Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ist eine leistungsstarke, zerstörungsfreie und markierungsfreie Bildgebungstechnik. Eine aufkommende Anwendung ist die stimulierte Raman-Histologie, bei der die zweifarbige SRS-Bildgebung an den Protein- und Lipid-Raman-Übergängen verwendet wird, um Pseudo-Hämatoxylin- und Eosin-Bilder zu erzeugen. Hier demonstrieren wir ein Protokoll für die zweifarbige SRS-Bildgebung in Echtzeit für die Gewebediagnose.
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Methodenartikel
Echtzeit-, zweifarbige stimulierte Raman-Streubildgebung des Mausgehirns für die Gewebediagnose
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) hat sich zu einem leistungsstarken optischen Bildgebungsverfahren für die Gewebediagnose entwickelt. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass zweifarbiges SRS in der Lage ist, Hämatoxylin und Eosin (H & E) -äquivalente Bilder zu liefern, die eine schnelle und zuverlässige Diagnose von Hirntumoren ermöglichen. Diese Fähigkeit hat aufregende intraoperative Krebsdiagnoseanwendungen ermöglicht. Die zweifarbige SRS-Bildgebung von Gewebe kann entweder mit einer Pikosekunden- oder Femtosekunden-Laserquelle durchgeführt werden. Femtosekundenlaser haben den Vorteil, dass sie flexible Bildgebungsmodi ermöglichen, einschließlich schneller hyperspektraler Bildgebung und zweifarbiger SRS-Bildgebung in Echtzeit. Ein spektraler Fokussierungsansatz mit chirped Laserpulsen wird typischerweise mit Femtosekundenlasern verwendet, um eine hohe spektrale Auflösung zu erreichen.
Die Zwei-Farben-SRS-Erfassung kann mit orthogonaler Modulation und Lock-in-Erkennung realisiert werden. Die Komplexität des Pulschirpens, der Modulation und der Charakterisierung ist ein Engpass für die weit verbreitete Einführung dieser Methode. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll, um die Implementierung und Optimierung von spektral fokussierendem SRS und der zweifarbigen Echtzeitbildgebung von Hirngewebe der Maus im Epi-Modus zu demonstrieren. Dieses Protokoll kann für eine breite Palette von SRS-Bildgebungsanwendungen verwendet werden, die die Hochgeschwindigkeits- und spektroskopische Bildgebungsfähigkeit von SRS nutzen.
Einleitung
Die traditionelle Gewebediagnostik stützt sich auf Färbeprotokolle, gefolgt von einer Untersuchung unter einem optischen Mikroskop. Eine gängige Färbemethode, die von Pathologen verwendet wird, ist die H & E-Färbung: Hämatoxylin färbt Zellkerne in einem violetten Blau und Eosin färbt die extrazelluläre Matrix und das Zytoplasma rosa. Diese einfache Färbung bleibt der Goldstandard in der Pathologie für viele Aufgaben der Gewebediagnose, insbesondere für die Krebsdiagnose. Die H & E-Histopathologie, insbesondere die gefrorene Schnitttechnik, die in einer intraoperativen Umgebung verwendet wird, hat jedoch immer noch Einschränkungen. Das Färbeverfahren ist ein mühsamer P....
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Protokoll
Alle experimentellen Tierverfahren wurden mit 200 μm, festsitzenden, geschnittenen Mäusegehirnen gemäß dem Protokoll (# 4395-01) durchgeführt, das vom Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Washington genehmigt wurde. Wildtyp-Mäuse (C57BL/6J-Stamm) werden mit CO2 eingeschläfert. Dann wird eine Kraniotomie durchgeführt, um ihr Gehirn zur Fixierung in 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung zu extrahieren. Die Gehirne sind in eine Mischung aus 3% Agarose und 0,3% Gelatine eingebettet und durch ein Vibratom in 200 μm dicke Scheiben geschnitten.
1. Anfängliche Ausrichtung<....
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Ergebnisse
Optimierung der spektralen Auflösung:
Die Ausbreitung durch ein Material wird durch das dispersive Medium (Länge und Material) und die Wellenlänge beeinflusst. Eine Änderung der Dispersionsstablänge wirkt sich auf die spektrale Auflösung und die Signalgröße aus. Es handelt sich um eine Geben-Nehmen-Beziehung, die je nach Anwendung unterschiedlich abgewogen werden kann. Die Stäbe strecken den Strahlpuls von breit in der Frequenz und schmal in der Zeit zu eng in der Frequenz und breit in der Zeit.
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Diskussion
Das in diesem Protokoll vorgestellte zweifarbige SRS-Bildgebungsschema hängt von der ordnungsgemäßen Implementierung der einfarbigen SRS-Bildgebung ab. Bei der einfarbigen SRS-Bildgebung sind die kritischen Schritte die räumliche Ausrichtung, die zeitliche Ausrichtung, die Modulationstiefe und die Phasenverschiebung. Die räumliche Kombination der beiden Balken wird durch einen dichroitischen Spiegel erreicht. Mehrere Lenkspiegel werden zur Feineinstellung verwendet, wenn die Strahlen zum dichroitischen Spiegel geschickt .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Danksagungen
Diese Studie wurde unterstützt durch NIH R35 GM133435 bis D.F.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 100 mm achromatisches Objektiv | THORLABS | AC254-100-B | Breitband, 650 - 1.050 nm, achromatisches Objektiv Brennweite, 100 mm |
| 20 MHz Bandpassfilter | Minicircuits | BBP-21.4+ | Lumped LC Bandpassfilter, 19,2 - 23,6 MHz, 50 Ω |
| 200 mm Achromatische Linse | THORLABS | AC254-200-B | Breitband, 650 - 1.050 nm, achromatische Linse Brennweite, 200 mm |
| Achromatische Halbwellenplatte | Union Optik | WPA2210-650-1100-M25.4 | Breitband Halbwellenplatte |
| Achromatische Viertelwellenplatte | Union Optik | WPA4210-650-1100-M25.4 | Breitband Halbwellenplatte |
| Strahlabnehmer | THORLABS | BSN11 | 10:90 Plattenstrahlteiler |
| Dichroitischer Spiegel | THORLABS | DMSP1000 | Es können auch andere Dichroiten mit einer Mittenwellenlänge um 1.000 nm verwendet werden. |
| DMSO (Dimethylsulfoxid) | Sigma Aldrich | 472301 | Lösungsmittel zur Kalibrierung der Raman-Verschiebung. Andere Lösungsmittel mit bekannten Raman-Peaks können verwendet werden. |
| Elektrooptischer Amplitudenmodulator | THORLABS | EO-AM-NR-C1 | die orthogonale Modulation und die Zweikanal-Bildgebung werden zwei EOMs benötigt. Die Resonanzversion wird empfohlen, damit eine niedrigere Ansteuerspannung verwendet werden kann. |
| Falsch H& E Staining Script | Matlab | https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining | |
| Fanout Buffer | PRL-414B | Pulse Research Lab | 1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer und Line Driver, zur Erzeugung der EOM-Treiberfrequenz und der Referenz zur Lock-in |
| Schnelle Fotodiode | THORLABS | DET10A2 | Si Detector, 1 ns Rise Time |
| Frequency Divider | PRL-220A | Pulse Research Lab | TTL Freq. Teiler (f/2, f/4, f/8, f/16), zur Erzeugung von 20MHz aus dem Laserausgang. |
| Hochdispersive Glasstäbe | Union Optic | CYLROD01 | Hohe Dispersion H-ZF52A Stablinse 120 mm, SF11 Stablinse 100 mm |
| Insight DS+ | Newport | Lasersystem, das in der Lage ist, zwei synchronisiert gepulste Laser (ein fester Strahl bei 1.040 nm und ein abstimmbarer Strahl im Bereich von 680-1.300 nm) mit einer Wiederholrate von 80 MHz auszugeben. | |
| Lock-in-Verstärker | Liquid Instruments | Moku Lab | Lock-in-Verstärker zur Extraktion des SRS-Signals von der Fotodiode. Ein Zurich Instrument HF2LI oder ein ähnliches Instrument kann ebenfalls verwendet werden. |
| Spiegel | THORLABS | BB05-E03-10 | Breitband-Dielektrischer Spiegel, 750 - 1.100 nm. Auch silberne Spiegel können verwendet werden. |
| Motorisierter Verzögerungstisch | Zaber | X-DMQ12P-DE52 | Verzögerungsstufe zur Feinsteuerung der zeitlichen Überlappung der Pumpe und der Stokes-Laser. Jeder andere motorisierte Tisch sollte funktionieren. |
| Öl-Immersionskondensator | Nikon | CSC1003 | 1.4 NA. Es können auch andere Kondensatoren mit NA>1,2 verwendet werden. |
| Oszilloskop | Tektronix | TDS7054 | Jedes andere Oszilloskop mit einer Bandbreite von 400 MHz oder höher sollte funktionieren. |
| Phasenschieber | SigaTek | SF50A2 | Zum Verschieben der Phase der Modulationsfrequenz |
| Fotodiode | Hamamatsu Corp | S3994-01 | Silizium-PIN-Diode mit großer Fläche (10 x 10 cm2). Es können auch andere Dioden mit großer Fläche und geringer Kapazität verwendet werden. |
| Polarisations-Strahlteiler | Union Optic | PBS9025-620-1000 | Breitband-Polarisations-Strahlteiler |
| Refactive Index Database | refractiveindex.info | ||
| Retro-Reflektor | Edmund Optics | 34-408 | BBAR Rechtwinkliges Prisma. Es können auch andere Prismen oder Retroreflektoren verwendet werden. |
| HF Leistungsverstärker | Minischaltungen | ZHL-1-2W+ | Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω |
| Scan-Spiegel | Cambridge Technologies | 6215H | Wir haben einen 5-mm-Spiegelsatz mit Silberbeschichtung |
| verwendet ScanImage | Vidrio | ScanImage Basic | Laser-Scanning-Mikroskop-Steuerungssoftware |
| Shortpass-Filter | THORLABS | FESH1000 | 25,0 mm Premium-Kurzpassfilter, Cut-Off-Wellenlänge: 1.000 nm. Für eine effiziente Unterdrückung der Stokes können zwei Filter notwendig sein. |
| Aufrechtes Mikroskop | Nikon | Eclipse FN1 | Es kann jeder andere Mikroskoprahmen verwendet werden. Steht ein Laser-Scanning-Mikroskop zur Verfügung, kann dieses direkt eingesetzt werden. Andernfalls mussten das Mikroskop um einen Galvoscanner und ein Scanobjektiv erweitert werden. |
| Wasser-Immersionsobjektiv | Olympus | XLPLN25XWMP2 | Das Multiphotonen-25X-Objektiv hat eine NA von 1,05. Andere ähnliche Ziele können verwendet werden. |
Referenzen
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
