Methodenartikel

Ein TNBS-induziertes Nagetiermodell zur Untersuchung der pathogenen Rolle von mechanischem Stress bei Morbus Crohn

DOI:

10.3791/63499

⸱

1. März 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

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Das vorliegende Protokoll beschreibt die Entwicklung eines Morbus Crohn-ähnlichen Colitis-Modells bei Nagetieren. Eine transmurale Entzündung führt zu einer Stenose an der TNBS-Instillationsstelle, und eine mechanische Vergrößerung wird im Segment proximal zur Stenose beobachtet. Diese Änderungen ermöglichen die Untersuchung der mechanischen Belastung bei Colitis.

Zusammenfassung

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Entzündliche Darmerkrankungen (IBD) wie Morbus Crohn (CD) sind chronisch entzündliche Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes, von denen etwa 20 pro 1.00.000 in Europa und den USA betroffen sind. CD ist gekennzeichnet durch transmurale Entzündungen, Darmfibrose und Luminalstenose. Obwohl entzündungshemmende Therapien helfen können, Entzündungen zu kontrollieren, haben sie keine Wirksamkeit bei Fibrose und Stenose bei CD. Die Pathogenese der CD ist nicht gut verstanden. Aktuelle Studien konzentrieren sich hauptsächlich auf die Abgrenzung von dysregulierten Immunantwortmechanismen des Darms. Während CD-assoziierte transmurale Entzündungen, Darmfibrose und luminale Stenose alle eine mechanische Belastung der Darmwand darstellen, ist die Rolle der mechanischen Belastung bei CD nicht gut definiert. Um festzustellen, ob mechanischer Stress eine unabhängige pathogene Rolle bei CD spielt, wurde ein Protokoll des TNBS-induzierten CD-ähnlichen Kolitis-Modells bei Nagetieren entwickelt. Dieses TNBS-induzierte transmurale Entzündungs- und Fibrosemodell ähnelt pathologischen Kennzeichen von CD im Dickdarm. Es wird durch intrakolonische Instillation von TNBS in den distalen Dickdarm erwachsener Sprague-Dawley-Ratten induziert. In diesem Modell führt eine transmurale Entzündung zu einer Stenose an der TNBS-Instillationsstelle (Site I). Mechanische Dehnung wird in dem Teil proximal zur Instillationsstelle (Site P) beobachtet, der mechanische Belastung, aber keine sichtbare Entzündung darstellt. Der distale bis zur Entzündung (Punkt D) distale Dickdarmabschnitt stellt weder eine Entzündung noch eine mechanische Belastung dar. Markante Veränderungen der Genexpression, der Immunantwort, der Fibrose und des Wachstums der glatten Muskulatur an verschiedenen Stellen (P, I und D) wurden beobachtet, was einen tiefgreifenden Einfluss mechanischer Belastungen hervorhebt. Daher wird uns dieses Modell der CD-ähnlichen Kolitis helfen, die pathogenen Mechanismen von CD besser zu verstehen, insbesondere die Rolle von mechanischem Stress und mechanischer stressinduzierter Genexpression bei Immundysregulation, Darmfibrose und Gewebeumbau bei CD.

Einleitung

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Entzündliche Darmerkrankungen (IBD), einschließlich Colitis ulcerosa (UC) und Morbus Crohn (CD), sind durch chronische Entzündungen im Magen-Darm-Trakt (GI) gekennzeichnet. Es betrifft ~ 1-2 Millionen Amerikaner1. Die geschätzten jährlichen Kosten für die IBD-Pflege in den USA belaufen sich auf 11,8 Milliarden US-Dollar. Im Gegensatz zu UC ist die CD durch transmurale Entzündung und Strikturbildung gekennzeichnet 2,3. Strikturbildung (Stenose) tritt bei bis zu 70% der CD-Patientenauf 3 und kann durch transmurale Entzündung (entzündliche Stenose) oder Darmfibrose (fibrotische Stenose) verursacht werden4,5. Darmfibrose ist gekennzeichnet durch übermäßige Kollagenablagerung und andere extrazelluläre Matrizen (ECM) mit glatten Muskelzellen (SMC) als einer der wichtigsten mesenchymalen Zelltypen, die an dem Prozess beteiligtsind 3,4. Die mit Hypertrophie assoziierte Hyperplasie der glatten Muskulatur ist eine weitere signifikante histologische Veränderung der fibrotischen Stenose bei CD6. Obwohl die Strikturbildung bei CD mit chronischen Entzündungen verbunden ist, ist keine entzündungshemmende Behandlung wirksam, außer der chirurgischen Behandlung 2,6. Die rezidivierenden Fälle nach der Operation betragen jedoch fast 100%, wenn genügend Zeitzur Verfügung gestellt wird 2,7. Als Entzündungsreaktion können sich Fibrose und SMC-Hyperplasie auch bei nicht-entzündlichen Zuständen (d.h. Darmverschluss) im Darm entwickeln 8,9; Es wird angenommen, dass sowohl entzündungsabhängige als auch unabhängige Mechanismen an der Strikturbildung beteiligtsind 3,4. Angesichts der Tatsache, dass umfangreiche Forschungen zu den entzündungsabhängigen Mechanismen keine wirksame Therapie für die Strikturbildung geführt haben, sind Studien zur möglichen Rolle entzündungsunabhängiger Mechanismen bei Darmfibrose erforderlich.

Als nicht-entzündlicher Faktor tritt mechanischer Stress (MS) im Zusammenhang mit Ödemen, Infiltration entzündlicher Zellen, Gewebedeformation, Fibrose und Stenose10,11,12,13 häufig bei IBD auf, insbesondere bei CD, die durch transmurale Entzündungen gekennzeichnet ist. Mechanischer Stress ist am bemerkenswertesten bei stenotischer CD, wo Stenose (entzündlich oder fibrotisch) an der Entzündungsstelle mechanische Belastung im lokalen Gewebe darstellt und zu Lumendehnung im Segment proximal zur Obstruktionsstelle führt10,14. Frühere In-vitro-Studien haben gezeigt, dass mechanischer Stress die Genexpression spezifischer Entzündungsmediatoren (d. h. COX-2, IL-6)8,14,15 und Wachstumsfaktoren (d. h. TGF-β) im Magen-Darm-Gewebe, insbesondere der glatten Darmmuskelzellen (SMC)16, verändert. Neuere Studien haben auch gezeigt, dass die Expression spezifischer profibrotischer Mediatoren wie des Bindegewebswachstumsfaktors (CTGF) sehr empfindlich auf mechanische Belastung reagiert17,18. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass mechanischer Stress eine unabhängige pathogene Rolle bei CD-assoziierten Entzündungen, Fibrosen und Gewebeumbauten spielen könnte. Die pathogene Bedeutung von mechanischem Stress bei Darmentzündungen, Fibrosen und Hyperplasie der glatten Muskulatur bei der KV bleibt jedoch weitgehend unerforscht. Dies kann zum Teil daran liegen, dass Entzündungen ein sichtbarerer und besser untersuchter Prozess sind als mechanischer Stress. Noch wichtiger ist, dass es kein klar definiertes Tiermodell von IBD gibt, um die Wirkung von mechanischem Stress von der von Entzündungen zu unterscheiden.

Die aktuelle Arbeit beschreibt ein Nagetiermodell der Morbushuhn-ähnlichen Colitis, die durch intrakolonische Injektion von Hapten Reagenz 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) 19,20 induziert wird, das dem Zweck dienen könnte, die Rolle der mechanischen Belastung bei CD zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass die TNBS-Instillation eine lokalisierte (~ 2 cm lange) transmurale Entzündung mit Lumenverengung (Stenose) im distalen Dickdarm induzierte. Die Stenose führt zu einer ausgeprägten Darmdehnung (mechanische Belastung)14,15, aber nicht zu einer sichtbaren Entzündung im Dickdarmsegment proximal zur Instillationsstelle. Im Gegenteil, das zur Stenosestelle distale Dickdarmsegment stellt weder eine Entzündung noch eine mechanische Belastung dar. Signifikante ortsspezifische Veränderungen in der Genexpression, Entzündung, Fibrose und SMC-Hyperplasie wurden an den drei verschiedenen Stellen beobachtet. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass mechanischer Stress, insbesondere die mechanische, stressinduzierte Genexpression, eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Fibrose und Hyperplasie bei Morbus Crohn Colitis spielen kann.

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Protokoll

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Alle Tierversuche wurden nach dem institutionellen Komitee für Tierpflege und -nutzung der University of Texas Medical Branch (#0907051C) durchgeführt. Männliche oder weibliche Sprague-Dawley-Ratten, ~ 8-9 Wochen alt, wurden für die Studie verwendet.

1. Tierpräparation

  1. Fasten Sie Ratten für 24 h und behandeln Sie sie über Nacht mit Abführmittel (Darmreiniger, siehe Materialtabelle).
  2. Am nächsten Tag betäuben Sie Ratten mit einem Anästhesiesystem (siehe Materialtabelle), indem Sie sie während der TNBS-Verabreichung 2% Isofluran zusammen mit 1 l / min Sauerstoff aussetzen. Überprüfen Sie auf Reflexe oder Quetschzehen, um die Anästhesie zu bestätigen.
  3. Bereiten Sie frische TNBS-Lösung entsprechend dem Körpergewicht vor.
    HINWEIS: TNBS - 65 mg/kg Körpergewicht in 250 μL 40% Ethanol wurden verwendet.
  4. Setzen Sie Ratten in Rückenlage auf den Anästhesietisch. Um Colitis zu induzieren, führen Sie durch den Anus einen medizinischen offenen Polyurethankatheter für ~ 7-8 cm vom Analrand ein und instillieren Sie vorsichtig TNBS (hergestellt in Schritt 1.3) in den Dickdarm19. Verabreichen Sie die Scheinkontrollratten nur mit 250 μL Kochsalzlösung.
  5. Nach dem Einträufeln von TNBS oder Kochsalzlösung halten Sie die Ratten in Rückenlage und leicht mit dem Kopf nach unten (~ 30 °), wobei der Anus für 2 Minuten geschlossen ist, um die TNBS-Verteilung zu unterstützen und Verschüttungen zu vermeiden.
  6. Versorgen Sie Ratten 7 Tage lang ad libitum mit Nahrung und Wasser und beobachten Sie die Ratten täglich auf Körpergewicht, Nahrungsaufnahme, Kot und allgemeinen Gesundheitszustand.

2. Gewebepräparate

  1. Am Tag der Euthanasie die Ratten mit CO 2-Inhalation einschläfern und Euthanasie mit zervikaler Luxation bestätigen.
  2. Öffnen Sie den Hinterleib der Ratte mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette.
  3. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Dickdarm (oberhalb des Analkanals) und übertragen Sie den Dickdarm sofort in den eiskalten 1x HBSS-Puffer.
  4. Begradigen Sie den Doppelpunkt im Puffer und messen Sie die Dickdarmlänge mit einem Lineal. Nehmen Sie Nylonfaden und kreisen Sie um den Dickdarm, um den äußeren Umfang der Dickdarmsegmente in Kontroll- und TNBS-behandelten Ratten zu messen. Nehmen Sie Gewebe in voller Dicke für die Histologie.
  5. Schneiden Sie den Dickdarm entlang der mesenterialen Tafel auf und reinigen Sie den Dickdarm gut mit HBSS-Puffer. Beurteilen Sie den Dickdarm für makroskopische Entzündungswerte basierend auf den zuvor beschriebenen Kriterien19 mit minimalen Modifikationen.
    HINWEIS: 0 = normale Schleimhaut; 1 = lokalisierte Hyperämie, aber keine Erosionen oder Geschwüre; 2 = Geschwür und Stenose (betroffener Bereich < 5 mm); 3 = schweres Geschwür, Narbe und Stenose (betroffener Bereich > 5 mm).
  6. Sammeln Sie Kolongewebeproben von der Stelle P (Portion 2-3 cm vor dem oralen Rand der Entzündungsstelle), der Stelle I (Entzündungsstelle, typischerweise 4-6 cm vom Ende des Dickdarms, wo TNBS eingeträufelt wird) und der Stelle D (Portion 1-2 cm distal bis zum Aboralrand der Entzündungsstelle) bzw. von TNBS-behandelten Ratten.
    HINWEIS: Aus jedem Segment wurde Dickdarmgewebe von ~ 1-2 cm Länge entnommen. Zusätzlich wurden die 2 cm langen Dickdarmgewebe (~4-6 cm vom Ende des Dickdarms) der mit Kochsalzlösung behandelten Ratten als Scheinkontrolle (S) entnommen (Abbildung 1).
  7. Entnehmen Sie Gewebeproben von jeder Stelle für die Präparation in voller Dicke und, falls gewünscht, Schleimhaut-/Submukosa- bzw. Muscularis externa-Schichten sowie21,22.
  8. Gewebeproben zunächst in flüssigem Stickstoff einfrieren, bevor sie bei -80 °C gelagert werden, um sie bis zu einem Jahr und für zukünftige Zwecke (z. B. RNA-Präparate) zu lagern.

3. Histopathologische Beurteilung von Darmentzündungen und Fibrose

  1. Fixieren Sie das Dickdarmgewebe in voller Dicke in 10% Formalin für 48 h und übertragen Sie es dann für 24-48 h auf 70% Ethanol.
  2. Verwenden Sie ein Mikrotom, um Paraffinabschnitte von 5 μm Dicke für Hämatoxylin und Eosin (H & E) bzw. Massons Trichromflecken 6,19,23 (siehe Materialtabelle) zu schneiden.
  3. Erfassen und betrachten Sie Bilder mit einem aufrechten Mikroskop, das mit einer hochauflösenden Kamera mit kompatibler Software ausgestattet ist (siehe Materialtabelle).
  4. Grad Entzündungs- und Fibroseindizes von zwei unabhängigen Prüfärzten, darunter ein gastrointestinaler chirurgischer Pathologe nach zuvor beschriebenen Kriterien 6,23 mit Modifikationen. Siehe Ergänzende Datei 1 für die Partituren.
  5. Messen Sie die Dicke und Zellzahl der kreisförmigen und longitudinalen Muskelschichten pro Querschnitt in vier Ansichten jeder H & E-gefärbten Probe und nehmen Sie den Mittelwert der vier Messungen für jede Probe.

4. RNA-Extraktion und quantitative RT-PCR

  1. Homogenisieren Sie herausgeschnittenes Dickdarmgewebe, das aus der Scheinkontrolle und drei Stellen (P, I, D) von TNBS-Colitis-Ratten im Extraktionsreagenz eines RNA-Extraktionskits gewonnen wurde (siehe Materialtabelle).
  2. Isolieren Sie RNA aus jeder Probe mit dem Kit. Eluieren Sie das RNA-Pellet in 30 μL RNase-freiem Wasser.
  3. Quantifizieren Sie die RNA-Konzentration und überprüfen Sie die Reinheit mit einem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektralphotometer (siehe Materialtabelle).
  4. Verwenden Sie 1 μg Gesamt-RNA, um cDNA21,22 mit dem RNA-Synthese-Kit zu synthetisieren (siehe Materialtabelle).
  5. Analysieren und quantifizieren Sie die Genexpression durch Durchführung einer Echtzeit-PCR mit 50 ng cDNA als Vorlage, Sonden von IL-6 und CTGF unter Verwendung eines kommerziellen PCR-Kits für ein Echtzeit-PCR-System (siehe Materialverzeichnis).
  6. Verwenden Sie das Kontrollgen 18S rRNA, um die Proben zu normalisieren und die relative Genexpression unter Verwendung der erhaltenen Cq-Werte zu quantifizieren.

5. Statistische Auswertung

  1. Verwenden Sie statistische Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien), um Scheinkontroll- und TNBS-Colitis-Ratten zu vergleichen.
  2. Betrachten Sie den p-Wert < 0,05 als statistisch signifikant15,19.
  3. Um die Unterschiede zwischen zwei Gruppen zu testen, verwenden Sie die t-Test-Analyse von Student und führen Sie einen ANOVA-Test durch, wenn die Vergleiche mehr als zwei Gruppenumfassen 15,19.

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Ergebnisse

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Makroskopische Ansicht der Morbus-Crohn-ähnlichen Colitis, induziert durch intrakolonische Instillation von TNBS
Wie in Abbildung 1 gezeigt, induzierte die intrakolone Instillation von TNBS bei Ratten eine lokalisierte transmurale Entzündung (~ 2 cm lang) mit verdickter Darmwand und verengtem Lumen (Stenose) an der Instillationsstelle im distalen Dickdarm (Abbildung 1A). Der Ort der TNBS-Instillation wird als Standort I bezeichnet. Als Folge ...

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Diskussion

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TNBS-induzierte Kolitis wurde 1989 eingeführt und wird seit 19,20,23 als experimentelles Modell für Morbus Crohn verwendet. Wesentliche Merkmale dieses Modells bei Nagetieren sind die Entwicklung einer transmuralen Entzündung, die den histopathologischen Läsionen, die bei menschlichem Morbus Crohn entwickelt wurden, sehr ähnlich ist19,20. Frühere Studien zum Modell haben...

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Offenlegungen

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Die Autoren berichten von keinem Interessenkonflikt und haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wird zum Teil durch Zuschüsse des NIH (R01 DK124611 bis XZS) und des US-Verteidigungsministeriums (W81XWH-20-1-0681 bis XZS) unterstützt. Die histologische Arbeit wurde mit Hilfe des UTMB Surgical Pathology Lab durchgeführt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ACT-1 Steuerungssoftware Ver2.63NikonDXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler mit 96-Well-SchnellreaktionsmodulBIO-RAD1851196
CFX96 Optisches Reaktionsmodul für real-time PCR-SystemeBIO-RAD1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro SpezialfärberDakoAR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173DakoAR173
DXM1200 Digitale Farb-HR-KameraNikonDXM1200
Eukaryotische 18S rRNA Endogene KontrolleThermoFisher Scientific4352930E
E-Z AnästhesieE-Z Systems Inc.EZ-155
GraphPad Prism 9GraphPad9.0.2 (161)
Hartschalen-96-Well-PCR-Platten, flaches Profil, dünnwandig, umrandet, weiß/klarBIO-RADHSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x ohne Calcium und Magnesium)CORNING21-021-CV
HM 325 MikrotomThermo Scientific23-900-667
IsofluranPiramalNDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging SystemLI-COR9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler mit Bedienfeld 5340 Thermal CyclerEppendorf5341
Medizinischer offener Polyurethan-KatheterCovidien8890703013
NanoDrop 2000/2000c SpektralphotometerThermo FisherScientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 aufrechtes MikroskopNikonE800
Nitrozellulose/Filterpapier Sandwiches Packung mit 50, 0,45 μ m, 7 x 8,5 cmBIO-RAD1620215
Polyethylenglykol 3350, osmotisches AbführmittelMiralaxC8175Dosis: 17 g in 226 mL Wasser
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Säulen, Sammelröhrchen (1,5 mL und 2 mL), RNasefreie Reagenzien und Puffer		QIAGEN74106
SuperScript III ErststrangsynthesesystemThermoFisher Scientific18080051
TaqMan Genexpressionsassays Rn00573960_g1 CTGF-SondeThermoFisher Scientific4331182
TaqMan Genexpressionsassays Rn99999011_m1 IL6-SondeThermoFisher Scientific4331182
TaqMan Fast Advanced MasterMix ThermoFisherScientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H& E Stain Kit #1Sakura6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automatisierter ObjektträgerfärbeerSakura6171
TNBS (Picrylsulfonsäurelösung)SIGMA-ALDRICH92822

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 5/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

Schlagwörter

TNBS Colitis Modelltransmurale Entz ndungDarmfibroseluminalen Stenosekolische DistensionTissue RemodelingGenexpression

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