Summary
ここで説明するイントラバイタルイメージング法は、コラーゲンの第二高調波発生と代謝補因子NAD(P)Hからの内因性蛍光を利用して、標識されていない腫瘍微小環境を腫瘍、間質、血管区画に非侵襲的にセグメント化し、4Dインタビタル内画像の詳細な解析を行います。
Abstract
生きた腫瘍微小環境内の多数の細胞型と細胞外マトリックス(ECM)との間の複雑で動的な生理学的相互作用を視覚化する能力は、腫瘍の進行を調節するメカニズムを理解するための重要なステップである。これは、現在の生体内イメージング技術によって達成することができますが、組織の不均一な性質と実験観察内の空間的文脈の必要性のために、依然として困難です。この目的のために、我々は、コラーゲン第二高調波発生イメージング、代謝補因子NAD(P)Hからの内因性蛍光、および腫瘍微小環境を腫瘍巣、周囲の間質またはECM、および血管系の基本ドメインに非侵襲的に区画化する手段としての蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)を組み合わせたイントラバイタルイメージングワークフローを開発しました。この非侵襲的プロトコルは、乳腺腫瘍モデルのタイムラプス画像の取得から後処理分析および画像セグメンテーションに至るまで、段階的なプロセスを詳述しています。このワークフローの主な利点は、代謝シグネチャを利用して、外因性蛍光標識を使用せずに動的に変化する生腫瘍微小環境をコンテキスト化することで、ヒト患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび外因性蛍光色素分子が容易に適用できない将来の臨床使用に有利になることである。
Introduction
腫瘍微小環境における細胞外マトリックス(ECM)は、疾患の進行をさらに促進するために、複数の細胞型によって動的に沈着および再構築されることが知られている1、2、3。これらのマトリックス変化は、細胞挙動を変化させる機械的および生物学的手がかりの両方を提供し、しばしばマトリックスリモデリングの継続的なサイクルをもたらす4。腫瘍細胞と細胞外マトリックスとの間の動的で相互的な相互作用の調査は、しばしば三次元(3D)体外培養またはマイクロ流体系を用いて行われる。これらのボトムアップアプローチはECMリモデリング5、6、7、増殖の増加8、上皮から間葉への移行9、10、11、12、および腫瘍細胞遊走および浸潤7、13、14、15、16のメカニズムを実証している。それらの焦点は、生理学的組織内に存在する相互作用の多様性および不均一性と比較して、均質な3Dマトリックス内のいくつかの細胞型(例えば、腫瘍細胞または線維芽細胞)に主に焦点を当ててきた。インビトロ系に加えて、エキソビボ腫瘍組織学はまた、これらの細胞間および細胞−ECM相互作用に関するいくつかの洞察を提供することができる17。免疫組織化学は、ECMの空間的に不均一な組成およびアーキテクチャに関して複数の細胞型を分析できるという利点を有するが、固定組織の静的エンドポイントは、細胞と微小環境との間の相互作用の動的性質を捕捉しない。イントラバイタルイメージングは、ネイティブの腫瘍微小環境の生理学的文脈における多様で動的な相互作用を調査する扉を開きました。
生体内腫瘍イメージングの能力は急速に進歩しています。画像化窓の設計および窓を移植するための外科的技術の改善により、様々な解剖学的位置(すなわち、原発性腫瘍、リンパ節、転移部位)における長期縦断的腫瘍画像化が可能になった18、19、20。さらに、複数の次元(スペクトル、空間蛍光強度、および寿命)で、高解像度および速度(ビデオレート)でデータを視覚化および収集する光学機器の能力は、広くアクセス可能になりつつある。改良された技術は、生理学的環境における細胞シグナル伝達および表現型ダイナミクスの急速な変化を探求する機会を提供する。最後に、光遺伝学的ツールの拡大および広範囲の遺伝的蛍光構築物は、特定の細胞型のタグ付けを可能にし、発生または疾患進行中の腫瘍微小環境または細胞系譜トレースにおける細胞遊走を捕捉する21、22。これらのツールをCRISPR/Cas9技術と組み合わせて使用することで、研究者はユニークな動物モデルをタイムリーに生成することができます。
これらすべての進歩により、生体内イメージングは動的および生理学的細胞相互作用を探求するためのますます強力な方法となっていますが、これらの生物学的相互作用に組織レベルで空間的、時間的、および構造的文脈を提供する戦略を開発することが依然として重要です。現在、多くの生体内イメージング研究は、血管系に蛍光色素を注入するか、または外因的に蛍光タンパク質を発現して身体的特徴を描写するマウスモデルを使用することによって、血管などの視覚的ランドマークの欠如を補っている。注射可能な色素および蛍光デキストランのような基質は、生体内コレクション19、 23、 24において血管系を首尾よく標識するために広く利用されている。ただし、このアプローチには制限がないわけではありません。1つは、追加のマウス操作が必要であり、その有用性は短期的な実験に限定されています。縦断的研究の場合、蛍光デキストランは、貪食細胞におけるデキストランの蓄積または経時的な周囲の組織への拡散を観察するにつれて問題となり得る25。マウスモデルへの外因性蛍光タンパク質の取り込みは、蛍光デキストランの代替として提示されているが、それ自体の限界を提示している。マウスモデル内の外因性蛍光色素の入手可能性と多様性は、依然として限られており、作成にコストがかかります。さらに、PDXモデルなどの特定のモデルでは、遺伝子操作は望ましくなく、不可能です。また、細胞内の蛍光または生物発光タンパク質の存在は、マウス内で、および免疫担当マウスモデル内で異物として認識され、これは宿主免疫系の応答に起因する転移の量を減少させることも示されている26、27。最後に、空間的文脈または後続のデータをセグメント化するために使用される外因性蛍光タンパク質または蛍光色素は、しばしば、目的の生理学的相互作用を調査するために使用され得る光スペクトルのプライム範囲を占める。
ECMからの固有のシグナルまたは組織内の細胞からの内因性蛍光の使用は、より詳細な細胞および空間分析のためにバイタル内データをセグメント化する潜在的な普遍的なラベルフリー手段を表す。第2高調波発生(SHG)は、ECM28を視覚化するために長い間使用されてきた。繊維組織29、30、31の特性評価を支援するための重要なツールのその後の開発により、局所ECM構造に対する細胞挙動を特徴付けることができる。さらに、内因性代謝産物であるNAD(P)Hからの自家蛍光は、インビボで腫瘍微小環境を区画化するための別の標識のないツールを提供する。NAD(P)Hは腫瘍細胞内で明るく蛍光を発し、成長している腫瘍巣の境界を周囲の間質から区別するために使用することができる21,32。最後に、血管系は、腫瘍微小環境および重要な細胞型特異的相互作用の部位において重要な生理学的構造である33、34、35。赤血球(RBC)または血漿の励起は、腫瘍血管系を視覚化するために使用され、2光子または3光子励起(2P;)を使用して、血流速度の測定が可能であることが示されている36。しかし、大きな血管は内因性の蛍光シグネチャによって容易に識別できますが、微妙で可変で蛍光性の低い小さな血管の同定には、より多くの専門知識が必要です。これらの固有の困難は、最適な画像セグメンテーションを妨げます。幸いなことに、これらの内因性蛍光源(すなわち、赤血球および血漿)は、血管系のユニークな光物理的特性を利用し、成長する生命内ツールボックスへの有用な付加物を表す蛍光寿命画像化37によっても測定することができる。
このプロトコルでは、内因性蛍光やSHGなどの固有のシグナルを使用して、4次元(4D)イントラバイタルイメージングのセグメンテーションを明示的に行うためのワークフローが、取得から解析まで記述されています。このプロトコルは、PDXモデルの場合のように、外因性蛍光が実用的または不可能である可能性がある乳房イメージングウィンドウを介した縦断的研究に特に適切である。しかし、ここで概説したセグメンテーションの原則は、腫瘍生物学、組織発生、さらには正常な組織生理学を調査する生体内ユーザーに広く適用できます。報告された一連の分析アプローチにより、ユーザーは、整列またはランダムなコラーゲン線維構成の領域間で細胞挙動を区別し、腫瘍微小環境の特定の領域に存在する細胞の数または挙動を比較し、ラベルフリーまたは内因性シグナルのみを使用して血管系を腫瘍微小環境にマッピングすることができる。これらの方法を組み合わせることで、乳腺の4Dイントラバイタルイメージングから得られる情報の深さを最大化し、追加の外因性ラベルの必要性を最小限に抑えるための運用フレームワークが作成されます。
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Protocol
記載されているすべての実験は、ウィスコンシン大学マディソン校の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。すべての動物実験における幸福と疼痛管理は最優先事項です。したがって、動物が手順の各ステップで快適で手入れが行き届いていることを確認するためにあらゆる努力が払われます。
1. 乳房イメージングウィンドウ(MIW)の生成
- 乳房イメージングウィンドウを構築するには、外科グレードのステンレス鋼から14mmリングを製造します。
- 5%の洗浄洗剤の熱い溶液を使用して機械加工された窓枠を洗浄し、実行中の脱イオン水(DI)の下で10分間すすぎ、100%エタノールに10分間浸してから、ヒートランプの下で乾燥させる。乾燥したMIWフレームをオートクレーブし、後で使用するために保管します。
- 次のようにMIWカバーガラスを準備します:#1.5 12 mm丸カバーガラスを100%エタノールに10分間浸し、ヒートランプの下で乾燥させた後、シアノアクリレート接着剤を使用して金属MIWフレームに固定します。接着剤を一晩硬化させる。
- アセトン浸漬綿棒を用いて余分な接着剤の組み立てられたMIWを洗浄し、70%エタノールに10分間浸漬して洗浄する。清掃した窓を乾かします。MIWを事前に準備し、外科的移植の前に滅菌ペトリ皿に保管してください。
2. MIWの外科的移植
- オートクレーブ手術器具を手術し、窓移植のための手術を開始する前に、70%エタノールで表面を消毒する。
- 滅菌フィールドで覆われた温暖化毛布を使用して、消毒された卓上で手術を行います。滅菌フィールドの上部で測定された温度が40°Cになるように加温ブランケットをセットします。
- 補助的な冷光を使用して、組織の乾燥を防ぎます。外科的処置を容易にするために虫眼鏡を使用してください。無菌の使い捨てのラボコート、手術用スリーブ、手袋、目の保護具、および外科的ベストプラクティスで推奨されているフェイスマスクで構成されるPPEを着用してください。
- イソフルラン設定が2.0%、酸素流量が2.0 L/minの麻酔気化器装置を使用してマウスを麻酔します。鎮痛剤(10mg / kgメロキシカム)を皮下注射で投与する。
注:最初の24時間以内に、好ましくは手術後最初の2日間は8〜12時間ごとに追加の用量を提供する。 - 麻酔をかけたら(つま先のピンチに反応しないことで確認)、目の乾燥を防ぐために保湿アイジェルを塗布します。脱毛クリームを使用して手術部位(4番目の 鼠径乳腺)で毛皮を除去し、続いて滅菌水浸しガーゼですすいでください。
- 脱毛した手術部位を手術用に準備するには、3つの交互のベタジンとエタノールスクラブで皮膚表面を消毒します。
- 手術を開始するには、鉗子を使用して4番目の乳腺番号4の上で皮膚を優しく持ち上げます。皮膚が体壁から引き離されたら、外科用マイクロハサミで鉗子の先端にある真皮層の〜1mmの部分を取り除く。出血が発生した場合は、出血が止まるまで滅菌ガーゼで穏やかな圧力をかけてください。
注:一般に、大きな腫瘍は、小さな腫瘍または正常組織よりも出血する可能性が大きい。 - 外科的開口部で鉗子を穏やかに動かして、下層の腺を切断しないように乳腺を真皮層から剥離する。
- 10mmの切開部を作成し、乳腺を周囲の真皮層から解放して、乳腺を貫通することなく縫合糸を配置できるようにします。PBSを加えて、露出した腺/腫瘍を覆い、乾燥を防ぎます。
- 5-0シルク編組縫合糸を使用して開口部の周囲に沿って財布紐縫合糸を作成します。真皮層がMIWの受容ノッチに係合するようにMIWの縁を挿入します。
- MIWの反対側で上皮を静かに伸ばし、真皮層がMIW円周全体の周りに受容ノッチを完全に噛み合うように金属MIWを所定の位置に押し込みます。財布の紐をしっかりと締めて真皮層を切り込みに引き込み、MIWを完全に固定するために結び付けます。
- MIWの真皮層に局所抗生物質を加え、胸骨臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまでマウスを継続的に監視する。MIW移植マウスをケージに入れた柔らかい寝具の上に別々に収容し、マウスがイメージングする前に48時間回復できるようにします。
3. イメージングのための顕微鏡ステージ上のマウスの位置決めとメンテナンス
- 顕微鏡ステージに加熱室を設置する。30 °C に設定した強制空気システムまたはその他の同様のシステムを使用してください。zフォーカスのドリフトを避けるために、客観的なヒーターを使用してください。イメージングの前に、システムが少なくとも 1 時間平衡状態になるのを待ちます。
注:麻酔を受けたマウスは体温を適切に維持することができないため、タイムラプス取得のために加熱された環境が必要です。対物ヒータは、対物レンズと撮像される組織が熱平衡に達するにつれてz焦点のドリフトを引き起こす現象である熱膨張の影響と戦うのに役立ちます。 - 顕微鏡の加熱チャンバが30°Cで安定したら、2%イソフルランの麻酔装置設定と2L/minの酸素流量でレシピエントマウスを麻酔します。
- マウスを鎮静させた後(つま先のピンチに反応しないことで確認)、綿アプリケーターとガラスクリーナーでMIWガラスの外側をきれいにし、乾燥を防ぐために眼軟膏を加え、必要に応じて尾静脈カテーテルを挿入します。
- 適切な水分補給を維持するために、0.5 mL PBSの初期皮下または尾静脈カテーテルを通して100 μLの初期注射を与える。イメージングセッションの間、2時間ごとに繰り返します。
- マウスが適切に準備されたら、顕微鏡をイメージング用にセットアップします。タイムラプス測定中の蒸発を減らすには、浸漬媒体に水の代わりに水性ゲルを使用してください。これは、ステージ上にマウスを置く前に行う必要があります。光学部品の詳細については、材料表をご覧ください。
- マウスを顕微鏡ステージの上に置き、イソフルランホースをはめ込み、MIWの襟をステージインサートの14mmの受け穴に押し込んで画像を安定させます。顕微鏡の眼球を使用してイメージングフィールドを焦点を合わせ、明視野照明を使用して血流で血管系を観察します。
- 視野の安定性を確認します。呼吸運動アーチファクトが存在する場合は、小さなフォームブロックとチンキのような粘着テープで腺の裏側に穏やかな圧縮を適用します。圧縮を適用した後、視野全体で血流が維持されていることを確認します。
- イメージングセッション中にイソフルランレベルを0.25%刻みで定期的に調整し、動物の呼吸を手動でカウントして適切な鎮静レベルを維持します。
- 動物の寿命と光学イメージングを改善するために、毎分(rpm)36〜40呼吸の速度を維持します。呼吸数が低いとマウスが実験を生き延びられなくなる可能性がありますが、60rpmを超える呼吸数は鎮静状態が悪くなり、画像データ内の呼吸および運動アーチファクトが増加する可能性があります。
4. 動的細胞挙動の4D、強度ベース、ラベルフリーのインバイタルイメージング用にセットアップ
- マウスを鎮静させ、倒立顕微鏡ステージ上にしっかりと配置したら、関心領域の位置決めを開始します。
- MIWに向けられた光源を使用して、顕微鏡の眼球を使用して、調査の可能性のある領域を特定する。ソフトウェアに x、y の位置を追加して保存し、これらの位置に戻ります。
注:このタイプの照明では、腫瘍の細かい部分は容易には見えません。目標は、単にさらなる調査のために地域を特定することです。焦点は血管系と血流を見ることです。 - ソフトウェアにいくつかの位置を保存した後、890nm励起とFAD/SHGフィルタキューブを使用して、選択した視野をプレビューします。4μsの最大ドウェル時間を使用し、低消費電力でPMTを高く設定してください。目標は、組織を過度のレーザー光に過度にさらすことなく視野をプレビューすることです。
- 適切な電力レベルを設定したら、Z スタックを設定します。MIWのガラス表面下の20〜50μmに豊富なコラーゲン線維(SHG)の外観を観察します。コラーゲンは、顕微鏡が腫瘍の奥深くまで切片化するにつれて、り普及しなくなります(図1B)。SHG内の空隙は、腫瘍塊の位置を明らかにする。
- 最初のコラーゲン線維が〜50〜100μmで現れる孤立細胞の層の下に、上部のzスライスをセットする。下部の Z スライスを約 250 μm に設定し、ファイバーがフェードアウトし、信号不良が支配的になります。保存されたすべての x-y 位置について、これを繰り返します。
- zスタック範囲を設定したら、ドウェルタイムを長く(最大8μs)、電力と検出器の設定を最適化します。必要に応じてパワーレベルを最適化し、各実験で組織を励起します。対物レンズの背面開口部で750nmで90mWまたは890nmで70mWまでの電力を使用することは許容範囲内です。
注:イメージングの深さ、組織内の散乱量、客観的な特性、および検出器の感度はすべて、画像を取得するために必要な電力量に大きく影響します。 - 実験目標に従って時間間隔を調整します。ほとんどの重要域内移行ムービーの収集ポイント間の 10 分間隔から開始します。
- 2P励起は細胞や組織に優しいですが、細胞のブロビングや急速に増加する自家蛍光、過度のフォトブリーチングなどの光毒性の兆候を認識してください。条件が示すように、レーザー出力を減らすか、タイムラプス間隔を長くします。
5. NAD(P)Hの蛍光寿命イメージング(FLIM)
- タイムラプス取得からのx-y位置を維持しながら、FLIMスタックを収集するように顕微鏡を設定します。GaAsP検出器の前のフィルタホルダーに440/80フィルタを挿入し、ソフトウェアでGaAsP検出器の電圧を800に設定します。検出器がオンのときは、部屋の照明を消します。
- ソフトウェアで、ガルバノメータベースの強度イメージングからFLIMイメージングモードに切り替えます。
- 血管系を識別してマスキングする目的で、解像度を 512 x 512 ピクセルに設定します。相補的な代謝情報を収集するには、解像度を 256 x 256 ピクセルに設定して、ライフタイム シグネチャの時間分解能を上げます。ドウェル時間を4μsに設定し、レーザーを750nmにチューニングします。
- プレビュースキャンを開始し、レーザー出力の調整を開始します。定分率弁別器(CFD)の読み出しが1 x105 から1 x106の間になるまでレーザー出力を調整します。1 x 106 を超えると、光子が蓄積され、全体的な結果が低下するため、使用しないでください。
- 電力レベルを設定したら、積分時間を90秒~120秒に設定し、FLIMコレクションを開始します。割り当てられた時間の間、視野から光子を取得します。
- オプション: 必要な収集がすべて行われ、マウスがステージから取り外されたら、計測器応答関数 (IRF) を収集します。市販の尿素結晶の表面をガラス底皿に同じパラメータで撮像してIRFを測定し、組織のイメージングに用いたセットアップを行った。
メモ: IRF は、電子的または光学的なセットアップによる遅延や反射を考慮します。IRFはすべてのFLIM集録で畳み込まれており、データからIRFを逆畳み込むことで、計算された蛍光減衰曲線の精度を向上させることができます。そうは言っても、計算されたIRFは、しばしば、測定されたIRFからの蛍光減衰曲線の品質を合理的に複製することができる。計算された IRF が減衰曲線の等価適合度をもたらし、測定された IRF の結果を適切に近似すると判断されるまで、IRF を測定することをお勧めします。
6. NADHライフタイム画像の解析
- FLIM ソフトウェアを開き、データセットから NAD(P)H ライフタイム イメージをインポートします。ソフトウェアの適切な使用方法の詳細については、蛍光寿命ハンドブック(材料表を参照)を参照してください。
- まず、ソフトウェアでモデルパラメータを定義します。メニューバーで、「 モデル>オプション」をクリックします。「 設定」>「多指数減衰」、「MLE >の適合方法」、「空間ビニング>平方」、「しきい値」>「ピーク」、および 「イメージを計算する前にシフトを修正」にチェックを入れます。
- メニューバーで、ドロップダウンメニューから 「色>A1% 」をクリックします。ウィンドウの右側で、3 成分適合として定義します。 ビンサイズを3>設定します。
- しきい値を ~10 >調整します。減衰行列が初めて計算された後にしきい値精度を再評価します。
- τ1 を 200 ps に固定します。これは赤血球の短い寿命を表しています。強度画像で見ることができる大きな血管の複数のスポットに最も一致する値を見つけるようにしてください。τ2 を 1200 ps に固定します。これは赤血球の長寿命を表しています。
メモ: 設定された値は、あくまでも出発点にすぎません。血管系をより多く引き出すために、値を最適化する必要があります。ほとんどの場合、常にではありませんが、これらの値は減少します。 - メニュー バーの [計算 ] で、[ 減衰マトリックス] を選択します。これにより、血管系が高い値を持つ初期A1%の寿命画像が生成されます。カーソル(十字線)を使用して血管系の上にカーソルを置きます。体系的に一度に 1 つずつ、τ1 と τ2 をフロート ( [修正] ボックスのチェックを外します)。これらの値は、固定パラメーターの最適化に役立つため、記録しておきます。
注:目標は、必ずしも画像内で最も正確な値を得ることではなく、血管系として識別される領域を劇的に減少させることなく、血管系と組織との間の差を最大化することである。 - τ1 と τ2 の適切なパラメータが特定されたら、メニュー バーでバッチ処理>計算を選択します。ほとんどの設定が Z スライス間で類似していることを確認します。
- 他の設定と大きく異なる設定がないことを確認してください。その場合は、最初にシフトを調整して、もう一度やり直してください。問題が解決しない場合は、新しいパラメータを使用して再設定してください。誤ったシフトは、適合値におけるノイズの大きな原因となり、隣接する腫瘍領域におけるA1%値を増加させる可能性がある。
- メニュータブで、ファイルを保存し、A1%ファイルをエクスポートします。これらのファイルを ImageJ にアップロードして、マスキングとセグメンテーションを行います。
7. 血管系の画像セグメンテーション
- ImageJ を開き、A1% 画像をテキスト画像としてートします。スタック内のすべての画像に対してこれを繰り返します。
- すべての A1% 画像を開いた状態で、[ Z プロジェクト> スタック>画像] を選択します。 最大強度投影 を使用して、画像を保存します。代表的な画像については、 補足データ 1 を参照してください。
- プラグイン>セグメンテーションに移動します。トレーニング可能な WEKA セグメンテーションプラグイン38 を選択します。
- WEKAウィンドウが開いたら、デフォルト設定を使用し、2つのクラスを作成し、血管系(高A1%領域)と非血管系(低A1%領域)の線をトレースして、ソフトウェアのトレーニングを開始します。
- ソフトウェアが血管系の高いA1%領域を一貫して識別し、バックグラウンドノイズのより高い領域を排除するまで、2つのクラスに新しいトレースを追加し続けます。代表的な分類子モデルについては、 補足モデル を参照してください。
- 分類された画像が生成されたら、[ 画像>タイプ>8ビット]をクリックします。イメージをしきい値に設定し、マスクを作成します。しきい値になったイメージをさらにクリーンアップする必要がある場合は、[ パーティクルの解析] 機能を使用します。
- しきい値が設定された画像の小さい領域と円形の領域が除外されるまで、サイズと円形度を調整します。血管系のみと非常に少ない背景を持つきれいなマスクが得られます。
- [ 選択範囲の編集] > [選択範囲の作成] >クリックします。ROI マネージャーの [> ツールの分析] をクリックして、選択を ROI マネージャー>転送します。
- 分類された画像を複製します。 >バイナリの処理に進みます。マスクを展開し、画像セグメンテーションに含まれる血管系からの距離を定義するには、[ 拡張] を選択します。マスクが目的の範囲に広がるまで繰り返します。この関心領域 (ROI) を ROI マネージャーに記録します。
注:このステップの目的は、血管の特定の近接度(例えば、血管のXμm内に存在する細胞の数)内の量または挙動を定量化することである。必要な拡張の量は、科学的問題によって完全に決定されます。 - 制限領域内のセル数を定量化するには、目的のウィンドウ(画像/チャンネル)を選択します。これは、血管マスクと同じ視野を共有する任意のウィンドウであり得る。ドロップダウンメニューから XOR 関数を使用して両方のROIを適用します。
注:この操作は、血管系自体を除いて、血管系から所望の距離内のアイテムを測定する。この組み合わせたROIアプローチを使用して、強度、細胞数、移動などの多数のパラメータを測定できます。
8. 腫瘍巣の画像セグメンテーション
- ImageJ の高解像度強度スキャンまたは FLIM コレクションから NADH イメージを開きます。
メモ: これは、個々の Z スライス、フルスタック、またはいくつかのスライスの Z 投影に適用することができます。 - プラグイン>セグメンテーションに移動します。トレーニング可能な WEKA セグメンテーションプラグインを選択します。
- WEKA ウィンドウが開いたら、デフォルト設定を使用して、NADH 高領域と NADH 低領域の 2 つのクラスにソフトウェアのトレーニングを開始します。NADH高域は、核を持つ細胞の非常に識別可能なパターンを持ち、ソフトウェアはそれを容易に識別します。
- オーバーレイを前後に切り替えて、目によって決定された腫瘍のすべての領域と腫瘍形態に関する事前知識を認識するまで、追加のトレーニングでアルゴリズムを改良し続けます。これは反復的なプロセスです。
- アルゴリズムが腫瘍のすべての領域を認識したら、[ 結果の作成] ボタンを選択します。これにより、新しい画像が生成されます。この画像を複製します。
- 最初に複製された画像を選択し、[画像] [種類] > [8 ビット] を選択して 8 ビット画像>変換します。このイメージをしきい値にして、バイナリマスクを作成します。次に、選択範囲を作成し、ROI マネージャーに転送します。これらのROIは間質を定義します。
- 複製したイメージの 2 番目を選択し、8 ビット イメージに変換します。[画像] > [編集] > [反転] を選択してこの画像を反転し、この画像をしきい値にしてバイナリ マスクを作成します。もう一度選択を作成し、ROI マネージャーに転送します。このROIは腫瘍巣を定義する。
9. 繊維組織またはアライメントによる画像セグメンテーション
- まず、SHG 画像を開き、Z 投影を準備して、前処理の必要性を評価します。良好な結果を得るには、識別可能なファイバーと低ノイズの高品質画像が必要です。
- オプション: SHG チャンネルの信号対ノイズ(SNR)を増加させるために ImageJ で前処理を行うには、転がり球の減算を使用して背景を減算します。ほとんどのアプリケーションでは、20 ピクセルから 50 ピクセルの間の転がり球減算を使用します。次に、画像を滑らかにして保存します。
- OrientationJ プラグインを開き、処理パラメータを設定します。OrientationJ ウィンドウで、ローカルテンソルウィンドウのサイズを定義します。このファイバ密度の 20 倍の画像の場合は、開始点として 10 ピクセルを 15 ピクセルに設定します。
- グラデーションモデルとして 「立方体スプライン 」を選択し、「 カラーサーベイ」ボックスにチェックマークを付けます。カラー調査を定義します。 色相 と 彩度 の両方を コヒーレンシとして設定し、 明るさ を 元のイメージとして定義し、[ 実行]をクリックします。
- プラグインの出力ファイルはRGBカラーマップです。位置合わせされた領域が、目で決定されるように、青とマゼンタの色相で適切に強調表示されるまで、ローカルテンソルウィンドウの値を調整します。
- 出力画像が満足のいくものになったら、このRGB画像を3つのチャンネルに分けます。 画像>カラー>分割チャンネルを選択します。
- マスキングの目的で整列領域の外観を向上させるには、「イメージ計算機の処理」を選択してイメージ電卓 >使用します。この演算子を使用して、青色の画像から緑色の画像を減算します。より制限の厳しいマスクにするには、赤色の画像から緑色の画像を減算します。ランダムな領域の場合は、緑のチャンネルから青のチャンネルを減算します。
- モー メント アルゴリズムを使用して 、結果の画像をしきい値に設定します。ほとんどの場合、これ以上の調整は必要ありません。ただし、必要に応じて調整してください。これにより、バイナリイメージが生成されます。
- 2 値化イメージを作成したら、「 > 2 進数を処理」>「ファイバー間の穴を塗りつぶす」を選択して穴を埋め 、中央値フィルターを使用してマスクの境界を丸めます。中央値フィルター 10 が適切な開始点であり、データに合うように調整します。マスクの一致を手動で検査し、誤った ROI があれば削除します。
- マスクが満足のいくものになったら、「選択範囲を 編集」>「選択範囲を作成」>選択範囲を作成します。この選択をROIマネージャに転送します。
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Representative Results
MIWのインストールと基本的な実験計画は、このプロセスの最初のステップです。この特定のMIW設計およびプロトコルは、縦断的研究19 により適しており、直立顕微鏡および倒立顕微鏡の両方で首尾よく利用されている。この場合、倒立顕微鏡は、より少ない呼吸アーチファクトで乳腺のより大きな画像安定性をもたらしたので、使用された。 図1Aでは、剛体MIWの寸法と移植プロセスのグラフィカルな概要を示しています。
ラベルフリーのMMTV-PyMT39乳腺腫瘍(図1B-E、図3A)内の典型的な視野は非常に不均一であり、コラーゲン線維、多数の間質細胞、腫瘍細胞の塊、および血管系(図3A)からなる。 一般に、コラーゲン線維は窓の近くでより豊富であり、腫瘍の奥深くまで存在量が減少する(図1B-E)腫瘍塊を取り囲む線維の組織もかなり変化し得、しばしばよりランダムな組織の領域がより高いアライメントの領域と同じ視野内にある(図2D、Hおよび図3I)。
生体内データを血管周囲領域、腫瘍および間質にセグメント化できる分析パイプラインを開発するために、このプロトコルは内因性NAD(P)HおよびSHGからのシグナルを使用することに焦点を当てた。腫瘍および間質の同定は容易であり得るが、腫瘍微小環境内の血管周囲領域の同定は困難な場合がある。血管系は、しばしば、明るいNAD(P)H+癌細胞塊間のNAD(P)Hシグナルの減少の狭いリボン内に存在する。すべての暗い境界が血管系を抱えているわけではないことに注意することが重要です。むしろ、いくつかの暗い領域は、単に腫瘍のひだまたは隣接する腫瘍葉の突き合わせである(黄色の矢印、 図2G)。さらに、熟練した目は、独特の外観を有するので、腫瘍からより大きな直径の血管を抽出することができるが、この区別は必ずしも些細なことではない。これは、外観がより微妙で可変である可能性がある小径の容器に特に当てはまります。この場合、NAD(P)Hの蛍光寿命の使用は、血管系の肯定的な同定を助けることができる(図2B、F)。蛍光寿命(FLIM)は、ある場所における光子の存在量や強度を測定するのではなく、励起された分子が光子を放出して基底状態に崩壊するのにかかる時間を測定します。赤血球(RBC)および血漿は、組織中の血管の同定およびセグメンテーションに活用することができる特徴的に短く特徴的な蛍光寿命32、37 を有することが示されている。
NAD(P)Hの蛍光寿命が血管系をどの程度良好に識別するかを決定するために、FLIM画像を収集した後、ローダミン標識デキストランの100μLボーラスを尾静脈に注入した。NAD(P)h FLIMの最大強度投影の比較は、蛍光標識されたデキストランで標識された血管を密接に反映している(図2I-J)。このアプローチを複数のマウスで繰り返すと、FLIM画像からのデキストランマスクの面積にわたる平均マスク面積が78.6%±12.3%であることが実証されました(図2L)。オーバーレイは100%ではなかったが、この技術は血管網全体を正確にマッピングしていた。報告された領域で観察された差異は、多くの場合、バイタル内ドリフトまたは登録の問題、モデルフィッティングによる容器の直径の薄さ、または成長する質量の圧力によるRBC排除による微細血管の損失に起因する可能性がある。重要なことに、この技術は、GFPまたはラベルフリー腫瘍モデルのような遺伝的にコードされた蛍光色素の両方の存在下で等しくうまく機能し(図2D,H)、それによって画像セグメンテーションのための血管系を同定するための非常に堅牢で広く適用可能な手段を提供する。
標識のない腫瘍塊の境界を描くために、NAD(P)H自己蛍光(図1C)を用いた。これは、NAD(P)H画像を独立して収集するか、NAD(P)H FLIMデータを合計して強度画像を生成することによってキャプチャできます。いずれの経路も、腫瘍微小環境の適切なセグメンテーションを可能にするであろう。一般的な観察として、癌細胞におけるNAD(P)Hの2光子励起は、明るい自己蛍光を惹起し、核が暗くなった鮮明な個々の細胞を示す画像を生成する(図2E、G)。このパターンを使用して、成長する質量の範囲を定義できます。NAD(P)Hの単純な強度ベースの閾値化は腫瘍区画の境界を定義するために可能ですが、訓練可能なセグメンテーションツールの方がしばしば優れた性能を発揮します(図3B、E)。細胞遊走や細胞突出解析など、他のいくつかの一般的な読み出しは、マウスモデル内で遺伝的にコードされた外因性蛍光、または蛍光標識された細胞株の移植の恩恵を受ける可能性があります(図2A)。これらの場合、質量の境界を画定する作業は、蛍光タンパク質の単純な閾値化で達成することができる。フルオロフォアの発現は、移植後に非常に不均一になることがあります。これにより、セグメンテーションの問題が発生することはありません。また、蛍光同種移植片または異種移植片によって作成された腫瘍は、MMTV-PyMT16のような遺伝的腫瘍モデルによって作成された腫瘍よりもコラーゲン線維の区画化された領域が少ないことがしばしば観察されている。
間質区画は、成長塊の外側または成長塊間の領域を包含し、間質のためのマスクは、腫瘍ROIを反転させることによって得られる(図3B−F)。その後、間質コンパートメントをコラーゲン線維アーキテクチャに基づいてサブROIにさらにコンパートメント化することができる。コラーゲン線維は間質における重要な特徴であり、細胞挙動を調節することが知られている線維組織の多様性が大きい40,41。多くの場合、整列またはランダムな繊維の多数の局所(<100μm)領域が画像16内に存在する。したがって、比較的整列した(赤/青の色相)またはランダムな(緑色の色相)繊維組織の領域(図3I)は、OrientationJプラグインで同定された。OrientationJコヒーレンシカラーマップを使用して、セグメンテーションの目的でローカル繊維組織に基づくマスクを作成できます(図3J)。次に、これらのマスクを重ね合わせて、特定の繊維組織の影響による異なる動的間質細胞挙動(図3K)を分析することができます(図3H、I)。
腫瘍微小環境の様々なコンパートメントに対するROIが定義されたので、それらは、生命内タイムラプスムービーの個々のフレームまたはチャネルに適用することができる。この時点で、図3Aに示すすべての信号が完全に内因性ソースから導出されていることを強調することが重要です。この画像は、純粋に内因性、ユビキタス、ラベルのないソースから得られる空間的および文脈的手がかりの豊かな可能性を示しています。ここでは、MMTV-PyMT腫瘍モデルを例として使用して、腫瘍微小環境(TME)の特定の位置におけるマクロファージの数および特性を定量化するための方法の適用性を例示した。以前のインバイタル研究42は、高レベルのFAD自己蛍光を発する細胞(図3A、マゼンタ細胞、黄色の矢印)がF4/80抗体で陽性に染色され、TME内のマクロファージの集団を表すことを示した。このワークフローを使用して画像をセグメント化することで、数を効率的かつ正確に調べたり、細胞間相互作用を経時的に監視したり、TMEの異なる区画内のマクロファージ(マゼンタ)のこのサブセットの代謝特性を観察することができます(図3A、黄色の矢印)。例えば、NAD(P)H高腫瘍巣内に特異的に存在するFAD高マクロファージの挙動を特徴付けることができる(図3E)。同様に、間質領域における線維の局所組織に対するマクロファージの挙動を調べることができる。いくつかの最近の報告は、間質中のマクロファージおよび他の遊走細胞が、それらの局所微小環境からの機械的手がかりに応答することを示した16,43,44。この方法により作製されたファイバー配向マスクを用いて、ランダムおよび整列コラーゲン組織の領域間のそれらの異なる挙動を調べることができる。最後に、この同じ焦点を絞った分析を適用して、血管系への定義された近接内に局在するマクロファージの数および挙動を決定することもできる。図3Gでは、血管系は赤色で見ることができ、マクロファージは再びマゼンタ色で見ることができる。NAD(P)H FLIM を使用した血管系のマスクを作成し、10 ピクセルの拡張によって拡張しました。選択された距離はデモンストレーションの目的で任意であったが、個々の実験の特定のニーズに合わせて最適化することができる。重要なことに、この画像は単一の Z スライスのものですが、この手順を 3D スタックに簡単に外挿して、容器の体積全体に関する動作を観察できることです。
図1:乳腺窓移植のグラフィカルな要約とMMTV-PyMT腫瘍の根底にある組織。 (A)乳房画像窓の寸法と一般的な移植プロセスの概略図。(B-E)これは、標識されていないMMTV-PyMT腫瘍代表からのモンタージュであり、MIWの表面下50μmから始まり、80μmの深さまで続く。深度値は、各画像の下に表示されます。コラーゲン線維(灰色)は、腫瘍の表面(NAD(P)H、青色)において、より深い部分よりも一般的である。スケール バー 100 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:GFP標識およびラベルフリーPyMT腫瘍の代表的な生体内画像と、血管系のマーカーとしてのNAD(P)h FLIMの検証。MMTV-PyMT腫瘍モデルからの乳腺脂肪パッドおよび代表的な乳腺腫瘍へのGFP-4T1細胞の典型的な同種移植片(E)の合成画像(A)である。NAD(P)H FLIM は両方のモデル (B,F) の血管系をマッピングします。GFP蛍光(C)およびNAD(P)H自己蛍光(G)を用いて腫瘍を同定した。コラーゲンはSHG(D,H)により可視化した。血管系を同定するためにNAD(P)h FLIMを用いた合成画像を、蛍光デキストラン(I,J,K)の尾静脈注入前後の生体内スタックの最大強度投影を比較することによって検証した。4匹のマウス(色は個々のマウスを識別する)および複数の視野(グラフ中の個々のドット)におけるデキストラン注射によって同定された領域に対するNAD(P)h FLIMによって決定された面積の比の定量化は、(L)に示されている。スケール バー 100 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:標識のないPyMT腫瘍内の内因性蛍光を用いた代表的な画像セグメンテーション。 典型的なPyMT乳腺腫瘍からの単一のzスライスの合成画像(A)を、内因性シグナルのみを用いて収集した。SHG(灰色)は、腫瘍のコラーゲン線維を視覚化する。NAD(P)H自家蛍光(タウ(τ)平均)の蛍光寿命イメージングは、細胞の代謝シグネチャ(緑からオレンジの色相)および血管の位置(赤)を報告します。FAD自己蛍光(マゼンタ)はマクロファージを同定する。このプロトコールで概説されているセグメンテーションスキームを使用して、標識のない腫瘍を、SHGおよびNAD(P)H自己蛍光のみを使用して、腫瘍巣(B,E)、間質(C,F)、および血管系(D,G)の区画にセグメント化した。間質とコラーゲン線維(H)は、整列した線維の局所領域((マゼンタ/青で示す)、 J、K)に分類することもできる。スケール バー 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足データ1:NAD(P)H FLIMからの適合A1%の代表的なデータセット。 これは、典型的なデータセットからの適合A1%の最大強度投影です。これは、トレーニング可能な分類子を使用する前の識別可能な品質と典型的なレベルの背景の代表です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足モデル:血管系の同定のために適合A1%に使用した代表的な分類器。 これは、ImageJ 内のトレーニング可能な WEKA セグメンテーションプラグインで使用するためのサンプル分類子モデルです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
4Dイントラバイタルイメージングは、ネイティブの腫瘍微小環境の空間的および時間的コンテキスト内の動的な生理学的相互作用を調査するための強力なツールです。この原稿は、第2高調波発生またはNAD(P)H自己蛍光からの内因性信号のみを使用して、腫瘍塊、隣接する間質、または血管網に近接した範囲内の動的細胞相互作用を区画化するための非常に基本的で適応可能な運用フレームワークを提供する。このプロトコルは、イメージングウィンドウの埋め込みから画像取得、解析、セグメンテーションまでの包括的で段階的な方法を提供します。この手法は、4Dのイントラバイタルデータをセグメント化して定量化するために必要な分析フレームワークに貢献すると考えています。
このプロトコルは、ラベルのないPDXモデルを含む多数の生体内マウスモデルと広く互換性があるように開発されました。PDXは信じられないほど有益なモデル45であるが、PDXモデルの性質は遺伝子操作にはり適していないため、生体内イメージングに課題をもたらす。したがって、NAD(P)Hや第二高調波発生(SHG)のような内因性代謝産物のみを使用して、標識されていない生理学的環境内の動的相互作用を視覚化および区画化できる方法を持つことは非常に有利であろう。PDXモデルにとって有利であることに加えて、この多次元アプローチは、生理学的問題に対処するために空間的および構造的文脈を必要とする癌性または正常組織におけるあらゆる生命内研究に理論的に適用することができる。コラーゲン線維からのNAD(P)H自家蛍光およびSHGは、すべての組織に遍在しており、生体内コレクションにおける普遍的で自由な資源を表す。このFLIMアプローチは、GFPのような外因性源からの蛍光の存在下で血管系を同定することができるため、堅牢である。このアプローチは、SHGおよびNAD(P)H発光を青色スペクトルで可視化することができ、それによって、研究に別途必要であり得る蛍光融合構築物のイメージングにおいて典型的に使用されない波長に存在するため、有利である。
このアプローチの新規で特に付加価値のある側面は、血管系のラベルフリー同定である。他のアプローチも機能しますが、NAD(P)Hの蛍光寿命を使用すると、追加の標識を必要とせずに明確なシグネチャを簡単に提供できます。このデータは、寿命が定義された血管が、血管系イメージングのゴールドスタンダードである蛍光デキストランの尾静脈注射から標識された血管系を反映していることを示しています。私たちの技術は、大きな血管が容易に視覚化される単純な2光子または3光子励起と比較して、より小さな血管を視覚化することに優れていますが、小さな血管は識別するためにより多くの専門知識を必要とします。生涯署名は、サイズに関係なく、すべての船舶で明確です。さらに、この追加のNAD(P)H FLIM取得は、腫瘍微小環境のセグメンテーションのための他のマーカーと容易に組み合わせることができる。NAD(P)Hの単一のFLIM取得により、血管系、腫瘍巣、および間質を定義するための要件が達成可能である。FLIMコレクションは、時系列の終了時または開始時に単一の集録を収集するか、4D集録全体を通してコレクションをインターリーブすることで、既存の実験計画に組み込むことができます。FLIM画像の適切な量の決定は、取得間隔、実験期間、画像安定性など、特定の実験ニーズと制約に依存しますが、この方法では少なくとも4Dシリーズごとに1つのFLIMコレクションが必要になります。
血管系の同定にNAD(P)H FLIM を利用するこのプロセスでは、FLIM データを数学的にフォームの指数関数に当てはめる必要があります。
A 1 + A2 + A3 =1で。文献で報告されたNAD(P)Hのほとんどの寿命画像は双指数として適合されるが、このアプリケーションでは、τ1およびτ2がRBCの報告された値に設定され、τ3が浮動することが許される3指数として適合された。重要なのは、目標は最も正確な寿命値を達成することではなく、セグメンテーションに最適な画像を提供することです。τ1およびτ2値がRBCの32,46の報告された値で最初に固定され、行列が計算されると、血管は血管において60%を超えるA 1%値および隣接する腫瘍において一般に40%未満のA1%値で際立つであろう。次のステップは、隣接する腫瘍におけるA1%を最小限に抑えながら、血管内のA1%を最大化しようとすることである。これは反復的なプロセスであり、それの終わりまでに、血管のA 1%値は90%より大きくなり、腫瘍のA1%値は10%未満になります。血管のA 1%値が均一に高く、バックグラウンドが均一に低かったら、これらのA1%ファイルをトレーニング可能なセグメンテーションツールにエクスポートします。これにより、残りのノイズが迅速に除去され、血管系のROIが定義されます。
乳腺脂肪パッドは体腔の外側に位置するため、手術は低侵襲であり、最良の結果は、第 4鼠径乳腺の上にMIWを移植することによって得られる。窓の移植のタイミングと実験がいつ行われるかは重要です。調査される生理学的時点の前に、手術後の治癒の24〜48時間を許可するのが最善です。手術自体は、窓を挿入するのに小さな切開(≈10mm)しか必要としませんが(図1A)、手術後の治癒時間により、移植プロセスによって蓄積した炎症や体液をクリアすることができます。さらに、それはまた、腫瘍が窓に成長し続けることを可能にする。どちらの要素も、不透明度/散乱を減らし、画像の安定性を高めることで、全体的な画質を向上させます。次に考慮すべきことは、実験の計画された合計期間です。これらの窓は縦断的研究のために設計されましたが、窓の硬い性質には2〜3週間の時間制限があります。その期間の後、窓は真皮層から脱落する傾向があり、それによって実験を汚染し、終了する。乳腺の縦断的研究が必要ない場合、MIWの外科的移植を排除する終末皮膚フラップ手順22 のような他の生命内方法がより良い選択肢であり得る。皮膚フラップ手順は、MIWの配置および寸法によって制約されないため、腺全体へのより良いアクセスを提供し、腺が体腔から引き離されるにつれてより大きな画像安定性を生成することができる。生体内イメージングアプローチにかかわらず、内因性蛍光を用いた微小環境のセグメンテーションは、その後の画像解析に依然として広く適用可能である。最後に考慮すべきことは、個々のイメージング実験の期間です。6〜8時間続く映画を取得するのは不合理ではありません。しかし、より長い収集の間、水分補給が問題となり、マウスの健康状態の綿密な監視が必要となる。
この方法の1つの重要な利点は、腫瘍微小環境のセグメンテーションに必要な内因性蛍光の様々な画像を、比較的容易に、マウスに追加の操作なしに収集できることである。ここで報告したフィルタ/ダイクロイックの組み合わせ(材料表)では、波長を890nmから750nmに切り替えることで、SHG画像とNADH画像を同じフィルタセットで取得できます。これにより集録遅延が生じますが、その後の画像セグメンテーションには影響しません。また、この方法は、内因性蛍光を使用するセグメンテーション技術の単なる出発点であり、より高度な光学構成では、必要に応じて同時取得が可能になることを覚えておくことも重要です。
血管系を特定するためにFLIMを使用することには限界があります。FLIMアプローチでは、特殊な電子機器、計測機器、および専門知識を収集する必要があります。しかし、これらの要件はすべて、現代の顕微鏡にますます統合され、イメージングコア施設の使用を通じてより利用可能になっています。FLIMは成熟した技術となっており、優れたデータを取得するのに多くのトレーニングは必要ありません。第2の制限は、FLIMの集録に時間がかかることです。蛍光デキストランで収集された画像のフレームレートは約1秒以下ですが、平均FLIMコレクションは60秒から120秒の範囲であり、生理学的タイムポイントがそれよりも短い場合、法外な場合があります。血管系のFLIM同定は、血管系の蛍光デキストランまたは多光子励起を注入した尾静脈の全てを置き換えることを意図するものではない;むしろ、これは、生体内イメージングのための成長しているツールボックスのさらに別のアプローチです。さらに、今後数年間で、より長い取得期間が劇的に短くなると予想しています。検出器と電子機器は急速に改善されており、検出器のデッドタイムが短縮されているため、同じ数の光子を捕捉するために必要な取得期間が短くなっています。取得時間の短縮を楽観視するもう1つの理由は、CSBDeep47のような機械学習ソフトウェアや画像復元アルゴリズムの出現です。これらのアルゴリズムは、より短い露光時間で動作するように訓練することができ、それによってセグメンテーション目的のために構造を正確に識別するために必要な光子の数を減らすことができる。これらを組み合わせることで、これらの多次元取得に必要な時間枠を急速に短縮できます。
生体内イメージングの使用は、研究者が生理学的腫瘍微小環境内で起こる多くの複雑な細胞間および細胞 - マトリックス相互作用を解明しようとするにつれて、より重要になるだけです。したがって、買収、セグメンテーション、分析機能の継続的な開発が必要です。この目的に向かって、微小環境セグメンテーションのための内因性蛍光の可能性を見落とさないことが重要です。このプロトコルでは、SHGおよびNAD(P)H強度およびFLIMを含む蛍光代謝産物からの内因性シグナルを、乳房TMEの生体内イメージング中のセグメンテーション目的で使用した。他の内因性代謝産物または内因性特性は、腫瘍細胞および微小環境の動的相互性を明らかにするための追加のシグナルを提供し得る。例えば、FADは、免疫集団42の動きをモニターするために使用でき、生成は、原形質膜または脂肪36のような構造的特徴を強調することができ、エラスチン蛍光は、動脈を静脈46から分離するために使用され得る。したがって、内因性蛍光は、研究コミュニティがバイタル内微小環境セグメンテーションおよび分析のためのツールボックスを構築し続けるにつれて最大限に活用されるべき豊富な多次元プラットフォームを提供し続けるでしょう。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、この研究に資金を提供したNCI R01 CA216248、CA206458、およびCA179556助成金に感謝したい。また、ケビン・エリセイリ博士と彼のイメージンググループが、私たちのイントラバイタルプログラムの早期開発における技術的専門知識に感謝したいと思います。我々はまた、ベン・コックス博士及びモーグリッジ研究所のエリセイリ・ファブリケーション・グループの他のメンバーに対し、MIWの初期段階における本質的な技術設計に感謝する。エレン・ドブソン博士は、ImageJ トレーニング可能な WEKA セグメンテーション ツールに関する有益な会話を支援しました。さらに、メリッサ・スカラ博士とアレクサ・バレス・ヒートン博士の顕微鏡のタイムリーな使用に感謝します。最後に、D.V.M.のBrigitte Raabe博士に、マウスの取り扱いとケアに関するすべての思慮深い議論とアドバイスに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 12mm round cover glass | Warner Instruments | # 64-0712 | MIW construction |
| 1.0 mL syringe for SQ injection | BD | 309659 | Syringe |
| 20x objective | Zeiss | 421452-988 | Water immersion |
| 27G needle for SQ injection | Covidien | 1188827012 | Needle |
| 40x objective | Nikon | MRD77410 | Water immersion |
| 5-0 silk braided suture | Ethicon | K870 | Suture for MIW implantation |
| Artificial tears gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | Eye gel |
| Betadine solution, 5% | Fisher Scientific | NC1558063 | Surgery antiseptic |
| cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | MIW construction |
| fluorescent dextran | Sigma | T1287-50mg | intravenous labelling of vasculature |
| forceps | Mckesson.com | Miltex #18-782 | stainless, 4 inch, curved |
| GaAsP photomultiplier tube | Hamamatsu | ||
| heating blanket | CARA 72 heating pad | 038056000729 | Temperature selectable |
| heating chamber | home built | ||
| Fluorescent lifetime handbook | Becker and Hickl | https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks | |
| inverted microscope base | Nikon | ||
| Isoflurane | Akorn | NDC 59399-106-01 | Anesthesia |
| Liqui-Nox | Fisher Scientific | 16-000-125 | MIW cleaning |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | Analgesic |
| Micro Hose | Scientific Commodities INC. | BB31695-PE/1 | |
| multiphoton scan head | Bruker Ultima II | Multiphoton scanhead and imaging platform | |
| NADH FLIM filter | Chroma | 284994 | ET 440/80 m-2P |
| Nair | CVS | 339826 | Depilatory cream |
| objective heater | Tokai Hit | STRG-WELSX-SET | |
| SHG/FAD filter | Chroma | 320740 | ET450/40m-2P |
| Sparkle glass cleaner | Amazon.com | B00814ME24 | Glass Cleaner for implanted MIW |
| SPC-150 photon counting board | Becker and Hickl | ||
| surgical light | FAJ | B06XV1VQVZ | Magnetic LED gooseneck light |
| surgical micro-scissors | Excelta | 366 | stainless, 3 inch |
| Triple antibiotic ointment | Actavis Pharma | NDC 0472-0179-34 | Antibiotic |
| TV catheter | Custom | BD 30G needle: 305106 | Catheter for TV injection |
| Two photon filter | Chroma | 320282 | ET585/65m-2P |
| two-photon laser | Coherent charmeleon | Tunable multiphoton laser | |
| ultrasound gel | Parker | PKR-03-02 | Water immersion gel |
| Urea crystals | Sigma | U5128-5G | Optional: FLIM IRF |
References
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