Dieses Protokoll beschreibt, wie man ein Continuous-Flow-Polymerase-Kettensystem auf der Basis eines Mikrofluidik-Chips aufbaut und wie man ein Kapillarelektrophoresesystem im Labor aufbaut. Es stellt eine einfache Methode für die Analyse von Nukleinsäuren im Labor vor.
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Methodenartikel
Amplifikation von Escherichia coli in einem Continuous-Flow-PCR-Mikrofluidik-Chip und deren Detektion mit einem Kapillarelektrophorese-System
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine traditionelle Methode zur Amplifikation eines Zielgens, die in der biomolekularen Diagnostik eine wichtige Rolle gespielt hat. Die herkömmliche PCR ist jedoch aufgrund der Effizienz bei niedrigen Temperaturschwankungen sehr zeitaufwändig. In dieser Arbeit wird ein Continuous-Flow-PCR (CF-PCR)-System vorgeschlagen, das auf einem mikrofluidischen Chip basiert. Die Amplifikationszeit kann stark verkürzt werden, indem die PCR-Lösung in einen Mikrokanal geleitet wird, der auf Heizgeräten mit unterschiedlichen Temperaturen platziert ist. Da die Kapillarelektrophorese (CE) ein idealer Weg zur Unterscheidung von positiven und falsch-positiven PCR-Produkten ist, wurde ein CE-System entwickelt, um eine effiziente Trennung der DNA-Fragmente zu erreichen. In dieser Arbeit wird der Prozess der Amplifikation von Escherichia coli (E. coli) durch das hauseigene CF-PCR-System und der Nachweis der PCR-Produkte durch CE beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, dass das Zielgen von E. coli innerhalb von 10 Minuten erfolgreich amplifiziert wurde, was darauf hindeutet, dass diese beiden Systeme für die schnelle Amplifikation und den Nachweis von Nukleinsäuren verwendet werden können.
Einleitung
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine molekularbiologische Technik, die zur Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente verwendet wird, wodurch Spuren von DNA hundertmillionenfach vervielfältigt werden. Es wurde häufig in der klinischen Diagnose, der medizinischen Forschung, der Lebensmittelsicherheit, der forensischen Identifizierung und anderen Bereichen eingesetzt. Der PCR-Prozess besteht im Wesentlichen aus drei Schritten: Denaturierung bei 90-95 °C, Glühen bei 50-60 °C und Verlängerung bei 72-77 °C. Thermozyklen sind ein wichtiger Bestandteil des PCR-Prozesses. Der herkömmliche PCR-Thermocycler ist jedoch nicht nur sperrig, sondern auch ineffizient und benöt....
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Protokoll
HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Herstellung eines CF-PCR-Mikrofluidik-Chips
- Erhitzen Sie den Siliziumwafer 25 Minuten lang bei 200 °C, um die Feuchtigkeit zu entfernen.
- Geben Sie 1 ml SU-8-2075 Fotolack pro Zoll des Wafers ab. Drehen Sie es auf dem Siliziumwafer mit einem Spin Coater bei 500 U/min für 5-10 s mit einer Beschleunigung von 100 U/min und dann bei 2.000 U/min für 30 s mit einer Beschleunigung von 500 U/min/s.
- Die Siliziumwaffel wird bei 65 °C für 3 Minu....
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Ergebnisse
Abbildung 5 zeigt das Elektropherogramm der PCR-Produkte und der DNA-Marker. Trace (Abbildung 5A) ist das CE-Ergebnis des CF-PCR-amplifizierten Produkts, Trace (Abbildung 5B) ist das CE-Ergebnis des durch Thermozyklen amplifizierten Produkts und Trace (Abbildung 5C) ist das CE-Ergebnis der 100 bp DNA-Leiter. Wir haben zunächst das Zielgen von E. coli im CF-PCR-System amplifiziert; Die PCR-Lösun.......
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Diskussion
Sowohl PCR als auch CE sind zwei beliebte Biotechnologien in der Analyse von Nukleinsäuren. Dieser Artikel beschreibt die Amplifikation von E. coli und den Nachweis der PCR-Produkte mit den CF-PCR- und CE-Systemen, die beide im eigenen Haus entwickelt wurden. Das Zielgen von E. coli wurde aufgrund der hohen Wärmeübertragungsraten innerhalb von 10 min erfolgreich amplifiziert. Die DNA-Fragmente, die kleiner als 1.500 bp waren, wurden innerhalb von 8 Minuten getrennt (Abbildung 5
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Wissenschafts- und Technologiekommission der Stadtverwaltung Shanghai, China, unterstützt (Nr. 19ZR1477500 und Nr. 18441900400). Wir bedanken uns für die finanzielle Unterstützung durch die University of Shanghai for Science and Technology (Nr.2017KJFZ049).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 100 bp DNA-Leiter | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 10x Fast Buffer I | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| 10x TBE | Beijing Solarbio Wissenschaft & Technik Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| Entwicklerlösung | Alfa Aesar, USA | L15459 | |
| dNTP-Gemisch (2,5 μ M) | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| EC-F | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| EC-R | Sangon Biotech, Shanghai, China | ||
| HEC, 1300K | Sigma-Aldrich, USA | 9004-62-0 | |
| Isopropanol | Aladdin, Shanghai, China | 67-63-0 | |
| Mikroskop Olympus, Japan | BX51 | ||
| Photolithographie & nbsp; | SÜSS MicroTec, Deutschland | MJB4 | |
| Photomultiplier-Röhre | Hamamatsu Photonics, Japan | R928 | |
| Fotolack | MicroChem, USA | SU-8 2075 | |
| PID-Temperaturregler | Shanghai, China | XH-W2023 | |
| Plasmareiniger | Harrick Plasma | PDC-32G-2 | |
| Polyvinylpyrrolidon (PVP) | Aladdin, Shanghai, China | P110608 | |
| Pumpe | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| Silikonschläuche | BIO-RAD, USA | ||
| Halbleiterrelais | KZLTD, China | KS1-25LA | |
| SpeedSTAR HS DNA Polymerase | Takara Bio Inc. | RR070A | |
| Stahlnadel | zhongxinqiheng,Suzhou,China | ||
SYBR GREEN  | Solarbio, Peking, China | SY1020 | |
| Temperatursensoren | EasyShining Technology, Chengdu, China | TCM-M207 | |
| Vorlage (E. coli) | Takara Bio Inc. | AK601 | |
| Tween 20 | Aladdin, Shanghai, China | T104863 | |
| Spannung Stromversorgung | Medina, NY, VEREINIGTE STAATEN VON AMERIKA | TREK MODELL 610E |
Referenzen
- Li, Z., et al. All-in-one microfluidic device for on-site diagnosis of pathogens based on an integrated continuous flow PCR and electrophoresis biochip. Lab on a Chip. 19 (16), 2663-2668 (2019).
- Crews, N., Wittwer, C., Gale, B.
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Nachdrucke und Genehmigungen
