Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

نهج تجزئة خال من الملصقات للتصوير داخل الجسم للبيئة الدقيقة لورم الثدي

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63413
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1,3
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

Summary

تستخدم طريقة التصوير داخل الحيوية الموصوفة هنا الجيل التوافقي الثاني من الكولاجين والتألق الداخلي من العامل الأيضي المساعد NAD (P) H إلى تقسيم بيئة مجهرية للورم غير المسمى بشكل غير جراحي إلى مقصورات الورم واللحمية والأوعية الدموية لإجراء تحليل متعمق للصور الحيوية 4D.

Abstract

تعد القدرة على تصور التفاعلات الفسيولوجية المعقدة والديناميكية بين العديد من أنواع الخلايا والمصفوفة خارج الخلية (ECM) داخل بيئة دقيقة حية للورم خطوة مهمة نحو فهم الآليات التي تنظم تطور الورم. في حين يمكن تحقيق ذلك من خلال تقنيات التصوير داخل الحيوية الحالية ، إلا أنه لا يزال يمثل تحديا بسبب الطبيعة غير المتجانسة للأنسجة والحاجة إلى السياق المكاني داخل الملاحظة التجريبية. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتطوير سير عمل التصوير داخل الحيوية الذي يجمع بين تصوير الجيل التوافقي الثاني من الكولاجين ، والتألق الداخلي من العامل المساعد الأيضي NAD (P) H ، والمجهر التصويري الفلوري مدى الحياة (FLIM) كوسيلة لتقسيم البيئة المجهرية للورم بشكل غير جراحي إلى المجالات الأساسية لعش الورم ، والسدى المحيط أو ECM ، والأوعية الدموية. يفصل هذا البروتوكول غير الجراحي العملية خطوة بخطوة التي تتراوح من الحصول على صور الفاصل الزمني لنماذج أورام الثدي إلى تحليل ما بعد المعالجة وتجزئة الصور. الميزة الأساسية لسير العمل هذا هي أنه يستغل التوقيعات الأيضية لوضع البيئة الدقيقة للورم الحي المتغيرة ديناميكيا في سياقها دون استخدام ملصقات الفلورسنت الخارجية ، مما يجعلها مفيدة لنماذج xenograft (PDX) المشتقة من المريض البشري والاستخدام السريري المستقبلي حيث لا يمكن تطبيق الفلوروفورات الخارجية بسهولة.

Introduction

من المعروف أن المصفوفة خارج الخلية (ECM) في البيئة الدقيقة للورم يتم ترسيبها ديناميكيا وإعادة تشكيلها بواسطة أنواع متعددة من الخلايا لزيادة تسهيل تطور المرض1،2،3. توفر تعديلات المصفوفة هذه إشارات ميكانيكية وبيولوجية تغير سلوك الخلية وغالبا ما تؤدي إلى دورة مستمرة من إعادة تشكيل المصفوفة4. غالبا ما يتم إجراء التحقيق في التفاعل الديناميكي المتبادل بين الخلايا السرطانية والمصفوفة خارج الخلية باستخدام ثلاثي الأبعاد (3D) في الثقافة المختبرية أو أنظمة الموائع الدقيقة. في حين أظهرت هذه النهج من القاعدة إلى القمة آليات إعادة تشكيل ECM 5,6,7 ، وزيادة الانتشار 8 ، والانتقال الظهاري إلى الوسيط 9,10,11,12 ، وهجرة الخلايا السرطانية وغزوها 7,13,14,15,16 ، كان تركيزهم في المقام الأول على عدد قليل من أنواع الخلايا (على سبيل المثال، الخلايا السرطانية أو الخلايا الليفية) ضمن مصفوفة 3D متجانسة مقارنة بتنوع وعدم تجانس التفاعلات الموجودة داخل الأنسجة الفسيولوجية. بالإضافة إلى الأنظمة المخبرية ، يمكن أن يوفر علم أنسجة الأورام خارج الجسم الحي أيضا بعض الأفكار حول تفاعلات الخلايا الخلوية والخلايا ECM17. تتميز الكيمياء النسيجية المناعية بقدرتها على تحليل أنواع متعددة من الخلايا فيما يتعلق بالتكوين والبنية غير المتجانسين مكانيا ل ECM ، لكن نقاط النهاية الثابتة للأنسجة الثابتة لا تلتقط الطبيعة الديناميكية للتفاعلات بين الخلايا والبيئة الدقيقة. فتح التصوير داخل الحيوية الباب لاستجواب التفاعلات المتنوعة والديناميكية داخل السياق الفسيولوجي للبيئة الدقيقة للورم الأصلي.

قدرات التصوير داخل الورم الحيوي تتقدم بسرعة. وقد مكنت التحسينات في تصميم نوافذ التصوير والتقنيات الجراحية لزرع النوافذ من تصوير الورم الطولي على المدى الطويل في مجموعة متنوعة من المواقع التشريحية (أي الورم الأولي والغدد الليمفاوية والمواقع النقيلية18،19،20). وعلاوة على ذلك، أصبحت قدرة الأجهزة البصرية على تصور البيانات وجمعها في أبعاد متعددة (أي كثافة التألق الطيفي المكاني ومدى الحياة)، وبدقة وسرعة عاليتين (معدل الفيديو) متاحة على نطاق واسع. توفر التكنولوجيا المحسنة فرصة لاستكشاف التغيرات السريعة في إشارات الخلايا وديناميكيات النمط الظاهري داخل بيئة فسيولوجية. وأخيرا ، فإن التوسع في الأدوات البصرية الجينية ومجموعة واسعة من تركيبات الفلورسنت الجينية تسمح بوضع علامات على أنواع معينة من الخلايا لالتقاط هجرة الخلايا في البيئة الدقيقة للورم أو تتبع سلالة الخلية أثناء التطور أو تطور المرض21,22. يوفر استخدام هذه الأدوات مع تقنية CRISPR / Cas9 للباحثين الفرصة لإنشاء نماذج حيوانية فريدة في الوقت المناسب.

في حين أن كل هذه التطورات تجعل التصوير داخل الحيوية طريقة قوية بشكل متزايد لاستكشاف التفاعلات الخلوية الديناميكية والفسيولوجية ، لا تزال هناك حاجة مهمة لتطوير استراتيجيات توفر سياقا مكانيا وزمنيا وهيكليا على مستوى الأنسجة لهذه التفاعلات البيولوجية. في الوقت الحالي ، تعوض العديد من دراسات التصوير داخل الحيوية عن نقص المعالم البصرية مثل الأوعية الدموية عن طريق حقن الأصباغ الفلورية في الأوعية الدموية أو استخدام نماذج الفئران التي تعبر خارجيا عن بروتينات الفلورسنت لتحديد السمات الفيزيائية. تستخدم الأصباغ والركائز القابلة للحقن مثل ديكستران الفلورسنت على نطاق واسع لتسمية الأوعية الدموية بنجاح في المجموعات الحيوية19 و 23 و 24. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لا يخلو من القيود. على سبيل المثال ، يتطلب الأمر تلاعبات إضافية بالماوس وتقتصر فائدته على التجارب قصيرة الأجل. بالنسبة للدراسات الطولية ، يمكن أن يكون ديكستران الفلورسنت مشكلة حيث نلاحظ تراكم الدكستران في الخلايا البلعمية أو الانتشار في الأنسجة المحيطة بمرور الوقت25. تم تقديم دمج البروتين الفلوري الخارجي في نموذج الفأر كبديل للديكستران الفلوري ولكنه يمثل قيودا خاصة به. لا يزال توافر وتنوع الفلوروفورات الخارجية داخل نماذج الفئران محدودا ومكلفا لإنشائه. بالإضافة إلى ذلك ، في نماذج محددة ، مثل نماذج PDX ، فإن التلاعب الجيني غير مرغوب فيه أو ممكن. وقد تبين أيضا أن وجود البروتينات الفلورية أو المضيئة الحيوية داخل الخلايا يتم التعرف عليها على أنها غريبة داخل الفأر ، وضمن نماذج الفئران المناعية ، وهذا يقلل من كمية الانبثاث بسبب استجابة الجهاز المناعي المضيف26,27. وأخيرا، غالبا ما تحتل البروتينات الفلورية الخارجية أو الأصباغ الفلورية المستخدمة في السياق المكاني أو لتقسيم البيانات اللاحقة نطاقات أولية من الطيف الضوئي يمكن استخدامها بطريقة أخرى للتحقيق في التفاعلات الفسيولوجية ذات الاهتمام.

يمثل استخدام الإشارة الجوهرية من ECM أو التألق الداخلي من الخلايا داخل الأنسجة وسيلة عالمية محتملة خالية من الملصقات لتقسيم البيانات داخل الحيوية لإجراء تحليل خلوي ومكاني أكثر تعمقا. لطالما استخدم الجيل التوافقي الثاني (SHG) لتصور ECM28. مع التطوير اللاحق لأدوات مهمة للمساعدة في توصيف تنظيم الألياف29،30،31 ، من الممكن توصيف سلوك الخلية بالنسبة لبنية ECM المحلية. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر التألق الذاتي من المستقلب الداخلي ، NAD (P) H ، أداة أخرى خالية من الملصقات لتقسيم البيئة الدقيقة للورم في الجسم الحي. يتألق NAD(P)H بشكل مشرق في الخلايا السرطانية ويمكن استخدامه للتمييز بين حدود عش الورم المتنامي من السدى المحيط به21,32. وأخيرا ، فإن الأوعية الدموية هي بنية فسيولوجية مهمة في البيئة الدقيقة للورم وموقع التفاعلات الرئيسية الخاصة بنوع الخلية 33،34،35. تم استخدام إثارة خلايا الدم الحمراء (RBC) أو بلازما الدم لتصور الأوعية الدموية للورم ، وباستخدام إثارة اثنين أو ثلاثة فوتونات (2P ؛ 3P) ، تبين أن قياس معدلات تدفق الدم ممكن36. ومع ذلك ، في حين أن الأوعية الدموية الأكبر يمكن التعرف عليها بسهولة من خلال توقيعات التألق الداخلية الخاصة بها ، فإن تحديد الأوعية الدموية الصغيرة الدقيقة والمتغيرة والأقل فلورسنت يتطلب المزيد من الخبرة. هذه الصعوبات المتأصلة تعيق تجزئة الصورة المثلى. لحسن الحظ ، يمكن أيضا قياس مصادر التألق الداخلي (أي خلايا الدم الحمراء وبلازما الدم) عن طريق التصوير الفلوري مدى الحياة37 ، والذي يستفيد من الخصائص الفيزيائية الضوئية الفريدة للأوعية الدموية ويمثل إضافة مفيدة إلى صندوق الأدوات المتنامي داخل الحيوية.

في هذا البروتوكول ، يتم وصف سير عمل لتجزئة التصوير داخل الحيوية رباعي الأبعاد (4D) بشكل صريح باستخدام إشارات جوهرية مثل التألق الداخلي و SHG من الاستحواذ إلى التحليل. هذا البروتوكول مناسب بشكل خاص للدراسات الطولية من خلال نافذة تصوير الثدييات حيث قد لا يكون التألق الخارجي عمليا أو ممكنا ، كما هو الحال مع نماذج PDX. ومع ذلك ، فإن مبادئ التجزئة الموضحة هنا قابلة للتطبيق على نطاق واسع على المستخدمين داخل المناطق الحيوية الذين يحققون في بيولوجيا الورم أو تطور الأنسجة أو حتى فسيولوجيا الأنسجة الطبيعية. ستسمح مجموعة أساليب التحليل المبلغ عنها للمستخدمين بالتمييز بين السلوك الخلوي بين مناطق تكوينات ألياف الكولاجين المحاذاة أو العشوائية ، ومقارنة أعداد أو سلوكيات الخلايا الموجودة في مناطق محددة من البيئة الدقيقة للورم ، وتعيين الأوعية الدموية إلى البيئة الدقيقة للورم باستخدام إشارة خالية من الملصقات أو جوهرية فقط. معا ، تخلق هذه الأساليب إطارا تشغيليا لزيادة عمق المعلومات المكتسبة من التصوير الحيوي 4D للغدة الثديية مع تقليل الحاجة إلى ملصقات خارجية إضافية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب الموصوفة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ويسكونسن ماديسون. الرفاه وإدارة الألم في جميع التجارب على الحيوانات أمر بالغ الأهمية. وبالتالي ، يتم بذل كل جهد ممكن للتأكد من أن الحيوان مريح ويحظى برعاية جيدة في كل خطوة من خطوات الإجراء.

1. توليد نافذة التصوير الثديي (MIW)

  1. لبناء نافذة التصوير الثديي ، قم بتصنيع حلقة 14 مم من الفولاذ المقاوم للصدأ من الدرجة الجراحية.
  2. نظف إطار النافذة المصنوع آليا باستخدام محلول ساخن من منظف تنظيف بنسبة 5٪ ، واشطفه لمدة 10 دقائق تحت الماء منزوع الأيونات (DI) ، وانقع في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 دقائق ، ثم جففه تحت مصباح حراري. قم بتعقيم إطار MIW المجفف وقم بتخزينه للاستخدام لاحقا.
  3. قم بإعداد زجاج غطاء MIW على النحو التالي: انقع زجاج الغطاء الدائري رقم 1.5 12 مم في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 دقائق ، وجففه تحت مصباح حراري ، ثم قم بتأمينه على إطار MIW المعدني باستخدام مادة لاصقة cyanoacrylate. علاج المادة اللاصقة بين عشية وضحاها.
  4. نظف MIW المجمع من المادة اللاصقة الزائدة باستخدام قطعة منقوعة من الأسيتون ، وقم بتنظيفها عن طريق غمرها في 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق. اترك النافذة التي تم تنظيفها حتى تجف. تحضير MIW مقدما وتخزينه في طبق بتري معقم قبل الزرع الجراحي.

2. الزرع الجراحي ل MIW

  1. أدوات الأوتوكلاف الجراحية وتعقيم الأسطح بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل البدء في الجراحة لزرع النافذة.
  2. قم بإجراء عملية جراحية على سطح طاولة معقم باستخدام بطانية تدفئة مغطاة بحقل معقم. اضبط بطانية الاحترار بحيث تكون درجة الحرارة المقاسة أعلى الحقل المعقم 40 درجة مئوية.
  3. استخدم الإضاءة الباردة الإضافية للمساعدة في منع تجفيف الأنسجة. استخدم النظارات المكبرة لتسهيل العملية الجراحية. ارتداء معدات الوقاية الشخصية التي تتكون من معطف مختبر معقم يستخدم مرة واحدة ، والأكمام الجراحية ، والقفازات ، وحماية العين ، وقناع الوجه على النحو الموصى به من قبل أفضل الممارسات الجراحية.
  4. تخدير الماوس باستخدام آلة تبخير التخدير مع إعداد الايزوفلوران من 2.0٪ ومعدل تدفق الأكسجين من 2.0 لتر / دقيقة. إدارة مسكن (10 مغ / كغ ميلوكسيكام) عن طريق الحقن تحت الجلد.
    ملاحظة: تقديم جرعات إضافية خلال أول 24 ساعة، ويفضل كل 8-12 ساعة لأول يومين بعد الجراحة.
  5. بمجرد تخديره (تأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم) ، ضع جل العين المرطب لمنع جفاف العينين. استخدم كريم مزيل الشعر لإزالة الفراء في موقع الجراحة (الغدة الثدييةالإربية 4) متبوعا بالشطف بشاش معقم منقوع بالماء.
  6. قم بإعداد الموقع الجراحي المزيل للشعر للجراحة عن طريق تعقيم سطح الجلد باستخدام 3 مقشرات بيتادين وإيثانول بالتناوب.
  7. لبدء الجراحة ، ارفع الجلد بلطف فوق الغدة الثديية الرابعة رقم 4 باستخدام الملقط. بمجرد سحب الجلد بعيدا عن جدار الجسم ، قم بإزالة قسم ~ 1 مم من الطبقة الجلدية عند طرف الملقط باستخدام مقص دقيق جراحي. في حالة حدوث نزيف ، ضع ضغطا لطيفا بشاش معقم حتى يتوقف النزيف.
    ملاحظة: بشكل عام، الأورام الكبيرة لديها قدرة أكبر على النزيف من الأورام الأصغر أو الأنسجة الطبيعية.
  8. افصل الغدة الثديية عن الطبقة الجلدية بحركات لطيفة للملقط عند الفتحة الجراحية لتجنب قطع الغدة الأساسية.
  9. قم بإنشاء شق 10 مم وحرر الغدة الثديية من الطبقة الجلدية في المحيط بحيث يمكن وضع الغرز دون اختراق الغدة الثديية. أضف PBS لتغطية الغدة / الورم المكشوف ومنع التجفيف.
  10. قم بإنشاء خيط خيط محفظة على طول محيط الفتحة باستخدام خياطة مضفرة بالحرير 5-0. أدخل حافة MIW بحيث تتفاعل الطبقة الجلدية مع الشق المتلقي ل MIW.
  11. قم بتمديد الظهارة بلطف على الجانب الآخر من MIW وادفع MIW المعدني إلى مكانه بحيث تقوم الطبقة الجلدية بإشراك الشق المتلقي بالكامل حول محيط MIW بأكمله. قم بربط سلسلة المحفظة بإحكام لسحب الطبقة الجلدية إلى الشق وربطها لتأمين MIW بالكامل.
  12. أضف مضادا حيويا موضعيا إلى الطبقة الجلدية في MIW ، وراقب الماوس باستمرار حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. ضع الفأر المزروع في MIW بشكل منفصل على فراش ناعم مع وضع كوخ صغير في القفص ، واسمح للفأر بالتعافي لمدة 48 ساعة قبل التصوير.

3. تحديد المواقع والحفاظ على الماوس على مرحلة المجهر للتصوير

  1. قم بإعداد غرفة التدفئة على مسرح المجهر. استخدم نظام الهواء القسري مضبوطا على 30 درجة مئوية أو أي نظام آخر مماثل. استخدم سخان موضوعي لتجنب الانجراف في التركيز البؤري z. اسمح للنظام بالوصول إلى التوازن لمدة 1 ساعة على الأقل قبل التصوير.
    ملاحظة: الفئران المخردة غير قادرة على الحفاظ على درجة حرارة جسمها بشكل صحيح ، وبالتالي ، من الضروري أن يكون لديك بيئة ساخنة لأي عمليات اكتساب بفاصل زمني . يساعد السخان الموضوعي على مكافحة آثار التمدد الحراري ، وهي ظاهرة تسبب الانجراف في التركيز البؤري z حيث تصل العدسة الموضوعية والأنسجة التي يتم تصويرها إلى التوازن الحراري.
  2. بمجرد استقرار غرفة التسخين على المجهر عند 30 درجة مئوية ، قم بتخدير الماوس المتلقي باستخدام إعدادات آلة التخدير بنسبة 2٪ من الأيزوفلوران ومعدل تدفق الأكسجين من 2 لتر / دقيقة.
  3. بعد تخدير الماوس (مؤكدا عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم) ، قم بتنظيف الجزء الخارجي من زجاج MIW باستخدام قضيب قطني ومنظف زجاجي ، وأضف مرهم العين لمنع التجفيف ، وأدخل قسطرة وريد الذيل إذا لزم الأمر.
  4. للحفاظ على الترطيب المناسب ، قم بإعطاء حقنة أولية من 0.5 مل PBS تحت الجلد أو 100 ميكرولتر من خلال قسطرة الوريد الذيلي. كرر كل 2 ساعة طوال مدة جلسة التصوير.
  5. بمجرد إعداد الماوس بشكل صحيح ، قم بإعداد المجهر للتصوير. لتقليل التبخر أثناء قياسات الفاصل الزمني، استخدم هلام مائي بدلا من الماء لوسائط الغمر. يجب أن يتم ذلك قبل وضع الماوس على المسرح. يرجى الاطلاع على جدول المواد للحصول على تفاصيل المكونات البصرية.
  6. ضع الماوس على مرحلة المجهر ، وقم بتركيب خرطوم الأيزوفلوران واضغط على طوق MIW في فتحة استقبال 14 مم في إدراج المرحلة لتحقيق الاستقرار في الصور. ضع مجال التصوير في بؤرة التركيز باستخدام مناظير المجهر واستخدم إضاءة الحقل الساطع لمراقبة الأوعية الدموية مع تدفق الدم.
  7. تحقق من استقرار مجال الرؤية. في حالة وجود قطع أثرية لحركة التنفس ، ضع ضغطا لطيفا على الجانب الخلفي من الغدة باستخدام كتلة رغوة صغيرة وقطعة تشبه السينكريتور من الشريط اللاصق. بعد تطبيق الضغط، تحقق من الحفاظ على تدفق الدم في جميع أنحاء مجال الرؤية.
  8. اضبط مستويات الأيزوفلوران بشكل دوري بزيادات بنسبة 0.25٪ أثناء جلسة التصوير للحفاظ على مستوى مناسب من التخدير عن طريق حساب التنفس الحيواني يدويا.
  9. الحفاظ على معدل 36-40 تنفس في الدقيقة (دورة في الدقيقة) لتحسين طول عمر الحيوان والتصوير البصري. يمكن أن تؤدي معدلات التنفس المنخفضة إلى عدم نجاة الماوس من التجربة ، في حين أن معدلات التنفس التي تزيد عن 60 دورة في الدقيقة قد تؤدي إلى ضعف التخدير ، مما قد يزيد من التنفس والحركة في بيانات الصورة.

4. إعداد للتصوير داخل الحيوية 4D ، القائم على الكثافة ، الخالي من الملصقات لسلوك الخلية الديناميكي

  1. بمجرد تخدير الماوس ووضعه بشكل آمن على مرحلة المجهر المقلوب ، ابدأ في تحديد المناطق ذات الاهتمام.
  2. باستخدام مصدر ضوء موجه إلى MIW ، استخدم مناظير المجهر لتحديد المناطق المحتملة للتحقيق. أضف واحفظ مواضع x و y في البرنامج للعودة إلى هذه المواضع.
    ملاحظة: لن تكون التفاصيل الدقيقة للورم مرئية بسهولة مع هذا النوع من الإضاءة. والهدف ببساطة هو تحديد المناطق لإجراء مزيد من التحقيقات. ينصب التركيز على رؤية الأوعية الدموية وتدفق الدم.
  3. بعد حفظ عدة مواضع في البرنامج ، قم بمعاينة مجالات العرض المختارة باستخدام إثارة 890 نانومتر ومكعب مرشح FAD / SHG. استخدم الحد الأقصى لوقت الإقامة البالغ 4 ميكروثانية مع طاقة أقل وإعداد PMT مرتفع. الهدف هو معاينة مجالات الرؤية دون تعريض الأنسجة لضوء الليزر المفرط.
  4. بمجرد تعيين مستويات الطاقة المناسبة، قم بإعداد مكدسات z. لاحظ ظهور ألياف الكولاجين الوفيرة (SHG) عند 20-50 ميكرومتر تحت السطح الزجاجي ل MIW. سيصبح الكولاجين أقل انتشارا حيث ينقسم المجهر أعمق في الورم (الشكل 1B). تكشف الفراغات في SHG عن موقع كتل الورم.
  5. اضبط شريحة z العلوية ، أسفل طبقة الخلايا الانفرادية حيث تظهر ألياف الكولاجين الأولى عند ~ 50-100 ميكرومتر. اضبط شريحة z السفلية على ~ 250 ميكرومتر ، حيث تتلاشى الألياف وتهيمن الإشارة الضعيفة. كرر ذلك لجميع مواضع x-y المحفوظة.
  6. بمجرد تعيين نطاق z-stack ، قم بزيادة وقت الإقامة (حتى 8 ميكروثانية) وتحسين إعدادات الطاقة والكاشف. قم بتحسين مستويات الطاقة حسب الحاجة لإثارة الأنسجة لكل تجربة. استخدام قوى تصل إلى 90 ميجاوات عند 750 نانومتر أو 70 ميجاوات عند 890 نانومتر عند الفتحة الخلفية للهدف ضمن نطاق مقبول.
    ملاحظة: سيؤثر عمق التصوير ومقدار التشتت داخل الأنسجة والخصائص الموضوعية وحساسية الكاشف بشكل كبير على مقدار الطاقة اللازمة للحصول على صورة.
  7. اضبط الفترات الزمنية وفقا للأهداف التجريبية. ابدأ بفترات زمنية مدتها 10 دقائق بين نقاط التجميع لمعظم أفلام الهجرة داخل المناطق الحيوية.
  8. على الرغم من أن الإثارة 2P لطيفة على الخلايا والأنسجة ، كن مدركا لعلامات السمية الضوئية ، مثل تبييض الخلايا أو التألق الذاتي المتزايد بسرعة ، والتبييض الضوئي المفرط. قلل من طاقة الليزر أو قم بزيادة فترات الفاصل الزمني كما تشير الظروف.

5. التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM) من NAD (P) H

  1. مع الحفاظ على مواضع x-y من عمليات الاستحواذ على الفاصل الزمني ، قم بإعداد المجهر لجمع مكدس FLIM. أدخل مرشحا 440/80 في حامل مرشح أمام كاشف GaAsP ، واضبط جهد كاشف GaAsP على 800 في البرنامج. أطفئ أضواء الغرفة عندما تكون أجهزة الكشف قيد التشغيل.
  2. في البرنامج ، قم بالتبديل من تصوير الكثافة المستند إلى الجلفانومتر إلى وضع تصوير FLIM.
  3. لغرض تحديد الأوعية الدموية وإخفائها، اضبط الدقة على 512 × 512 بكسل. لجمع معلومات التمثيل الغذائي التكميلية، اضبط الدقة على 256 × 256 بكسل لزيادة الدقة الزمنية للتوقيع مدى الحياة. اضبط وقت الإقامة على 4 ميكروثانية واضبط الليزر على 750 نانومتر.
  4. ابدأ معاينة المسح الضوئي وابدأ في ضبط طاقة الليزر. اضبط طاقة الليزر حتى تكون قراءة أداة تمييز الكسر الثابت (CFD) بين 1 × 105 و 1 × 106. لا تتجاوز 1 × 106 لأن هذا سيؤدي إلى تراكم الفوتون والنتائج الإجمالية السيئة.
  5. بمجرد تعيين مستوى الطاقة ، اضبط وقت التكامل بين 90 ثانية و 120 ثانية وابدأ مجموعة FLIM. سوف يكتسب الفوتونات من مجال الرؤية للوقت المخصص.
  6. اختياري: بعد إجراء جميع المجموعات اللازمة وإزالة الماوس من المسرح ، قم بجمع وظيفة استجابة الأداة (IRF). قم بقياس IRF عن طريق تصوير سطح بلورات اليوريا المتاحة تجاريا في طبق زجاجي القاع بنفس المعلمات وإعداده المستخدم لتصوير الأنسجة.
    ملاحظة: حسابات IRF لأي تأخير أو انعكاسات بسبب الإعداد الإلكتروني أو البصري. يتم تعقيد IRF في جميع عمليات الاستحواذ على FLIM ، ويمكن أن يؤدي فك ارتباطه بالبيانات إلى تحسين دقة منحنيات اضمحلال التألق المحسوبة. مع ذلك ، يمكن ل IRFs المحسوبة في كثير من الأحيان تكرار جودة منحنيات الاضمحلال الفلورية بشكل معقول من IRF المقاسة. من الممارسات الجيدة قياس IRF حتى يتم تحديد أن IRF المحسوب سينتج عنه نوبات مكافئة من منحنيات الاضمحلال ويقارب بشكل كاف النتائج من IRF المقاسة.

6. تحليل صور NADH مدى الحياة

  1. افتح برنامج FLIM واستورد صورة عمر NAD(P)H من مجموعة البيانات. لمزيد من التفاصيل حول كيفية استخدام البرنامج بشكل صحيح ، يرجى الرجوع إلى كتيبات عمر الفلورسنت (انظر جدول المواد).
  2. للبدء ، حدد معلمات النموذج في البرنامج. في شريط القوائم، انقر فوق خيارات > النموذج. حدد المربعات التالية: الإعدادات > الاضمحلال متعدد الأس، وطريقة الملاءمة > MLE، ومربع > الربط المكاني، وذروة > العتبة، وحدد إصلاح التحول قبل حساب الصورة.
  3. في شريط القوائم، انقر فوق اللون > A1٪ من القائمة المنسدلة. على الجانب الأيمن من النافذة ، حدده على أنه مناسب من ثلاثة مكونات. اضبط حجم سلة المهملات > 3.
  4. اضبط > العتبة ~ 10. أعد تقييم دقة العتبة بعد حساب مصفوفة الاضمحلال لأول مرة.
  5. إصلاح τ1 إلى 200 ps. هذا يمثل العمر القصير لخلايا الدم الحمراء. حاول العثور على القيمة التي تتطابق بشكل أفضل مع بقع متعددة في الأوعية الدموية الأكبر ، والتي يمكن رؤيتها في صورة الكثافة. إصلاح τ2 إلى 1200 ps. هذا يمثل العمر الطويل لخلايا الدم الحمراء.
    ملاحظة: القيم المحددة هي مجرد نقطة بداية. ستحتاج القيم إلى تحسينها لإبراز الأوعية الدموية أكثر. في معظم الحالات ، ولكن ليس دائما ، ستنخفض هذه القيم.
  6. ضمن حساب في شريط القائمة، حدد مصفوفة الاضمحلال. سيؤدي ذلك إلى توليد صور أولية لمدة1٪ مع وجود قيم عالية للأوعية الدموية. استخدم المؤشر (الشعيرات المتقاطعة) للتمرير فوق الأوعية الدموية. بشكل منهجي وواحد في كل مرة ، قم بتعويم ( قم بإلغاء تحديد مربع الإصلاح) τ1 و τ2. سجل هذه القيم لأنها ستساعد في تحسين المعلمات الثابتة.
    ملاحظة: الهدف ليس بالضرورة الحصول على القيم الأكثر دقة في الصورة ، ولكن بالأحرى زيادة التفاوت بين الأوعية الدموية والأنسجة إلى أقصى حد دون تقليل المساحة المحددة على أنها الأوعية الدموية بشكل كبير.
  7. بمجرد تحديد المعلمات المناسبة ل τ1 و τ2 ، في شريط القوائم ، حدد حساب > معالجة الدفعات. تأكد من أن معظم الإعدادات متشابهة بين شرائح z.
  8. تأكد من التحقق من عدم وجود إعداد واحد مختلف تماما عن الآخرين. إذا كان الأمر كذلك، فاضبط التحول أولا وحاول مرة أخرى. إذا استمرت المشكلة، فقم بالرفض باستخدام معلمات جديدة. يمكن أن يكون التحول غير الصحيح سببا كبيرا للضوضاء في النوبات ويمكن أن يزيد من قيم A1٪ في مناطق الورم المجاورة.
  9. في علامة تبويب القائمة، احفظ الملفات ثم قم بتصدير ملفاتA 1٪. قم بتحميل هذه الملفات في ImageJ للإخفاء والتجزئة.

7. تجزئة صورة الأوعية الدموية

  1. افتح ImageJ وقم باستيراد صورة A1٪ كصورة نصية. كرر ذلك لجميع الصور داخل المكدس.
  2. مع فتح جميع الصور A1٪، حدد Image > Stack > Z-Project. استخدم عرض الكثافة القصوى واحفظ الصور. راجع البيانات التكميلية 1 للحصول على صورة تمثيلية.
  3. انتقل إلى المكونات الإضافية > التجزئة. حدد المكون الإضافي لتجزئة WEKA القابل للتدريب 38.
  4. بمجرد فتح نافذة WEKA ، استخدم الإعدادات الافتراضية وابدأ في تدريب البرنامج عن طريق إنشاء فئتين وخطوط تتبع فوق الأوعية الدموية (مناطق A 1٪ عالية) وغير الأوعية الدموية (مناطق منخفضة A1٪).
  5. استمر في إضافة آثار جديدة إلى الفئتين حتى يحدد البرنامج باستمرار المناطق العالية A1٪ من الأوعية الدموية مع القضاء على أي مناطق أعلى من ضوضاء الخلفية. انظر النموذج التكميلي للاطلاع على نموذج المصنف التمثيلي.
  6. بمجرد إنتاج الصورة المصنفة ، انقر فوق Image > Type > 8 Bit. عتبة الصورة وإنشاء قناع. إذا كانت الصورة المتقاربة لا تزال بحاجة إلى مزيد من التنظيف، فاستخدم وظيفة تحليل الجسيمات .
  7. اضبط الحجم والدائرية حتى يتم استبعاد أي مناطق أصغر ودائرية من الصورة العتبية. يتم الحصول على قناع نظيف مع الأوعية الدموية فقط وخلفية قليلة جدا.
  8. انقر فوق تحرير > التحديد > إنشاء تحديد. انقل التحديد إلى مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق تحليل أدوات > > مدير عائد الاستثمار.
  9. تكرار الصورة المصنفة. انتقل إلى معالجة > ثنائي. لتوسيع القناع وتحديد المسافة من الأوعية الدموية التي سيتم تضمينها في تجزئة الصورة، حدد توسيع. كرر ذلك حتى يتوسع القناع إلى النطاق المطلوب. سجل منطقة الاهتمام هذه (ROI) في مدير عائد الاستثمار.
    ملاحظة: الهدف من هذه الخطوة هو تحديد كمية أو سلوك داخل مكان معين من الأوعية الدموية (على سبيل المثال، عدد الخلايا الموجودة داخل X ميكرومتر من الأوعية الدموية). يتم تحديد مقدار التمدد المطلوب بالكامل من خلال السؤال العلمي.
  10. لتحديد عدد الخلايا داخل المناطق المقيدة، حدد النافذة (صورة/قناة) ذات أهمية. يمكن أن يكون هذا أي نافذة تشترك في نفس مجال الرؤية مثل قناع الأوعية الدموية. قم بتطبيق كل من عائد الاستثمار باستخدام وظيفة XOR من القائمة المنسدلة.
    ملاحظة: ستقوم هذه العملية بقياس العناصر ضمن المسافة المطلوبة من الأوعية الدموية ، باستثناء الأوعية الدموية نفسها. يمكن بعد ذلك استخدام نهج عائد الاستثمار المشترك هذا لقياس العديد من المعلمات ، مثل الكثافة أو رقم الخلية أو الترحيل.

8. تجزئة صورة عش الورم

  1. افتح صورة NADH إما من مسح ضوئي عالي الدقة أو مجموعة FLIM في ImageJ.
    ملاحظة: يمكن القيام بذلك على شرائح z الفردية أو المكدسات الكاملة أو تطبيقه على إسقاطات z لبضع شرائح.
  2. انتقل إلى المكونات الإضافية > التجزئة. حدد المكون الإضافي لتجزئة WEKA القابل للتدريب.
  3. بمجرد فتح نافذة WEKA ، استخدم الإعدادات الافتراضية وابدأ في تدريب البرنامج في فئتين من المناطق العالية NADH والمناطق المنخفضة NADH. سيكون للمناطق العالية من NADH نمط ملحوظ جدا من الخلايا ذات النوى وسيتعرف البرنامج عليها بسهولة.
  4. استمر في التبديل ذهابا وإيابا مع التراكب لتحسين الخوارزمية بتدريب إضافي حتى تتعرف على جميع مناطق الورم كما تحددها العين والمعرفة المسبقة بمورفولوجيا الورم. هذه عملية تكرارية.
  5. بمجرد أن تتعرف الخوارزمية على جميع مناطق الورم ، حدد الزر إنشاء نتيجة . سيؤدي ذلك إلى إنتاج صورة جديدة. كرر هذه الصورة.
  6. حدد أول صورة مكررة وقم بتحويلها إلى صورة 8 بت عن طريق تحديد صورة > نوع > 8 بت. عتبة هذه الصورة لإنشاء قناع ثنائي. ثم قم بإنشاء تحديد ونقله إلى مدير عائد الاستثمار. ستحدد عائد الاستثمار هذا السدى.
  7. حدد الثانية من الصورة المكررة وقم بتحويلها إلى صورة 8 بت. عكس هذه الصورة عن طريق تحديد صورة > تحرير > عكس، ثم قم بتحديد هذه الصورة لإنشاء قناع ثنائي. مرة أخرى إنشاء تحديد ونقله إلى مدير عائد الاستثمار. سيحدد عائد الاستثمار هذا عش الورم.

9. تجزئة الصورة حسب تنظيم الألياف أو محاذاتها

  1. للبدء ، افتح صور SHG ، وقم بإعداد أي إسقاط z ، وقم بتقييم الحاجة إلى أي معالجة مسبقة. للحصول على نتائج جيدة، يلزم الحصول على صور عالية الجودة مع ألياف يمكن تمييزها وضوضاء منخفضة.
  2. اختياري: للمعالجة المسبقة في ImageJ لزيادة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) لقناة SHG، اطرح الخلفية باستخدام طرح الكرة المتدحرجة. بالنسبة لمعظم التطبيقات، استخدم طرح الكرة المتدحرجة بين 20 بكسل و50 بكسل. ثم قم بتنعيم الصورة وحفظها.
  3. افتح المكون الإضافي OrientationJ وقم بتعيين معلمات المعالجة. في نافذة OrientationJ، حدد حجم نافذة الموتر المحلي. للحصول على صورة 20x لكثافة الألياف هذه، اضبط 10 بكسل على 15 بكسل كنقطة بداية.
  4. حدد Cubic Spline كنموذج تدرج وحدد مربع مسح اللون. تعريف مسح الألوان. قم بتعيين كل من الصبغة والتشبع كتماسك ، ثم حدد السطوع كصورة أصلية ، اضغط على تشغيل.
  5. ملف الإخراج الخاص بالمكون الإضافي هو خريطة ألوان RGB. اضبط قيمة نافذة الموتر المحلية حتى يتم تمييز المناطق المحاذاة ، كما تحددها العين ، بشكل صحيح بألوان زرقاء وأرجوانية.
  6. بمجرد أن تصبح صورة الإخراج مرضية ، افصل صورة RGB هذه إلى 3 قنوات. حدد صورة > لون > قناة مقسمة.
  7. لتحسين مظهر المناطق المحاذاة لغرض الإخفاء، استخدم حاسبة الصور عن طريق تحديد عملية > حاسبة الصور. باستخدام عامل التشغيل هذا، اطرح الصورة الخضراء من الصورة الزرقاء. للحصول على قناع أكثر تقييدا، اطرح الصورة الخضراء من الصورة الحمراء. بالنسبة للمناطق العشوائية، اطرح القناة الزرقاء من القناة الخضراء.
  8. عتبة الصورة الناتجة باستخدام خوارزمية اللحظات . في معظم الحالات ، لا ينبغي أن يحتاج هذا إلى مزيد من التعديلات. ومع ذلك ، اضبط إذا لزم الأمر. سيؤدي ذلك إلى إنتاج صورة ثنائية.
  9. بمجرد إنشاء الصورة الثنائية ، املأ الثقوب عن طريق تحديد Process > Binary > Fill Holes بين الألياف وتقريب حدود القناع باستخدام مرشح وسيط. مرشح متوسط من 10 هو نقطة انطلاق جيدة ، قم بضبطه لجعل البيانات مناسبة تماما. افحص القناع يدويا بحثا عن اتفاق وقم بإزالة أي عائد استثمار خاطئ.
  10. بمجرد أن يصبح القناع مرضيا، قم بإنشاء تحديد عن طريق تحديد تحرير > > إنشاء تحديد. نقل هذا التحديد إلى مدير عائد الاستثمار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تركيب MIW والتخطيط التجريبي الأساسي هي الخطوات الأولى في هذه العملية. هذا التصميم والبروتوكول الخاص ب MIW أكثر قابلية للدراسات الطولية19 وقد تم استخدامه بنجاح مع كل من المجاهر المستقيمة والمقلوبة. في هذه الحالة ، تم استخدام المجهر المقلوب لأنه أدى إلى استقرار صورة أكبر للغدة الثديية مع عدد أقل من القطع الأثرية التي تتنفس. في الشكل 1A ، نقدم أبعاد MIW الصلبة ونظرة عامة رسومية لعملية الزرع.

مجال الرؤية النموذجي داخل ورم الثدي MMTV-PyMT39 الخالي من الملصقات (الشكل 1B-E ، الشكل 3A) غير متجانس للغاية ، ويتألف من ألياف الكولاجين ، والعديد من الخلايا اللحمية ، وكتل من الخلايا السرطانية ، والأوعية الدموية (الشكل 3A). بشكل عام ، تكون ألياف الكولاجين أكثر وفرة بالقرب من النافذة وتقل في الوفرة في عمق الورم (الشكل 1B-E) يمكن أيضا أن يكون تنظيم الألياف المحيطة بكتل الورم متنوعا تماما ، وغالبا ما يكون مع مناطق أكثر عشوائية في نفس مجال الرؤية مثل مناطق المحاذاة الأعلى (الشكل 2D و H والشكل 3I).

لتطوير خط أنابيب تحليل يمكنه تقسيم البيانات داخل الحيوية إلى مناطق محيطة بالأوعية الدموية والورم والسدى ، ركز هذا البروتوكول على استخدام الإشارة من NAD (P) H و SHG الداخليين. في حين أن تحديد الورم والسدى يمكن أن يكون مباشرا ، إلا أن تحديد المناطق المحيطة بالأوعية الدموية داخل البيئة الدقيقة للورم يمكن أن يكون تحديا. غالبا ما توجد الأوعية الدموية داخل الشرائط الضيقة لإشارة NAD (P) H المخفضة بين كتل الخلايا السرطانية NAD (P) H + الساطعة. من المهم أن نلاحظ أنه ليس كل الحدود المظلمة تؤوي الأوعية الدموية. بدلا من ذلك ، فإن بعض المناطق المظلمة هي ببساطة طيات الورم أو مؤخرة فصوص الورم المجاورة (السهم الأصفر ، الشكل 2G). علاوة على ذلك ، في حين أن العين المحنكة يمكنها استخراج الأوعية الدموية ذات القطر الأكبر من الورم لأن لها مظهرا مميزا ، فإن هذا التمييز ليس تافها دائما. هذا ينطبق بشكل خاص على الأوعية ذات القطر الأصغر حيث قد يكون مظهرها أكثر دقة ومتغيرا. في هذه الحالة ، يمكن أن يساعد استخدام عمر التألق ل NAD (P) H في التعرف الإيجابي على الأوعية الدموية (الشكل 2B ، F). لا يقيس عمر التألق (FLIM) وفرة أو شدة الفوتونات في موقع ما ، ولكن الوقت الذي تستغرقه تلك الجزيئات المثارة لإصدار فوتون واضمحلاله إلى حالتها الأرضية. وقد ثبت أن خلايا الدم الحمراء (RBC) وبلازما الدم لها عمر فلوري قصير ومميز بشكل مميز32,37 يمكن الاستفادة منه لتحديد وتجزئة الأوعية في الأنسجة.

لتحديد مدى جودة عمر التألق ل NAD (P) H في تحديد الأوعية الدموية داخل الحيوية ، تم حقن بلعة 100 ميكرولتر من ديكستران المسمى بالرودامين في الوريد الذيل بعد جمع صورة FLIM. تعكس مقارنات إسقاطات الكثافة القصوى ل NAD(P)H FLIM عن كثب تلك الأوعية الموسومة بدكستران المسمى بالفلورسنت (الشكل 2I-J). أظهر تكرار هذا النهج في العديد من الفئران أن متوسط مساحة القناع من صورة FLIM فوق مساحة قناع الدكستران كان 78.6٪ ± 12.3٪ (الشكل 2L). في حين أن التراكب لم يكن 100٪ ، إلا أن هذه التقنية كانت ترسم بدقة شبكة الأوعية الدموية بأكملها. ويمكن أن تعزى الاختلافات التي لوحظت في المناطق المبلغ عنها في كثير من الأحيان إلى الانجراف داخل الأقطار أو التسجيل، أو أقطار السفن الأرق بسبب تركيب النماذج، أو فقدان الأوعية الدقيقة بسبب استبعاد RBC بسبب ضغط الكتلة المتنامية. الأهم من ذلك ، أن هذه التقنية تعمل بشكل جيد على قدم المساواة في وجود كل من الفلوروفورات المشفرة وراثيا مثل GFP أو نماذج الأورام الخالية من الملصقات (الشكل 2D ، H) ، وبالتالي توفير وسيلة قوية للغاية وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لتحديد الأوعية الدموية لتجزئة الصورة.

لتحديد حدود كتل الورم الخالية من الملصقات ، تم استخدام التألق الذاتي NAD (P) H (الشكل 1C). يمكن التقاط ذلك إما عن طريق جمع صورة NAD(P)H بشكل مستقل أو جمع بيانات NAD(P)H FLIM لإنشاء صورة كثافة. سيسمح أي من الطريقين بتجزئة مناسبة للبيئة الدقيقة للورم. كملاحظة عامة ، فإن الإثارة ثنائية الفوتون ل NAD (P) H في الخلايا السرطانية تثير التألق الذاتي الساطع الذي ينتج صورة تظهر خلايا فردية هشة ذات نوى مظلمة (الشكل 2E ، G). يمكن استخدام هذا النمط لتحديد مدى الكتلة المتنامية. في حين أن العتبة البسيطة القائمة على الكثافة ل NAD (P) H ممكنة لتحديد حدود حجرة الورم ، فإن أداة التجزئة القابلة للتدريب غالبا ما تعمل بشكل أفضل (الشكل 3B ، E). قد تستفيد بعض القراءات الشائعة الأخرى ، مثل هجرة الخلايا أو التحليل النتوء الخلوي ، من التألق الخارجي المشفر وراثيا داخل نموذج الماوس أو زرع خطوط الخلايا المصنفة بالفلورسنت (الشكل 2A). في هذه الحالات ، يمكن إنجاز مهمة ترسيم حدود الكتلة من خلال عتبة بسيطة للبروتين الفلورسنت. في بعض الأحيان يمكن أن يصبح التعبير عن الفلوروفور غير متجانس تماما بعد الزرع. هذا لا ينبغي أن يسبب مشاكل التجزئة. أيضا ، غالبا ما لوحظ أن الأورام التي تم إنشاؤها بواسطة allografts الفلورسنت أو xenografts لديها مناطق مجزأة أقل من ألياف الكولاجين من الأورام التي أنشأتها نماذج الورم الوراثي مثل MMTV-PyMT16.

تشمل المقصورة اللحمية المناطق خارج الكتلة المتنامية أو بين الكتل المتنامية ، ويتم الحصول على قناع للسدى عن طريق عكس عائد الاستثمار على الورم (الشكل 3B-F). يمكن بعد ذلك تقسيم المقصورة اللحمية إلى عائد استثمار فرعي يعتمد على بنية ألياف الكولاجين. ألياف الكولاجين هي سمة مهمة في السدى ولها مجموعة كبيرة ومتنوعة من منظمات الألياف ، والتي من المعروف أنها تعدل سلوك الخلايا40,41. غالبا ما توجد العديد من المناطق المحلية (<100 ميكرومتر) من الألياف المحاذاة أو العشوائية داخل الصورة16. لذلك ، تم تحديد مناطق تنظيم الألياف المحاذاة نسبيا (الألوان الحمراء / الزرقاء) أو العشوائية (الأشكال الخضراء) (الشكل 3I) باستخدام المكون الإضافي OrientationJ. باستخدام خريطة ألوان تماسك OrientationJ ، يمكن إنشاء أقنعة تستند إلى تنظيم الألياف المحلي لأغراض التجزئة (الشكل 3J). يمكن بعد ذلك تراكب هذه الأقنعة لتحليل سلوك الخلايا اللحمية الديناميكية التفاضلية (الشكل 3K) بسبب تأثيرات تنظيم الألياف المحدد (الشكل 3H ، I).

الآن بعد أن تم تحديد عائد الاستثمار لمختلف مقصورات البيئة الدقيقة للورم ، يمكن تطبيقها على الإطارات الفردية أو القنوات الخاصة بفيلم الفاصل الزمني داخل الحيوية. في هذه المرحلة ، من المهم التأكيد على أن جميع الإشارات الموضحة في الشكل 3A مستمدة بالكامل من مصادر داخلية. توضح هذه الصورة الإمكانات الغنية للإشارات المكانية والسياقية التي يمكن أن تأتي من مصادر داخلية بحتة ومنتشرة في كل مكان وخالية من التسميات. هنا ، استخدمنا نموذج ورم MMTV-PyMT كمثال لتوضيح تطبيق الطريقة لتحديد عدد وخصائص البلاعم داخل مواقع محددة من البيئة الدقيقة للورم (TME). أظهرت دراسة سابقة داخل الحيوية42 أن الخلايا التي تنبعث منها مستويات عالية من التألق الذاتي FAD (الشكل 3A ، الخلايا الأرجوانية ، الأسهم الصفراء) تلطخ بشكل إيجابي مع الأجسام المضادة F4/80 وتمثل مجموعة من البلاعم داخل TME. باستخدام سير العمل هذا لتقسيم الصورة ، من الممكن فحص العدد بكفاءة ودقة ، أو مراقبة التفاعلات بين الخلايا والخلايا بمرور الوقت ، أو حتى مراقبة الخصائص الأيضية لهذه المجموعة الفرعية من البلاعم (أرجوانية) داخل مقصورات مختلفة من TME (الشكل 3A ، الأسهم الصفراء). على سبيل المثال ، يمكن وصف سلوك البلاعم عالية FAD التي توجد على وجه التحديد داخل عش الورم NAD (P) H-high (الشكل 3E). وبالمثل ، يمكن فحص سلوكيات البلاعم فيما يتعلق بالتنظيم المحلي للألياف في منطقة السدى. أشارت بعض التقارير الأخيرة إلى أن البلاعم وغيرها من الخلايا المهاجرة في السدى تستجيب للإشارات الميكانيكية من بيئتها الدقيقة المحلية16،43،44. باستخدام أقنعة محاذاة الألياف التي تنتجها هذه الطريقة ، من الممكن فحص سلوكياتها التفاضلية بين مناطق منظمات الكولاجين العشوائية والمتوائمة. أخيرا ، يمكن أيضا تطبيق هذا التحليل المركز نفسه لتحديد عدد وسلوك البلاعم المترجمة على مقربة محددة من الأوعية الدموية. في الشكل 3G ، يمكن رؤية الأوعية الدموية باللون الأحمر ، ويمكن رؤية البلاعم مرة أخرى باللون الأرجواني. تم إنشاء قناع للأوعية الدموية باستخدام NAD(P)H FLIM ثم تم توسيعه من خلال توسيع 10 بكسل. كانت المسافة المختارة تعسفية لأغراض العرض التوضيحي ولكن يمكن تحسينها لتلبية الاحتياجات الخاصة للتجربة الفردية. الأهم من ذلك ، في حين أن هذه الصورة هي من شريحة z واحدة ، يمكن استقراء هذا الإجراء بسهولة إلى مكدسات 3D لمراقبة السلوك حول الحجم الكامل للوعاء.

Figure 1
الشكل 1: ملخص رسومي لزرع نافذة الثدي والتنظيم الأساسي لورم MMTV-PyMT. (أ) أبعاد نافذة التصوير الثديي وتخطيطية لعملية الزرع العامة. (ب-هاء) هذا مونتاج من ممثل ورم MMTV-PyMT غير مسمى يبدأ من 50 ميكرومتر تحت سطح MIW ويستمر حتى عمق 80 ميكرومتر. يتم توفير قيم العمق أسفل كل صورة. ألياف الكولاجين (الرمادي) أكثر انتشارا على سطح الورم (NAD(P)H، الأزرق) منها على أعماق أكبر. شريط المقياس 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صورة تمثيلية داخل الحيوية لورم PyMT المسمى والخالي من الملصقات GFP والتحقق من صحة NAD(P)H FLIM كعلامة للأوعية الدموية. صورة مركبة (A) لمجموعة نموذجية من خلايا GFP-4T1 في وسادة الدهون الثديية وورم ثديي تمثيلي من نموذج ورم MMTV-PyMT (E). NAD(P)H FLIM خرائط الأوعية الدموية في كلا النموذجين (B,F). تم استخدام التألق GFP (C) والتألق الذاتي NAD (P) H (G) لتحديد الورم. تم تصور الكولاجين بواسطة SHG (D ، H). تم التحقق من صحة صورة مركبة باستخدام NAD(P)H FLIM لتحديد الأوعية الدموية من خلال مقارنة إسقاطات الكثافة القصوى للمكدس داخل الحيوية قبل وبعد حقن الوريد الذيل للديكستران الفلورسنت (I,J,K). يظهر في (L) التقدير الكمي لنسبة المساحة التي تحددها NAD(P)H FLIM على المساحة المحددة بواسطة حقن ديكستران في أربعة فئران (يحدد اللون الفئران الفردية) ومجالات رؤية متعددة (نقاط فردية في الرسم البياني). أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تجزئة الصورة التمثيلية باستخدام التألق الداخلي داخل ورم PyMT الخالي من الملصقات. تم جمع صورة مركبة (A) لشريحة z واحدة من ورم ثديي نموذجي PyMT باستخدام إشارات جوهرية فقط. SHG (رمادي) يتصور ألياف الكولاجين للورم. التصوير الفلوري مدى الحياة من NAD (P) H التألق الذاتي (تاو (τ) يعني) تقارير التوقيعات الأيضية للخلايا (الأخضر إلى البرتقالي الألوان) وموقع الأوعية الدموية (الأحمر). يحدد التألق الذاتي FAD (أرجواني) البلاعم. باستخدام مخطط التجزئة الموضح في هذا البروتوكول ، تم تقسيم الورم الخالي من الملصقات إلى مقصورات لعش الورم (B ، E) ، والسدى (C ، F) ، والأوعية الدموية (D ، G) باستخدام SHG و NAD (P) H فقط التألق الذاتي. يمكن أيضا تصنيف السدى وألياف الكولاجين (H) إلى مناطق محلية من الألياف المحاذاة ((كما هو موضح باللون الأرجواني / الأزرق) ، J ، K). أشرطة المقياس 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البيانات التكميلية 1: مجموعة بيانات تمثيلية من A1٪ من NAD(P)H FLIM. هذا هو الحد الأقصى لإسقاط الكثافة ل A1٪ المجهزة من مجموعة بيانات نموذجية. إنه ممثل لجودة تحديد الهوية الممكنة ومستوى نموذجي من الخلفية قبل استخدام المصنف القابل للتدريب. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

النموذج التكميلي: مصنف تمثيلي يستخدم في تركيب A1٪ لتحديد الأوعية الدموية. هذا نموذج مصنف نموذجي للاستخدام في المكون الإضافي لتجزئة WEKA القابل للتدريب داخل ImageJ. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التصوير داخل الحيوية 4D هو أداة قوية للتحقيق في التفاعلات الفسيولوجية الديناميكية داخل السياق المكاني والزمني للبيئة الدقيقة للورم الأصلي. توفر هذه المخطوطة إطارا تشغيليا أساسيا وقابلا للتكيف لتقسيم تفاعلات الخلايا الديناميكية داخل كتلة الورم أو السدى المجاورة أو على مقربة من شبكة الأوعية الدموية باستخدام إشارات داخلية فقط من الجيل التوافقي الثاني أو التألق الذاتي NAD(P)H. يوفر هذا البروتوكول طريقة شاملة خطوة بخطوة من زرع نافذة التصوير إلى الحصول على الصور وتحليلها وتقسيمها. نعتقد أن هذه التقنية ستساهم في إطار التحليل اللازم لتقسيم وقياس البيانات الحيوية 4D.

تم تطوير هذا البروتوكول ليكون متوافقا على نطاق واسع مع العديد من نماذج الماوس داخل الحيوية ، بما في ذلك نماذج PDX غير المصنفة. PDX هي نموذج غني بالمعلومات بشكل لا يصدق45 ولكنها تشكل تحديا للتصوير داخل الحيوية لأن طبيعة نموذج PDX ليست مناسبة تماما للتلاعب الجيني. لذلك ، سيكون من المفيد جدا أن يكون لديك طريقة يمكنها تصور وتقسيم التفاعلات الديناميكية داخل بيئتها الفسيولوجية غير المصنفة باستخدام مستقلبات داخلية فقط مثل NAD (P) H والجيل التوافقي الثاني (SHG). بالإضافة إلى كونه مفيدا لنماذج PDX ، يمكن تطبيق هذا النهج متعدد الأبعاد نظريا على أي دراسة داخل الحيوية في الأنسجة السرطانية أو الطبيعية التي تحتاج إلى سياق مكاني وهيكلي لمعالجة مسألة فسيولوجية. NAD(P)H التألق الذاتي و SHG من ألياف الكولاجين في كل مكان لجميع الأنسجة وتمثل موردا عالميا ومجانيا في المجموعات داخل الحيوية. نهج FLIM هذا قوي أيضا لأنه يمكنه تحديد الأوعية الدموية في وجود التألق من مصادر خارجية مثل GFP. هذا النهج مفيد أيضا لأن انبعاثات SHG و NAD (P) H يمكن تصورها في الطيف الأزرق ، وبالتالي الإقامة في طول موجي لا يستخدم عادة في تصوير هياكل الاندماج الفلوري التي قد تكون ضرورية للدراسة.

جانب هذا النهج الجديد وله قيمة مضافة خاصة هو تحديد الأوعية الدموية بدون تسميات. في حين أن النهج الأخرى يمكن أن تعمل ، فإن استخدام عمر التألق ل NAD (P) H يوفر بسهولة توقيعا واضحا دون الحاجة إلى وضع علامات إضافية. تظهر البيانات أن الأوعية المحددة مدى الحياة تعكس الأوعية الدموية المصنفة من حقن الوريد الذيل من ديكستران الفلورسنت ، المعيار الذهبي لتصوير الأوعية الدموية. تتفوق تقنيتنا في تصور الأوعية الدموية الأصغر مقارنة بالإثارة البسيطة ثنائية الفوتون أو ثلاثية الفوتون ، حيث يتم تصور الأوعية الكبيرة بسهولة ، ولكن الأوعية الأصغر تتطلب المزيد من الخبرة لتحديدها. توقيع العمر لا لبس فيه لجميع السفن ، بغض النظر عن الحجم. علاوة على ذلك ، يمكن بسهولة دمج هذا الاستحواذ الإضافي NAD (P) H FLIM مع علامات أخرى لتجزئة البيئة الدقيقة للورم. من خلال اقتناء FLIM واحد ل NAD (P) H ، يمكن تحقيق متطلبات تحديد الأوعية الدموية وعش الورم والسدى. يمكن دمج مجموعة FLIM في التصميم التجريبي الحالي من خلال جمع عملية استحواذ واحدة في نهاية أو بداية سلسلة زمنية أو تداخل المجموعات طوال عملية الاستحواذ 4D بأكملها. يعتمد تحديد الكمية المناسبة من صور FLIM على الاحتياجات والقيود التجريبية المحددة ، مثل فترات الاكتساب أو المدة التجريبية أو استقرار الصورة ، ولكن على الأقل ، ستكون هناك حاجة إلى مجموعة FLIM واحدة لكل سلسلة 4D لهذه الطريقة.

تتطلب عملية استخدام NAD(P)H FLIM لتحديد الأوعية الدموية ملاءمة بيانات FLIM رياضيا مع دالة أسية للنموذج

Equation 1

مع A 1 + A2 + A3 =1. في حين أن معظم الصور مدى الحياة ل NAD (P) H التي تم الإبلاغ عنها في الأدبيات يتم تركيبها كثنائية الأس ، في هذا التطبيق تم تركيب NAD (P) H كثلاثي الأس حيث يتم تعيين τ1 و τ2 على القيم المبلغ عنها من RBC و τ3 يسمح لها بالطفو. الأهم من ذلك ، أن الهدف ليس تحقيق القيمة الأكثر دقة مدى الحياة ، ولكن بدلا من ذلك لتوفير صورة مثالية للتقسيم. عندما يتم تثبيت قيم τ1 و τ2 في البداية عند القيم المبلغ عنها ل RBC32,46 ويتم حساب المصفوفة ، ستبرز الأوعية الدموية بقيم A 1٪ أكبر من 60٪ في الأوعية الدموية وقيم A1٪ بشكل عام أقل من 40٪ في الورم المجاور. الخطوة التالية هي محاولة تعظيم A 1٪ في الأوعية الدموية مع تقليل A1٪ في الورم المجاور. هذه عملية تكرارية ، وبحلول نهايتها ، ستكون قيم A 1٪ للأوعية الدموية أكبر من 90٪ مع قيم A1٪ للورم أقل من 10٪. بمجرد أن تكون قيم A 1٪ للأوعية الدموية مرتفعة بشكل موحد والخلفية منخفضة بشكل موحد ، قم بتصدير ملفات A1٪ هذه إلى أداة تجزئة قابلة للتدريب. سيؤدي ذلك إلى إزالة أي ضوضاء متبقية بسرعة وتحديد عائد الاستثمار للأوعية الدموية.

نظرا لأن وسادة الدهون الثديية تقع خارج تجويف الجسم ، فإن الجراحة طفيفة التوغل ، ويتم الحصول على أفضل النتائج عن طريق زرع MIW فوق الغدة الثديية الإربية 4. توقيت زرع النافذة ومتى سيتم إجراء التجربة أمر بالغ الأهمية. من الأفضل السماح ب 24 - 48 ساعة من الشفاء بعد الجراحة قبل النقطة الزمنية الفسيولوجية التي سيتم التحقيق فيها. في حين أن الإجراء نفسه لا يتطلب سوى شق صغير (≈ 10 مم) لإدخال النافذة (الشكل 1A) ، فإن وقت الشفاء بعد الجراحة سيسمح بإزالة أي التهاب وسوائل تراكمت بسبب عملية الزرع. علاوة على ذلك ، سيسمح أيضا للورم بالاستمرار في النمو في النافذة. سيؤدي كلا العاملين إلى تحسين جودة الصورة الإجمالية عن طريق تقليل التعتيم / التشتت وزيادة استقرار الصورة. الشيء التالي الذي يجب مراعاته هو المدة الإجمالية المخطط لها للتجربة. في حين تم تصميم هذه النوافذ للدراسات الطولية ، فإن الطبيعة الجامدة للنافذة تتحمل حدا زمنيا يتراوح من 2 إلى 3 أسابيع. بعد تلك الفترة الزمنية ، تميل النافذة إلى الإزاحة من الطبقة الجلدية ، وبالتالي تلويث التجربة وإنهائها. إذا لم تكن هناك حاجة إلى دراسة طولية للغدة الثديية ، فقد تكون الطرق الأخرى داخل الحيوية مثل إجراء رفرف الجلد الطرفي22 الذي يلغي الزرع الجراحي ل MIW خيارا أفضل. يوفر إجراء رفرف الجلد وصولا أفضل إلى الغدة بأكملها لأنه غير مقيد بوضع وأبعاد MIW ، ويمكن أن ينتج عنه استقرار أكبر للصورة حيث يتم سحب الغدة بعيدا عن تجويف الجسم. بغض النظر عن نهج التصوير داخل الحيوية ، فإن تجزئة البيئة الدقيقة باستخدام التألق الداخلي لا تزال قابلة للتطبيق على نطاق واسع لتحليل الصور اللاحق. آخر شيء يجب مراعاته هو مدة تجربة التصوير الفردية. ليس من غير المعقول الحصول على أفلام تدوم من 6 إلى 8 ساعات. ومع ذلك ، خلال المجموعات الأطول ، يصبح الترطيب مشكلة ، ويلزم مراقبة دقيقة لصحة الماوس.

إحدى المزايا المهمة لهذه الطريقة هي أنه يمكن جمع الصور المختلفة للتألق الداخلي المطلوب لتجزئة البيئة الدقيقة للورم بسهولة نسبية ودون تلاعبات إضافية بالفأر. باستخدام تركيبة الفلتر/ثنائي اللون التي تم الإبلاغ عنها هنا (جدول المواد)، يمكن الحصول على كل من صور SHG وNADH بنفس الفلتر الذي تم تعيينه عن طريق تبديل الأطوال الموجية من 890 نانومتر إلى 750 نانومتر. في حين أن هذا يخلق تأخير في الاستحواذ ، إلا أنه لا يؤثر على تجزئة الصورة اللاحقة. من المهم أيضا أن نتذكر أن هذه الطريقة تمثل مجرد نقطة انطلاق لتقنية التجزئة باستخدام التألق الداخلي ، وقد تسمح التكوينات البصرية الأكثر تقدما بعمليات الاستحواذ المتزامنة إذا لزم الأمر.

هناك قيود على استخدام FLIM لتحديد الأوعية الدموية. يتطلب نهج FLIM إلكترونيات وأجهزة متخصصة وخبرة لجمعها. ومع ذلك ، يتم دمج جميع هذه المتطلبات بشكل متزايد في المجاهر الحديثة وأكثر توافرا من خلال استخدام مرافق التصوير الأساسية. أصبحت FLIM تقنية ناضجة والحصول على بيانات جيدة لا يتطلب الكثير من التدريب. القيد الثاني هو أن عمليات الاستحواذ على FLIM تستغرق وقتا طويلا. في حين أن معدل الإطارات لصورة تم جمعها باستخدام ديكستران الفلورسنت يبلغ حوالي ثانية أو أقل ، فإن متوسط مجموعة FLIM يمكن أن يتراوح من 60 ثانية إلى 120 ثانية ، والتي قد تكون باهظة إذا كانت النقاط الزمنية الفسيولوجية أقصر من ذلك. لا يقصد من تحديد FLIM للأوعية الدموية استبدال جميع ديكستران الفلورسنت المحقون بحقن الوريد الذيل أو إثارة الفوتونات المتعددة للأوعية الدموية ؛ بدلا من ذلك ، إنه نهج آخر في صندوق الأدوات المتنامي للتصوير داخل الحيوية. علاوة على ذلك، نتوقع أن تصبح أوقات الاستحواذ الأطول أقصر بشكل كبير في السنوات القادمة. تتحسن أجهزة الكشف والإلكترونيات بسرعة ، مما يقلل من الوقت الميت للكاشف ، وبالتالي يتطلب فترات اكتساب أقصر لالتقاط نفس العدد من الفوتونات. سبب آخر للتفاؤل بأوقات اكتساب أقصر هو ظهور برامج التعلم الآلي أو خوارزمية استعادة الصور مثل CSBDeep47. ومن المحتمل أن يتم تدريب هذه الخوارزميات على العمل مع أوقات تعرض أقصر، وبالتالي تقليل عدد الفوتونات اللازمة لتحديد الهياكل بدقة لأغراض التجزئة. ويمكن أن يؤدي ذلك معا إلى تقليل الأطر الزمنية اللازمة لعمليات الاستحواذ المتعددة الأبعاد هذه.

سيصبح استخدام التصوير داخل الحيوية أكثر أهمية فقط حيث يحاول الباحثون الكشف عن العديد من التفاعلات المعقدة بين الخلايا الخلوية ومصفوفة الخلايا التي تحدث داخل البيئة الدقيقة للورم الفسيولوجي. ولذلك، هناك حاجة إلى مواصلة التطورات في قدرات الاقتناء والتقسيم والتحليل. تحقيقا لهذه الغاية ، من المهم عدم إغفال إمكانات التألق الداخلي لتجزئة البيئة الدقيقة. في هذا البروتوكول ، تم استخدام الإشارة الداخلية من SHG ومستقلبات التألق ، بما في ذلك كثافة NAD (P) H و FLIM ، لأغراض التجزئة أثناء التصوير داخل الحيوية ل TME الثديي. يمكن أن توفر المستقلبات الداخلية الأخرى أو الخصائص الجوهرية إشارات إضافية للكشف عن المعاملة بالمثل الديناميكية للخلايا السرطانية والبيئة الدقيقة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام FAD لمراقبة حركة السكان المناعيين42 ، ويمكن لجيل 3P تسليط الضوء على السمات الهيكلية مثل أغشية البلازما أوالدهون 36 ، ويمكن استخدام فلورة الإيلاستين لفصل الشرايين عن الأوردة46. لذلك ، سيستمر التألق الداخلي في توفير منصة غنية متعددة الأبعاد يجب استخدامها على أكمل وجه مع استمرار مجتمع البحث في بناء مجموعة الأدوات لتجزئة وتحليل البيئة الدقيقة داخل الحيوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن ينوه بمنح NCI R01 CA216248 و CA206458 و CA179556 لتمويل هذا العمل. نود أيضا أن نشيد بالدكتور كيفن إليسيري ومجموعة التصوير الخاصة به على خبرتهم التقنية في التطوير المبكر لبرنامجنا الحيوي. كما نشكر الدكتور بن كوكس والأعضاء الآخرين في مجموعة Eliceiri Fabrication Group في معهد Morgridge للأبحاث على تصميمهم التقني الأساسي خلال المراحل المبكرة من MIW. ساعدت الدكتورة إلين دوبسون في إجراء محادثات مفيدة حول أداة تجزئة WEKA القابلة للتدريب على ImageJ. بالإضافة إلى ذلك ، نود أن نشكر الدكتورة ميليسا سكالا والدكتورة أليكسا باريس هيتون على استخدام المجهر في الوقت المناسب. وأخيرا، نود أن نشكر الدكتورة بريجيت رابي، D.V.M، على جميع المناقشات المدروسة والنصائح حول التعامل مع الماوس والعناية به.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 12mm round cover glass Warner Instruments # 64-0712 MIW construction
1.0 mL syringe for SQ injection BD 309659 Syringe
20x objective Zeiss 421452-988 Water immersion
27G needle for SQ injection Covidien 1188827012 Needle
40x objective Nikon MRD77410 Water immersion
5-0 silk braided suture Ethicon K870 Suture for MIW implantation
Artificial tears gel Akorn NDC 59399-162-35 Eye gel
Betadine solution, 5% Fisher Scientific NC1558063 Surgery antiseptic
cotton-tipped applicator Fisher Scientific 23-400-101
Cyanoacrylate adhesive Loctite 1365882 MIW construction
fluorescent dextran Sigma T1287-50mg intravenous labelling of vasculature
forceps Mckesson.com Miltex #18-782 stainless, 4 inch, curved
GaAsP photomultiplier tube Hamamatsu 
heating blanket CARA 72 heating pad  038056000729 Temperature selectable
heating chamber home built
Fluorescent lifetime handbook Becker and Hickl https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverted microscope base Nikon
Isoflurane Akorn NDC 59399-106-01 Anesthesia
Liqui-Nox Fisher Scientific 16-000-125 MIW cleaning
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10 Analgesic
Micro Hose Scientific Commodities INC.  BB31695-PE/1
multiphoton scan head Bruker Ultima II Multiphoton scanhead and imaging platform
NADH FLIM filter Chroma 284994 ET 440/80 m-2P
Nair CVS 339826 Depilatory cream
objective heater Tokai Hit STRG-WELSX-SET
SHG/FAD filter Chroma 320740 ET450/40m-2P
Sparkle glass cleaner Amazon.com B00814ME24 Glass Cleaner for implanted MIW
SPC-150 photon counting board Becker and Hickl
surgical light FAJ B06XV1VQVZ Magnetic LED gooseneck light
surgical micro-scissors Excelta 366 stainless, 3 inch
Triple antibiotic ointment Actavis Pharma NDC 0472-0179-34 Antibiotic
TV catheter Custom BD 30G needle: 305106 Catheter for TV injection
Two photon filter Chroma 320282 ET585/65m-2P
two-photon laser Coherent charmeleon Tunable multiphoton laser
ultrasound gel Parker PKR-03-02 Water immersion gel
Urea crystals Sigma U5128-5G Optional: FLIM IRF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (3), 171-198 (2019).
  2. Afik, R., et al. Tumor macrophages are pivotal constructors of tumor collagenous matrix. The Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2315-2331 (2016).
  3. Varol, C., Sagi, I. Phagocyte-extracellular matrix crosstalk empowers tumor development and dissemination. The FEBS Journal. 285 (4), 734-751 (2018).
  4. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nature Communications. 11 (1), 5120 (2020).
  5. Han, W., et al. Oriented collagen fibers direct tumor cell intravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11208-11213 (2016).
  6. Malandrino, A., Mak, M., Kamm, R. D., Moeendarbary, E. Complex mechanics of the heterogeneous extracellular matrix in cancer. Extreme Mechanics Letters. 21, 25-34 (2018).
  7. Lugo-Cintrón, K. M., et al. Breast Fibroblasts and ECM Components Modulate Breast Cancer Cell Migration Through the Secretion of MMPs in a 3D Microfluidic Co-Culture Model. Cancers. 12 (5), 1173 (2020).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. The Journal of Cell Biology. 163 (3), 583-595 (2003).
  9. Zhang, K., et al. The collagen receptor discoidin domain receptor 2 stabilizes SNAIL1 to facilitate breast cancer metastasis. Nature Cell Biology. 15 (6), 677-687 (2013).
  10. Malik, G., et al. Plasma fibronectin promotes lung metastasis by contributions to fibrin clots and tumor cell invasion. Cancer Research. 70 (11), 4327-4334 (2010).
  11. Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. Epithelial-mesenchymal transition phenotype is associated with clinicopathological factors that indicate aggressive biological behavior and poor clinical outcomes in invasive breast cancer. Journal of Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).
  12. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nature Cell Biology. 17 (5), 678-688 (2015).
  13. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophysical Journal. 107 (11), 2546-2558 (2014).
  14. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 8 (8), 821-835 (2016).
  15. Ray, A., Morford, R. K., Ghaderi, N., Odde, D. J., Provenzano, P. P. Dynamics of 3D carcinoma cell invasion into aligned collagen. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 10 (2), 100-112 (2018).
  16. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  17. Esbona, K., et al. The Presence of Cyclooxygenase 2, Tumor-Associated Macrophages, and Collagen Alignment as Prognostic Markers for Invasive Breast Carcinoma Patients. The American Journal of Pathology. 188 (3), 559-573 (2018).
  18. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  19. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  20. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).
  21. Boone, P. G., et al. A cancer rainbow mouse for visualizing the functional genomics of oncogenic clonal expansion. Nature Communications. 10 (1), 5490 (2019).
  22. Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  23. Leung, E., et al. Blood vessel endothelium-directed tumor cell streaming in breast tumors requires the HGF/C-Met signaling pathway. Oncogene. 36 (19), 2680-2692 (2017).
  24. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: Bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of The American Society of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  25. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  26. Baklaushev, V. P., et al. Modeling and integral X-ray, optical, and MRI visualization of multiorgan metastases of orthotopic 4T1 breast carcinoma in BALB/c Mice. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 158 (4), 581-588 (2015).
  27. Baklaushev, V. P., et al. Luciferase Expression Allows Bioluminescence Imaging But Imposes Limitations on the Orthotopic Mouse (4T1) Model of Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), 7715 (2017).
  28. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  29. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 16007 (2014).
  30. Liu, Y., et al. Fibrillar Collagen Quantification With Curvelet Transform Based Computational Methods. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 198 (2020).
  31. Püspöki, Z., Storath, M., Sage, D., Unser, M. Transforms and Operators for Directional Bioimage Analysis: A Survey. Advances in Anatomy, Embryology, and Cell Biology. 219, 69-93 (2016).
  32. Saytashev, I., et al. Multiphoton excited hemoglobin fluorescence and third harmonic generation for non-invasive microscopy of stored blood. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3449-3460 (2016).
  33. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  34. von Au, A., et al. Circulating fibronectin controls tumor growth. Neoplasia. 15 (8), New York, N.Y. 925-938 (2013).
  35. Murgai, M., et al. KLF4-dependent perivascular cell plasticity mediates pre-metastatic niche formation and metastasis. Nature Medicine. 23 (10), 1176-1190 (2017).
  36. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2125 (2018).
  37. Yakimov, B. P., et al. Label-free characterization of white blood cells using fluorescence lifetime imaging and flow-cytometry: molecular heterogeneity and erythrophagocytosis. Biomedical Optics Express. 10 (8), 4220-4236 (2019).
  38. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), Oxford, England. 2424-2426 (2017).
  39. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
  40. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  41. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1221-1232 (2011).
  42. Szulczewski, J. M., et al. In Vivo Visualization of Stromal Macrophages via label-free FLIM-based metabolite imaging. Scientific Reports. 6, 25086 (2016).
  43. Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. Biomechanical Contributions to Macrophage Activation in the Tumor Microenvironment. Frontiers in Oncology. 10, 787 (2020).
  44. Pakshir, P., et al. Dynamic fibroblast contractions attract remote macrophages in fibrillar collagen matrix. Nature Communications. 10 (1), 1850 (2019).
  45. Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (4), 547-573 (2016).
  46. Shirshin, E. A., et al. Two-photon autofluorescence lifetime imaging of human skin papillary dermis in vivo: assessment of blood capillaries and structural proteins localization. Scientific Reports. 7 (1), 1171 (2017).
  47. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 183،
نهج تجزئة خال من الملصقات للتصوير داخل الجسم للبيئة الدقيقة لورم الثدي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burkel, B. M., Inman, D. R.,… More

Burkel, B. M., Inman, D. R., Virumbrales-Muñoz, M., Hoffmann, E. J., Ponik, S. M. A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (183), e63413, doi:10.3791/63413 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter