SRS显微镜可以实现对各种细胞结构及其独特的生物分子成分的同步成像，这可以显着促进我们对脊髓疾病的发病和发展的理解。

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Disclosures

作者无需披露任何信息，也没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

本署透过拨款16103215、16148816、16102518、16102920、T13-607/12R、T13-706/11-1、T13-605/18W、C6002-17GF、C6001-19E、N_HKUST603/19、创新及科技署（ITCPD/17-9）、大学教育资助委员会卓越领域计划（AoE/M-604/16， AOE/M-09/12）及香港科技大学（科大）资助RPC10EG33，支持这项工作。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#2 Forceps Dumont 11223-20 For laminectomy
10X objective Nikon CFI Plan Apo Lambda 10X
25X objective Olympus XLPLN25XSVMP2
Burn cream Betadine
Camera Sony α6300
Current amplifier Stanford research SR570
Current photomultiplier modules Hamamatsu H11461-01
D2 665 nm long-pass dichroic mirror Semrock FF665-Di02-25x36 For directing epi-fluorescence signal to the detection module
D3 700 nm short-pass dichroic mirror Edmund 69-206 For separating SRS from TPEF detection path
Depilating cream Veet
FS1 975 nm short-pass filter Edmund 86-108 For blocking stokes beam
FS1 Bandpass filter Semrock FF01-850/310 For blocking stokes beam
Fs2 Bandpass filter Semrock FF01-525/50 For selecting YFP signal
Fs2 Shortpass filter Semrock FF01-715/SP-25 For blocking fs excitation laser beam
Half-wave plate Thorlabs SAHWP05M-1700
High-speed photodetector MenloSystems FPD 310-F For checking Stokes beam modulation
Iodine Betadine
IR Scope FJW FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X
Iris Thorlabs CPA1
L1 Thorlabs AC254-060-B-ML
L10 Thorlabs LA4052-A
L2 Thorlabs LA1422-B
L3 Thorlabs AC254-050-B
L4 Thorlabs AC254-060-B-ML
L7 f=100 mm, AB coating
L8 Thorlabs LA4874-A
L9 Thorlabs AC254-035-B-ML
Lock-in amplifier APE
Mirror Thorlabs PF10-03-P01
Motorized flipper Thorlabs MFF101/M
multifunctional acquisition card National Instrument PCIe-6363
Oscilloscope Tektronix TDS2012C
Photodiode APE For detecting SRS signal
Picosecond laser source APE picoEmerald
Polarizing beam splitter Thorlabs CCM1-PBS252/M
Power meter Newport 843-R
Saline Braun
Scan lens L5 Thorlabs SL50-CLS2
Scanning mirror Cambridge Technology 6215H
Silicone gel World Precision Inc. KWIK-SIL
Ti:sapphire fs laser Coherent Chameleon Ultra II
Tube lens L6 Thorlabs TTL200-S8

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生物工程，第178期，
<em>体内</em> 使用双光子荧光和受激拉曼散射显微镜对生物组织进行成像
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Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (178), e63411, doi:10.3791/63411 (2021).

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