Methodenartikel

Proteinfällung auf organischer Lösungsmittelbasis für eine robuste Proteomreinigung vor der Massenspektrometrie

DOI:

10.3791/63503

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7. Februar 2022

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1Department of Chemistry, Dalhousie University, 2Proteoform Scientific Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorliegende Protokoll beschreibt die lösungsmittelbasierte Proteinfällung unter kontrollierten Bedingungen für eine robuste und schnelle Gewinnung und Reinigung von Proteomproben vor der Massenspektrometrie.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Während mehrere Fortschritte in der Massenspektrometrie (MS) die qualitative und quantitative Proteomanalyse verbessert haben, sind zuverlässigere Front-End-Ansätze zur Isolierung, Anreicherung und Verarbeitung von Proteinen vor MS entscheidend für eine erfolgreiche Proteomcharakterisierung. Geringe, inkonsistente Proteinrückgewinnung und Restverunreinigungen wie Tenside sind schädlich für die MS-Analyse. Die Proteinfällung wird im Vergleich zu anderen Probenvorbereitungsstrategien oft als unzuverlässig, zeitaufwendig und technisch anspruchsvoll angesehen. Diese Bedenken werden durch den Einsatz optimaler Proteinausscheidungsprotokolle überwunden. Für die Acetonfällung ist die Kombination von spezifischen Salzen, Temperaturregelung, Lösungsmittelzusammensetzung und Fällungszeit von entscheidender Bedeutung, während die Effizienz der Chloroform-/Methanol-/Wasserfällung von der richtigen Pipettierung und der Manipulation der Durchstechflasche abhängt. Alternativ werden diese Fällungsprotokolle in einer Einweg-Spinkartusche optimiert und halbautomatisch. Die erwarteten Ergebnisse der lösungsmittelbasierten Proteinfällung im konventionellen Format und unter Verwendung einer zweistufigen Einweg-Filtrations- und Extraktionskartusche werden in dieser Arbeit veranschaulicht. Dazu gehört die detaillierte Charakterisierung proteomischer Gemische durch Bottom-up-LC-MS/MS-Analyse. Die überlegene Leistung von SDS-basierten Arbeitsabläufen wird auch im Vergleich zu nicht kontaminiertem Protein demonstriert.

Einleitung

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Die Proteomanalyse durch Massenspektrometrie ist aufgrund der verbesserten Empfindlichkeit, Auflösung, Scangeschwindigkeit und Vielseitigkeit moderner MS-Instrumente immer strenger geworden. MS-Fortschritte tragen zu einer höheren Proteinidentifizierungseffizienz und einer präziseren Quantifizierungbei 1,2,3,4,5. Mit verbesserter MS-Instrumentierung fordern die Forscher eine entsprechend konsistente Front-End-Probenvorbereitungsstrategie, die in der Lage ist, hochreine Proteine in kürzester Zeit über alle Phasen des Workflows hinweg quantitativ zurückzugewinnen 6,7,8,9,10,11 . Um den Proteomstatus eines biologischen Systems genau widerzuspiegeln, müssen Proteine effizient und unvoreingenommen aus der nativen Probenmatrix isoliert werden. Zu diesem Zweck gewährleistet die Einbeziehung eines denaturierenden Tensids wie Natriumdodecylsulfat (SDS) eine effiziente Proteinextraktion und -solubilisierung12. SDS stört jedoch stark die Elektrospray-Ionisation, was zu einer starken MS-Signalunterdrückung führt, wenn es nicht ordnungsgemäß eliminiertwird 13.

Für die anschließende Proteomanalyse stehen verschiedene SDS-Depletionsstrategien zur Verfügung, wie z.B. die Retention von Proteinen über einem Molekulargewichts-Cutoff-Filter, der in Einweg-Spinkartuschen14,15,16 enthalten ist. Die filtergestützte Probenvorbereitungsmethode (FASP) wird bevorzugt, da sie SDS unter 10 ppm effektiv erschöpft und eine optimale MS ermöglicht. Die Proteinrückgewinnung mit FASP ist jedoch variabel, was die Erforschung anderer Techniken veranlasste. Chromatographische Ansätze, die selektiv Protein (oder Tensid) einfangen, haben sich zu verschiedenen praktischen Kartuschen oder perlenbasierten Formaten entwickelt 17,18,19,20,21. Angesichts dieser einfachen und (idealerweise) konsistenten Strategien zur Proteinreinigung wird der klassische Ansatz der Proteinfällung mit organischen Lösungsmitteln oft als vielversprechender Ansatz zur Proteinisolierung übersehen. Während gezeigt wird, dass die Ausfällung von Lösungsmitteln SDS erfolgreich unter kritische Werte abbaut, ist die Proteinrückgewinnung seit langem ein Problem dieses Ansatzes. Mehrere Gruppen haben eine Proteinrückgewinnungsverzerrung beobachtet, mit inakzeptabel niedrigen Niederschlagsausbeuten als Funktion der Proteinkonzentration, des Molekulargewichts und der Hydrophobie22,23. Aufgrund der Vielfalt der in der Literatur berichteten Niederschlagsprotokolle wurden standardisierte Niederschlagsbedingungen entwickelt. Im Jahr 2013 berichteten Crowell et al. erstmals über die Abhängigkeit der Ionenstärke von der Ausfällungseffizienz von Proteinen in 80% Aceton24. Für alle untersuchten Proteine erwies sich die Zugabe von bis zu 30 mM Natriumchlorid als unerlässlich, um die Ausbeute zu maximieren (bis zu 100% Rückgewinnung). In jüngerer Zeit zeigten Nickerson et al., dass die Kombination von noch höherer Ionenstärke (bis zu 100 mM) mit erhöhter Temperatur (20 °C) während der Acetonfällung zu einer nahezu quantitativen Erholung in 2-5 min25 führte. Es wurde ein leichter Rückgang der Rückgewinnung von niedermolekularen (LMW) Proteinen beobachtet. Daher zeigte ein nachfolgender Bericht von Baghalabadi et al. die erfolgreiche Rückgewinnung von LMW-Proteinen und Peptiden (≤5 kDa) durch Kombination spezifischer Salze, insbesondere Zinksulfat, mit einem höheren Gehalt an organischem Lösungsmittel (97% Aceton)26.

Während die Verfeinerung des Fällungsprotokolls eine zuverlässigere Proteinreinigungsstrategie für MS-basierte Proteomik verleiht, hängt der Erfolg der konventionellen Niederschlagung stark von der Benutzertechnik ab. Ein primäres Ziel dieser Arbeit ist es, eine robuste Fällungsstrategie zu präsentieren, die die Isolierung des Proteinpellets vom kontaminierenden Überstand erleichtert. Eine Einwegfiltrationskartusche wurde entwickelt, um das Pipettieren zu eliminieren, indem aggregiertes Protein über einem porösen PTFE-Membranfilterisoliert wird 27. MS-störende Bauteile im Überstand werden in einem kurzen, langsamen Zentrifugationsschritt effektiv entfernt. Die Einweg-Filterpatrone bietet auch eine austauschbare SPE-Kartusche, die eine anschließende Probenreinigung nach der Resobilisierung und dem optionalen Proteinaufschluss vor der Massenspektrometrie ermöglicht.

Eine Reihe von empfohlenen Proteom-Fällungs-Workflows werden hier vorgestellt, einschließlich modifizierter Aceton- und Chloroform/Methanol/Wasser-28-Protokolle , in einem konventionellen (auf Durchstechflaschen basierenden) und einem halbautomatischen Format in einer Einweg-Zwei-Zustands-Filtrations- und Extraktionskartusche. Die daraus resultierenden Proteinrückgewinnungsraten und SDS-Abbaueffizienzen werden zusammen mit der Bottom-up-LC-MS/MS-Proteomabdeckung hervorgehoben, um das erwartete Ergebnis jedes Protokolls zu demonstrieren. Die praktischen Vor- und Nachteile, die mit jedem Ansatz verbunden sind, werden diskutiert.

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Protokoll

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1. Wesentliche Überlegungen und Probenvorbereitung

  1. Verwenden Sie nur hochreine Lösungsmittel (Aceton, Chloroform, Methanol) (>99,5%) und Chemikalien, frei von überschüssiger Feuchtigkeit.
  2. Natriumchlorid- und Zinksulfatlösungen (1 M) in Wasser herstellen.
    HINWEIS: Salzlösungen können unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden, solange sie frei von Verunreinigungen oder mikrobiellem Wachstum sind.
  3. Verwenden Sie die kleinste Mikrozentrifugendurchstechflasche aus Polypropylen (PP), die ausreicht, um das erforderliche Volumen an Proben und Lösungsmitteln zu erhalten, um die Ausfällung zu induzieren.
  4. Stellen Sie sicher, dass die SDB-Konzentration in der auszufällenden Probe nicht größer als 2 % (w/v) ist. Wenn SDS höher ist, verdünnen Sie die Probe mit Wasser.
  5. Stellen Sie eine Proteinkonzentration zwischen 0,01 und 10 g/L für eine optimale Fällungseffizienz sicher.
    HINWEIS: Die optimale Masse für die Ausfällung liegt zwischen 1-100 μg Protein.
  6. Stellen Sie sicher, dass alle Lösungsmittel und Lösungen vor dem Gebrauch frei von Feinstaub sind. Führen Sie entweder eine Filtration (<0,5 μm) oder einen Zentrifugationsschritt (10.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur) durch, um ungelöste Partikel zu entfernen.
  7. Wenn Disulfidbindungsreduktion und Alkylierung erforderlich sind, führen Sie diese Schritte vor der Proteinausfällung durch. Überschüssige reduzierende und alkylierende Reagenzien werden durch den Fällungsprozess entfernt.
  8. Fallen Sie die Proteine aus, indem Sie eines der Protokolle auswählen und ausführen (Schritte 2, 3, 4 oder 5).

2. Schnelle (Fläschchen-basierte) Proteinfällung mit Aceton

  1. 90 μL (partikelfreie) Protein- oder Proteomlösung in ein PP-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren. Dann fügen Sie 10 μL wässriges NaCl von 1 M hinzu.
    HINWEIS: Wenn die Ionenstärke des Proteomextrakts bereits 100 mM übersteigt, ist kein zusätzliches Salz erforderlich.
  2. Pipettieren Sie 400 μL Aceton in die Probe. Verschließen Sie die Durchstechflasche und klopfen Sie vorsichtig auf die Durchstechflasche, um die Lösungsmittel zu kombinieren. Ein kräftiges Mischen ist nicht erforderlich.
    HINWEIS: Das Volumen von Protein, Salz und Aceton kann erhöht werden, solange das relative Verhältnis von jedem beibehalten wird.
  3. Lassen Sie die Durchstechflasche bei Raumtemperatur ungestört mindestens 2 min inkubieren.
    HINWEIS: Längere Inkubationen, einschließlich solcher bei reduzierter Temperatur (z. B. herkömmliche Acetonfällung verwendet über Nacht Niederschlag im Gefrierschrank), können zur Bildung größerer (sichtbarer) aggregierter Proteinpartikel führen (Abbildung 1A), die im Allgemeinen die gesamte Proteinrückgewinnung nicht verbessern.
  4. Legen Sie nach der Inkubation Proben in eine Zentrifuge und notieren Sie die Ausrichtung der Durchstechflasche. Drehen Sie für mindestens 2 min, bei 10.000 x g oder höher bei Raumtemperatur.
  5. Lösen Sie die Durchstechflasche und dekantieren Sie den Überstand vorsichtig, indem Sie die Durchstechflasche langsam in einen Abfallbehälter umdrehen. Befestigen Sie die umgekehrte Durchstechflasche mit einem Papiertuch, um Lösungsmittelreste aus der Durchstechflasche zu ziehen.
    VORSICHT: Lösungsmittelabfälle sollten gemäß den entsprechenden Protokollen aufbewahrt und entsorgt werden.
  6. Für SDS-haltige Proben geben Sie 400 μL frisches Aceton ab und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
    HINWEIS: Schritt 2.6 ist optional.
    1. Zentrifugieren Sie die Probe sofort (10.000 x g oder höher für 1 min bei Raumtemperatur) und legen Sie die Durchstechflasche in der gleichen Ausrichtung wie die anfängliche Drehung in den Rotor. Dekantieren Sie das Waschlösungsmittel wie in Schritt 2.5 beschrieben.
  7. Lassen Sie die Probe bei geöffneter Kappe vollständig trocknen (~ 1 min). Rekapitulieren Sie die Durchstechflasche und fahren Sie mit der Solubibilisierung des Pellets fort (Schritt 6).

3. Ausfällung von niedermolekularen (LMW) Peptiden (ZnSO4 + Aceton)

  1. Geben Sie 54 μL Proteomextrakt in eine 2 ml PP-Durchstechflasche ab und fügen Sie dann 6 μL 1 M ZnSO4 hinzu.
    HINWEIS: Eine optimale Rückgewinnung von LMW-Peptiden (≤5 kDa) wird durch Zugabe von Aceton zu einem Volumenanteil von 97 % erreicht. Unter der Annahme einer 2 ml PP-Durchstechflasche beträgt das maximale Anfangsprobenvolumen 54 μL.
  2. 1940 μL Aceton zu einem Volumenanteil von 97 % hinzufügen. Zum Mischen vorsichtig schwenken und mindestens 2 min ungestört auf der Tischplatte stehen lassen.
  3. Zentrifen Sie (10.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur) und entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Durchstechflasche umkehren und dann die Durchstechflasche mit einem Papiertuch berühren.
  4. Für SDS-haltige Proben geben Sie 400 μL frisches Aceton ab und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.
    HINWEIS: Schritt 3.4 ist optional.
    1. Die Probe wird sofort gemäß Schritt 3.3 zentrifugiert, wobei die Durchstechflasche in der gleichen Ausrichtung wie die anfängliche Drehung in den Rotor gelegt wird. Dekantieren Sie das Waschlösungsmittel wie in Schritt 3.3 beschrieben.
  5. Das resultierende trockene Pellet in einem wässrigen Lösungsmittel mit kurzer Vortex oder Beschallung (~ 5 min) wieder auflösen.

4. Proteinausfällung durch Chloroform/Methanol/Wasser (CMW)

  1. Geben Sie 100 μL der Protein- oder Proteomlösung in eine PP-Durchstechflasche ab. 400 μL Methanol hinzufügen, gefolgt von 100 μL Chloroform. Die Durchstechflasche und den Wirbel kurz verschließen, um sie zu mischen.
    HINWEIS: Für den CMW-Niederschlag werden 1,5 ml Fläschchen mit schmalem Boden bevorzugt (Abbildung 2A).
    ACHTUNG: Chloroform-Lösungsmittel sollte in einer geeigneten Lüftungshaube gehandhabt werden. Alle Lösungsmittel, die mit Chloroform in Berührung kommen, sollten bei der Entsorgung als halogenierter Abfall behandelt werden.
  2. Dosieren Sie schnell 300 μL Wasser direkt in die Mitte der Durchstechflasche. Verschließen Sie die Durchstechflasche. Lassen Sie die Probe 1 min lang ungestört auf der Tischplatte sitzen.
    HINWEIS: Die Lösung wird sofort wolkig weiß angezeigt. Vermeiden Sie es, die Durchstechflasche nach Zugabe von Wasser zu mischen.
  3. Legen Sie die PP-Durchstechflasche in eine Zentrifuge und drehen Sie sie für mindestens 5 Minuten (10.000 x g oder höher bei Raumtemperatur).
    HINWEIS: Nach der Zentrifugation bilden sich zwei sichtbare Lösungsmittelschichten (obere Schicht = Methanol/Wasser; unten = Chloroform). An der Lösungsmittelgrenzfläche bildet sich ein festes Proteinpellet (Abbildung 2A).
  4. Entfernen Sie mit einer großen Mikropipettenspitze (1 ml) und halten Sie die Durchstechflasche bei ~ 45 ° und entfernen Sie ~ 700 μL des Lösungsmittels mit einer gleichmäßigen Rate aus der oberen Schicht.
  5. Verwenden Sie eine kleinere (200 μL) Mikropipettenspitze, um die obere Lösungsmittelschicht von der ~ 45 ° geneigten Durchstechflasche zu entfernen. In einer kontinuierlichen Bewegung pipettieren, bis die obere Lösungsmittelschicht eine Perle in der Durchstechflasche bildet.
  6. 400 μL frisches Methanol in die Durchstechflasche der Probe geben, ohne das Pellet zu stören, indem das Lösungsmittel an der Seite der Durchstechflasche abgegeben wird.
  7. Verschließen Sie die Durchstechflasche. Kombinieren Sie die Lösungsmittelschichten, indem Sie die Durchstechflasche vorsichtig schaukeln, um die Lösungsmittel miteinander zu verwirbeln.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine Störung des Pellets zu vermeiden. Wirbeln Sie die Durchstechflasche nicht auf.
  8. Unter Berücksichtigung der Ausrichtung der Durchstechflasche im Rotor zentrifugieren Sie mindestens 10 min (10.000 x g bei Raumtemperatur). Das Proteinpellet haftet am Boden der Durchstechflasche (Abbildung 2B).
  9. Kippen Sie die Durchstechflasche um 45°, wobei das Pellet nach unten zeigt. Platzieren Sie die Pipettenspitze entlang der Oberkante der Durchstechflasche und entfernen Sie den Überstand mit einer 1 ml Mikropipettenspitze mit einer langsamen, aber kontinuierlichen Geschwindigkeit. Halten Sie ~ 20 μL Lösungsmittel in der Durchstechflasche zurück.
  10. Waschen Sie das Proteinpellet für SDS-haltige Proben, indem Sie langsam 400 μL frisches Methanol dosieren. Wirbeln Sie die Durchstechflasche nicht auf.
    1. Fahren Sie direkt mit der Zentrifugation fort (10.000 x g für 2 min bei Temperatur) und legen Sie die Durchstechflasche mit der gleichen Ausrichtung wie die anfängliche Drehung in den Rotor.
  11. Entfernen Sie das Lösungsmittel gemäß Schritt 4.9. Lassen Sie die Probe in einem Rauch an der Luft trocknen, bis das restliche Lösungsmittel verdunstet.
  12. Konsultieren Sie die empfohlenen Resolubilisierungsverfahren in Schritt 6.

5. Proteinfällung mit einer Einweg-Filterpatrone

HINWEIS: Jedes in den Schritten 2-5 beschriebene lösungsmittelbasierte Fällungsprotokoll kann in einer zweistufigen Filtrations- und Extraktionskartusche durchgeführt werden (siehe Materialtabelle).

  1. Wenn der Stecker an der oberen Filterpatrone befestigt ist (Abbildung 3A), dosieren Sie das gewünschte Volumen des extrahierten Proteoms, Salzes und Lösungsmittels, wie in einer der drei folgenden Optionen beschrieben.
    1. (Option 1) Für die Proteinfällung mit Aceton 90 μL Protein- oder Proteomlösung, 10 μL 1 M wässriges NaCl und 400 μL Aceton kombinieren. Inkubieren Sie für mindestens 2 Minuten auf dem Tisch.
      HINWEIS: Für konzentrierte Proteinproben (1 g/L) entsteht ein sichtbarer Niederschlag (Abbildung 3B).
    2. (Option 2) Für die LMW-Peptidfällung kombinieren Sie 15 μL der Probe, 1,5 μL 1 MZnSO 4 und 485 μL Aceton. Inkubieren Sie für mindestens 2 Minuten auf dem Tisch.
      HINWEIS: Eine Salzkonzentration von 90 mM in der wässrigen Probe hat keinen Einfluss auf die Erholung im Vergleich zu den in Schritt 3 empfohlenen 100 mM.
    3. (Option 3) Für die CMW-Fällung fügen Sie 50 μL Proteomextrakt, 200 μL Methanol und 50 μL Chloroform hinzu. Die Durchstechflasche verschließen und kurz zum Kombinieren umdrehen.
      1. Geben Sie schnell 150 μL Wasser direkt in die Mitte der Durchstechflasche ab. Inkubieren Sie für 1 min auf der Tischplatte.
  2. Zentrifuge für 2 min bei 2.500 x g bei Raumtemperatur mit dem Stecker noch an der Filterkartusche befestigt.
  3. Drehen Sie die Patrone um, schrauben Sie sie ab und entfernen Sie den Stecker von der Patronenbasis.
  4. Legen Sie die Filterpatrone in eine saubere Durchstechflasche und kehren Sie sie zur Zentrifuge zurück. Drehen Sie für 3 Minuten bei 500 x g bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie das Durchflusslösungsmittel aus der unteren Durchstechflasche.
    HINWEIS: Wenn in der oberen Filterpatrone Lösungsmittel verbleibt, kehren Sie zur Zentrifuge zurück und führen Sie eine zusätzliche Drehung durch.
  5. Waschen Sie das Proteinpellet, indem Sie 400 μL Aceton in die Filtrationskartusche geben (bei CMW-Fällung in Schritt 5.1.3 400 μL Methanol zugeben).
  6. Zentrifuge für 3 min bei 500 x g bei Raumtemperatur oder bis kein Lösungsmittel mehr in der oberen Kartusche verbleibt.
  7. Das Fällungspellet wie in Schritt 6 beschrieben wieder auflösen.

6. Resolubilisierung von Proteinpellets

  1. Befeuchten Sie die Membran an der Basis der Filtrationskartusche, indem Sie 2-5 μL Isopropanol unmittelbar vor den unten beschriebenen Resolubilisierungsprotokollen direkt auf die Membran dosieren.
  2. Befolgen Sie eine der folgenden Resolubilisierungsmethoden.
    1. (Option 1) Mindestens 20 μL wässriger Puffer mit ≥2% SDB in die Filtrationspatrone geben. Kappe und Wirbel kräftig (~1 min). Alternativ beschallen (>10 min), um das Proteinpellet zu dispergieren.
      1. Erhitzen Sie die Probe bei 95 °C für 5 min). Wiederholen Sie den Mischschritt nach dem Erhitzen.
        HINWEIS: Laemmli Gel-Ladepuffer kann das Proteinpellet wieder auflösen. SDS-haltige Proben sind jedoch nicht kompatibel mit Trypsin-Aufschluss und Umkehrphasen-LC und MS.
    2. (Option 2) Bereiten Sie eine Lösung von 80% (v/v) Ameisensäure in Wasser vor. Die saure Lösung (-20 °C) sowie die Filtrationskartusche mit ausgefälltem Protein werden vorgekühlt.
      1. Geben Sie 50 μL kalte Ameisensäure in die Kartusche; Kappe und Wirbel für 30 s. Zurück zum Gefrierschrank (-20 °C) für 10 min.
      2. Wirbeln Sie die Patrone erneut für 30 s. Wiederholen Sie dann den Kühl- und Mischzyklus noch einmal (10 min, -20 °C, 30 s Vortex).
      3. Fügen Sie Wasser zu einem endgültigen 500 μL hinzu und verdünnen Sie die Ameisensäure auf 8%.
        HINWEIS: Das kalte Ameisensäureprotokoll ist mit dem nachfolgenden Trypsinaufschluss nicht kompatibel, aber mit LC-MS kompatibel.
    3. (Option 3) 50 μL frisch zubereiteter 8 Mio. Harnstoff in Wasser in die Filterpatrone geben. Beschallung für 30 min.
      1. Lassen Sie die Kartusche 1 Stunde (bis über Nacht) auf der Tischplatte inkubieren.
      2. Verdünnen Sie den 8 M Harnstoff mindestens 5-fach mit Wasser oder einem geeigneten Puffer.
        HINWEIS: Nach der Verdünnung ist das Harnstoff-Solubilisierungsprotokoll mit der nachfolgenden Trypsin-Verdauung sowie LC-MS kompatibel.

7. Proteinverdauung

  1. Für die Bottom-up-MS-Analyse unterziehen Sie die re-solubilisierten Proteine der enzymatischen Verdauung mit einer der beiden unten genannten Methoden.
    1. (Option 1) Bei der Ameisensäure-Resobilisierung ist das Anfangsvolumen von 80 % Ameisensäure in Schritt 6.2.2.1 auf 25 μl zu reduzieren. In Schritt 6.2.2.3 wird die Ameisensäure mit 375 μl Wasser auf 5 % (v/v) verdünnt.
    2. Geben Sie Pepsin mit einem ungefähren Protein-Enzym-Verhältnis von 50:1 in die Kartusche ab. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei Raumtemperatur mit einem an der Filterpatrone befestigten Stecker.
  2. (Option 2) Für die Resolubilisierung in Harnstoff ist ein pH-Wert zwischen 8 und 8,3 unter Einbeziehung von 100 mM Tris oder Ammoniumbicarbonat in Schritt 6.2.3.2 sicherzustellen.
    1. Fügen Sie Trypsin bei einem ungefähren Verhältnis von Protein zu Enzymmasse von 50: 1 hinzu. Mit einem an der Kartusche befestigten Stecker wird die Probe über Nacht in einem warmen Wasserbad bei 37 °C inkubiert.
    2. Beenden Sie den Aufschluss, indem Sie die Lösung mit 10% TFA auf ein letztes 1% ansäuern.
  3. Gewinnen Sie das Pepsin- oder Trypsin-verdaute Protein zurück, indem Sie den Pfropfen von der Basis des Filters entfernen und die in einer sauberen Durchstechflasche enthaltene Kartusche zentrifugieren (2 min, 5000 x g, Raumtemperatur).

8. SPE-Bereinigung

HINWEIS: Für eine zusätzliche Probenentsalzung nach dem Aufschluss oder Lösungsmittelaustausch kann die Probe wie beschrieben einer umgekehrten Phasenreinigung unterzogen werden.

  1. Grundierung einer SPE-Kartusche (siehe Materialtabelle) durch Passieren von 300 μL Methanol (2 min, 400 x g), gefolgt von 300 μL 5% Acetonitril/0,1% TFA (2 min, 400 x g).
  2. Schließen Sie die grundierte SPE-Kartusche an die Basis der Filtrationskartusche an, die resolubilisiertes oder verdautes Protein enthält.
  3. Drehen Sie das Protein durch die SPE-Kartusche (5 min, 800 x g bei Raumtemperatur). Wenn das Lösungsmittel in der oberen Kartusche verbleibt, bringen Sie die Kartusche zur Zentrifuge zurück und wiederholen Sie die Drehung.
    HINWEIS: Wenn Sie die Probe ein zweites Mal durch die SPE-Kartusche führen, kann dies die Wiederherstellung verbessern.
  4. 300 μL 5 % Acetonitril/0,1 % TFA in Wasser in die Kartusche geben. Zum Waschen durch die SPE-Kartusche (2 min, 2000 x g) fließen. Verwerfen Sie den Flow-Through.
  5. Für LMW-Proteine oder verdaute Peptide eluieren Sie die Probe, indem Sie 300 μL 50% Acetonitril/0,1% TFA (5 min, 2500 x g) fließen lassen.
  6. Für intakte Proteine folgen Sie Schritt 8.5 mit einem zusätzlichen Elutionsschritt mit 300 μL 75% Acetonitril/0,1% TFA. Kombinieren Sie die beiden resultierenden Extrakte.
    HINWEIS: Schritt 8.6 ist optional.

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Ergebnisse

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Abbildung 4 fasst die erwartete SDS-Erschöpfung nach einer Fläschchen- oder kartuschengestützten Ausfällung von Proteinen in einer Einweg-Filterpatrone unter Verwendung von Aceton zusammen. Die konventionelle Inkubation über Nacht (-20 °C) in Aceton wird mit dem schnellen Acetonfällungsprotokoll bei Raumtemperatur (Schritt 2) sowie der CMW-Niederschlagsmenge (Schritt 4) verglichen. Das Rest-SDS wurde mit dem Methylenblau-Wirkstoff-Assay (MBAS)29 quantifiziert. Kurz ge...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine optimale MS-Charakterisierung wird erreicht, wenn das verbleibende SDS unter 10 ppm erschöpft ist. Während alternative Ansätze wie FASP und Auf-Perlen-Verdauung eine quantitative SDS-Erschöpfung mit variabler Rückgewinnung31,32,33 bieten, besteht das Hauptziel des Niederschlags darin, Reinheit und Ertrag gleichzeitig zu maximieren. Dies hängt davon ab, den Überstand (der das SDS enthält) effektiv zu isolieren, ohne das Prot...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Doucette-Labor konzipierte und patentierte die ProTrap XG, die in dieser Studie verwendet wurde. AAD ist auch Gründungspartner von Proteoform Scientific, das die Probenvorbereitungskartusche vermarktet hat.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada finanziert. Die Autoren danken Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Kanada) und SPARC BioCentre (Molecular Analysis) am Hospital for Sick Children (Toronto, Kanada) für ihre Beiträge zur Erfassung von MS-Daten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AcetonFisher ScientificAC177170010≤ 0,002 % Aldehyd
AcetonitrilFisher ScientificA998-4HPLC-Grad
AmmoniumbicarbonatMillipore SigmaA6141-1KGSolide
Beta-MercapptoethanolMillipore SigmaM3148-25MLMolekularbiologie-Bewertung
BromophenolblauMillipore SigmaB8026-5GBromophenol-blaues Natriumsalz
ChloroformFisher ScientificC298-400Chloroform
AmeisensäureHoneywell56302Eluentes Additiv für LC-MS
Fusions-Lumos-MassenspektrometerThermoFisher Scientificzur Analyse der Standardproteinmischung
GlycerolMillipore Sigma356352-1L-MFür Molekularbiologie > 99 %
IsopropanolFisher ScientificA4641HPLC-Grad
MethanolFisher ScientificA452SK-4HPLC-Grad
MikrozentrifugeFisher Scientific75-400-102Bis zu 21.000 xg
Mikrozentrifugenröhre (1,5 ml)Fisher Scientific05-408-130Konischer Boden
Mikrozentrifugenröhre                (2 mL)Fisher Scientific02-681-321Abgerundeter Boden
Mikropipetten-Spitzen                (0.1-10 & mu; L)Fisher Scientific21-197-28Universelle Pipetspitze, nicht steril
Mikropipetten-Spitzen                (1-200 & mu; L)Fisher Scientific07-200-302Universelle Pipetspitze, nicht steril
Mikropipetten-Spitzen              (200–1000 & mu; L)Fisher Scientific07-200-303Universelle Pipetspitze, nicht steril
MikropipettenFisher Scientific13-710-903Mikropipet-Trio-Paket
PepsinMillipore SigmaP0525000Lyophilisiertes Pulver,                     >3200 Einheiten/mg
ProTrap XGProteoform ScientificPXG-000250 komplette Einheiten pro Box
NatriumchloridMillipore SigmaS9888-1KGACS-Reagenz, >99 %
NatriumdodecylsulfatThermoFisher Scientific28312Pulverfester Stoff
timsTOF Pro MassenspektrometerBrukerzur Analyse von Leberproteom-Extrakt
TrifluoressigsäureThermoFisher ScientificL06374. AP99%
TrisFisher ScientificBP152-500Molekularbiologie-Bewertung
TrypsinMillipore Sigma9002-07-7Von der Rinder-Bauchspeicheldrüse, TPCK-behandelt
HarnstoffBio-Rad1610731Solide
Wasser (deionisiert)Sartorius Arium Mini Wasseraufbereitungssystem76307-662Typ-1-Ultrareine (18,2 MΩ cm)
ZinksulfatMillipore Sigma307491-100GSolide

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
  2. Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. Journal of Proteomics. 175, 42-55 (2018).
  3. Quaranta, A., et al. N -Glycosylation profiling of intact target proteins by high-resolution mass spectrometry (MS) and glycan analysis using ion mobility-MS/MS. Analyst. 145 (5), 1737-1748 (2020).
  4. Van Der Burgt, Y. E. M., et al. Structural analysis of monoclonal antibodies by ultrahigh resolution MALDI in-source decay FT-ICR mass spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2079-2085 (2019).
  5. Anderson, L. C., et al. Identification and characterization of human proteoforms by top-down LC-21 Tesla FT-ICR mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (2), 1087-1096 (2017).
  6. Nickerson, J. L., et al. Recent advances in top-down proteome sample processing ahead of MS analysis. Mass Spectrometry Reviews. , (2021).
  7. Kelly, R. T. Single-cell Proteomics: Progress and Prospects. Molecular and Cellular Proteomics. 19 (11), 1739-1748 (2020).
  8. Alexovič, M., Sabo, J., Longuespée, R. Microproteomic sample preparation. Proteomics. 21 (9), 2000318(2021).
  9. Shishkova, E., Coon, J. J. Rapid preparation of human blood plasma for bottom-up proteomics analysis. STAR Protocols. 2 (4), 100856(2021).
  10. Duong, V. A., Park, J. M., Lee, H. Review of three-dimensional liquid chromatography platforms for bottom-up proteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1524(2020).
  11. Gan, G., et al. SCASP: A simple and robust SDS-aided sample preparation method for proteomic research. Molecular and Cellular Proteomics. 20, 100051(2021).
  12. Kachuk, C., Doucette, A. A. The benefits (and misfortunes) of SDS in top-down proteomics. Journal of Proteomics. 175, 75-86 (2018).
  13. Rundlett, K. L., Armstrong, D. W. Mechanism of signal suppression by anionic surfactants in capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 68 (19), 3493-3497 (1996).
  14. Wis, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  15. Ni, M., et al. Modified filter-aided sample preparation (FASP) method increases peptide and protein identifications for shotgun proteomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 31 (2), 171-178 (2017).
  16. Zhao, Q., et al. imFASP: An integrated approach combining in-situ filter-aided sample pretreatment with microwave-assisted protein digestion for fast and efficient proteome sample preparation. Analytica Chimica Acta. 912, 58-64 (2016).
  17. Kanshin, E., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757(2014).
  18. Hughes, C. S., et al. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments. Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).
  19. Dagley, L. F., Infusini, G., Larsen, R. H., Sandow, J. J., Webb, A. I. Universal solid-phase protein preparation (USP3) for bottom-up and top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (7), 2915-2924 (2019).
  20. Hengel, S. M., et al. Evaluation of SDS depletion using an affinity spin column and IMS-MS detection. Proteomics. 12 (21), 3138-3142 (2012).
  21. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. PROTEOMICS. 14 (9), 1006-1010 (2014).
  22. Thongboonkerd, V., McLeish, K. R., Arthur, J. M., Klein, J. B. Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International. 62 (4), 1461-1469 (2002).
  23. Klont, F., et al. Assessment of sample preparation bias in mass spectrometry-based proteomics. Analytical Chemistry. 90 (8), 5405-5413 (2018).
  24. Crowell, A. M. J., Wall, M. J., Doucette, A. A. Maximizing recovery of water-soluble proteins through acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 796, 48-54 (2013).
  25. Nickerson, J. L., Doucette, A. A. Rapid and quantitative protein precipitation for proteome analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 19 (5), 2035-2042 (2020).
  26. Baghalabadi, V., Doucette, A. A. Mass spectrometry profiling of low molecular weight proteins and peptides isolated by acetone precipitation. Analytica Chimica Acta. 1138, 38-48 (2020).
  27. Crowell, A. M. J., MacLellan, D. L., Doucette, A. A. A two-stage spin cartridge for integrated protein precipitation, digestion and SDS removal in a comparative bottom-up proteomics workflow. Journal of Proteomics. 118, 140-150 (2015).
  28. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  29. Arand, M., Friedberg, T., Oesch, F. Colorimetric quantitation of trace amounts of sodium lauryl sulfate in the presence of nucleic acids and proteins. Analytical Biochemistry. 207 (1), 73-75 (1992).
  30. Tukey, J. W. Exploratory data analysis. Biometrics. 33, at http://www.jstor.org/stable/2529486 768(1977).
  31. Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).
  32. Sielaff, M., et al. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range. Journal of Proteome Research. 16 (11), 4060-4072 (2017).
  33. Supasri, K. M., et al. Evaluation of filter, paramagnetic, and STAGETips aided workflows for proteome profiling of symbiodiniaceae. Processes. 9 (6), 983(2021).
  34. Botelho, D., et al. Top-down and bottom-up proteomics of SDS-containing solutions following mass-based separation. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2863-2870 (2010).
  35. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  36. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. Journal of Chromatography A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  37. Bryzgunova, O., et al. A reliable method to concentrate circulating DNA. Analytical Biochemistry. 408 (2), 354-356 (2011).
  38. Asakura, T., Adachi, K., Schwartz, E. Stabilizing effect of various organic solvents on protein. Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6423-6425 (1978).
  39. Loo, J. A., Loo, R. R. O., Udseth, H. R., Edmonds, C. G., Smith, R. D. Solvent-induced conformational changes of polypeptides probed by electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (3), 101-105 (1991).
  40. Simpson, D. M., Beynon, R. J. Acetone precipitation of proteins and the modification of peptides. Journal of Proteome Research. 9 (1), 444-450 (2010).
  41. Güray, M. Z., Zheng, S., Doucette, A. A. Mass spectrometry of intact proteins reveals +98 u chemical artifacts following precipitation in acetone. Journal of Proteome Research. 16 (2), 889-897 (2017).
  42. Doucette, A. A., Vieira, D. B., Orton, D. J., Wall, M. J. Resolubilization of precipitated intact membrane proteins with cold formic acid for analysis by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6001-6012 (2014).
  43. Beavis, R. C., Chait, B. T. Rapid, sensitive analysis of protein mixtures by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (17), 6873-6877 (1992).
  44. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. Journal of Neurochemistry. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  45. Vuckovic, D., Dagley, L. F., Purcell, A. W., Emili, A. Membrane proteomics by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Analytical approaches and challenges. Proteomics. 13 (3-4), 404-423 (2013).
  46. Smith, L. M., et al. The human proteoform project: Defining the human proteome. Science Advances. 7 (46), (2021).

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