Methodenartikel

Imaging-geführter Bioreaktor zur Erzeugung von biotechnologisch hergestelltem Atemwegsgewebe

DOI:

10.3791/63544

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6. April 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Protokoll beschreibt einen bildgebenden Bioreaktor, der die selektive Entfernung des endogenen Epithels aus der Luftröhre der Ratten und die homogene Verteilung exogener Zellen auf der Lumenoberfläche ermöglicht, gefolgt von einer langfristigen In-vitro-Kultur des Zell-Gewebe-Konstrukts.

Zusammenfassung

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Wiederholte Verletzungen des Atemwegsgewebes können die Lungenfunktion beeinträchtigen und chronische Lungenerkrankungen wie chronisch obstruktive Lungenerkrankungen verursachen. Fortschritte in der regenerativen Medizin und Bioreaktortechnologien bieten Möglichkeiten, im Labor gezüchtete funktionelle Gewebe- und Organkonstrukte herzustellen, die zum Screening von Medikamenten, zum Modellieren von Krankheiten und zum Entwickeln von Gewebeersatz verwendet werden können. Hier wird ein miniaturisierter Bioreaktor in Verbindung mit einer Bildgebungsmodalität beschrieben, die eine In-situ-Visualisierung des inneren Lumens der explantierten Rattenluftröhre während der In-vitro-Gewebemanipulation und - kultur ermöglicht. Mit diesem Bioreaktor demonstriert das Protokoll die bildgebungsgeführte selektive Entfernung endogener zellulärer Komponenten unter Beibehaltung der intrinsischen biochemischen Eigenschaften und der Ultrastruktur der Atemwegsgewebematrix. Weiterhin werden die Abgabe, gleichmäßige Verteilung und anschließende verlängerte Kultur exogener Zellen auf dem dezellularisierten Atemwegslumen mit optischer Überwachung in situ gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass der bildgebende Bioreaktor potenziell verwendet werden kann, um die Bildung von funktionellem In-vitro-Atemwegsgewebe zu erleichtern.

Einleitung

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Die luminale Oberfläche der Atemwege ist von einer Epithelschicht ausgekleidet, die hauptsächlich aus mehrfach beritzelten, Keulen-, Kelch- und basalen Stammzellen besteht 1,2. Die Epithelschicht dient als primärer Abwehrmechanismus der Lunge und fungiert als biophysikalische Barriere, die das darunter liegende Atemwegsgewebe vor eingeatmeten Krankheitserregern, Partikeln oder chemischen Gasen schützt. Es schützt das Atemwegsgewebe durch mehrere Mechanismen, einschließlich interzellulärer Tight-Junction-Bildung, mukoziliärer Clearance und antimikrobieller und antioxidativer Sekretion....

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Protokoll

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Das folgende Tiergewebeprotokoll wurde von der Tierschutzrichtlinie und den Vorschriften des Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) am Stevens Institute of Technology genehmigt und entspricht den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) für die Verwendung von Versuchstieren.

1. Entwurf und Bau eines bildgebenden Trachea-Bioreaktors für Ratten

  1. Entwicklung und Herstellung von Ratten-Luftröhren-Bioreaktoren
    1. Erstellen Sie mithilfe der CAD-Generatorsoftware ein CAD-Modell (Computer Aided Design) der Bioreaktorkammer mit relevantem Design, z. B. Einlässen, Auslässen und Gewebekulturkammer....

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Ergebnisse

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Die auf der GRIN-Linse basierende In-situ-Bildgebungsmodalität kann die Visualisierung des inneren Lumens des Tracheals in situ ermöglichen (Abbildung 5A). Mit diesem bildgebenden Verfahren können sowohl Hellfeld- als auch Fluoreszenzbilder der nativen und entepithelialisierten Luftröhren erhalten werden (Abbildung 5B,C). Vor der CFSE-Markierung wurde kein fluoreszierendes Signal von der nativen Luftröhre beobachtet (

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Diskussion

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In dieser Arbeit haben wir einen bildgebungsgeführten Bioreaktor entwickelt, der (i) die Überwachung des Luftröhrenlumens in situ nach der Zellentfernung und exogenen Zellabgabe und (ii) die langfristige In-vitro-Kultur des zellgesäten Luftröhrengewebes ermöglichen kann. Mit diesem speziell angefertigten Bioreaktor demonstrierten wir (i) die selektive Entfernung der endogenen Epithelzellen aus dem Luftröhrenlumen unter Verwendung von Waschmittel und vibrationsunterstützter Atemwegswäsche und (ii) eine g.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde zum Teil vom Forschungsprogramm der American Thoracic Society Foundation, der New Jersey Health Foundation und der National Science Foundation (CAREER Award 2143620) an J.K. unterstützt. und die National Institutes of Health (P41 EB027062) an G.V.N.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1&mal; PBSGibco, Thermo Fisher Scientific10-010-031
3-Port-SteckverbinderWorld Precision Instruments14048-20
4-Port-SteckverbinderWorld Precision Instruments14047-10
BeschleunigungsmesserSTMicroelectronicsIIS3DWBTR
Achromatisches DublettThorlabsAC254-150-A-ML
Aluminium StiftstummelTED PELLA16111
Antibiotisch-antimykotischThermo Fisher Scientific15240062
MontagestangeThorlabsER1
RundkopfschraubenMcMaster-Carr91255A274
KäfigwürfelThorlabsC4W
Carbon doppelseitiges leitfähiges KlebebandTED PELLA16073
CFSE-BeschriftungskitAbcamab113853
Citrisolv (Clearingmittel)Decon1061
C-Mount-AdapterThorlabsSM1A9
Kollagen IAdvanced BioMatrix5153
Leitfähige flüssige SilberfarbeTED PELLA16034
Siegroitischer SpiegelSemrockDI03-R488Wellenlängen des reflektierten Lasers:  473,0 +- 2 nm 488,0 +3/-2 nm
Dulbeccos modifizierter Eagle' s mediumGibco, Thermo Fisher Scientific11965118
Adapter für weibliches Luer-Schott auf SchlauchtülleCole-ParmerEW-45501-30
Luer-Buchse auf SchlauchtülleCole-ParmerEW-45508-03
Luer-Buchse auf männlichen Luer-AnschlussCole-ParmerZY-45508-80
Fötales RinderserumGibco, Thermo Fisher Scientific10082147
FilterobjektivChroma Technology CorpET535/50m
FluoreszenzmikroskopNikonEclipse E1000 - D
Fusion 360Autodesk
SechskantmutterMcMaster-Carr91813A160
Hexamethyldisilazan (HMDS)Fisher ScientifcAC120585000
Imaging FaserSELFOC, NSG GruppeGRIN-Objektiv
LaserOpto EngineMDL-D-488-150mW
LinsentubenThorlabsSM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)Thermo Fisher ScientificL3224
MACH 3 CNC-SteuerungssoftwareNeumodische Lösungen
ObjektivOlympusUCPLFLN20X
Peristaltische PumpeCole ParmerL/S Standard digitales Pumpensystem
Rekombinantes menschliches FGF-basicPeproTech100-18B
SicherungsringThorlabsSM1RR
Scientific CMOS KameraPCO PandaPCO Panda 4.2
NatriumdodecylsulfatVWR97064-472
Solidworks ( 2019)Dassault Systè mes
Stapelbarer LinsentubusThorlabsSM1L10
Subwoofer-PlattenverstärkerDayton AudioSPA250DSP
Subwoofer-LautsprecherDayton AudioRSS21OHO-4Membrandurchmesser: 21 cm
SpritzenpumpeWorld Precision InstrumentsAL-4000
Käfigplatte mit GewindeThorlabsCP33
Luer-Adapter mit GewindeCole-ParmerEW-45513-81
RohrlinseThorlabsAC254-150-A-ML
Tygon SchlauchCole-Parmer13-200-110
XY TranslatorThorlabsCXY1

Referenzen

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  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of N....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Regeneration von AtemwegsgewebeIn situ BildgebungDezellularisierung der Tracheamesenchymale StammzellenZell Hydrogel ApplikationFluoreszenzmikroskopieKrankheitsmodellierungTissue Engineering

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