Das vorliegende Protokoll beschreibt die lösungsmittelbasierte Proteinfällung unter kontrollierten Bedingungen für eine robuste und schnelle Gewinnung und Reinigung von Proteomproben vor der Massenspektrometrie.
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Methodenartikel
Proteinfällung auf organischer Lösungsmittelbasis für eine robuste Proteomreinigung vor der Massenspektrometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Während mehrere Fortschritte in der Massenspektrometrie (MS) die qualitative und quantitative Proteomanalyse verbessert haben, sind zuverlässigere Front-End-Ansätze zur Isolierung, Anreicherung und Verarbeitung von Proteinen vor MS entscheidend für eine erfolgreiche Proteomcharakterisierung. Geringe, inkonsistente Proteinrückgewinnung und Restverunreinigungen wie Tenside sind schädlich für die MS-Analyse. Die Proteinfällung wird im Vergleich zu anderen Probenvorbereitungsstrategien oft als unzuverlässig, zeitaufwendig und technisch anspruchsvoll angesehen. Diese Bedenken werden durch den Einsatz optimaler Proteinausscheidungsprotokolle überwunden. Für die Acetonfällung ist die Kombination von spezifischen Salzen, Temperaturregelung, Lösungsmittelzusammensetzung und Fällungszeit von entscheidender Bedeutung, während die Effizienz der Chloroform-/Methanol-/Wasserfällung von der richtigen Pipettierung und der Manipulation der Durchstechflasche abhängt. Alternativ werden diese Fällungsprotokolle in einer Einweg-Spinkartusche optimiert und halbautomatisch. Die erwarteten Ergebnisse der lösungsmittelbasierten Proteinfällung im konventionellen Format und unter Verwendung einer zweistufigen Einweg-Filtrations- und Extraktionskartusche werden in dieser Arbeit veranschaulicht. Dazu gehört die detaillierte Charakterisierung proteomischer Gemische durch Bottom-up-LC-MS/MS-Analyse. Die überlegene Leistung von SDS-basierten Arbeitsabläufen wird auch im Vergleich zu nicht kontaminiertem Protein demonstriert.
Einleitung
Die Proteomanalyse durch Massenspektrometrie ist aufgrund der verbesserten Empfindlichkeit, Auflösung, Scangeschwindigkeit und Vielseitigkeit moderner MS-Instrumente immer strenger geworden. MS-Fortschritte tragen zu einer höheren Proteinidentifizierungseffizienz und einer präziseren Quantifizierungbei 1,2,3,4,5. Mit verbesserter MS-Instrumentierung fordern die Forscher eine entsprechend konsistente Front-End-Probenvorbereitungsstrategie, die in der Lage ist, hochreine Proteine in kürzester Zeit über alle P....
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Protokoll
1. Wesentliche Überlegungen und Probenvorbereitung
- Verwenden Sie nur hochreine Lösungsmittel (Aceton, Chloroform, Methanol) (>99,5%) und Chemikalien, frei von überschüssiger Feuchtigkeit.
- Natriumchlorid- und Zinksulfatlösungen (1 M) in Wasser herstellen.
HINWEIS: Salzlösungen können unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden, solange sie frei von Verunreinigungen oder mikrobiellem Wachstum sind. - Verwenden Sie die kleinste Mikrozentrifugendurchstechflasche aus Polypropylen (PP), die ausreicht, um das erforderliche Volumen an Proben und Lösungsmitteln zu erhalten, um die Ausfällung zu induzieren.
- Stellen Sie....
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Ergebnisse
Abbildung 4 fasst die erwartete SDS-Erschöpfung nach einer Fläschchen- oder kartuschengestützten Ausfällung von Proteinen in einer Einweg-Filterpatrone unter Verwendung von Aceton zusammen. Die konventionelle Inkubation über Nacht (-20 °C) in Aceton wird mit dem schnellen Acetonfällungsprotokoll bei Raumtemperatur (Schritt 2) sowie der CMW-Niederschlagsmenge (Schritt 4) verglichen. Das Rest-SDS wurde mit dem Methylenblau-Wirkstoff-Assay (MBAS)29 quantifiziert. Kurz ge.......
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Diskussion
Eine optimale MS-Charakterisierung wird erreicht, wenn das verbleibende SDS unter 10 ppm erschöpft ist. Während alternative Ansätze wie FASP und Auf-Perlen-Verdauung eine quantitative SDS-Erschöpfung mit variabler Rückgewinnung31,32,33 bieten, besteht das Hauptziel des Niederschlags darin, Reinheit und Ertrag gleichzeitig zu maximieren. Dies hängt davon ab, den Überstand (der das SDS enthält) effektiv zu isolieren, ohne das Prot.......
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Offenlegungen
Das Doucette-Labor konzipierte und patentierte die ProTrap XG, die in dieser Studie verwendet wurde. AAD ist auch Gründungspartner von Proteoform Scientific, das die Probenvorbereitungskartusche vermarktet hat.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada finanziert. Die Autoren danken Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Kanada) und SPARC BioCentre (Molecular Analysis) am Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) für ihre Beiträge zur Erfassung von MS-Daten.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Aceton | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤ 0,002 % Aldehyd |
| Acetonitril | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC-Grad |
| Ammoniumbicarbonat | Millipore Sigma | A6141-1KG | Solide |
| Beta-Mercapptoethanol | Millipore Sigma | M3148-25ML | Molekularbiologie-Bewertung |
| Bromophenolblau | Millipore Sigma | B8026-5G | Bromophenol-blaues Natriumsalz |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-400 | Chloroform |
| Ameisensäure | Honeywell | 56302 | Eluentes Additiv für LC-MS |
| Fusions-Lumos-Massenspektrometer | ThermoFisher Scientific | zur Analyse der Standardproteinmischung | |
| Glycerol | Millipore Sigma | 356352-1L-M | Für Molekularbiologie > 99 % |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4641 | HPLC-Grad |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC-Grad |
| Mikrozentrifuge | Fisher Scientific | 75-400-102 | Bis zu 21.000 xg |
| Mikrozentrifugenröhre (1,5 ml) | Fisher Scientific | 05-408-130 | Konischer Boden |
| Mikrozentrifugenröhre (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | Abgerundeter Boden |
| Mikropipetten-Spitzen (0.1-10 & mu; L) | Fisher Scientific | 21-197-28 | Universelle Pipetspitze, nicht steril |
| Mikropipetten-Spitzen (1-200 & mu; L) | Fisher Scientific | 07-200-302 | Universelle Pipetspitze, nicht steril |
| Mikropipetten-Spitzen (200–1000 & mu; L) | Fisher Scientific | 07-200-303 | Universelle Pipetspitze, nicht steril |
| Mikropipetten | Fisher Scientific | 13-710-903 | Mikropipet-Trio-Paket |
| Pepsin | Millipore Sigma | P0525000 | Lyophilisiertes Pulver, >3200 Einheiten/mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 50 komplette Einheiten pro Box |
| Natriumchlorid | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS-Reagenz, >99 % |
| Natriumdodecylsulfat | ThermoFisher Scientific | 28312 | Pulverfester Stoff |
| timsTOF Pro Massenspektrometer | Bruker | zur Analyse von Leberproteom-Extrakt | |
| Trifluoressigsäure | ThermoFisher Scientific | L06374. AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | Molekularbiologie-Bewertung |
| Trypsin | Millipore Sigma | 9002-07-7 | Von der Rinder-Bauchspeicheldrüse, TPCK-behandelt |
| Harnstoff | Bio-Rad | 1610731 | Solide |
| Wasser (deionisiert) | Sartorius Arium Mini Wasseraufbereitungssystem | 76307-662 | Typ-1-Ultrareine (18,2 MΩ cm) |
| Zinksulfat | Millipore Sigma | 307491-100G | Solide |
Referenzen
- Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
- Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E.
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Nachdrucke und Genehmigungen
