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Immunology and Infection

Un modello di roditore indotto da TNBS per studiare il ruolo patogeno dello stress meccanico nella malattia di Crohn

Published: March 1, 2022 doi: 10.3791/63499
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1
1Department of Internal Medicine, the University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, the University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Il presente protocollo descrive lo sviluppo di un modello di colite simile al Crohn nei roditori. L'infiammazione transmurale porta alla stenosi nel sito di instillazione del TNBS e l'allargamento meccanico è osservato nel segmento prossimale alla stenosi. Questi cambiamenti consentono di studiare lo stress meccanico nella colite.

Abstract

Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) come il morbo di Crohn (CD) sono disturbi infiammatori cronici del tratto gastrointestinale che colpiscono circa 20 per 1.00.000 in Europa e negli Stati Uniti. La CD è caratterizzata da infiammazione transmurale, fibrosi intestinale e stenosi luminale. Sebbene le terapie antinfiammatorie possano aiutare a controllare l'infiammazione, non hanno efficacia sulla fibrosi e sulla stenosi nella CD. La patogenesi della CD non è ben compresa. Gli studi attuali si concentrano principalmente sulla delineazione dei meccanismi di risposta immunitaria intestinale disregolati. Mentre l'infiammazione transmurale associata a CD, la fibrosi intestinale e la stenosi luminale rappresentano tutte uno stress meccanico alla parete intestinale, il ruolo dello stress meccanico nella CD non è ben definito. Per determinare se lo stress meccanico svolge un ruolo patogeno indipendente nella CD, è stato sviluppato un protocollo di colite CD-like indotta da TNBS nei roditori. Questo modello di infiammazione e fibrosi transmurale indotta da TNBS assomiglia ai segni patologici della CD nel colon. È indotta dall'instillazione intracolonica di TNBS nel colon distale di ratti adulti Sprague-Dawley. In questo modello, l'infiammazione transmurale porta alla stenosi nel sito di instillazione del TNBS (Sito I). La distensione meccanica si osserva nella porzione prossimale al sito di instillazione (Sito P), rappresentando lo stress meccanico ma non l'infiammazione visibile. La porzione del colon distale all'infiammazione (Sito D) non presenta né infiammazione né stress meccanico. Sono stati osservati cambiamenti distintivi dell'espressione genica, della risposta immunitaria, della fibrosi e della crescita muscolare liscia in diversi siti (P, I e D), evidenziando un profondo impatto dello stress meccanico. Pertanto, questo modello di colite simile alla CD ci aiuterà a comprendere meglio i meccanismi patogenetici della CD, in particolare il ruolo dello stress meccanico e dell'espressione genica indotta dallo stress meccanico nella disregolazione immunitaria, nella fibrosi intestinale e nel rimodellamento dei tessuti nella CD.

Introduction

La malattia infiammatoria intestinale (IBD), compresa la colite ulcerosa (UC) e il morbo di Crohn (CD), è caratterizzata da infiammazione cronica nel tratto gastrointestinale (GI). Colpisce ~ 1-2 milioni di americani1. I costi annuali stimati per l'assistenza IBD negli Stati Uniti sono di $ 11,8 miliardi. A differenza della UC, il CD è caratterizzato da infiammazione transmurale e formazione di stenosi 2,3. La formazione di stenosi (stenosi) si verifica fino al 70% dei pazienti con CD3 e può essere causata da infiammazione transmurale (stenosi infiammatoria) o fibrosi intestinale (stenosi fibrotica)4,5. La fibrosi intestinale è caratterizzata da un'eccessiva deposizione di collagene e da altre matrici extracellulari (ECM) con cellule muscolari lisce (SMC) come uno dei principali tipi di cellule mesenchimali coinvolte nel processo 3,4. L'iperplasia della muscolatura liscia associata all'ipertrofia è un altro cambiamento istologico significativo nella stenosi fibrotica nella CD6. Sebbene la formazione di stenosi nella CD sia associata a infiammazione cronica, nessun trattamento antinfiammatorio è efficace, ad eccezione del trattamento chirurgico 2,6. Tuttavia, le recidive post-chirurgiche sono quasi il 100%, dato il tempo sufficiente 2,7. Come risposta infiammatoria, la fibrosi e l'iperplasia SMC possono anche svilupparsi in condizioni non infiammatorie (cioè ostruzione intestinale) nell'intestino 8,9; si ritiene che sia i meccanismi dipendenti dall'infiammazione che quelli indipendenti siano coinvolti nella formazione dellastenosi 3,4. Dato che un'ampia ricerca sui meccanismi dipendenti dall'infiammazione non si è tradotta in alcuna terapia efficace per la formazione della stenosi, sono necessari studi sul possibile ruolo dei meccanismi indipendenti dall'infiammazione nella fibrosi intestinale.

Come fattore non infiammatorio, lo stress meccanico (SM) associato a edema, infiltrazione di cellule infiammatorie, deformazione dei tessuti, fibrosi e stenosi 10,11,12,13 è comunemente riscontrato nell'IBD, in particolare nella CD, che è caratterizzata da infiammazione transmurale. Lo stress meccanico è più notevole nella CD stenotica, dove la stenosi (infiammatoria o fibrotica) nel sito di infiammazione presenta stress meccanico nel tessuto locale e porta alla distensione del lume nel segmento prossimale al sito di ostruzione10,14. Precedenti studi in vitro hanno dimostrato che lo stress meccanico altera l'espressione genica di specifici mediatori infiammatori (cioè COX-2, IL-6)8,14,15 e fattori di crescita (cioè TGF-β) nei tessuti gastrointestinali, in particolare nelle cellule muscolari lisce intestinali (SMC)16. Studi recenti hanno anche scoperto che l'espressione di specifici mediatori pro-fibrotici come il fattore di crescita del tessuto connettivo (CTGF) è altamente sensibile allo stress meccanico17,18. È stato ipotizzato che lo stress meccanico potrebbe svolgere un ruolo patogeno indipendente nell'infiammazione, nella fibrosi e nel rimodellamento dei tessuti associati a CD. Tuttavia, il significato patogeno dello stress meccanico nell'infiammazione intestinale, nella fibrosi e nell'iperplasia della muscolatura liscia nella CD rimane in gran parte inesplorato. Ciò può essere in parte dovuto al fatto che l'infiammazione è un processo più visibile e meglio studiato rispetto allo stress meccanico. Ancora più importante, non esiste un modello animale ben definito di IBD per distinguere l'effetto dello stress meccanico da quello dell'infiammazione.

Il lavoro attuale descrive un modello di roditore di colite simile al Crohn indotta dall'iniezione intracolonica del reagente apteno acido solfonico 2,4,6-trinitrobenzene (TNBS)19,20, che può servire allo scopo di studiare il ruolo dello stress meccanico nella CD. È stato riscontrato che l'instillazione di TNBS ha indotto un'infiammazione transmurale localizzata (~ 2 cm di lunghezza) con restringimento del lume (stenosi) nel colon distale. La stenosi porta a marcata distensione intestinale (stress meccanico)14,15 ma infiammazione non visibile nel segmento del colon prossimale al sito di instillazione. Al contrario, il segmento del colon distale al sito di stenosi non presenta né infiammazione né stress meccanico. Cambiamenti significativi sito-specifici nell'espressione genica, nell'infiammazione, nella fibrosi e nell'iperplasia SMC sono stati osservati nei tre diversi siti. I risultati suggeriscono che lo stress meccanico, in particolare l'espressione genica indotta dallo stress meccanico, può svolgere un ruolo fondamentale nello sviluppo della fibrosi e dell'iperplasia nella colite di Crohn.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Texas Medical Branch (#0907051C). Per lo studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley maschi o femmine, di circa 8-9 settimane.

1. Preparazione animale

  1. Ratti veloci per 24 ore e trattarli con lassativo (detergente intestinale, vedi Tabella dei materiali) durante la notte.
  2. Il giorno successivo, anestetizzare i ratti utilizzando un sistema di anestesia (vedi Tabella dei materiali) esponendoli al 2% di isoflurano insieme a 1 L / min di ossigeno durante la somministrazione di TNBS. Controllare i riflessi o le dita dei piedi per confermare l'anestesia.
  3. Preparare una soluzione TNBS fresca in base ai pesi corporei.
    NOTA: TNBS - Sono stati utilizzati 65 mg/kg di peso corporeo in 250 μL di etanolo al 40%.
  4. Metti i ratti in posizione supina sul tavolo dell'anestesia. Per indurre la colite, inserire attraverso l'ano un catetere in poliuretano aperto di grado medico per ~ 7-8 cm dal bordo anale e instillare delicatamente TNBS (preparato nel passaggio 1.3) nel colon19. Somministrare i ratti di controllo fittizi con 250 μL di sola soluzione salina.
  5. Dopo aver instillato TNBS o soluzione salina, mantenere i ratti in posizione supina e leggermente a testa in giù (~ 30 °), con l'ano chiuso per 2 minuti per aiutare la distribuzione TNBS ed evitare fuoriuscite.
  6. Fornire ai ratti cibo e acqua ad libitum per 7 giorni e osservare i ratti ogni giorno per il peso corporeo, l'assorbimento di cibo, le feci e le condizioni generali di salute.

2. Preparazioni tissutali

  1. Il giorno dell'eutanasia, l'eutanasia dei ratti usando l'inalazione di CO2 e confermare l'eutanasia con lussazione cervicale.
  2. Aprire l'addome del ratto usando forbici e pinze chirurgiche.
  3. Rimuovere con attenzione l'intero colon (sopra il canale anale) e trasferire immediatamente il colon al tampone HBSS 1x ghiacciato.
  4. Raddrizzare i due punti nel buffer e misurare la lunghezza del colon usando un righello. Prendi il filo di nylon e gira intorno al colon per misurare la circonferenza esterna dei segmenti del colon in controllo e dei ratti trattati con TNBS. Prendi tessuti a tutto spessore per l'istologia.
  5. Tagliare il colon lungo la tavola mesenterica e pulire bene il colon con il tampone HBSS. Valutare il colon per il punteggio di infiammazione macroscopica in base ai criteri precedentemente descritti19 con modifiche minime.
    NOTA: 0 = mucosa normale; 1 = iperemia localizzata ma senza erosioni o ulcere; 2 = ulcera e stenosi (area interessata < 5 mm); 3 = ulcera grave, cicatrice e stenosi (area interessata > 5 mm).
  6. Raccogliere campioni di tessuto del colon dal sito P (porzione 2-3 cm prima del margine orale del sito di infiammazione), dal sito I (sito di infiammazione, in genere 4-6 cm dalla fine del colon, dove viene instillato TNBS) e dal sito D (porzione distale di 1-2 cm al margine aborale del sito di infiammazione), rispettivamente da ratti trattati con TNBS.
    NOTA: Il tessuto del colon di circa 1-2 cm di lunghezza è stato prelevato da ciascun segmento. Inoltre, i tessuti del colon di 2 cm di lunghezza (~ 4-6 cm dalla fine del colon) dei ratti trattati con soluzione salina sono stati presi come controllo fittizio (S) (Figura 1).
  7. Prelevare campioni di tessuto da ciascun sito per la preparazione a tutto spessore e, se lo si desidera, rispettivamente gli strati di mucosa/sottomucosa e muscularis externa e21,22.
  8. Congelare i campioni di tessuto in azoto liquido prima di conservarli a -80 °C per la conservazione fino a un anno e per scopi futuri (ad esempio, preparati di RNA).

3. Valutazione istopatologica dell'infiammazione intestinale e della fibrosi

  1. Fissare i tessuti del colon a tutto spessore in formalina al 10% per 48 ore, quindi trasferire al 70% di etanolo per 24-48 ore.
  2. Utilizzare un microtomo per tagliare sezioni di paraffina di 5 μm di spessore rispettivamente per ematossilina ed eosina (H &E) e le macchie tricrome di Masson 6,19,23 (vedi Tabella dei materiali).
  3. Acquisire e visualizzare le immagini con un microscopio verticale dotato di una telecamera ad alta risoluzione con software compatibile (vedere Tabella dei materiali).
  4. Indici di infiammazione e fibrosi di grado da parte di due ricercatori indipendenti, tra cui un patologo chirurgico gastrointestinale secondo i criteri descritti in precedenza 6,23 con modifiche. Vedere il file supplementare 1 per i punteggi.
  5. Misurare lo spessore e il numero di cellule degli strati muscolari circolari e longitudinali per sezione trasversale in quattro viste di ciascun campione colorato H & E e prendere la media delle quattro misurazioni per ciascun campione.

4. Estrazione di RNA e RT-PCR quantitativa

  1. Omogeneizzare i tessuti del colon asportati ottenuti dal controllo fittizio e tre siti (P, I, D) di ratti colite TNBS nel reagente di estrazione di un kit di estrazione dell'RNA (vedi Tabella dei materiali).
  2. Isolare l'RNA da ciascun campione utilizzando il kit. Eluire il pellet di RNA in 30 μL di acqua priva di RNasi.
  3. Quantificare la concentrazione di RNA e verificarne la purezza utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a microvolume (vedere Tabella dei materiali).
  4. Utilizzare 1 μg di RNA totale per sintetizzare il cDNA 21,22 utilizzando il kit di sintesi dell'RNA (vedere Tabella dei materiali).
  5. Analizzare e quantificare i livelli di espressione genica eseguendo la PCR in tempo reale con 50 ng di cDNA come modello, sonde di IL-6 e CTGF utilizzando un kit PCR commerciale per il sistema PCR in tempo reale (vedere Tabella dei materiali).
  6. Utilizzare il gene di controllo 18S rRNA per normalizzare i campioni e quantificare l'espressione genica relativa utilizzando i valori Cq ottenuti.

5. Analisi statistica

  1. Utilizzare un software di analisi statistica (vedere Tabella dei materiali) per confrontare il controllo fittizio e i ratti colite TNBS.
  2. Si consideri il valore p < 0,05 statisticamente significativo15,19.
  3. Per testare le differenze tra due gruppi, utilizzare l'analisi t-test dello studente ed eseguire un test ANOVA se i confronti sono più di due gruppi15,19.

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Representative Results

Visione macroscopica della colite simile al Crohn indotta dall'instillazione intra-colon di TNBS
Come mostrato nella Figura 1, l'instillazione intracolonica di TNBS nei ratti ha indotto un'infiammazione transmurale localizzata (~ 2 cm di lunghezza) con parete intestinale ispessita e lume ristretto (stenosi) nel sito di instillazione nel colon distale (Figura 1A). Il sito di instillazione di TNBS è indicato come sito I. Come risultato dell'infiammazione transmurale e della stenosi, sia l'infiammazione che lo stress meccanico sono presenti nel sito I. La stenosi nel sito I ha portato a una marcata distensione del lume nel segmento prossimale al sito di instillazione di TNBS (sito P) (Figura 1). La circonferenza del colon è stata significativamente aumentata nei siti P e I, rispetto al colon di controllo fittizio (p < 0,05 vs controllo) (Figura 1B). Mentre meccanicamente disteso, il sito P non ha mostrato infiammazione visibile. Al contrario, il segmento del colon distale al sito di instillazione del TNBS è il sito D e non presenta né infiammazione né distensione meccanica (Figura 1A,B).

Per aiutare a distinguere l'effetto dello stress meccanico dall'infiammazione, abbiamo seguito un design unico nella raccolta di campioni di tessuto dal colon nel modello descritto nel passaggio 2.6. Il sito P è l'obiettivo principale dello studio, poiché questa parte è meccanicamente distesa nel modello CD. Il sito D è l'autocontrollo, in quanto non presenta sollecitazioni meccaniche. I siti P e D non mostrano alcuna infiammazione visibile (Figura 1). Tuttavia, il sito in cui soffro di infiammazione e stress meccanico (Figura 1).

Cambiamenti sito-specifici del punteggio di infiammazione nei siti P, I e D nei ratti colite
Sono stati sviluppati criteri per classificare l'infiammazione in base al punteggio macroscopico del tessuto vivo (0-3)19 e al punteggio microscopico dei campioni colorati H&E (0-3)23 come descritto con modifiche. I risultati hanno mostrato che il punteggio macroscopico dell'infiammazione nel sito I era di 2,70 ± 0,20 nei ratti trattati con TNBS (7 giorni dopo l'induzione dell'infiammazione), aumentato drasticamente rispetto a quello dei controlli fittizi (0,30 ± 0,22, p < 0,05) e quello dei siti P (0,80 ± 0,26) e D (0,50 ± 0,22) dei ratti colite (Figura 1C). I punteggi di infiammazione nei siti P e D non sono significativamente aumentati rispetto allo sham (Figura 1C). L'imaging microscopico ha mostrato infiammazione transmurale indotta dal trattamento TNBS nei ratti (Figura 2A). Il punteggio microscopico di infiammazione nel sito I era di 2,80 ± 0,27 nei ratti trattati con TNBS, ancora una volta significativamente (p < 0,05, n = 5 ciascun gruppo) aumentato rispetto a quello nei controlli fittizi (0,3 ± 0,2) e nei siti P (1,0 ± 0,31) e D (0,80 ± 0,38) dei ratti colite. I punteggi di infiammazione nei siti P e D non sono stati significativamente aumentati rispetto a sham (Figura 2C).

Cambiamenti sito-specifici della fibrosi e dell'iperplasia e dell'ipertrofia della muscolatura liscia nei siti P, I e D nei ratti colite
Il punteggio della fibrosi è stato determinato in base alla colorazione tricromatica di Mason (Figura 2B) in diversi siti (P, I, D) (Figura 2A). Il sistema di classificazione per la fibrosi è descritto nel file supplementare 1. È stato riscontrato che il punteggio della fibrosi è significativamente aumentato non solo nel sito I (2,60 ± 0,25) ma anche nel sito P (1,60 ± 0,24) dei ratti colite, rispetto al controllo fittizio (0,40 ± 0,25. p < 0,05) (Figura 2D). Lo spessore e il numero di cellule degli strati muscolari lisci circolari e longitudinali sono stati misurati in diversi siti in campioni colorati H & E (4 viste per campione). Lo spessore e il numero di cellule degli strati muscolari lisci sia circolari che longitudinali sono stati significativamente aumentati nei siti I e P (Figura 2E, F). Il sito D nei ratti colite non mostra alcun aumento significativo del punteggio di fibrosi, del numero di cellule muscolari lisce o dello spessore muscolare (Figura 2).

Espressione sito-specifica di geni meccanosensibili nei siti P, I e D nei ratti colite
IL-6 svolge un ruolo fondamentale nell'infiammazione intestinale, in quanto promuove la differenziazione delle cellule T, danneggia la funzione di barriera e influenza la funzione neuromuscolare 8,24. CTGF è un mediatore pro-fibrotico ben riconosciuto, in quanto la sua inibizione può invertire il processo di fibrosi17. Ancora più importante, studi recenti hanno scoperto che l'espressione genica di IL-6 e CTGF è altamente reattiva allo stress meccanico 8,14,18. L'espressione sito-specifica degli mRNA IL-6 e CTGF è stata determinata nel tessuto a tutto spessore dei ratti con controllo fittizio e colite TNBS. I livelli di espressione dell'mRNA di IL-6 e CTGF erano significativamente aumentati nel sito di infiammazione (sito I) rispetto ai controlli fittizi. Nel sito P, dove c'è distensione meccanica ma nessuna infiammazione visibile, anche l'espressione di mRNA di IL-6 e CTGF è aumentata drasticamente rispetto ai ratti di controllo (Figura 3A,B). Tuttavia, i livelli di mRNA IL-6 e CTGF nel sito D dei ratti colite non erano significativamente diversi da quelli nei controlli fittizi (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Modello di roditore della colite CD-like indotta da TNBS (7 giorni). (A) Vista prospettica del controllo fittizio e del colon trattato con TNBS (in alto) e vista macroscopica della superficie mucosa del colon distale (in basso). Le caselle gialle indicano diversi siti di tessuto del colon. S, controllo fittizio; I, sito di infiammazione; P, sito del colon disteso prossimale al sito di infiammazione; D, sito non disteso distale all'infiammazione. (B) Circonferenza del colon nel controllo fittizio e diversi siti (P, I, D) del colon trattato con TNBS. (C) Punteggio di infiammazione macroscopica del colon di controllo fittizio e diversi siti del colon trattato con TNBS. n = 5, *p < 0,05 vs. ratti finti del gruppo. Le barre rappresentano la SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Valutazione istopatologica. Viste microscopiche nelle macchie tricrome di H & E (A) e Masson (B) che mostrano la distribuzione del collagene in finte e diversi siti di ratti colite. L'analisi quantitativa mostra un aumento dell'indice di infiammazione microscopica (C), della fibrosi (D) e dello spessore muscolare (ipertrofia) (E) e del numero di cellule muscolari lisce (iperplasia) (F) nei siti I e P, ma non D, nei ratti trattati con TNBS. In (E) e (F), le barre aperte sono per lo strato circolare di muscolo liscio e le barre striate sono per lo strato longitudinale di muscolo liscio. n = 5 in ogni gruppo, *p < 0,05 vs. ratti finti del gruppo. Le barre nei grafici rappresentano SEM. Barre in (A) e (B) = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Espressione sito-specifica di geni meccanosensibili (IL-6 e CTGF) nella colite CD-like. (A) Espressione di mRNA IL-6 nel colon di controllo fittizio e in diversi siti (P, I e D) della colite del colon trattata con TNBS. (B) Espressione di mRNA CTGF nel colon di controllo fittizio e in diversi siti (P, I e D) della colite del colon trattata con TNBS. n = 4 o 5, *p < 0,05 vs. S (controllo fittizio). Le barre rappresentano la SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: Punteggio di infiammazione e fibrosi. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

La colite indotta da TNBS è stata introdotta nel 1989 ed è stata utilizzata come modello sperimentale della malattia di Crohn da allora 19,20,23. Le caratteristiche significative di questo modello nei roditori includono lo sviluppo di un'infiammazione transmurale che assomiglia molto alle lesioni istopatologiche sviluppate nella malattia di Crohn umana19,20. Precedenti studi sul modello si sono concentrati principalmente sulla risposta immunitaria aberrante nello strato mucoso nel sito di infiammazione visibile (il sito I)19,20,23. Poca attenzione è stata prestata alle porzioni intestinali prossimali e distali all'infiammazione. Il presente studio sul sito di infiammazione, così come sul segmento prossimale disteso e sul segmento distale non disteso, rivela apparenti cambiamenti sito-specifici nell'espressione genica, nella risposta infiammatoria e nelle caratteristiche istopatologiche. Il modello è stato rivisitato per affrontare il potenziale ruolo patogenetico dello stress meccanico nella fibrosi e nel rimodellamento dei tessuti nella malattia di Crohn.

È stato riscontrato che l'infiammazione acuta si sviluppa immediatamente dopo l'esposizione della mucosa di TNBS in etanolo e raggiunge il picco al giorno 319. Sono presenti infiammazione transmurale e stenosi infiammatoria, che è associata alla distensione del lume nel sito P in ogni ratto trattato con TNBS. Entro il giorno 7, l'infiammazione transmurale cronica è ben sviluppata nel sito I, come trovato nel presente studio e riportato altrove20. Nel frattempo, i cambiamenti fibrotici sono evidenti nel sito, caratterizzato da un'eccessiva deposizione di collagene, come visto nel presente studio e altrove20. L'instillazione di TNBS nell'etanolo nel colon distale danneggia il tessuto della mucosa locale23 e porta all'infiammazione transmurale in un'area localizzata del colon. L'infiammazione transmurale con infiltrazione infiammatoria, edema e deformazione tissutale10,12,13 nel sito di instillazione presenta infiammazione e stress meccanico14 all'area localizzata (Sito I). Inoltre, l'infiammazione transmurale causa anche stenosi luminale nel sito I10. È stato riscontrato che la stenosi, un'ostruzione intestinale parziale, provoca distensione meccanica nel segmento prossimale (sito P). Tuttavia, la parte distale al sito di instillazione non è distesa (sito D). Come si trova nei sistemi di punteggio macroscopico e istologico, mentre il sito I presenta sia infiammazione che stress meccanico, i siti P e D non presentano infiammazione. Inoltre, il sito P mostra una circonferenza significativamente aumentata (e quindi uno stress meccanico, secondo la legge di Laplace14), ma il sito D no. Pertanto, uno studio sui cambiamenti sito-specifici, in particolare il sito P, esplorerà l'importanza patogenetica dello stress meccanico nel modello di infiammazione nell'intestino.

È stato osservato che l'espressione dei geni meccano-sensibili IL-6 e CTGF era aumentata nel sito I e nel sito P allungato meccanicamente, ma non nel sito D vicino, dove non vi è distensione meccanica. Per esaminare l'ipotesi che lo stress meccanico possa contribuire allo sviluppo della fibrosi e dell'iperplasia della muscolatura liscia, i punteggi della fibrosi e i numeri di cellule muscolari lisce misurati e lo spessore muscolare nei siti P, I e D sono stati determinati separatamente. È stato riscontrato che la fibrosi e l'iperplasia SMC sono presenti nei siti I e P. Tuttavia, la fibrosi e l'iperplasia della muscolatura liscia non vengono rilevate nel sito D. Questi risultati indicano che lo stress meccanico può svolgere un ruolo patogeno indipendente nella sintesi del collagene e nella proliferazione cellulare nell'infiammazione intestinale. Ulteriori studi sono giustificati per determinare se questo effetto può essere mediato dall'espressione indotta da stress meccanico di fattori pro-fibrotici e di crescita come CTGF nei siti P e I.

Sebbene il modello animale descritto possa essere utilizzato per affrontare lo stress meccanico nella colite stenotica simile a CD, ha limitazioni nell'obiettivo a lungo termine di definire pienamente il ruolo patogeno dello stress meccanico nell'infiammazione. Ad esempio, gli effetti dello stress meccanico e dell'infiammazione nel sito I del modello descritto non possono essere differenziati. Sebbene si presuma che lo stress meccanico sia presente nel sito I a causa di infiltrazioni infiammatorie, deformazione dei tessuti, stenosi e distensione, non è possibile determinare quanto stress meccanico contribuisca ai cambiamenti patologici. Potrebbero essere necessari ulteriori studi completi che utilizzino approcci in vitro, in vivo ed ex vivo. Ad esempio, prevenire la distensione meccanica alimentando gli animali colite esclusivamente con una dieta liquida chiara25 può aiutare a creare uno stato di perdita di distensione meccanica nel modello di colite. D'altra parte, l'induzione della distensione meccanica pura dalla banda di ostruzione15 può aiutare a creare un modello di guadagno di stress meccanico. Inoltre, il modello di allungamento meccanico in vitro in cellule coltivate14,15 aiuta nella determinazione quantitativa degli effetti dello stress meccanico sull'espressione e sulla funzione genica, poiché la modalità e l'entità dello stress meccanico possono essere finemente controllate nel contesto in vitro.

Per preparare un modello riproducibile di infiammazione transmurale e stenotica nella colite CD-like come descritto nello studio, deve essere utilizzato TNBS a 65 mg/kg in 250 μL di etanolo al 40%. Il modello è stato testato principalmente su ratti, maschi o femmine, di 8-9 settimane. Dopo l'instillazione di TNBS alla dose, l'infiammazione transmurale viene costantemente sviluppata nel sito di instillazione locale. L'infiammazione è associata all'infiltrazione di cellule infiammatorie, all'edema e all'ispessimento della parete intestinale, portando al restringimento del lume nel sito di instillazione, simile alle caratteristiche patologiche della malattia di Crohn20. Studi pilota in laboratorio hanno dimostrato che il TNBS a dosi inferiori a 50 mg / kg nello stesso volume di etanolo al 40% potrebbe causare infiammazione intestinale ma stenosi non affidabile nel sito I. Pertanto, non ci sarebbe alcuna apparente distensione meccanica nel sito P. D'altra parte, TNBS a dosi superiori a 80 mg / kg può causare gravi infiammazioni e decessi. L'attuale protocollo che utilizza TNBS a 65 mg/kg in 250 μL di etanolo al 40% difficilmente causa decessi (1 ratto su 16 di colite TNBS).

È stato scoperto che la pulizia intestinale il giorno prima dell'instillazione di TNBS è un passo importante per garantire un colon relativamente pulito per un modello affidabile di colite stenotica. Per questo, i ratti devono digiunare per 24 ore e dare un detergente intestinale durante la notte prima del trattamento TNBS. È anche importante mantenere i ratti in posizione supina e leggermente a testa in giù con l'ano chiuso per 2 minuti dopo l'instillazione di TNBS. Questo aiuta a garantire una buona distribuzione di TNBS all'interno del colon distale.

In sintesi, è stato riscontrato che l'instillazione intracolonica di TNBS a 65 mg / kg in 250 μL di etanolo al 40% ha indotto costantemente colite CD-simile nei ratti. L'infiammazione transmurale nel modello è associata a stenosi nel sito di instillazione di TNBS. La distensione meccanica, ma non l'infiammazione, si osserva nel segmento prossimale alla stenosi. Né l'infiammazione né lo stress meccanico sono presenti nel segmento distale alla stenosi. Con questi cambiamenti in diversi siti del colon in un ratto colite, si può distinguere lo stress meccanico da infiammazione nella colite simile a CD.

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Disclosures

Gli autori non segnalano alcun conflitto di interessi e non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è supportato in parte da sovvenzioni di NIH (R01 DK124611 a XZS) e del Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (W81XWH-20-1-0681 a XZS). Il lavoro di istologia è stato svolto con l'aiuto del laboratorio di patologia chirurgica utmb.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ACT-1 Control Software Ver2.63 Nikon DXM1200F
C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BIO-RAD 1851196
CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems BIO-RAD 1845097
Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer Dako AR310
Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 Dako AR173
DXM1200 Digital Color HR Camera Nikon DXM1200
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control ThermoFisher Scientific 4352930E
E-Z Anesthesia E-Z Systems Inc. EZ-155
GraphPad Prism 9 GraphPad 9.0.2 (161)
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear BIO-RAD HSP9601
HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) CORNING 21-021-CV
HM 325 Microtome Thermo Scientific 23-900-667
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-10
LI-COR Odyssey Digital Imaging System LI-COR 9120
Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler Eppendorf 5341
Medical grade open end polyurethane catheter Covidien 8890703013
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND2000CLAPTOP
Nikon Eclipse E800 Upright Microscope Nikon E800
Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm BIO-RAD 1620215
Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative Miralax C8175 Dose: 17g in 226 mL of water
RNeasy Mini Kit (250)
250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers		 QIAGEN 74106
SuperScript III First-Strand Synthesis System ThermoFisher Scientific 18080051
TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe ThermoFisher Scientific 4331182
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher Scientific 4444557
Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 Sakura 6190
Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer Sakura 6171
TNBS (Picrylsulfonic acid solution) SIGMA-ALDRICH 92822

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References

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Immunologia e infezione Numero 181

Erratum

Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 05/20/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.

The first sentence of the Introduction was updated from:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

to:

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.

Step 1.3 in the Protocol was updated from:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.

to:

Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.

Un modello di roditore indotto da TNBS per studiare il ruolo patogeno dello stress meccanico nella malattia di Crohn
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Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K.,… More

Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Qiu, S., Shi, X. Z. A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. J. Vis. Exp. (181), e63499, doi:10.3791/63499 (2022).

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