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Methodenartikel

Inaktivierung von Krankheitserregern durch Photolyse von Riboflavin-5′-Phosphat im sichtbaren Licht

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DOI:

10.3791/63531

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6. April 2022

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1Department of Biotechnology, Ming Chuan University, 2Department of Tourism and Leisure, Hsing Wu University, 3Department of Science Education and Application, National Taichung University of Education, 4Department of Soil and Environmental Sciences, National Chung Hsing University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Inaktivierung pathogener Bakterien mit reaktiven Sauerstoffspezies vor, die während der Photolyse von Flavinmononukleotid (FMN) unter blauer und violetter Lichtbestrahlung niedriger Intensität entstehen. Die FMN-Photolyse hat sich als einfache und sichere Methode für hygienische Prozesse erwiesen.

Zusammenfassung

Riboflavin-5'-phosphat (oder Flavinmononukleotid; FMN) ist empfindlich gegenüber sichtbarem Licht. Verschiedene Verbindungen, einschließlich reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), können durch FMN-Photolyse bei Bestrahlung mit sichtbarem Licht erzeugt werden. Die durch FMN-Photolyse erzeugten ROS sind schädlich für Mikroorganismen, einschließlich pathogener Bakterien wie Staphylococcus aureus (S. aureus). Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Deaktivierung von S. aureus als Beispiel durch photochemische Reaktionen vor, an denen FMN unter Bestrahlung mit sichtbarem Licht beteiligt ist. Das bei der FMN-Photolyse erzeugte Superoxid-Radikal-Anion () wird mittels Nitroblautetrazolium (figure-abstract-1NBT)-Reduktion ausgewertet. Die mikrobielle Lebensfähigkeit von S. aureus, die reaktiven figure-abstract-2 Spezies zugeschrieben wird, wurde verwendet, um die Wirksamkeit des Verfahrens zu bestimmen. Die bakterielle Inaktivierungsrate ist proportional zur FMN-Konzentration. Violettes Licht ist bei der Inaktivierung von S. aureus effizienter als die Bestrahlung mit blauem Licht, während das rote oder grüne Licht die FMN-Photolyse nicht antreibt. Der vorliegende Artikel demonstriert die FMN-Photolyse als einfache und sichere Methode für sanitäre Prozesse.

Einleitung

Riboflavin-5′-phosphat (FMN) entsteht durch Phosphorylierung an der Riboflavin-5′-Position der Ribitylseitenkette und wird von allen Flavoproteinen für zahlreiche zelluläre Prozesse zur Energiegewinnung benötigt. Es spielt auch die Rolle des Vitamins für einige Funktionen im menschlichen Körper1. FMN ist etwa 200-mal wasserlöslicher als Riboflavin2.

Die antibakterielle photodynamische Inaktivierung (aPDI) von Bakterien ist ein wirksames Mittel zur Kontrolle der Resistenz gegen Bakterien3,4, da sie nicht von der Art der bakteriellen Resistenz abhängt. Klinisch wird aPDI zur Behandlung von Weichteilinfektionen eingesetzt, um die Infektion der nosokomialen Haut durch multiresistente Bakterienzu verringern 5,6,7,8,9. aPDI erzeugt auch den Zelltod, indem es reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt. ROS, wie Superoxidradikale (), Singulett-Sauerstoff, Hydroxylradikale (figure-introduction-1•OH) und Peroxyl-Radikale, sind freie Radikale oder Moleküle, die reaktiven Sauerstoff 10,11,12 enthalten und normalerweise reaktiv sind 13. Ähnlich wie DNA-Schäden, die durch ROS verursacht werden, sind auch die Membranperoxidation und die Zerstörung von Endothelzellen nachteilige biochemische Reaktionen, die auf ROS in Zellenzurückzuführen sind 12.

Die Verwendung von aPDI für pathogene Bakterien beinhaltet eine sichtbare oder UV-Lichtquelle zur Inaktivierung von Mikroorganismen in Gegenwart chemischer Verbindungen wie Methylthioniniumchlorid 14, PEI-c e6-Konjugat 15, Porphyrin16, Titandioxid 17, Toluidinblau O 18 und Zinkoxid-Nanopartikel 19. Toluidinblau O und Methylenblau sind Phenothiaziniumfarbstoffe und Methylenblau hat toxische Eigenschaften. Zinkoxid-Nanopartikel und UV-Strahlung sind mit negativen Auswirkungen auf Gesundheit und Umwelt verbunden. Daher verdient die Nutzung eines zuverlässigen, sicheren und einfachen Photosensibilisators durch Photolyse unter sichtbarer Bestrahlung weitere Untersuchungen.

Der Mikronährstoff, Riboflavin oder FMN, ist nicht toxisch und wird in der Tat für die Lebensmittelherstellung oder Fütterungverwendet 20. Sowohl FMN als auch Riboflavin sind sehr empfindlich gegenüber Lichteinstrahlung2. Unter UV 1,2,21,22,23 und Blaulichteinstrahlung 10,24 erreichen diese beiden Verbindungen einen angeregten Zustand. Das aktivierte Riboflavin oder FMN, das durch Photolyse erzeugt wird, wird in seinen Triplett-Zustand befördert und ROS werden gleichzeitigerzeugt 2,25. Kumar et al. berichteten, dass Riboflavin, das durch UV-Licht aktiviert wird, selektiv eine erhöhte Schädigung des Guanin-Anteils der DNA in pathogenen Mikroorganismen verursacht26. Unter Bestrahlung mit UV-Licht wird gezeigt, dass photodynamisch aktiviertes Riboflavin die Bildung von 8-OH-dG, einem Biomarker für oxidativen Stress, in doppelsträngiger DNAfördert 27. Es wird berichtet, dass S. aureus und E. coli während der Riboflavin- oder FMN-Photolyse durch ROS deaktiviert werden10,24,28. Eine frühere Studie der Autoren zeigte, dass die photolytischen Reaktionen mit Riboflavin und FMN Kristallviolett, einen Triarylmethanfarbstoff und ein antibakterielles Mittel, das Kristallviolett erzeugt und den größten Teil der antimikrobiellen Fähigkeit von Kristallviolett28 erzeugtfigure-introduction-2, reduzieren und eliminieren. Wenn Flavin-Adenin-Dinukleotid oder FMN mit blauem Licht bestrahlt wird, erzeugen die resultierenden ROS Apoptose in HeLa-Zellen für ihre Vergiftung in vitro29. Unter Verwendung einer photochemischen Behandlung in Gegenwart von Riboflavin inaktivierten Cui et al. Lymphozyten durch Hemmung ihrer Proliferation und Zytokinproduktion30.

Die Photolyse von Riboflavin wird zur Inaktivierung von Blutpathogenen durch UV 10,24 verwendet, jedoch können Blutbestandteile unter UV-Lichtbestrahlung beeinträchtigt werden30. Es wird auch berichtet, dass Thrombozyten, die UV-Strahlung ausgesetzt sind, die Leistung der Aktivierungsmarker P-Selektin und LIMP-CD63 auf ihren Membranen progressiv verbessern. Die Zytotoxizität von UV- und hochintensiver Bestrahlung muss untersucht werden, und ein Photosensibilisator, der während einer FMN-Photoreaktion mit sichtbarem Licht unkompliziert und sicher ist, wäre von großem Nutzen.

Licht kürzerer Wellenlängen hat mehr Energie und verursacht viel eher schwere Schäden an Zellen. In Gegenwart eines geeigneten Photosensibilisators kann die Bestrahlung mit violettem Licht geringer Intensität jedoch pathogene Mikroorganismen hemmen. Die Photosensibilisierung und die Erzeugung von FMN bei Bestrahlung mit violettem Licht ist daher wichtig zu untersuchen, um den Weg zu bestimmen, auf dem ROS aus der FMN-Photolyse die Inaktivierung von figure-introduction-3 Bakterien erhöht.

Antimikrobielle Kontrolle ist ein häufiges Problem und die Entwicklung neuer Antibiotika dauert oft Jahrzehnte. Nach der Bestrahlung mit violettem Licht kann die Photoinaktivierung, die durch FMN vermittelt wird, umweltpathogene Bakterien vernichten. Diese Studie stellt ein wirksames antimikrobielles Protokoll in vitro vor, das violettes Licht verwendet, um die FMN-Photolyse zu steuern und somit für aPDI zu erzeugen figure-introduction-4 . Die mikrobielle Lebensfähigkeit von S. aureus wird verwendet, um die Machbarkeit von FMN-induziertem aPDI zu bestimmen.

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Protokoll

1. Einrichtung des Photolysesystems

  1. Sechs Leuchtdioden (LED) (DC 12 V) werden an der Innenseite eines undurchsichtigen Kunststoffbechers (8 cm x 7 cm) montiert, wie in Figur 1 gezeigt, um ein Photolysesystem31 einzurichten.
  2. Geben Sie Reaktanten (siehe unten) in die Glasreagenzgläser (13 mm Durchmesser und 100 mm Höhe) und befestigen Sie die Röhrchen oben im Becher, wie in Abbildung 1 gezeigt. Stellen Sie den Versuchsaufbau in einen Raum mit einer konstanten Temperatur von 25 ± 3 °C.
  3. Überwachen und erfassen Sie die Temperatur der Testeinheiten während der photolytischen Reaktionen mit einem Infrarot-Thermometer.
    HINWEIS: Abbildung 2 zeigt die Emissionsspektren für blaues, grünes, rotes und violettes Licht, wie sie mit einem kalibrierten optischen UV-Vis-Spektrometer aufgezeichnet wurden. Die Wellenlängen, die dem Extinktionsmaximum für blaue, grüne, rote und violette LED-Lichter entsprechen, die in der Studie verwendet wurden, sind 465, 529, 632 bzw. 405 nm. Die LED-Chips können die Apparatur bei Bestrahlungsexperimenten erwärmen. Das gesamte Photoreaktionssystem wurde daher in jedem Experiment in einem Raum platziert, in dem die Temperatur konstant bei 25 ± 3 °C gehalten wurde.

2. Der Einfluss der Lichtwellenlänge auf die Photolyse von FMN (Abbildung 3)

  1. Bereiten Sie eine 0,1 mM FMN-Lösung in 100 mM Kaliumphosphatpuffer (PB) (pH 7,8) vor. Belichten Sie FMN-Proben (jeweils 3 ml) 5 Minuten lang blauem, grünem, rotem oder violettem Licht mit einer Intensität von 10 W/m2 . Bewahren Sie 3 ml FMN-Lösung als Kontrolle im Dunkeln auf.
  2. Aufzeichnung der Absorption von bestrahlten FMN-Proben im Bereich von 250-750 nm mit einem UV/Visible-Spektralphotometer.

3. Nitroblautetrazolium (NBT)-Reduktionsmethode zum Nachweis figure-protocol-1 (Abbildung 4).

ANMERKUNG: Die hier verwendete NBT-Reduktionsmethode wurde gegenüber dem Assay für Riboflavin-Photoreaktion leicht modifiziert. Die NBT-Reduktionsmethode wird verwendet, um das Niveau der durch die FMN-Photolyse erzeugten figure-protocol-2 Werte zu bewerten. Das photochemisch angeregte FMN wird zunächst durch L-Methionin zu einem Semichinon reduziert, das dann ein Elektron an Sauerstoff abgibt, wodurch 31 entstehtfigure-protocol-3. Das erzeugte figure-protocol-4 NBT reduziert zu Formazan, das eine charakteristische Absorption bei 560 nm32 aufweist.

  1. Fügen Sie 109,3 mg L-Methionin zu 73,3 ml PB (100 mM; pH 7,8) hinzu. Vortex die Lösung, um das L-Methionin aufzulösen.
  2. Nachdem das L-Methionin vollständig aufgelöst ist, fügen Sie der Lösung 10 mg NBT-Pulver und 1,53 ml 0,117 mM FMN hinzu. Für jeden 1 ml der Reaktionslösung (d. h. eine Mischung aus FMN, L-Methionin und NBT) betragen die Endkonzentrationen von FMN, Methionin und NBT 2,4 x 10-6 M, 1,0 x 10-2 M bzw. 1,6 x 10-4 M.
  3. Die Reaktionslösung (1 ml) wird 1-5 min lang blauer oder violetter LED-Lichtbestrahlung bei 10 W/m2 ausgesetzt.
  4. Detektieren Sie die Spezies (aus der Absorption bei 560 nm), die durch die photochemische Reaktion erzeugt wird, die figure-protocol-5 NBT reduziert und Formazan produziert.

4. Lebensfähigkeit von S. aureus nach FMN-Photolyse (Abbildung 5)

  1. Eine Kolonie von S. aureus (BCRC 10451) wird von einer kultivierten Platte in 10 ml Lysogenbrühe übertragen, die in einem 15-ml-Reagenzglas mit Schraubverschluss entnommen wird. Kultur in einem Shaker bei 37 °C für 16 h.
  2. Übertragen Sie 0,5 ml der Kultur in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Geben Sie sterilisiertes Wasser in das Zentrifugenröhrchen, um die Kultur auf eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm (OD600) (~ 6 x 107 KBE/ml) zu verdünnen.
  3. Geben Sie 0,5 ml der Kultur in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 14.000 x g und dekantieren Sie den Überstand, um ein Zellpellet zu erhalten.
  4. Fügen Sie 1 ml FMN-gepufferte Lösung (30, 60 und 120 μM FMN in PB) zu den wie in Schritt 4.3 erhaltenen Zellpellets hinzu und wirbeln Sie aus. Für die Bestrahlungskontrolle fügen Sie 1 ml PB allein hinzu.
  5. Übertragen Sie je 1 ml lebensfähige bakterielle Zelllösungen, die nur 30 μM FMN und PB enthalten, in Glasröhrchen und bestrahlen Sie sie mit violettem Licht bei 10 W/m2 für 30 min.
  6. Übertragen Sie jeweils 1 ml lebensfähiger bakterieller Zelllösungen, die 30, 60 und 120 μM FMN und PB enthalten, in Glasröhrchen und bestrahlen Sie sie mit blauem Licht bei 20 W/m2 für 120 min. Stellen Sie ein weiteres Glasröhrchen mit 1 ml lebensfähiger Bakterienzelllösung auf, die 120 μM FMN enthält, und bestrahlen Sie es 60 Minuten lang mit blauem Licht bei 20 W/m2 .
  7. Stellen Sie die Reagenzgläser wie in den Schritten 4.5 und 4.6 beschrieben auf und decken Sie sie mit dicken Aluminiumfolien ab. Diese Röhren dienen als Dunkelregler.
  8. Bewahren Sie die Bestrahlungskammer (sowie die Dunkelregler) während der Bestrahlungszeit von 30-120 min in einem Kühlraum bei 9 ± 1 °C auf.
    HINWEIS: Die von LED-Leuchten freigesetzte Wärme kann nicht ignoriert werden, da die im Inneren des Bechers platzierten LED-Chips das Photoreaktionssystem während der Bestrahlungsexperimente erwärmen können. Die Versuche wurden daher in einem Kühlraum bei 9 ± 1 °C durchgeführt.
  9. Nach der Bestrahlung werden 0,2 ml aus jeder der Reaktionslösungen auf eine Luria-Agarplatte (LA) übertragen. Die Bakterien mit einem L-förmigen Glasstab auf der Platte verteilen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  10. Berechnen Sie die lebensfähige Keimzahl und die Inaktivierungsraten von S. aureus nach nächtlichem Wachstum.
    ANMERKUNG: Die Inaktivierungsrate von S. aureus wird als prozentuale Reduktion berechnet, die [1 -I / D] ×100% entspricht, wobei I und D die Anzahl der KBE in der bestrahlten Probe bzw. der Dunkelkontrolle bezeichnen. Die prozentuale Minderung ist definiert als negativer Wert der Inaktivierungsrate.

5. Nachweis von figure-protocol-6 In S. aureus (Abbildung 6)

  1. Bereiten Sie die S. aureus-Proben wie in Schritt 4 beschrieben vor.
  2. Die Bakteriendichte der Proben wird mit sterilisiertem Wasser auf eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm (OD600, ~6 x 106 KBE/ml) verdünnt. Übertragen Sie 0,5 ml der Kultur in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie bei 14.000 x g für 10 min und dekantieren Sie den Überstand, um ein Zellpellet zu erhalten.
  3. Fügen Sie 0,1093 g L-Methionin, 0,1 g NBT und 25 ml FMN (400, 240 oder 120 μM) zu 75 ml PB hinzu. Für jeden 1 ml des applizierten Reaktanten betragen die Endkonzentrationen von FMN, Methionin und NBT 100 (60 oder 30) x 10-6 M, 7,3 x 10-3 M bzw. 1,2 x 10-3 M.
  4. 1 ml jeder Reaktantenlösung (d. h. mit unterschiedlichen FMN-Konzentrationen) zu den wie in Schritt 5.2 erhaltenen Zellpellets zugeben. Bestrahlen Sie die Lösungen mit violettem Licht bei 10 W/m2 für 10 min.
  5. Das Gemisch wird bei 14.000 x g für 10 min zentrifugiert und der Überstand dekantiert. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), um das reduzierte NBT zu extrahieren. Die erzeugten figure-protocol-7 Spezies werden aus der Absorption bei 560 nm nachgewiesen.

6. Statistische Auswertung

  1. Drücken Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) von drei unabhängigen Tests aus.
  2. Wenden Sie einen homoskedastischen Zweistichproben-t-Test an, um zu beurteilen, ob zwei Messungen unterschiedlich sind. p-Werte < 0,05 gelten als statistisch signifikant.

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Ergebnisse

Einfluss der Lichtwellenlänge auf FMN
Die Absorptionsspektren von 0,1 mM FMN, die mit blauen, grünen, roten und violetten LEDs bestrahlt werden, sind in Abbildung 3 dargestellt. Es gibt zwei Peaks für FMN (372 nm und 444 nm) für die Dunkelkontrolle. Grünes und rotes Licht haben keine Wirkung, da Änderungen in den Spektren unbedeutend sind. Auf der anderen Seite ist die jeweilige Absorption von FMN bei 444 nm nach blauer und violetter Lichtbestrahlung bei 10 W/m2

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Diskussion

Ein Photosensibilisator erhöht die photochemische Reaktion chemischer Verbindungen, um ROS zu erzeugen. Pathogene Mikroorganismen können durch Lichtbestrahlung in Gegenwart von Photosensibilisatoren inaktiviert werden. Diese Studie bestimmt den aPDI von S. aureus aufgrund von ROS, das durch violette Lichtbestrahlung eines exogenen Photosensibilisators FMN erzeugt wird.

Wie in Abbildung 3 dargestellt, ist die Extinktion bei FMN bei 444 nm nach 5 Minuten Be...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Tak-Wah Wong und Herrn Zong-Jhe Hsieh für ihre Unterstützung bei den Experimenten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Blaue, grüne und rote LED-LeuchtenVita LED Technologies Co., Tainan, TaiwanDC 12 V 5050
DimethylsulfoxidSigma-Aldrich, St. Louis, MO190186
Infrarot-ThermometerRaytek Co. Santa Cruz, CAMT4
LB BouillonDifco Co., NJ
L-MethioninSigma-Aldrich, St. Louis, MO1.05707
NBTBio Basic, Inc. Markham, Ontario, Kanada
StromversorgungChina tech Co., New Taipei City, TaiwanYP30-3-2
Riboflavin 5′-phosphatSigma-Aldrich, St. Louis, MOR7774
RNaseNew England BioLabs, Inc. Ipswich, MA
SolarstromzählerTenmars Electronics Co., Taipeh, TaiwanTM-207
Staphylococcus aureus subsp. aureusBioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan10451
Optisches UV-Vis-SpektrometerOcean Optics, Dunedin, FLUSB4000
UV-Vis-SpektralphotometerHitachi High-Tech Science Corporation, Tokio, JapanU-2900
Violette LEDLong-hui Electronic Co., LTD, Dongguan, China

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