Eine robuste Methode für die großtechnische Produktion von Sphäroiden für High-Content-Screening- und Analyseanwendungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von drei verschiedenen Arten von Sphäroiden in einer Weise, die sie für ein groß angelegtes High-Content-Screening und -Analyse geeignet macht. Darüber hinaus werden Beispiele vorgestellt, die zeigen, wie sie auf Sphäroid- und Einzelzellebene analysiert werden können.

Zusammenfassung

High-Content-Screening (HCS) und High-Content-Analyse (HCA) sind Technologien, die Forschern die Möglichkeit geben, groß angelegte quantitative phänotypische Messungen aus Zellen zu extrahieren. Dieser Ansatz hat sich als wirksam erwiesen, um unser Verständnis einer breiten Palette von grundlegenden und angewandten Ereignissen in der Zellbiologie zu vertiefen. Bis heute stützte sich die Mehrheit der Anwendungen für diese Technologie auf die Verwendung von Zellen, die in Monoschichten gezüchtet wurden, obwohl zunehmend erkannt wird, dass solche Modelle viele der Wechselwirkungen und Prozesse, die in Geweben auftreten, nicht rekapitulieren. Daher hat sich bei der Entwicklung und Verwendung von 3-dimensionalen (3D) Zellanordnungen wie Sphäroiden und Organoiden eine Entstehung herausgebildet. Obwohl diese 3D-Modelle im Kontext von Krebsbiologie- und Drug-Delivery-Studien besonders leistungsfähig sind, stellen ihre Herstellung und Analyse in einer reproduzierbaren Weise, die für HCS und HCA geeignet ist, eine Reihe von Herausforderungen dar. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von multizellulären Tumorsphäroiden (MCTS) und zeigt, dass es auf drei verschiedene Zelllinien in einer Weise angewendet werden kann, die mit HCS und HCA kompatibel ist. Das Verfahren erleichtert die Herstellung von mehreren hundert Sphäroiden pro Bohrloch und bietet den spezifischen Vorteil, dass bei Verwendung in einem Screening-Regime Daten aus mehreren hundert Strukturen pro Bohrloch gewonnen werden können, die alle auf identische Weise behandelt werden. Es werden auch Beispiele bereitgestellt, die detailliert beschreiben, wie die Sphäroide für die hochauflösende Fluoreszenzbildgebung verarbeitet werden und wie HCA quantitative Merkmale sowohl auf Sphäroidebene als auch aus einzelnen Zellen innerhalb jedes Sphäroides extrahieren kann. Dieses Protokoll könnte leicht angewendet werden, um eine Vielzahl wichtiger Fragen in der Zellbiologie zu beantworten.

Einleitung

Traditionell wurden zellbasierte Assays in Monoschichten durchgeführt, die auf einem festen Substrat wachsen, das effektiv als zweidimensionale (2D) Umgebung betrachtet werden kann. Es wird jedoch zunehmend erkannt, dass 2D-Zellkulturmodelle in einigen Kontexten keine physiologische Relevanz haben und viele der komplexen Interaktionen, die zwischen Zellen auftreten, nicht replizieren ^können1. Dreidimensionale (3D) Zellkulturmethoden werden bei Forschern immer beliebter, und 3D-Zellmodelle zeigen ein hohes Potenzial, die physiologischen Bedingungen, mit denen Zellen in der Gewebeumgebung konfrontiert sind, besser nachzuahmen2^. Es gibt verschiedene Arten von 3D-Zellbaugruppen, die verwendet wurden, aber die beiden häufigsten Typen sind Sphäroide und Organoide. Sphäroide können aus vielen verschiedenen Zelllinien gezüchtet werden, und sie können je nach verwendetem Zelltyp und ihrer Montagemethode verschiedene Formen und Größen ^annehmen3. Darüber hinaus können Sphäroide auch als multizelluläre Tumorsphäroide (MCTS) bezeichnet werden, wenn sie aus Krebszelllinien gezüchtet werden, und diese Modelle haben besondere Verwendung für präklinische In-vitro-Arzneimittelverabreichungs- und Toxizitätsstudien ^gefunden4,5. Organoide hingegen zielen darauf ab, die Gewebe und Organe in unserem Körper besser nachzuahmen und können komplexere morphologische Anordnungen annehmen. Die Produktion von Organoiden beinhaltet die Verwendung von adulten Stammzellen oder pluripotenten Stammzellen, die in die entsprechenden Zellen umprogrammiert werden können, um dem interessierenden Gewebe oder Organ zu ähneln. Sie werden vor allem eingesetzt, um die Entwicklung von Organen zu untersuchen und Krankheiten und Wirt-Pathogen-Interaktionen zu ^{modellieren6.}

Es gibt eine Reihe von verschiedenen Methoden, um 3D-Zellbaugruppen zu erzeugen. Gerüstbasierte Methoden bieten ein Substrat oder eine Unterstützung, an die sich Zellen entweder anheften oder darin wachsen können. Diese Gerüste können verschiedene Formen haben und aus einer Vielzahl von verschiedenen Materialien hergestellt werden. Am häufigsten sind extrazelluläre Matrixkomponenten (ECM) und Hydrogele, die so konzipiert sind, dass sie der natürlichen extrazellulären Umgebung von Zellen ähneln und dadurch physiologische Interaktionen ^{erleichtern4,7}. ECM-Kellermaterial wurde aus dem Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkom-Tumor extrahiert und enthält nachweislich eine reichhaltige Mischung von ECM-Komponenten, einschließlich Laminin, Typ-IV-Kollagen und ^Perlecan8. Trotz seiner vorteilhaften Zusammensetzung gibt es jedoch zwei Hauptherausforderungen bei seiner Verwendung, nämlich seine Variabilität von Charge zu Charge und dass es zwei verschiedene Aggregatzustände unter und über 10 ° C ^8,9 aufweist. Im Gegensatz dazu haben Hydrogele den Vorteil, dass sie in Bezug auf ihre Komponenten und Steifigkeit flexibel sind und an die gewünschte 3D-Zellbaugruppe angepasst werden ^können7,10. Gerüstbasierte Methoden sind für das Organoidwachstum unerlässlich, werden aber auch häufig für Sphäroide verwendet. Gerüstfreie Methoden, die verhindern, dass sich Zellen an der Oberfläche festsetzen, auf der sie wachsen, sind in der Regel nur mit der Sphäroidmontage kompatibel. Beispiele hierfür sind Ultra-Low-Attachment-Platten (ULA) mit entweder flachem Boden oder U-Boden, die eine Aggregation der Zellen zu Sphäroiden ermöglichen, oder die Verwendung einer kontinuierlichen Bewegung der Zellen in Spinner-/^{Rotationskolben10.}

Die Verwendung von 3D-Zellanordnungen zur Untersuchung einer Vielzahl von biologischen Ereignissen gewinnt schnell an Popularität; Es ist jedoch von wesentlicher Bedeutung, dass die für ihre Kultur gewählte Methode angemessen und mit den Plänen für ihre nachgelagerte Analyse vereinbar ist. Zum Beispiel erzeugt die Verwendung von ULA-Platten Sphäroide von hoher Konsistenz; Diese Methode beschränkt sich jedoch auf die Herstellung eines einzelnen Sphäroids pro Well, wodurch der Durchsatz begrenzt wird. Besondere Beachtung ist geboten, wenn die Fluoreszenzbildgebung der 3D-Struktur geplant ist. Das Substrat oder die Platte, auf der die Baugruppe angebaut wird, muss optisch kompatibel sein, und es muss darauf geachtet werden, die Auswirkungen der Lichtstreuung, die durch möglicherweise verwendete Gerüste verursacht wird^{, zu minimieren11.} Dieses spezielle Problem wird akuter, wenn die numerische Blende der Objektivlinsen des Mikroskops zunimmt.

Einer der Hauptgründe für die Auswahl der Arbeit mit einem 3D-Zellmodell ist wohl die Extraktion volumetrischer Bilddaten nicht nur über die gesamte Baugruppe, sondern auch über die einzelnen Zellen darin. Insbesondere MCTS-Modelle beginnen sich als sehr leistungsfähig zu erweisen, um unser Verständnis dafür zu vertiefen, wie Therapeutika von außen zu zentralen Zellen gelangen (wie sie es in einem Tumor benötigen würden⁾¹², und daher ist es wichtig, Wissen von einzelnen Zellen auf verschiedenen Schichten zu gewinnen. Die bildgebende Technologie, die quantitative Informationen aus einzelnen Zellen extrahiert, wird als High-Content-Analyse (HCA) bezeichnet und ist ein leistungsfähiger Ansatz im Kontext des ^Screenings13. Bisher wurde HCA fast ausschließlich auf Monolayer-Kulturen angewendet, aber es gibt eine zunehmende Erkenntnis, dass dieser Ansatz die Kraft hat, auf 3D-Kulturen angewendet zu werden, so dass eine breite Palette von zellulären Funktionen und Prozessen untersucht werden ^kann14. Es hätte den klaren Vorteil, dass eine große Anzahl von 3D-Baugruppen analysiert werden könnte, die möglicherweise Daten auf Zellebene aus jeder Struktur liefern. Die Herausforderungen, die mit der Bildgebung von potenziell dickzelligen Baugruppen verbunden sind, sowie die großen Datensätze, die generiert werden, müssen jedoch überwunden werden.

In diesem Artikel wird ein robustes gerüstbasiertes Verfahren zur Großserienfertigung von MCTS im 96-Well-Format vorgestellt. Das Verfahren ermöglicht die Herstellung von mehreren hundert 3D-Zellbaugruppen in jedem Bohrloch. Es werden Beispiele für drei verschiedene Zelltypen gezeigt, die solide Tumormodelle von Leber, Lunge und Dickdarm darstellen. Die Sphäroide, die sich bilden, können von einer Vielzahl von Größen sein, und so wird HCA verwendet, um Strukturen einer bestimmten Größe und / oder Morphologie auszuwählen. Diese Eigenschaft bietet den zusätzlichen Vorteil, dass alle beobachteten Phänotypen über Sphäroide unterschiedlicher Größe hinweg verglichen werden können, aber alle auf die gleiche Weise im selben Brunnen behandelt werden. Dieser Ansatz ist mit hochauflösender Bildgebung kompatibel und liefert sowohl quantitative Daten auf Zellebene als auch auf subzellulärer Ebene von denselben zellulären Anordnungen. Diese Methode der Sphäroidproduktion hat gegenüber Methoden, die ein einzelnes Sphäroid pro Bohrloch erzeugen, den zusätzlichen Vorteil, dass die große Anzahl von Sphäroiden, die in jedem Bohrloch produziert werden, möglicherweise genügend Biomasse für andere nachgelagerte Analysen wie Transkriptom- und Proteomprofilierung liefert.

Protokoll

1. Zellkultur

1. Medien vorbereiten
   1. Bereiten Sie je nach Art der Zelllinie spezifische Zellkulturmedien vor. Stellen Sie sicher, dass alle Medien für die Zellerhaltung 10% fötales Rinderserum (FBS) enthalten.
      HINWEIS: Verschiedene Zelllinien verwenden unterschiedliche Medien. HT-29 Dickdarmkarzinomzellen (ATCC HTB-38) werden in McCoys 5A + 10% FBS gezüchtet. HepG2 hepatozelluläre Karzinomzellen (ATCC HB-8065) werden in Minimum Essential Medium + 1% L-Glutamin + 10% FBS gezüchtet. H358 bronchoalveoläre Karzinomzellen (ATCC CRL-5807) werden in RPMI 1640 medium + 1% L-Glutamin + 10% FBS gezüchtet. Alle Medien, die L-Glutamin und FBS enthalten, werden als vollständige Medien bezeichnet. Bei der Beschichtung von Zellen, um als Sphäroide zu wachsen, ist ein phenolrotfreies Medium mit 10% FBS erforderlich, um eine Färbung des ECM-Kellermaterials zu vermeiden, die wiederum Artefakte während des Bildgebungsprozesses verursachen kann.
2. Subkulturzellen
   1. Wenn die Zellen zu etwa 80% konfluent sind, waschen Sie kurz mit 2 ml Trypsin-EDTA (0,25% (w / v) Trypsin / 0,53 mM EDTA). Trypsin-EDTA abpumpen, 3 ml frisches Trypsin-EDTA hinzufügen und 3-5 min bei 37 °C inkubieren.
   2. Wenn sich die Zellen von der Zellkulturschale lösen, fügen Sie 7 ml frisches Vollmedium hinzu.
   3. 1 ml Zellsuspension in eine neue 10 cm Zellkulturschale pipettieren und 9 ml frisches Vollmedium hinzufügen, um eine 1:10-Verdünnung der Zellen zu erhalten.
   4. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% _CO2.
   5. Subkulturieren Sie die Zellen alle 3-5 Tage, abhängig von der Zelllinie.

2. Erzeugung von Sphäroiden

1. Beschichtung von 96-Well-Platten mit ECM-Kellermaterial
   1. Auftauen von ECM-Kellermaterial über Nacht auf Eis.
   2. Verdünnen Sie ECM-Kellermaterial in kaltem phenolrotfreiem serumfreiem Medium mit vorgekühlten Spitzen, die bei -20 ° C gehalten werden.
      HINWEIS: Die Endkonzentration des ECM-Kellermaterials hängt von der verwendeten Zelllinie ab. Für HT-29- und H358-Zellen verwenden Sie 4 mg·^{mL-1 ECM-Kellermaterial} . Für HepG2-Zellen verwenden Sie 4 mg·^{mL-1 ECM-Kellermaterial} mit reduziertem Wachstumsfaktor.
   3. Pippen Sie 15 μL des ECM-Kellermaterials/der Mediumlösung in eine 96-Well-Bildplatte.
      HINWEIS: Für die Sphäroidproduktion in großem Maßstab kann dieser Schritt sowohl mit einer 8-Kanal-Pipette als auch mit einem 96-Kanal-Pipettierkopf durchgeführt werden, solange die Spitzen und das Reservoir, die das ECM-Kellermaterial enthalten, gekühlt sind.
   4. Zentrieren Sie die Platte für 20 min bei 91 x g bei 4 °C.
   5. Inkubieren Sie die Platte nicht länger als 30 min bei 37 °C.
2. Subkultur- und Zählzellen
   1. Inkubieren Sie die Zellen während der Platteninkubationszeit mit Trypsin-EDTA und resuspendieren Sie sie in einem vollständigen Medium, das 10% FBS enthält.
   2. Pipette 10 μL der Zellsuspension in eine Hämozytometer-Zählkammer. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in 4 Quadranten der Kammer.
   3. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen innerhalb der Zellsuspension, indem Sie die mittlere Anzahl der Zellen innerhalb der 4 Quadranten bestimmen.
      HINWEIS: Zellen können auch mit automatisierten Zellzählgeräten gezählt werden.
   4. Zentrifen Sie die Zellen bei 135 x g für 4 min bei Raumtemperatur (RT).
   5. Sobald die Zellen pelletiert sind, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem phenolrotfreien vollständigen Medium, um eine Konzentration von 1 x ¹⁰⁶ Zellen pro ml zu erhalten.
3. Samenzellen in ECM-Keller-Material-beschichtete Platten
   1. Verdünnen Sie die Zellen in einem phenolrotfreien Vollmedium.
      HINWEIS: Die Dichte der ausgesäten Zellen hängt von der verwendeten Zelllinie ab. Für HT-29- und HepG2-Zellen werden pro Bohrung 3 x ¹⁰⁴ Zellen ausgesät; für ^H358-Zellen werden pro Well 4 x 104 Zellen ausgesät.
   2. Säen Sie die Zellen in einem Gesamtvolumen von 35 μL pro Well. Stellen Sie sicher, dass Sie sie tropfenweise in einer kreisförmigen Bewegung hinzufügen.
      HINWEIS: Für die großtechnische Sphäroidproduktion kann dieser Schritt mit einer 8-Kanal-Pipette durchgeführt werden, solange die Pipettierkreisbewegung erreicht werden kann.
   3. Die Zellen für 1 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% _CO2 inkubieren.
   4. Bereiten Sie eine Lösung von ECM-Kellermaterial in phenolrotfreiem Vollmedium vor, was zu einer Endkonzentration von 2% ECM-Kellermaterial im Bohrloch führt. Um dies zu erreichen, fügen Sie 1,2 μL ECM-Kellermaterial zu 23,8 μL phenolrotfreiem Vollmedium pro Vertiefung hinzu, was zu einem Endvolumen von 60 μL pro Vertiefung führt.
   5. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% _CO2.
   6. Ersetzen Sie das Medium am folgenden Tag durch 100 μL frisches phenolrotfreies Vollmedium.
   7. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag durch 100 μL frisches phenolrotfreies Vollmedium.

3. Immunfluoreszenzfärbung von Sphäroiden

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Nürnberg et al., 202015, übernommen. Diese Anpassungen beruhen in erster Linie auf der Tatsache, dass die in diesem Protokoll beschriebenen Sphäroide kleiner sind als die in den Arbeiten Nürnberg et ^al.15 verwendeten und somit kürzere Inkubationszeiten ermöglichen. So werden beispielsweise die Sperrzeiten von 2 h auf 1 h reduziert. Da das Protokoll für die Hochdurchsatzproduktion von Sphäroiden ausgelegt ist, werden außerdem alle Verarbeitungsschritte in der Vertiefung durchgeführt, in der die Sphäroide kultiviert werden, so dass die Übertragung einzelner Sphäroide in Rohre nicht erforderlich ist.

1. Bereiten Sie alle Lösungen und Puffer vor, die für die Fixierung und Färbung erforderlich sind
   1. Bereiten Sie Phosphat Buffered Saline (PBS) vor, indem Sie 1 PBS-Tablette pro 200 ml Wasser hinzufügen. Autoklavieren Sie das PBS.
   2. Paraformaldehyd (PFA) nach den Schritten 3.1.3-3.1.4 herstellen.
   3. Verwenden Sie einen beheizten Rührer, um 400 ml PBS in einem Abzug auf 60-70 °C zu erhitzen. Unter Rühren 15 g PFA hinzufügen. Sobald sich die PFA aufgelöst hat, fügen Sie 50 μL von 1 M CaCl2 und 50 μL von 1 M _MgCl2 hinzu.
   4. Fügen Sie 100 ml PBS hinzu, um ein Endvolumen von 500 ml zu erhalten. Verwenden Sie NaOH, um die PFA auf pH 7,4 auszugleichen. Filtern Sie die PFA durch sterile Vakuumfilter (Porengröße 0,22 μm), aliquot und lagern Sie sie bei -20 °C.
   5. Bereiten Sie eine 1 M Glycin-Stammlösung vor, indem Sie 3,75 g Glycin zu 50 ml PBS hinzufügen. Bei 4 °C lagern.
   6. Bereiten Sie 5 ml Permeabilisierungspuffer vor, indem Sie 100 μL Triton X-100, 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) und 1,5 ml 1 M Glycin zu 2,4 ml PBS hinzufügen. Bei 4 °C nicht länger als 2 Wochen lagern.
   7. Bereiten Sie 5 ml Blockpuffer vor, indem Sie 100 μL Triton X-100, 0,5 ml DMSO und 0,05 g Rinderserumalbumin (BSA) zu 4,9 ml PBS hinzufügen. Aliquot den Sperrpuffer in 1,5-ml-Röhrchen geben und bei -20 °C lagern.
   8. Bereiten Sie 5 ml Antikörper-Inkubationspuffer vor, indem Sie 10 μL Polysorbat 20, 0,05 g BSA und 250 μL DMSO zu 4,74 ml PBS hinzufügen. Aliquot den Antikörper-Inkubationspuffer in 1,5-ml-Röhrchen und lagern ihn bei -20 °C.
      HINWEIS: In dem hier beschriebenen Protokoll werden Sphäroide nur in den inneren 60 Vertiefungen einer 96-Well-Platte montiert, obwohl sie in allen 96 Wells der Platte hergestellt werden können. Der Grund dafür, nur Sphäroide in den inneren 60 Vertiefungen vorzubereiten, ist, dass einige Objektivlinsen mit hoher numerischer Apertur aufgrund des "Rocks" auf einigen Plattentypen nicht in der Lage sind, den gesamten Brunnen der äußeren Vertiefungen physisch abzubilden. Die oben genannten Volumina sind ausreichend für die Herstellung von 60 Wells, die Sphäroide enthalten.
2. Fixieren und Permeabilisieren der Sphäroide
   1. Entfernen Sie das Medium vorsichtig von den Sphäroiden und stellen Sie sicher, dass die ECM-Kellermaterialschicht nicht gestört wird.
   2. Waschen Sie die Sphäroide zweimal mit 70 μL PBS für jeweils 3 Minuten.
   3. Fixieren Sie die Sphäroide mit 70 μL 3% PFA für 1 h bei 37 °C.
   4. Waschen Sie die Sphäroide zweimal mit 70 μL PBS für jeweils 3 Minuten.
   5. Abschrecken mit 70 μL 0,5 M Glycinlösung für 30 min bei 37 °C.
   6. Permeabilisieren Sie die Sphäroide mit 70 μL des Permeabilisierungspuffers für 30 min bei RT.
   7. Waschen Sie die Sphäroide zweimal mit 70 μL PBS für jeweils 3 Minuten.
   8. Inkubieren Sie die Sphäroide in 70 μL Sperrpuffer für 1 h bei 37 °C.
      HINWEIS: Sobald die Sphäroide fixiert sind, können alle nachfolgenden Verarbeitungsschritte mit einer 8-Kanal-Pipette oder einem 96-Well-Pipettierkopf, falls verfügbar, durchgeführt werden. Dies erhöht die Geschwindigkeit der Sphäroidpräparation vor der Bildgebung.
3. Immunflecken-Sphäroide mit primären und sekundären Antikörpern
   1. Verdünnen Sie den primären Antikörper zu einer geeigneten Verdünnung im Antikörper-Inkubationspuffer und fügen Sie 70 μL zu jeder Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Sphäroide mit dem primären Antikörper über Nacht.
      HINWEIS: Die Verdünnung hängt vom spezifischen verwendeten Antikörper ab. In dem hier gezeigten Beispiel werden Lysosomen mit Maus-Anti-LAMP1-Antikörpern unter Verwendung einer Verdünnung von 1:500 immungefärbt.
   2. Waschen Sie die Sphäroide am nächsten Tag 5 Mal mit 70 μL PBS für jeweils 3 Minuten.
   3. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper bei einer Verdünnung von 1:500, fluoreszenzkonjugiertes Phalloidin bei 1:500 und Hoechst 33342 (aus einem 1 mg ml-1-Vorrat) bei ¹ :5000 im Antikörper-Inkubationspuffer und fügen Sie 70 μL zu jeder Vertiefung hinzu. Über Nacht inkubieren.
      HINWEIS: Die Antikörperverdünnung hängt vom spezifischen verwendeten Antikörper ab. Empfohlen werden stark kreuzadsorbierte sekundäre Antikörper, die eine hohe Photostabilität und hohe Helligkeit aufweisen.
   4. Waschen Sie die Sphäroide am nächsten Tag 5 Mal mit 70 μL PBS für jeweils 3 Minuten.
      HINWEIS: Platten können vor der Bildgebung bis zu zwei Wochen bei RT gelagert werden, solange die Sphäroide mit PBS bedeckt bleiben.

4. Bildaufnahme und Analyse von Sphäroiden

1. Bildaufnahme
   1. Setzen Sie die 96-Well-Platte, die Sphäroide enthält, in ein konfokales High-Content-Screening-Mikroskop ein.
   2. Wählen Sie die geeigneten Laser aus, um die verwendeten Fluorophore anzuregen.
   3. Erfassen Sie die Kanäle nacheinander, um Übersprechen zu vermeiden.
   4. Stellen Sie die Sphäroide mit geeigneten Objektiven dar.
      HINWEIS: Die Verwendung von Wassertauchobjektiven wird empfohlen, falls verfügbar. Zum Beispiel kann ein 20x / 1.0 NA-Objektiv einen ganzen Brunnen in ~ 77 Sichtfeldern abbilden. Ein 63x/1,15 NA Objektiv kann einen ganzen Brunnen in ca. 826 Sichtfeldern abbilden.
   5. Bild ~30-40 Scheiben, abhängig von der Tiefe des Sphäroides, wobei jede Schicht in einem Intervall von 1,5 μm von der vorhergehenden aufgenommen wird.
2. Bildanalyse
   1. Für die morphologische Analyse von Sphäroiden führen Sie die Schritte 4.2.2-4.2.6 aus.
   2. Segmentieren Sie die Sphäroide basierend auf der fluoreszierend konjugierten Phalloidin-Färbung.
   3. Segmentieren Sie die Kerne basierend auf der Hoechst 33342-Färbung.
   4. Segmentieren Sie das Zytoplasma jeder Zelle durch den verbleibenden Hoechst 33342-Fleck, der im Zellzytoplasma vorhanden ist.
   5. Berechnen Sie verschiedene morphologische Eigenschaften der Sphäroide, einschließlich Volumen, Oberfläche, Sphärizität und der Anzahl der Kerne pro Sphäroide.
      HINWEIS: Diese Informationen werden mit verschiedenen Algorithmen extrahiert, die in der Bildanalysesoftware Ihrer Wahl integriert sind.
   6. Verarbeiten Sie die Bilder weiter, um Sphäroide kleiner als 75.000 ^μm3 und größer als 900.000 ^μm3 zu entfernen.
      HINWEIS: Diese Werte sind Vorschläge, um das Entfernen von sehr kleinen Zellbaugruppen und großen Baugruppen zu ermöglichen, die möglicherweise durch die Fusion mehrerer Sphäroide entstanden sind. Sphäroide können in diesem Schritt auch in verschiedene Größenklassen eingeteilt werden.
   7. Um einzelne Zellen innerhalb von Sphäroiden zu analysieren, führen Sie die Schritte 4.2.8-4.2.12 aus.
   8. Segmentieren Sie die Sphäroide basierend auf der fluoreszierend konjugierten Phalloidin-Färbung.
   9. Segmentieren Sie die Kerne basierend auf der Hoechst 33342-Färbung.
   10. Segmentieren Sie das Zytoplasma jeder Zelle durch den verbleibenden Hoechst 33342-Fleck, der im Zellzytoplasma vorhanden ist.
   11. Segmentieren Sie die Lysosomen anhand der sekundären Antikörperfärbung.
   12. Berechnen Sie verschiedene morphologische Eigenschaften der Zellen in jedem Sphäroid, einschließlich der Anzahl der Lysosomen pro Zelle, des Zellvolumens und der Zelloberfläche.
       HINWEIS: Diese Informationen werden mit verschiedenen Algorithmen extrahiert, die in der Bildanalysesoftware Ihrer Wahl integriert sind.

Ergebnisse

In diesem Protokoll wird eine robuste Methode zur Herstellung von 3D-Zellkulturanordnungen in Form von Sphäroiden beschrieben, bei denen verschiedene Zelltypen verwendet werden, um verschiedene Tumorgewebe darzustellen. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung von Hunderten von Sphäroiden pro Well, wodurch zellbasierte Assays in einer High-Content-Weise durchgeführt werden können (Abbildung 1). Dieser Ansatz wurde zuvor verwendet^, um die Aufnahme von Nanopartikeln in HT...

Diskussion

Der hier beschriebene Ansatz beschreibt eine Plattform zur Erzeugung von mehreren hundert Sphäroiden pro Bohrloch in einer Weise, die für HCS und HCA geeignet ist. Im Vergleich zu anderen populären Methoden, wie der Verwendung von ULA-Platten mit flachem und rundem Boden, die die Bildung von nur einem Sphäroid pro Bohrloch ^{ermöglichen18,19}, bietet diese Methode die Möglichkeit^, hochauflösende Informationen aus einer großen Anzahl von Sphäroiden in einem Screening...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,05 % Trypsin-EDTA (1x), Phenolrot	Gibco	25300054
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma Aldrich	A6003
Calciumchlorid	Fisher Scientific	10050070
CellCarrier-96 Ultra Microplates, gewebekulturbehandelt, schwarz, 96-well mit Deckel	Perkin Elmer	6055302	Diese Platten wurden umbenannt in Phenoplates
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Fötales Kälberserum (FBS), qualifiziert, EU-zugelassen, Herkunft aus Südamerika, hitzeinaktiviertes	Gibco	10500064
Glycin	Fisher Scientific	BP381-1
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11029
L-Glutaminlösung, 200 mM	Gibco	25030024
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	14533
Magnesiumchlorid	Fisher Scientific	10647032
Matrigel Basalmembran Matrix, Phenol Red-frei, LDEV-frei, 10 mL	Corning	356237	Diese Matrigel-Formulierung finden Sie unter der gleichen Katalognummer auch bei BD Biosciences
Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	356231	Diese Matrigel-Formulierung ist unter der gleichen Katalognummer auch bei Corning
McCoy's 5A Medium	Gibco	26600023
McCoy's 5A Medium mit L-Glutamin und Natriumbicarbonat, ohne phenolrotes	Hyclone	10358633
Minimum Essential Medium (MEM)	Gibco	21090022
Minimum Essential Medium (MEM), ohne Glutamin, ohne Phenolrot	Gibco	51200046
Maus monoklonaler Anti-LAMP1-Antikörper (Konzentrat)	Entwicklungsstudien Hybridom Bank	H4A3-a
Neubauer Zählkammer	Hirschmann	8100203
Nunclon Gewebekulturschale mit Deckel, Polystyrol, 92 mm x 17 mm	ThermoFisher Scientific	150350
Opera Phenix HCS System und Harmony HCA Software	Perkin Elmer	HCSHH14000000
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma Aldrich	P6148
Phalloidin Alexa Fluor 568	Invitrogen	A12380
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Tabletten	Sigma Aldrich	P4417
Polysorbat 20	Sigma Aldrich	P5927
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870010
RPMI 1640 Medium, ohne Glutamin, ohne Phenolrot	Gibco	11835063
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
Stericup sterile Vakuumfiltereinheiten	Millipore	SCGVU05RE