Summary
O objetivo deste protocolo é caracterizar um novo modelo de neurodegeneração glaucomatosa baseado na cauterização térmica 360° do plexo vascular limbal, induzindo hipertensão ocular subaguda.
Abstract
O glaucoma, segunda causa de cegueira no mundo, é um grupo heterogêneo de doenças oculares caracterizadas por danos estruturais ao nervo óptico e degeneração das células ganglionares da retina (CGR), resultando em disfunção visual pela interrupção da transmissão de informações visuais do olho para o cérebro. A pressão intraocular elevada é o fator de risco mais importante; Assim, vários modelos de hipertensão ocular têm sido desenvolvidos em roedores por abordagens genéticas ou experimentais para investigar as causas e efeitos da doença. Dentre essas, algumas limitações têm sido relatadas, como invasividade cirúrgica, avaliação funcional inadequada, exigência de treinamento extensivo e extensão altamente variável do dano retiniano. O presente trabalho caracteriza um método simples, de baixo custo e eficiente para induzir hipertensão ocular em roedores, baseado na cauterização em círculo completo do plexo limbal a baixa temperatura, um dos principais componentes da drenagem aquosa do humor. O novo modelo proporciona uma hipertensão ocular subaguda tecnicamente fácil, não invasiva e reprodutível, associada à degeneração progressiva do CGR e do nervo óptico, e uma taxa de recuperação clínica pós-operatória única que permite estudos funcionais in vivo por métodos eletrofisiológicos e comportamentais.
Introduction
A literatura médica entende o glaucoma como um grupo heterogêneo de neuropatias ópticas caracterizadas por degeneração progressiva das células ganglionares da retina (CGRs), dendritos, soma e axônios, resultando em escavação estrutural (escavação) do disco óptico e deterioração funcional do nervo óptico, levando à amaurose em casos não controlados pela interrupção da transmissão de informações visuais do olho para océrebro1. Atualmente, o glaucoma é a causa mais comum de cegueira irreversível em todo o mundo, com previsão de atingir aproximadamente 111,8 milhões de pessoas em 20402, afetando profundamente a qualidade de vida (QV) dos pacientes e levando a importantes preocupações socioeconômicas3.
A pressão intraocular (PIO) elevada é um dos mais importantes e o único fator de risco modificável para o desenvolvimento e progressão do glaucoma. Dentre os múltiplos tipos de glaucoma, todos, exceto o glaucoma de tensão normal (GNT), estão associados à PIO elevada em algum momento da história clínica da doença. Apesar dos notáveis avanços clínicos e cirúrgicos para atingir a PIO e retardar ou interromper a progressão da doença, os pacientes ainda perdem a visão devido ao glaucoma 4,5. Portanto, o conhecimento aprofundado da fisiopatologia complexa e multifatorial dessa doença é imperativo para o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes, especialmente para fornecer neuroproteção aos CGRs.
Entre uma variedade de abordagens experimentais para a compreensão dos mecanismos da doença, os modelos animais baseados em hipertensão ocular (OHT) mais se assemelham ao glaucoma humano. Os modelos de roedores são particularmente úteis por serem de baixo custo, fácil manuseio, manipulação genética, vida útil curta e características anatômicas e fisiológicas oculares comparáveis aos humanos, como produção e drenagem do humor aquoso 6,7,8,9,10,11,12,13 . Os modelos atualmente utilizados incluem esclerose da malha trabecular após injeção de solução salina hipertônica em veias episclerais 14, injeção intracameral de microesferas15 ou substâncias viscoelásticas 16, cauterização de veias vórtices 17, fotocoagulação da tela trabecular com laser de argônio18, sutura circunlimbal 19 e uso de um modelo transgênico de OHT relacionada à idade (camundongos DBA/2J)8. No entanto, invasividade, opacificação pós-operatória da córnea, ruptura do segmento anterior, curvas de aprendizado extensas, equipamentos caros e PIO pós-operatória altamente variável estão entre algumas das armadilhas relatadas associadas aos modelos atuais, tornando o desenvolvimento de um modelo alternativo de ESB uma demanda para superar esses problemas20,21,22.
O presente protocolo formaliza um novo procedimento cirúrgico para induzir OHT como substituto do glaucoma, baseado na cauterização do plexo limbal (LPC) emroedores23. Trata-se de um modelo fácil, reprodutível, acessível e não invasivo, que proporciona alta eficiência e baixa variabilidade de elevação da PIO, associado a uma taxa excepcionalmente alta de recuperação clínica completa, proporcionando avaliação funcional in vivo em um número reduzido de animais utilizados em cada experimento. A técnica cirúrgica induz OHT subaguda com retorno gradual aos níveis basais em poucos dias, o que modela o ataque hipertensivo observado no glaucoma agudo de ângulo fechado. Além disso, a recuperação da PIO no modelo é seguida por neurodegeneração glaucomatosa contínua, o que é útil para futuros estudos mecanísticos da degeneração secundária dos CGRs, que ocorre em vários casos de glaucoma humano apesar do controle adequado da PIO.
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Protocol
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Declaração para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e Visual da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) e aprovada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais em Experimentação Científica do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio de Janeiro (protocolo 083/17). No presente trabalho, foram utilizados ratos Lister Hooded, de ambos os sexos, com idade entre 2-3 meses e peso de 180-320 g. No entanto, o procedimento pode ser adaptado em diferentes linhagens de ratos de várias faixas etárias.
1. Cirurgia de hipertensão ocular e seguimento clínico
- Animais domésticos em ambiente de temperatura controlada e ciclo claro/escuro de 12 h (6h: luz acesa/ 18h: luz apagada) com alimento padrão peletizado irradiado por radiação gama (Nuvilab® CR-1, Quimtia S/A, Brasil) e água (filtro triplo, com carvão ativado atóxico) disponível ad libitum.
- Preparar uma calda de coquetel anestésico composta por três partes de cloridrato de cetamina a 10% e uma parte de cloridrato de xilazina a 2% (diluente: água estéril).
- Conter suavemente o animal segurando a pele dorsal e induzir anestesia pela administração intraperitoneal de 1 μL/g de peso corporal da mistura (cetamina: 75 mg/kg; xilazina: 5 mg/kg). Verifique se há anestesia adequada após aproximadamente 5 min, realizando uma resposta de pinça do dedo.
- Anestesiar topicamente ambas as superfícies oculares instilando colírio de proximetacaína a 0,5%. Aguarde 30-60 s e remova a solução restante da face anterior do globo, tocando suavemente a conjuntiva bulbar nasal ou lateral com um pequeno cotonete estéril.
- Medir a PIO basal dos olhos controles experimentais e contralaterais colocando o animal em decúbito ventral na bancada, de modo que a superfície corneana seja facilmente acessível à ponta do tonômetro.
- Use o tonômetro portátil de aplanação ou rebote (Figura 1A). Posicione a ponta do tonômetro de forma que ela toque levemente a zona corneana central perpendicularmente. Adquira e faça uma média de 3 a 5 médias confiáveis geradas por máquinas. Cada média é calculada automaticamente pelo aparelho após seis medições individuais bem-sucedidas.
- Carregue o tonômetro de rebote com uma sonda e pressione o botão de medição uma vez para ligá-lo, enquanto coloca a ponta do dispositivo para cima, a fim de evitar que a sonda caia. Após ligar, o visor mostrará 00 indicando que o equipamento está pronto para medir.
- Posicione o aparelho com a ponta da sonda a uma distância de 1-4 mm da córnea e adquira as medidas pressionando rápida e cuidadosamente o botão de medição, sem movimentar o equipamento. Cada medida bem-sucedida é identificada por um bipe curto e, após seis vezes, a média é exibida na tela do dispositivo.
NOTA: Apesar da longa experiência com tonômetro de aplanação, para otimizar todo o procedimento os autores recomendam o uso de um tonômetro de rebote, que facilita a obtenção de medidas confiáveis da PIO.
- Colocar o animal em decúbito lateral leve sob estereomicroscópio e planejar cuidadosamente a cirurgia inspecionando o olho experimental em aumento de 40x. Não se esqueça de manter o olho de controle contralateral lubrificado durante o procedimento, instilando uma gota de carmelose sódica ou hialuronato de sódio.
- Com o auxílio de pinças curvas, empurre suavemente o globo ocular experimental de modo a expor a vasculatura que envolve 360° do limbo13. Com a outra mão, cauterizar suavemente os vasos ao redor da córnea com um cautério oftálmico de baixa temperatura (1.300 °F; Bovie Medical, EUA) (Figura 1B-E).
OBS: O referido cautério possui ponta arredondada que deve tocar longitudinalmente a vasculatura do limbo. - Cuidado para não cauterizar a periferia corneana, pois isso pode resultar em opacificação corneana pós-operatória, o que impossibilita a avaliação in vivo da função retiniana.
- Observar o surgimento de pequenas marcas circulares de cauterização no limbo escleral, a obliteração da vasculatura limbal e a dilatação pupilar no olho operado, sinais de sucesso do procedimento cirúrgico.
OBS: Como a vasculatura limbal de ratos e camundongos é anatomicamente semelhante13,24 e o cautério utilizado possui ponta pequena e suave, este protocolo pode funcionar também para o olho de camundongo sem qualquer adaptação. - Após a cirurgia, verificar a PIO pós-operatória imediata em ambos os olhos, como descrito no passo 1.5.
- Aplicar uma gota de acetato de prednisolona oftálmica (1,2 mg/mL) e mantê-la em contato com a superfície anterior do olho experimental por cerca de 40 s, substituindo-a por uma pomada oftálmica de antibióticos (cloridrato de oxitetraciclina 30 mg/g mais polimixina B 10.000 U/g; ou ciprofloxacina 3,5 mg/g). Realizar injeção intramuscular de cloridrato de tramadol (dose única; 2 mg/kg) para prevenir dor após o procedimento.
- Acompanhe de perto a recuperação do animal da anestesia, preferencialmente em um ambiente quente, como uma almofada de aquecimento ou dentro de sua gaiola de alojamento com cama adequada. Preste atenção ao padrão respiratório.
- Realizar acompanhamento clínico diário do olho experimental com medicações tópicas compostas por anti-inflamatório não esteroidal (AINE, por exemplo, colírio cetorolaco trometamol 0,5%) e pomada antibiótica (preferencialmente a mesma utilizada imediatamente após a cirurgia).
NOTA: O uso de AINEs em vez de colírios anti-inflamatórios esteroidais é recomendado porque este último pode induzir OHT e é regularmente aplicado para modelos de glaucoma induzido por glicocorticoides em roedores.- Sob sedação leve (cetamina: 18,75 mg/kg; xilazina: 1,25 mg/kg), medir a PIO preferencialmente no mesmo período do dia, para evitar viés devido à flutuação fisiológica da PIO circadiana.
- Durante o exame ocular, observe intercorrências clínicas raras, como hifema, fibrose corneana ou adelgaçamento escleral associado ao prolapso uveal. Edema de córnea, quemose e hiperemia conjuntival são comuns, mas temporários.
- Observar recuperação clínica completa por volta do 7º dia de pós-operatório. A revascularização do limbo geralmente começa nos primeiros dois dias após a cirurgia, de acordo com o retorno gradual esperado da PIO aos valores basais.
2. Análise da resposta optomotora (OMR)
OBS: Para este procedimento, foi utilizado um sistema específico25.
- Organize quatro monitores de computador em um quadrilátero, que delimitam uma arena com uma plataforma no meio. Nos monitores, exibe a imagem de um cilindro virtual com grades senoidais orientadas verticalmente (listras alternadas em preto e branco), girando em torno da plataforma a uma velocidade fixa (12 graus/s) e contraste (100%).
- Posicione uma câmera de vídeo acima da plataforma, permitindo que o experimentador observe os movimentos do animal. Realizar o teste em condições fotópicas e definir o software preferencialmente no modo manual/separado, a fim de avaliar cada olho separadamente.
- Permita que os animais se habituem por aproximadamente 2 min na plataforma. Mantenha o cursor da mira vermelha no quadro de vídeo entre os olhos do animal em movimento livre, pois indica o centro do cilindro virtual (Figura 1G)25.
- Observar a TMO, que consiste em um rastreamento reflexivo da cabeça e pescoço do animal provocado pelas grades rotatórias. Teste as vias visuais esquerda e direita girando as direções das grades de onda senoidal no sentido horário e anti-horário, respectivamente.
- Inicialmente apresentam um estímulo com baixa frequência espacial (0,042 ciclos/grau). Em seguida, incremente a frequência progressivamente até que o movimento de rastreamento não seja mais notado. A maior frequência espacial em que uma OMR clara é eliciada corresponde à frequência espacial limiar do olho avaliado.
- Se o animal eventualmente cair da plataforma durante o exame, devolva-o imediatamente à plataforma e retome o teste.
3. Registro do eletrorretinograma padrão (PERG)
OBS: O eletrorretinograma foi registrado utilizando-se um sistema específico para processamento de sinais e software relacionado para armazenamento e análise das formas de onda.
- Anestesiar profundamente os animais por injeção intramuscular de cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina (75 mg/kg e 5 mg/kg, respectivamente). A anestesia profunda (plano cirúrgico) diminui as chances de artefatos por movimentos musculares involuntários ou fontes alternativas de ruído durante o exame. Verifique se há anestesia adequada realizando uma resposta de pinça do dedo do pé.
LEGENDA: Os agentes anestésicos citados não afetam a amplitude da resposta26. Como uma pequena agulha inserida na córnea foi usada como eletrodo ativo, a anestesia intramuscular é preferida em vez da intraperitoneal, pois é mais fácil de reinjetar caso o rato necessite de uma dose de reforço (1/2 da dose inicial), com menores chances de modificar a posição do eletrodo e, assim, levando a registros mais reprodutíveis durante todo o experimento, que pode durar até 60 min. - Anestesiar topicamente a córnea com uma gota de cloridrato de proximetacaína 0,5% e manter o olho umedecido com lubrificantes oftálmicos.
- Inserir cuidadosamente o eletrodo ativo (agulha de aço inoxidável 0,25 mm × 15 mm) na periferia temporal da córnea. Além disso, inserir os eletrodos de referência e terra (agulha de aço inoxidável 0,4 mm × 37 mm) no tecido subcutâneo do canto temporal ipsilateral e em um dos membros pélvicos, respectivamente (Figura 1I).
- Para o PERG, ajuste o estímulo para um xadrez reservatório preto e branco, alternando em 15 reversões/s com luminância média constante (250 cd/m2). Defina o filtro passa-banda para 1 Hz-100 Hz.
NOTA: O estímulo de reversão rápida gera o PERG em estado estacionário, um sinusóide estável e reprodutível que reúne o componente de onda mais provavelmente associado à resposta bioelétrica RGC: a deflexão NII do PERG de estado transitório. - Posicionar o animal a 20 cm da tela de estímulo (monitor LCD 0,58 m; Figura 1I), monitore a linha de base do sinal e inicie a aquisição do PERG pressionando o botão Analysis no sistema de aquisição.
- Durante o procedimento, mantenha os animais adaptados à luz do ambiente (luz branca de ~140 lux). Aqui, seis frequências espaciais distintas (em ciclos por grau: 0,018, 0,037, 0,073, 0,146, 0,292, 0,585) foram apresentadas em sequência aleatória.
NOTA: O software usado para processamento de sinais executa automaticamente a média. A média de 200-300 ondas individuais foi considerada adequada para se destacar do ruído e analisar a amplitude das ondas.
4. Quantificação de somas de células ganglionares da retina
NOTA: O procedimento a seguir é para quantificação de somas RGC, com base na coloração imunohistoquímica de montagens planas da retina com um anticorpo contra a proteína de domínio homeobox/POU 3A específica do cérebro (Brn3a).
- Submeter animais de experimentação à eutanásia por luxação cervical, precedida de inalação de dióxido de carbono para induzir inconsciência.
- Imediatamente após a eutanásia, dissecar ambos os olhos sob um microscópio estéreo, usando pinça dentada e tesoura curva.
- Realizar dissecção cuidadosa de modo que tanto a porção distal dos músculos extraoculares quanto a carúncula permaneçam aderidas ao globo ocular, pois são marcos importantes para a orientação topográfica da retina (descritos no passo 4.5). Tente salvar um trecho do nervo óptico ligado ao globo o maior tempo possível para análises futuras.
- Após a enucleação, colocar os olhos em uma solução de 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA 4%) em tampão fosfato 0,1 M (PBS) e mantê-lo por 24 h para fixação química adequada.
- Separe a retina do resto dos tecidos oculares.
- Sob um microscópio dissecante, coloque o globo ocular em uma placa de Petri coberta com PBS 1x e preste atenção a pontos de referência importantes, como carúncula nasal, fissuras coroides e impressões esclerais de vórtices para orientação topográfica adequada27.
- Penetrar na câmara anterior a partir da córnea central usando pinça dentada e tesoura curva (westcott). Realizar dois cortes radiais na face superior (dorsal) da esclera, em direção ao forame escleral do nervo óptico, de modo a delimitar o quadrante dorsal do globo ocular.
- Separe a córnea do resto do globo terrestre através de um corte longitudinal de 360° no limbo escleral. Retirar o cristalino e a íris e delimitar o quadrante dorsal da retina utilizando as mesmas demarcações radiais esclerais descritas acima (passo 4.5.2).
- Desprender cuidadosamente o tecido retiniano da coroide e esclera, evitando lacerações aleatórias por todo o tecido e eventual perda topográfica de orientação.
- Separe o corpo ciliar da ora serrata da retina. Remova cuidadosamente o corpo vítreo restante do copo da retina usando uma pinça curva não dentada mais uma tesoura curva (puxe o vítreo e disseque-o perto da membrana limitante interna) e uma pequena escova.
NOTA: A remoção do humor vítreo é um passo importante para obter um sinal imuno-histoquímico forte e limpo.
- Transfira retinas isoladas para uma placa de cultura de 24 poços (uma retina por poço) contendo 1 mL de 1x PBS e mantenha a retina interna voltada para cima.
- Permeabilizar o tecido lavando 3x por 10 min com um tensoativo não iônico 0,5% diluído em 1x PBS (0,3 mL). Em seguida, manter o tecido agitando suavemente em albumina de soro bovino (BSA) a 5% em surfactante não iônico a 2% e 1x PBS (solução bloqueadora; 0,25 mL) por 60 min à temperatura ambiente.
- Durante a etapa 4.7, preparar a solução de anticorpos primários Brn3a diluindo 1:200 em tensoactivo não iónico a 0,5% e 1x PBS mais BSA a 5% e armazená-la a 4 °C.
- Após 60 minutos de bloqueio tecidual, incubar as retinas em 0,2 mL de solução de anticorpos primários a 4 °C por 72 h com agitação suave.
- Lavar o tecido 3x por 10 min com 1x PBS, em seguida, incubar o tecido por 2 h à temperatura ambiente em 0,2 mL da solução de anticorpos secundários diluída 1:750 em 1x PBS mais 5% BSA.
- Além disso, incubar o tecido por 10 min em solução de contracoloração nuclear para coloração de núcleos fluorescentes. Concluir a imunohistoquímica com uma etapa final de lavagem com 1x PBS (0,3 mL) repetido 3x.
- Transfira retinas com o auxílio de duas pequenas escovas para lâminas de microscópio de vidro, mantendo o lado vítreo para cima. Posicionar o quadrante dorsal da retina para cima sobre as lâminas do microscópio (previamente delimitado no passo 4.5.3). Realizar mais dois cortes radiais em direção à cabeça do nervo óptico para delimitar os outros 3 quadrantes (nasal, ventral e temporal).
Observação : as dimensões de corte não são fixas. Eles não devem ser muito curtos que prejudiquem um achatamento eficiente da retina na lâmina e não devem ser muito longos para que atinja o forame do nervo óptico e separe completamente o quadrante retiniano delimitado do resto do tecido. - Finalmente, aplique 0,2 mL de meio de montagem antifade em uma lamínula de vidro e coloque-a na retina plana para análise microscópica do tecido. Para estimar a densidade de RGCs, examine as montagens planas sob um microscópio confocal de epifluorescência usando uma objetiva de 40x/1,3.
- Para cada quadrante da retina, tire oito fotos: duas da retina central (~0,9 mm do disco óptico), três da retina média (~2,0 mm do disco óptico) e três da retina periférica (~3,7 mm do disco óptico), totalizando 32 fotos por retina. Use o software FIJI para contar células positivas para Brn3a e estimar a densidade celular média.
5. Exame do nervo óptico
- Após a eutanásia e enucleação do globo ocular (passos 4.1-4.3), remover o segmento proximal da porção intraorbital do nervo óptico (1-2 mm), incluindo parte da porção intraocular, e colocar imediatamente as amostras em frascos/tubos contendo 0,2-0,3 mL de fixador a frio (solução de glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,4)) por 2 h.
NOTA: As seguintes etapas para o processamento do nervo óptico são executadas nos mesmos frascos / tubos da etapa 5.1 - Lave o material 3x por 5 min com tampão cacodilato de sódio 0,1 M frio. Tecido pós-fixação por 1 h sob agitação suave em solução de tetróxido de ósmio a 1,0% em ferrocianeto de potássio a 0,8% e cloreto de cálcio 5 nM diluído em tampão cacodilato de sódio 0,1 M a 4 °C (0,1-0,2 mL).
- Lavar fragmentos de nervo óptico 3x por 5 min com tampão cacodilato de sódio 0,1 M frio e, posteriormente, com água destilada fria, 3x por 1 min. Manter o material durante a noite sob agitação suave em uma solução de acetato de uranila a 1,0% em água destilada para coloração a 4 °C (0,1-0,2 mL). Lave os fragmentos 3x com água destilada fria.
- Desidratar progressivamente o tecido com uma série graduada de acetona (0,5 mL cada), com posterior substituição das seguintes diluições em água destilada: incubação 2x 7 min em acetona gelada a 15%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 30%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 50%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 70%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 80%; 2x 7 min de incubação em acetona gelada a 90%; 2x 15 min de incubação em acetona 100% à temperatura ambiente (TR).
- Realizar 3 etapas de infiltração/incorporação, com posterior substituição das seguintes soluções: 1 parte de resina epóxi: 2 partes de acetona (volume total: 0,5 mL), em TR por 12 h; 1 parte de resina epóxi: 1 parte de acetona (volume total: 0,5 mL), em TR por 12 h; 2 partes de resina epóxi: 1 parte de acetona (volume total: 0,5 mL), em TR por 12 h. Finalmente, infiltrar-se o tecido em resina epóxi pura em RT por 24 h.
- Retire as amostras do porta-amostras, transfira-as para moldes de incorporação e deixe polimerizar por 48 h a 60 °C. Cortar cortes transversais semifinos (300-400 nm) dos fragmentos do nervo óptico usando um ultramicrótomo, coletá-los e transferi-los para uma lâmina de vidro do microscópio. Cortes coratórios com azul de toluidina e imagem com microscópio óptico em aumento de 100x.
- Para análise ultraestrutural, realizar cortes transversais ultrafinos (70 nm), coletá-los em grades de cobre e corá-los com acetato de uranila e citrato de chumbo. Examine as seções em um microscópio eletrônico de transmissão.
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Representative Results
As variáveis quantitativas foram expressas como média ± erro padrão da média (EPM). Com exceção da comparação da dinâmica da PIO entre os grupos ESB e controle (Figura 1F), a análise estatística foi realizada por meio de ANOVA two-way seguida do teste de comparações múltiplas de Sidak. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
A Figura 1 ilustra os passos cirúrgicos do modelo de cauterização do plexo limbal (LPC) em círculo completo, com marcos importantes como o desaparecimento dos vasos límbicos induzido pela terma em 360°, bem como a midríase leve a moderada no olho operado ao final do procedimento.
Na presente série de 131 ratos, a cauterização completa do plexo limbal (LPC) induziu elevação da PIO imediatamente após a cirurgia de 13,0 ± 0,2 mmHg no início do estudo para 22,7 ± 0,4 mmHg. O pico da PIO pós-operatória foi observado no primeiro dia de pós-operatório (25,3 ± 0,6 mmHg), seguido por um retorno gradual aos níveis basais no6º dia de pós-operatório (análise estatística: teste t múltiplo corrigido para comparações múltiplas usando o método de Holm-Sidak; Figura 1F). Fibrose ou edema corneano eram intercorrências clínicas que poderiam comprometer a medida precisa da PIO. A primeira, por um lado, foi rara, acometendo 3,92% dos animais e observada tardiamente durante o seguimento pós-operatório, poupando os primeiros 5 dias de hipertensão ocular e preservando o perfil de OHT subagudadescrito23. O edema de córnea, por outro lado, foi uma complicação mais comum nos primeiros dias de pós-operatório (1-3 dias), mas principalmente leve e temporário, não afetou de forma robusta a PIO23.
A função retiniana foi avaliada comportamental e eletrofisiologicamente por meio do reflexo optomotor e do padrão-ERG, respectivamente (Figura 1G-J). Ambos os parâmetros apresentaram duas fases de comprometimento: uma fase aguda da hipertensão ocular no3º dia pós-operatório e uma fase de degeneração secundária no 30ºdia pós-operatório (Figura 1H, Figura J e Tabela 1). No meio, foi detectado um período de recuperação funcional, como discutido anteriormente em outro artigo23.
Em comparação com os colegas de controle dos nervos ópticos, a contagem axonal nos cortes transversais semifinos do nervo óptico mostrou diminuição progressiva após a cirurgia (3º dia: 68,3% ± 0,9%; 7º dia: 59,2% ± 2,6%; 14º dia: 45,4% ± 2,2%; 30ºdia: 28,2% ± 3,0%; ANOVA two-way: p < 0,0001; Figura 2A). Ultra-estruturalmente, os nervos ópticos dos olhos controles apresentavam fibras mielinizadas densamente compactadas, separadas por processos de células gliais finas, além de evidentes microtúbulos axonais e neurofilamentos (Figura 2B). Em contraste, aos 3 dias após OHT, encontramos ruptura focal de feixes de axônios, algumas fibras degeneradas, vacuolização citoplasmática em processos de células gliais e cromatina condensada em núcleos de células gliais. Após 7 dias da indução da OHT, houve aumento de fibras axonais degeneradas, processos hipertróficos de células gliais e inchaço e vazios em fibras axonais individuais. Aos 14 dias, uma das alterações mais proeminentes foi um maior desarranjo das fibras do nervo óptico, associado à invasão de processos celulares gliais entre os axônios. Feixes filamentares preenchiam esses processos e fibras degeneradas escuras, sendo mais comum a quebra da mielina, associada a lamelas descoladas e vacuolizadas (Figura 2B).
A densidade dos perfis de Brn3a+ diminuiu ao longo do tempo (Figura 2C), principalmente nos quadrantes dorsal e temporal da retina, para 32,4% ± 9,6% e 35,7% ± 9,1% após 30 dias, respectivamente (Figuras 2D-G e Tabela 2).
Figura 1: Termocauterização do plexo vascular limbal e consequências para a função retiniana in vivo. (A) Métodos alternativos para mensuração da PIO em ratos: tonometria de rebote (superior) e tonometria de aplanação (inferior). (B-E) Procedimento cirúrgico; cabeça de seta: plexo vascular limbal; seta: pinça curva utilizada para expor a superfície anterior do globo ocular e otimizar a avaliação cirúrgica dos vasos límbicos; haxixe: a ponta redonda do cautério oftálmico de baixa temperatura; asterisco: marca de cauterização. Barra de escala: 2 mm. Inset em (D) mostra em maior magnificação a vasculatura do limbo a ser cauterizada. (F) Tempo de evolução das medidas da PIO nos olhos ESB (vermelho) e controle (preto) (n = 131). Seta vertical para baixo: cirurgia LPC. * = p < 0,05 (G) Arena para análise da resposta optomotora, composta por quatro monitores de computador dispostos em um quadrilátero, com uma plataforma no meio. Os monitores exibem a imagem de um cilindro virtual composto por listras verticais alternadas em preto e branco se movendo ao redor do animal com velocidade de rotação constante e frequências espaciais variáveis. A mira vermelha corresponde ao centro do cilindro virtual. (H) Respostas optomotoras. Duas fases distintas são distinguidas no seguimento cirúrgico: a fase de OHT (0-5 dias) e a fase de degeneração secundária (6-30 dias). = p < 0,0001. (I) Eletrodos e posicionamento do animal para aquisição do ERG-padrão (PERG): o eletrodo ativo na periferia temporal da córnea e os eletrodos de referência e terra no tecido subcutâneo do canto temporal ipsilateral e de um dos membros posteriores, respectivamente. O animal é posicionado a 20 cm da tela de estímulo. (J) Amplitude do PERG em estímulos com diferentes frequências espaciais. Semelhante à resposta optomotora, a avaliação do PERG também mostra duas fases distintas de respostas após a cirurgia: hipertensa ocular aos 3 dias pós-operatórios, seguida de recuperação nos dias 7 e 14, embora ainda estatisticamente inferior às respostas virgens, e subsequente diminuição aos 30 dias após a cirurgia. c/d = ciclos por grau. Grupo ingênuo: olhos de animais não expostos a qualquer manipulação experimental prévia. (H) e (J) mostram média ± EPM, mais réplicas individuais em (H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação estrutural da retina e do nervo óptico após cauterização do plexo vascular limbal (LPC) com cautério oftálmico a baixa temperatura. (A) A contagem de axônios em tempos distintos após OHT (n = 3). = p = 0,0005, **** = p < 0,0001. (B) Micrografias eletrônicas da degeneração do nervo óptico após OHT. A imagem à esquerda mostra o nervo óptico de controle, e as imagens a seguir ilustram a degeneração progressiva após 3, 7 e 14 dias de OHT. Cabeça de seta: fibras mielinizadas normais; setas finas: fibras degeneradas; asterisco: vacuolização citoplasmática; hashes: processo de células gliais; e Nu: núcleo de células gliais. (C) Fotomicrografias de campos de contagem representativos de RGCs marcados com anticorpo para Brn3a (vermelho) e núcleos marcados com TO-PRO3 (azul); barra de escala: 50μm. (D-G) Distribuição da densidade celular média de Brn3a+ nos quatro quadrantes da retina após 3-30 dias da cirurgia. Os gráficos mostram médias individuais das densidades de CGR para 3-11 animais por tempo após o procedimento. * = p < 0,05; ** = p < 0,01; = p < 0,001; = p < 0,0001. Os dados quantitativos são médios ± MEV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Análise estatística dos dados do PERG. ANOVA two-way seguida do teste de comparações múltiplas de Sidak. Valor de p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. c/d = ciclos por grau. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Perda regional do CGR após o CPL. EPM: erro padrão da média. Controle: olho companheiro. Valores de p menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significativos (*). Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
A cauterização do plexo limbal (LPC) é um novo modelo pós-trabecular com a vantagem de ter como alvo estruturas vasculares de fácil acesso, não necessitando de dissecção conjuntival outenonal 17,28. Diferentemente do modelo de cauterização de veias vórtices, um renomado modelo de OHT baseado no comprometimento cirúrgico da drenagem venosa coroide, não se espera que a congestão venosa influencie a elevação da PIO no modelo LPC, uma vez que as veias límbicas estão situadas a montante no fluxo de humor aquoso. Além disso, é tecnicamente fácil de aprender e de baixo custo, exigindo principalmente um cautério térmico de baixa temperatura. Além disso, está associada a uma taxa única de indução de OHT e recuperação clínica completa (> 90%, como relatado anteriormente)23, o que reduz o número de animais necessários para experimentos e permite análises eletrofisiológicas e comportamentais. Finalmente, a degeneração glaucomatosa está presente tanto na camada RGC quanto no nervo óptico em um período de tempo relativamente curto após a cirurgia, permitindo desenhos experimentais em curto ou médio prazo23. Estudos futuros são necessários para melhor elucidar o impacto da cauterização da vasculatura limbal de círculo completo nas camadas individuais da retina.
As etapas críticas do protocolo cirúrgico são: (1) a ponta de cauterização deve tocar suavemente o limbo escleral paralelo ao eixo do vaso; (2) O tecido corneano deve ser poupado, não só durante a cauterização, mas também durante a manipulação dos animais. Realizar regularmente a instilação de colírios e a remoção do excesso de solução da superfície ocular com um cotonete (cuidado para não esfregar o cotonete na superfície da córnea ao remover qualquer líquido, pois leva à abrasão epitelial da córnea e eventuais complicações pós-cirúrgicas); (3) um círculo completo de marcas de cauterização contíguas deve ser visualizado; (4) não negligenciar o acompanhamento clínico pós-operatório com anti-inflamatório não esteroidal e pomada antibiótica, pelo menos até o5º dia de pós-operatório.
A elevação subaguda da PIO observada no modelo descrito difere da dinâmica pressórica do glaucoma de ângulo aberto, mas é semelhante ao glaucoma agudo de ângulo fechado, glaucoma neovascular ou múltiplos tipos de glaucoma pós-trabecular com pressão venosa episcleral elevada29. Essa é uma das principais limitações desse método, uma vez que o glaucoma de ângulo aberto é o fenótipo mais prevalente da doença, caracterizado por OHT crônica e degeneração lentamente progressiva do CGR. No entanto, a associação da normalização progressiva da PIO com a degeneração contínua do CGR representa uma oportunidade única para estudar, em um mesmo modelo animal, tanto os mecanismos biológicos que ligam a hipertensão ocular com o desenvolvimento e a progressão do glaucoma, quanto o processo degenerativo secundário mais observado nos casos de glaucoma de ângulo aberto, quando os pacientes apresentam evolução do glaucoma apesar do sucesso clínico ou cirúrgico em atingir a PIO alvo30. Assim, esse modelo representa uma oportunidade para melhor elucidar esse fenômeno por meio de desenhos experimentais de curto ou médio prazo e, eventualmente, desenvolver terapias neuroprotetoras independentes de pressão para beneficiar pacientes que ainda perdem a visão apesar do melhor tratamento de controle da PIO.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos aos nossos técnicos de laboratório José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza e Luciano Cavalcante Ferreira. Pesquisa financiada pela FAPERJ, CNPq e CAPES.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Isofar | 201 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Active electrode for electroretinography | Hansol Medical Co | - | Stainless steel needle 0.25 mm × 15 mm |
| Anestalcon | Novartis Biociências S/A | MS-1.0068.1087 | Proxymetacaine hydrochloride 0.5% |
| Calcium chloride | Vetec | 560 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Cautery Low Temp Fine Tip 10/bx | Bovie Medical Corporation | AA00 | Low-temperature ophthalmic cautery |
| Cetamin | Syntec do Brasil Ltda | 000200-3-000003 | Ketamine hydrochloride 10% |
| DAKO | Dako North America | S3023 | Antifade mounting medium |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 28718-90-3 | diamidino-2-phenylindole; blue fluorescent nuclear counterstain; emission at 452±3 nm |
| Ecofilm | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0487 | Carmellose sodium 0.5% |
| EPON Resin | Polysciences, Inc. | - | Epoxy resin used for electron microscopy, composed of a mixture of four reagents: Poly/Bed 812 Resin (CAT#08791); DDSA - Dodecenylsuccinic Anhydride (CAT#00563); NMA - Nadic Methyl Anhydride (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol (CAT#00553) |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16110 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Hyabak | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-8042140002 | Sodium hyaluronate 0.15% |
| Icare Tonolab | Icare Finland Oy | TV02 (model number) | Rebound handheld tonometer |
| IgG donkey anti-mouse antibody + Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Secondary antibody solution |
| LCD monitor 23 inches | Samsung Electronics Co. Ltd. | S23B550 | Model LS23B550, for electroretinogram recording |
| LSM 510 Meta | Carl Zeiss | - | Confocal epifluorescence microscope |
| Maxiflox | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0298.0489 | Ciprofloxacin 3.5 mg/g |
| MEB-9400K | Nihon Kohden Corporation | - | System for electroretinogram recording |
| monoclonal IgG1 mouse anti-Brn3a | MilliporeSigma | MAB-1585 | Brn3a primary antibody solution |
| Neuropack Manager v08.33 | Nihon Kohden Corporation | - | Software for electroretinogram signal processing |
| Optomotry | CerebralMechanics | - | System for optomotor response analysis |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Potassium ferrocyanide | Electron Microscopy Sciences | 20150 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Reference and ground electrodes for electroretinography | Chalgren Enterprises | 110-63 | Stainless steel needles 0.4 mm × 37 mm |
| Sodium cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Ster MD | União Química Farmacêutica Nacional S/A | MS-1.0497.1287 | Prednisolone acetate 0.12% |
| Terolac | Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda | MS-1.0497.1286 | Ketorolac trometamol 0.5% |
| Terramicina | Laboratórios Pfizer Ltda | MS-1.0216.0024 | Oxytetracycline hydrochloride 30 mg/g + polymyxin B 10,000 U/g |
| Tono-Pen XL | Reichert Technologies | 230635 | Digital applanation handheld tonometer |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher Scientific | T3605 | Far red-fluorescent nuclear counterstain; emission at 661 nm |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Non-ionic surfactant |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Used for electron microscopy tissue preparation (step 5) |
| Xilazin | Syntec do Brasil Ltda | 7899 | Xylazine hydrochloride 2% |
| Carl Zeiss | - | Stereo microscope for surgery and retinal dissection |
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