Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63554
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1, 1
1Centre for Host-Microbiome Interactions, King’s College London, 2Wellcome Trust Cell Therapies and Regenerative Medicine Ph.D. Programme, King’s College London, 3Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, Cambridge University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות לביסוס אורגנואידים של המעי הדק של מורין, בידוד תאי לימפואידים מולדים מסוג 1 מהלמינה פרופריה של המעי הדק מורין, והקמת תרביות משותפות תלת-ממדיות (3D) בין שני סוגי התאים כדי לחקור אינטראקציות דו-כיווניות בין תאי אפיתל במעי לבין תאי לימפואידים מולדים מסוג 1.

Abstract

תרביות משותפות מורכבות של אורגנואידים עם תאי מערכת החיסון מספקות כלי רב-תכליתי לחקירת האינטראקציות הדו-כיווניות העומדות בבסיס האיזון העדין של הומאוסטזיס הרירי. מערכות תלת-ממדיות ורב-תאיות אלה מציעות מודל רדוקציוניסטי לטיפול במחלות רב-גורמיות ולפתרון קשיים טכניים המתעוררים בעת חקר סוגי תאים נדירים כגון תאי לימפה מולדים (ILCs) המתגוררים ברקמות. מאמר זה מתאר מערכת מורין המשלבת אורגנואידים של המעי הדק ו-ILCs מסוג 1 (ILC1s) שמקורם במעי הדק, אשר ניתן להרחיבם בקלות לאוכלוסיות ILC או חיסוניות אחרות. ILCs הם אוכלוסייה תושבת רקמות אשר מועשרת במיוחד ברירית, שם הם מקדמים הומאוסטזיס ומגיבים במהירות לנזק או לזיהום. תרביות אורגנואידיות משותפות עם ILCs כבר החלו לשפוך אור על מודולי איתות חדשים של אפיתל-חיסון במעיים, וחשפו כיצד תת-קבוצות ILC שונות משפיעות על שלמות והתחדשות מחסום אפיתל במעיים. פרוטוקול זה יאפשר חקירות נוספות של אינטראקציות הדדיות בין אפיתל לתאי מערכת החיסון, אשר טומנות בחובן פוטנציאל לספק תובנות חדשות על המנגנונים של הומאוסטזיס ודלקת רירית.

Introduction

התקשורת בין אפיתל המעיים לבין מערכת החיסון של המעיים היא מרכזית בשמירה על הומאוסטזיס של המעיים1. שיבושים באינטראקציות אלה קשורים למחלות מקומיות ומערכתיות כאחד, כולל מחלות מעי דלקתיות (IBD) וסרטן במערכת העיכול2. דוגמה בולטת לרגולטור ביקורתי נוסף של הומאוסטזיס שתואר לאחרונה מגיעה ממחקר של תאי לימפה מולדים (ILCs), שהתגלו כשחקני מפתח בנוף החיסוני במעיים3. ILCs הם קבוצה של תאי חיסון מולדים הטרוגניים המווסתים הומאוסטזיס במעיים ומתזמרים דלקת בעיקר באמצעות איתות בתיווך ציטוקינים4.

ה-ILC של מורין מחולקים באופן נרחב לתת-סוגים המבוססים על פרופילי ביטוי של גורם שעתוק, קולטן וציטוקינים5. ILCs מסוג 1, הכוללים תאי הרג טבעי ציטוטוקסיים (NK) ו-ILCs דמויי עוזר מסוג 1 (ILC1s), מוגדרים על ידי ביטוי של גורם השעתוק (eomesodermin) Eomes וחלבון T-box המבוטא בתאי T (T-bet)6, בהתאמה, וציטוקינים מפרישים הקשורים לחסינות מסוג T עוזר סוג-1 (TH1): אינטרפרון-γ (IFNγ) וגורם נמק הגידול (TNF), בתגובה לאינטרלוקין (IL)-12, IL-15 ו- IL-187. במהלך הומאוסטזיס, ILC1s תושבי רקמות מפרישים β גורם גדילה משתנה (TGF-β) כדי להניע התפשטות אפיתל ושיפוץ מטריצה8. ILCs מסוג 2 (ILC2s) מגיבים בעיקר לזיהום הלמינת באמצעות הפרשה של ציטוקינים הקשורים ל-T helper Type-2 (TH2): IL-4, IL-5 ו-IL-13, והם מאופיינים בביטוי של קולטן יתום הקשור לחומצה רטינואית (ROR) α (ROR-α)9 וחלבון קושר GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . בעכברים, תאי ILC2 "דלקתיים" במעיים מאופיינים גם בביטוי של קולטן דמוי לקטין של תאי Killer (תת-משפחה של חבר G 1, KLRG)13 שבו הם מגיבים לתאי אפיתל שמקורם ב-IL-2514,15. לבסוף, ILC מסוג 3, הכוללים תאים משרי רקמות לימפואידיות ו-ILCs דמויי עוזר מסוג 3 (ILC3s), תלויים בפקטור השעתוק ROR-γt16, ומתקבצים לקבוצות המפרישות גורם מגרה מושבה מקרופאג' גרנולוציטים (GM-CSF), IL-17 או IL-22 בתגובה לאותות IL-1β ו-IL-23 מקומיים17. תאים משרי רקמות לימפואידיות מתקבצים במדבקות של פייר והם חיוניים להתפתחותם של איברים לימפואידיים משניים אלה במהלך התפתחות18, בעוד ש- ILC3s הם תת-הסוג הנפוץ ביותר של ILC במעי הדק של מורין בוגר למינה פרופריה. אחת ממערכות התרבית המשותפת האורגנואידית המוקדמות ביותר במעי מורין עם ILC3s נרתמה כדי להקניט את ההשפעה של הציטוקינים IL-22 על מתמר האותות והמפעיל של שעתוק 3 (STAT-3) בתיווך Leucine-Rich Repeat המכיל קולטן מצומד לחלבון G 5 (Lgr5)+ התפשטות תאי גזעבמעיים 19, דוגמה רבת עוצמה לאינטראקציה רגנרטיבית של ILC-אפיתל. תאי ILCs מפגינים הטרוגניות חותם-הטרוגניות בין איברים20,21 ומפגינים פלסטיות בין תת-קבוצות בתגובה לקיטוב ציטוקינים22. מה שמניע את ההטבעות הספציפיות לרקמות ואת הבדלי הפלסטיות האלה, ואיזה תפקיד הם ממלאים במחלות כרוניות כמו IBD23, נותרו נושאים מרגשים שניתן לטפל בהם באמצעות תרביות אורגנואידיות משותפות.

אורגנואידים במעיים התגלו כמודל מוצלח ואמין לחקר אפיתל המעי24,25. אלה נוצרים על ידי culturing אפיתל מעיים Lgr5+ תאי גזע, או קריפטות מבודדות שלמות, הכוללות תאי Paneth כמקור אנדוגני של Wnt Family Member 3A (Wnt3a). מבנים תלת-ממדיים אלה מתוחזקים בהידרוג'לים סינתטיים26 או בביו-חומרים המחקים את הלמינה פרופריה הבסיסית, למשל, מטריצה חוץ-תאית בסיסית (TBEM) צולבת תרמית,ויש להם תוספת נוספת לגורמי גדילה המחקים את הנישה הסובבת אותה, ובראשם גורם הגדילה האפיתליאלי (EGF), מעכב החלבון המורפוגנטי של העצם (BMP) נוג'ין, ו-Lgr5-ליגנד ו-Wnt-אגוניסט R-Spondin127 . בתנאים אלה, האורגנואידים שומרים על קוטביות אפיתל אפיתליאלית אפיתלית אפיתלית-בסיסית ומשחזרים את מבנה הקריפטה-וילי של אפיתל המעי עם קריפטות של תאי גזע ניצנים המתמיינים באופן סופני לתאים מחסלים ומפרישים במרכז האורגנואיד, אשר לאחר מכן משילים לתוך הפסאודולומן הפנימי על ידי אנוכיס28. אף על פי שאורגנואידים במעיים לבדם זכו ליתרון עצום כמודלים רדוקציוניסטיים של התפתחות אפיתל ודינמיקה בבידוד29,30, הם טומנים בחובם פוטנציאל עתידי עצום להבנת האופן שבו התנהגויות אלה מווסתות, מושפעות או אפילו מופרעות על ידי תא החיסון.

בפרוטוקול הבא מתוארת שיטה של תרבית משותפת בין אורגנואידים במעיים קטנים של מורין לבין ILC1s שמקורם בלמינה פרופריה, אשר שימשה לאחרונה כדי לזהות כיצד אוכלוסייה זו מפחיתה באופן בלתי צפוי את חתימות המעיים של דלקת ובמקום זאת תורמת להתרבות אפיתל מוגברת באמצעות TGF-β במערכת זו8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

יש להשלים את כל הניסויים בהתאם להנחיות הרגולטוריות והמוסדיות הרלוונטיות לשימוש בבעלי חיים ולעמוד בהן. האישור האתי למחקר המתואר במאמר ובסרטון שלהלן נרכש בהתאם ובהתאם לכל ההנחיות הרגולטוריות והמוסדיות הרלוונטיות לשימוש בבעלי חיים.

כל העכברים נלכדו על ידי נקע צוואר הרחם על פי הנוהל האתי הסטנדרטי, שנערך על ידי אנשים מאומנים. לפני קצירת איברים ורקמות, חיתוך עורק הירך או עריפת ראשים נערך (בהתאם לפרוטוקול ביד) כהערכות מאשרות של המוות. בעלי חיים שוכנו בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים (אלא אם כן צוין אחרת) ביחידה מסחרית מוכרת וביחידת בעלי חיים בקינגס קולג ' בלונדון בהתאם לחוק החיות הבריטי (נהלים מדעיים) 1986 (רישיון פרויקט משרד הפנים בבריטניה (PPL:70/7869 עד ספטמבר 2018; P9720273E מספטמבר 2018).

1. הקמת אורגנואידים במעיים קטנים של מורין

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מתאר את הדור של אורגנואידים במעי המעי הדק של מורין. קריפטות מבודדות תחילה מרקמות, עוברות החייאה ב-TBEM, ולאחר מכן מודגרות במדיה המכילה EGF, Noggin ו-R-Spondin (ENR). הקמת אורגנואידים במעיים קטנים של מורין תוארה היטב גם במקומות אחרים 24,25,27.

  1. הניחו את TBEM על קרח כדי להפשיר (40 μL/well) והניחו תרבית רקמה סטנדרטית שטופלה (מתייחסת לצלחות עם משטח הידרופילי וטעון שלילי) צלחת 24 בארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס לחימום מוקדם.
    הערה: 500 μL של TBEM יפשיר בערך 2-4 שעות; אל תשאירו אותו בטמפרטורת החדר.
  2. הכן ~ 4 מ"ל או 550 מ"ל לבאר של מדיום ENR על ידי הוספת EGF, Noggin ו- R-Spondin למדיום הבסיסי (טבלה 1) והצב בחממה של 37 °C.
  3. יש ללקות חיה בת 6-12 שבועות ולנתח את המעי הדק באמצעות מלקחיים ומספריים זעירים. מניחים אותו ב-15 מ"ל של מלח בעל מאגר פוספט (PBS) על קרח.
  4. באמצעות הקיבה והקקום כנקודות אוריינטציה, לבודד את האזור הרצוי של המעי הדק (תריסריון, ג'ג'ונום או איליאום). בפרוטוקול זה, האילאום מבודד.
  5. להטביע את המעי ב- PBS על צלחת פטרי 10 ס"מ2 על קרח. באמצעות מלקחיים, להסיר שומן בעדינות, אבל לגמרי, מן המעי.
  6. חותכים את הרקמה לאורך באמצעות מספריים מיקרודיסקציה (רצוי עם קצוות מעוגלים כדי למנוע ניקוב). שמירה על המעי שקוע ב- PBS, לנער כדי להסיר חומר צואה, ולשמור על הצד הרירי למעלה כדי לעקוב אחר כיוון הרקמה.
  7. מעבירים את הרקמה למכסה היבש של צלחת פטרי על קרח, ומניחים את הריריות/ווילוס של המעי כלפי מעלה. מחזיקים קצה אחד של המעי עם מלקחיים, מגרדים בעדינות את הריר באמצעות הקצה הזוויתי של מגלשת זכוכית נקייה.
  8. מלאו את הצלחת ב-PBS קר כקרח ושטפו את הרקמה.
  9. ציפו מראש צינור של 50 מ"ל עם PBS2 (PBS + 2% FCS; ראו טבלה 1) כדי למנוע הידבקות של הרקמה לפלסטיק ולהוסיף 10 מ"ל של PBS קר כקרח לצינור זה. חותכים את המעי למקטעים דקים (כ-2 מ"מ) ומעבירים אותם לצינור ה-50 מ"ל המצופה מראש ב-PBS2.
  10. באמצעות פיפטה של 25 מ"ל המצופה מראש ב-PBS2, פיפטה את המקטעים למעלה ולמטה 5-10 פעמים כדי לנקות את שברי הרקמה.
  11. אפשרו למקטעים להסתפק ב-15-30 שניות, הסירו והשליכו את ה-PBS supernatant, וחזור על שלבים 1.10 ו-1.11 עד שהפתרון יהיה ברור (בערך 3-4 פעמים).
  12. אפשרו למקטעים להתיישב ולהשליך את ה-PBS supernatant. הוסף 30 מ"ל של מאגר בידוד קריפטה קר כקרח (טבלה 1).
  13. הניחו את הצינורות על רולר אופקי או נדנדה ב-30-60 סל"ד (או עדין) למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. אל תדגרו במהירויות גבוהות יותר, בטמפרטורות גבוהות יותר או במשך זמן ארוך יותר, שכן הקריפטות יתפרקו בטרם עת ויהפכו לתאים בודדים עם כדאיות ותפוקה נמוכות יותר.
    הערה: משלב זה ואילך, כל ההליכים צריכים להתבצע בסביבה אספטית באמצעות חומרים וריאגנטים סטריליים.
  14. אפשר למקטעי מעיים להתיישב בבסיס צינור 50 מ"ל. הסר את מאגר בידוד הקריפטה מבלי לשבש את המקטעים המיושבים ולהעביר אותו לצינור 50 מ"ל על קרח.
    הערה: אם תהליך הבידוד של הקריפטה היה קפדני מדי, ניתן לראות קריפטות בשבר זה. לכן ניתן לשמור אותו כרזרבה אך יושלך באופן אופטימלי בסוף הפרוטוקול.
  15. הוסיפו 20 מ"ל של PBS קר כקרח למקטעי מעיים. באמצעות פיפטה 25 מ"ל מצופה מראש ב-PBS2, פיפטה מקטעי מעיים עולים ויורדים 5-8 פעמים.
  16. תן לקטעים להסתפק ב -30 שניות. ציפו מראש צינור 50 מ"ל ו-25 מ"ל פיפטה עם PBS2. באמצעות פיפטה זו, אספו את הסופרנטנט (שבריר 1) לתוך צינור ה-50 מ"ל המצופה מראש והניחו את הצינור על הקרח.
    הערה: שבר זה משמש לשטיפת מאגר הבידוד הנותר של הקריפטה. עם זאת, הוא משמש גם כשלב בקרת איכות נוסף; אם הצינורות היו נמרצים מדי, קריפטות יהיו בשפע בשבר השטיפה הזה, ואם הוא היה עדין מדי, יהיה מעט מאוד פסולת בחלק זה. באופן אופטימלי, שבר 1 מושלך בסוף הפרוטוקול, אך ניתן להשתמש בו כדי ליצור אורגנואידים אם מתעוררות בעיות עם שברים 2-4 המתקבלים להלן.
  17. חזרו על שלבים 1.15 ו-1.16 אך הוסיפו 10 מ"ל של PBS קר כקרח במקום 20 מ"ל והניחו את הסופרנט בצינור טרי של 50 מ"ל המצופה מראש ב-PBS2 (שבר 2).
  18. חזור על שלב 1.17 פעמיים נוספות אך אסוף את הסופרנאטנט שנוצר עם שבר 2 (לתוך אותו צינור של 50 מ"ל משלב 1.17) כדי לקבל שברים 2-4. צינור יחיד זה של 50 מ"ל אמור להכיל את הקריפטות המנותקות ב-30 מ"ל של PBS קר כקרח.
  19. מוציאים 50 μL aliquot מתוך 2-4 השברים המרוכזים ומניחים אותו על מכסה. הערך את נוכחותן של קריפטות אפיתל באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך.
    הערה: אם קריפטות אינן קיימות, חזור על שלבים 1.17 ו- 1.18 תוך שימוש בכוח רב יותר במהלך צנרת עד לשחרור קריפטות. ודא שהקריפטות לא נפרקו בטרם עת במאגר הבידוד של הקריפטה משלב 1.14 או בחלק 1 משלב 1.16.
  20. ציפו מראש מסננת של 100 מיקרומטר וצינור 50 מ"ל ב-PBS2. מעבירים את שברי הקריפטה במאגר דרך מסננת זו אל תוך הצינור המצופה מראש של 50 מ"ל.
  21. סובב כלפי מטה שברים מתוחים של קריפטה ב-300 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  22. יש להשליך את הסופרנטנט ולהחיות את הקריפטות ב-10 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם קר כקרח. העבר את הקריפטות לצינור של 15 מ"ל.
  23. סובבו את הקריפטות בטמפרטורה של 210 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר תאים בודדים ולימפוציטים.
  24. קריפטות Resuspend ב-1 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם קר כקרח.
  25. מוציאים אליקו 10 μL ומניחים אותו על מכסה. באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך, ספרו את מספר הקריפטות כדי לקבוע את ריכוז הקריפטה.
  26. חשב את אמצעי האחסון הנדרש עבור ~ 400 ו ~ 1,500 קריפטות. ציפו מראש קצה p1000 עם PBS2 והשתמשו בקצה זה כדי לטפטף את הנפחים הנדרשים (המכילים כ-400 ו-1,500 קריפטות) לצינורות נפרדים של 1.5 מ"ל.
  27. סובב את הקריפטות ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  28. הסר כמה שיותר סופרנטנט, ולאחר מכן שחזר את הקריפטות ב-80 μL של TBEM המונחות על קרח (קצוות פיפטה טרום-מגניבים ב-4 °C (4 °F) כדי למנוע ג'לציה של מטריצה, המתרחשת ב-12 °C (64 °F).
  29. הסר את צלחת 24 הבאר, הממוקמת בשלב 1.1, מהאינקובטור. פיפט בעדינות 40 μL של קריפטות למרכז באר בתנועה איטית ומעגלית כדי ליצור מבנה כיפה שטוח אך תלת-ממדי, או לתוך שלוש כיפות קטנות נפרדות.
    הערה: הכדאיות של האורגנואידים היא הנמוכה ביותר במרכז הכיפה שבה חומרי מזון וגזים מחלחלים בצורה פחות יעילה31; לפיכך, מקסום שטח הפנים החשוף למדיה תוך שמירה על מבנים תלת-ממדיים ברורים הוא קריטי.
  30. חזור על שלב 1.29 כדי ליצור בסך הכל שתי בארות עם צפיפות של ~ 200 קריפטות לכל באר ושתי בארות נוספות עם צפיפות של ~ 750 קריפטות לכל באר. הניחו ישירות את הצלחת באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2) למשך 15-20 דקות, תוך הקפדה שלא לשבש את כיפות המטריצה הצמיגיות אך עדיין נוזליות.
  31. הוסף 550 μL של מדיית ENR שחוממה מראש לבאר (משלב 1.2) ודגירה למשך 24 שעות ב- 37 ° C ו- 5% CO2. בשלב זה, מוצע להשלים את מדיום ENR עם 5 μM של אגוניסט Wnt (CHIR 99021) ומעכב 5 μM Rho Kinase (Y-27632) עבור 24 השעות הראשונות של התרבית לאחר הבידוד כדי לשפר את התשואה והיעילות של יצירת אורגנואידים של קריפטות שבודדו זה עתה מרקמה.
    הערה: קריפטות צריכות להיסגר וליצור מבנים מעוגלים תוך 24 שעות, וניצני קריפטה אמורים להופיע תוך 2-4 ימים (איור 1A).
  32. החלף עם מדיום ENR טרי בסוף הדגירה בשלב 1.31, ולאחר מכן כל ~ 2 ימים או כאשר מחוון ה- pH של פנול במדיום התרבית הופך לכתום חיוור אך לפני שהוא הופך לצהוב.

2. תחזוקה של אורגנואידים במעיים קטנים של מורין

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מתאר את התחזוקה וההעברה של אורגנואידים של מעיים קטנים של מורין. האורגנואידים נקטפים תחילה, ולאחר מכן משבשים אותם מכנית באמצעות קצה p1000 כפוף. תהליך זה שובר אורגנואידים גדולים המורכבים מקריפטות רבות למספר שברים קטנים יותר לצורך התפשטות ומשחרר תאים מתים שהצטברו בפסאודולומן. תחזוקה של אורגנואידים במעי הדק מורין תוארה היטב גם במקומות אחרים 24,25,27. כל ההליכים צריכים להתבצע בסביבה אספטית באמצעות חומרים סטריליים וריאגנטים. מעבר או הרחבה של אורגנואידים אחת ל-4-5 ימים, לפני שהתפוצצות האורגנואידים מתרחשת מהצטברות משמעותית של פסולת בלומן האורגנואידי. ניתן להעביר אורגנואידים ביחס של 1:2-1:3 בהתאם לצפיפות האורגנואידים, שתהיה אופטימלית בין 100-200 אורגנואידים לבאר.

  1. כמו בשלבים 1.1 ו-1.2, להפשיר TBEM על קרח (40 μL/well) ולהכין מדיום ENR (550 μL לבאר). מקם את תרבית הרקמה הבינונית והסטנדרטית שטופלה בצלחת 24-well באינקובטור של 37 °C ( 37 °C ).
  2. הסר את הצלחת המכילה אורגנואידים מהאינקובטור. השליכו את התקשורת מהבאר כדי לעבור.
  3. הוסף 500 μL של DMEM/F12 מתקדם קר כקרח לבאר. באמצעות קצה p1000 (מצופה מראש במדיה כדי למנוע הידבקות של אורגנואידים לפנים הקצה), קוצרים את האורגנואידים לצינור של 15 מ"ל.
  4. שטפו את תחתית הבאר עם 250-300 μL של DMEM/F12 מתקדם קר כקרח כדי להבטיח שלא יישארו אורגנואידים בבאר, והצטברו לצינור 15 מ"ל המכיל אורגנואידים שנקטפו משלב 2.3. חזור על שלבים 2.3 ו- 2.4 בעת מעבר בארות מרובות ואגד את האורגנואידים מבארות מרובות לתוך אותו צינור 15 מ"ל.
  5. סובבו את האורגנואידים כלפי מטה ב-300 x גרם למשך 3 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  6. לאחר הצנטריפוגה, ודא שישנם ארבעה שברים נראים לעין: שבר בסיס עם אורגנואידים בריאים, שבר מטריצה מרכזי וברור, שבר מטריצה המכיל תאים בודדים ומתים, ושכבה סופרנאטנטית עליונה המכילה תאים בודדים ומתים. הסר את הסופרנאטנט, את שבר הפסולת וכמה שיותר מקטע המטריצה השקוף מבלי לשבש את כדור האורגנואידים.
  7. כופפו בעדינות את קצה קצה הפיפטה p1000 (בערך 2-5 מ"מ עיקול). ציפו מראש את הטיפ הזה ב-PBS2 או ב-DMEM/F12 מתקדם. באמצעות קצה זה, פיפט את האורגנואידים למעלה ולמטה 10-20 פעמים כדי לשבש באופן מכני את האורגנואידים ואת המטריצה הנותרת.
  8. סובב למטה ב 210 x g במשך 3 דקות ב 4 °C (64 °F).
  9. כמו בשלב 2.6, הסר את הסופרנטנט, את שבר הפסולת וכמה שיותר מקטע המטריצה השקוף מבלי לשבש את הכדור של קריפטות מנותקות. אם קריפטות בריאות או אורגנואידים קטנים לא יצרו גלולה ברורה, צנטריפוגה שוב ב 300 x g במשך 3 דקות ב 4 °C (64 °F).
  10. חשב את הנפח הנדרש של TBEM (80-120 μL לכל באר של אורגנואידים שנקטפו, תלוי אם נעשה שימוש ביחס מעבר של 1:2 או 1:3).
  11. בצעו החייאה של הכדור בנפח המחושב של TBEM והחלו 40 μL לכל באר על לוחית 24 הבאר שחוממה מראש כדי ליצור כיפה. הניחו ישירות את הצלחת באינקובטור (37 מעלות צלזיוס; 5% CO2) למשך 15-20 דקות.
  12. הוסף 550 μL של מדיום ENR לכל באר ודגירה ב 37 °C ו 5% CO2. בדוק תרביות להיווצרות אורגנואידים לאחר 24 שעות. החלף במדיום ENR טרי כל 2-3 ימים לאחר המעבר.

3. בידוד של תאי לימפה מולדים של למינה פרופריה במעי הדק

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מתאר את הבידוד של ILC1 מהמעי הדק מורין למינה פרופריה של עכברי הכתב RORγtGFP. זה כולל הסרת תאי אפיתל, עיכול רקמות, הפרדת שיפוע צפיפות של לימפוציטים ובידוד ILC1 באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS). בידוד FACS בעקבות אסטרטגיית ההדבקה באיור 2 דורש את מאסטרמיקס הכתם החוץ-תאי (טבלה 4), כאשר פקדי ההכתמה הנוספים המתוארים בטבלה 2 ובטבלה 3 עבור המכונה (טבלה 2) והגידור (טבלה 3) מוגדרים. עכברי הכתבים RORγtGFP משמשים לבידוד ILC1 חי וטהור ולשער את RORγtGFP+ ILC3. עיבוד רקמות לבידוד לימפוציטים של למינה פרופריה תואר היטב גם במקום אחר32.

  1. עיבוד רקמות
    הערה: רקמה משכפולים של בעלי חיים ביולוגיים בודדים נשמרת בנפרד בפרוטוקול זה. דגימות אלה צריכות להיות מסומנות כראוי ולהישמר על קרח במידת האפשר. יש לאפשר לכל הריאגנטים למעט אנזימי עיכול להגיע לטמפרטורת החדר כדי להבטיח עיכול מהיר של הרקמות.
    1. הניחו את TBEM על קרח כדי להפשיר (40 μL/well). שמור על צלחת סטנדרטית שטופלה בתרבית רקמה 24 בארות באינקובטור של 37 °C כדי להתחמם מראש.
    2. הכינו מאגר להסרת אפיתל טרי ובמאגר עיכול (ראו טבלה 1). הכן מדיום שיפוע צפיפות צמיגות נמוכה איזוטונית (LVDGM) (90% LVDGM ו- 10% 10x PBS), 40% LVDGM איזוטוני ו- 80% LVDGM איזוטוני במאגר נטרול (טבלה 1).
    3. יש לגדל חיה בת 6-12 שבועות, לנתח את המעי הדק באמצעות מלקחיים ומספריים זעירים, ולהניח את המעי ב-15 מ"ל של PBS על קרח.
    4. טבלו את המעי ב-PBS על צלחת פטרי בגודל 10 ס"מ2 על קרח והשתמשו במלקחיים כדי להסיר שומן בעדינות אך לחלוטין מהמעי.
    5. הסירו את המדבקות של פייר (כ-5-10; רצות בשורה הפוכה לקו רקמת השומן) באמצעות מספריים של מיקרו-דיסקציה כדי לרוקן תאים משרי רקמות לימפואידיות ותאי B.
      הערה: המדבקות של פייר נעדרות ב-Rag-/- ובבעלי חיים אחרים מדולדלים משושלת. בניגוד לבועות אוויר, הכתמים של פייר יישארו במקומם אם יזוזו.
    6. חותכים את הרקמה לאורך באמצעות מספריים מיקרודיסקציה (רצוי עם קצוות מעוגלים כדי למנוע ניקוב). שמירה על המעי שקוע ב- PBS, לנער כדי להסיר חומר צואה.
    7. חותכים את הרקמה לחתיכות באורך 2-4 ס"מ ומעבירים אותן לצינור של 50 מ"ל.
    8. הוסיפו כ-20-40 מ"ל של PBS קר כקרח ורעדו במרץ במשך 5-15 שניות כדי להסיר ריריות ופסולת.
    9. השליכו את תכולת הצינור לצלחת פטרי טרייה והחליפו את שברי המעיים לאותו צינור 50 מ"ל באמצעות מלקחיים.
    10. חזור על שלבים 3.1.8 ו- 3.1.9 3-4 פעמים, או עד שה- PBS ברור.
  2. הסרת אפיתל
    1. מניחים את שברי המעיים לתוך צלחת פטרי טרייה על קרח. באמצעות מלקחיים, להרים מקטעי מעיים ולהסיר עודפי נוזלים על ידי הקשה על משטח יבש.
    2. חותכים את הרקמה לחתיכות של כ-0.75-1 ס"מ ומעבירים אותן לצינור טרי של 50 מ"ל. הוסף 5-7 מ"ל של מאגר להסרת אפיתל (טבלה 1). סובבו את הצינור וודאו שכל מקטעי המעיים שקועים במאגר.
    3. דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם נדנדה (100-150 סל"ד) למשך 12-15 דקות. מערבולת הצינור במשך 20-30 שניות.
    4. חזור על שלבים 3.2.1-3.2.3 פעם נוספת, תוך השלכת הסופרנטנט המעונן (השבר מכיל אפיתל ותאי תוך-אפיתל) והחלפתו במאגר הסרת אפיתל טרי.
  3. עיכול הרקמה
    1. הוסיפו את תכולתכם לצלחת פטרי טרייה. באמצעות מלקחיים, להרים את קטעי המעיים ולהקיש על משטח יבש כדי להשליך עודפי נוזלים. מכניסים את הקטעים לצלחת פטרי טרייה על קרח.
    2. קבץ את הקטעים למרכז צלחת הפטרי למסה צפופה. באמצעות שני אזמלים או מספריים חדים, גורסים דק את הרקמה עד שהיא מגיעה למרקם צמיג שיכול לעבור דרך קצה פיפטה p1000.
    3. באמצעות פינצטה, מכניסים את הרקמה הטחונה לצינור נקי של 50 מ"ל. שטפו את צלחת הפטרי ב-1-2 מ"ל של מאגר עיכול (טבלה 1) כדי לאסוף את כל הרקמה שנותרה ולאגד אותה לתוך צינור ה-50 מ"ל עם הרקמה הגרוסה.
    4. מוסיפים 5-7 מ"ל של חיץ עיכול לרקמה הגרוסה ומוודאים שכל הרקמה נאספת בתחתית הצינור.
    5. דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם נדנדה בינונית (כ-100-150 סל"ד) למשך 15 דקות. מערבולת את הצינור במשך 20-30 שניות כל 5 דקות כדי לסייע לעיכול.
    6. בזמן שהדגימות דוגרות, הניחו מסננת של 40 מיקרומטר על גבי צינור טרי של 50 מ"ל לכל דגימה. ציפו את המסננים ב-1-2 מ"ל של מאגר מנטרל (טבלה 1).
    7. מערבולת הדגימות במשך 20-30 שניות לאחר שהדגירה הסתיימה.
    8. סנן את הרקמה המעוכלת חלקית דרך מסנן ה-40 מיקרומטר המצופה לתוך צינור ה-50 מ"ל המכיל מאגר מנטרל.
    9. השתמשו בפינצטה כדי לאסוף רקמה לא מעוכלת מהמסנן של 40 מיקרומטר ולהחזיר אותה לצינור ה-50 מ"ל שבו בוצע העיכול, לסיבוב השני של העיכול. הסר את המסננים ושטפו אותם עם מאגר עיכול כדי לעקור כל רקמה לא מעוכלת הדבקה במסנן.
    10. לאחר שכמה שיותר רקמות לא מעוכלות הוסרו מהמסנן והוכנסו בחזרה לצינור ה-50 מ"ל שבו בוצע העיכול, שטפו את המסנן עם חיץ מנטרל של 1-2 מ"ל מעל צינור ה-50 מ"ל שהכיל את הסופרנאטנט המסונן.
    11. הוסיפו 20-25 מ"ל של חיץ מנטרל לסופרנט המסונן והניחו אותו על קרח כדי לשמור על הכדאיות של תאים מבודדים במהלך הסיבוב השני של עיכול הרקמות.
    12. הוסף עוד 5-10 מ"ל של חיץ עיכול לרקמה הלא מעוכלת וחזור על שלבים 3.3.5-3.3.10, תוך הקפדה לסנן את הרקמה המעוכלת לאותו צינור כפי שנעשה בו שימוש בשלב 3.3.8 (ניתן גם לעשות שימוש חוזר באותו מסנן). יש לשטוף את המסנן עם מאגר נטרול עד להגעה לקו של 50 מ"ל, ולאחר מכן להשליך את כל הרקמה שנותרה לא מעוכלת.
  4. בידוד לימפוציטים על ידי שיפוע צפיפות
    1. סובבו את הסופרנאטים שנאספו עבור כל שכפול ביולוגי ב-500 x גרם למשך 10 דקות.
    2. במהלך שלב 3.4.1, הוסף 5 מ"ל של 80% LVDGM איזוטוני לצינור 15 מ"ל עבור כל שכפול ביולוגי.
    3. לאחר צנטריפוגה, השליכו את הסופרנאטנט מהרקמה המסוננת והמעוכלת. בצעו החייאה של הכדור ב-10 מ"ל של 40% LVDGM איזוטוני, מה שמבטיח שהכדור הומוגני היטב, ולא נותרו נתחים גדולים.
    4. הגדרת עזר הפיפטה להגדרה האיטית ביותר שלה, הטה את צינור 15 מ"ל המכיל 80% LVDGM איזוטוני, ושכב בעדינות רבה את 10 מ"ל של תרחיף התא ב-40% LVDGM איזוטוני כדי להבטיח שהתרחפת התא לא תתערבב עם השבר של 80%.
      הערה: אם השברים צריכים אי פעם להתערבב בטעות, הפיצו במהירות לימפוציטים שהגיעו לשבר של 80% בין שני צינורות של 50 מ"ל מלאים ב-PBS, וצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-500 x גרם. לאחר מכן, השליכו את ה-supernatant, וחזור על שלבים 3.4.3-3.4.4.
    5. סובבו את הצינורות ב-900 x g ו-20 °C (20 °F), כאשר ההאצה והפירוק מוגדרים להגדרה הנמוכה ביותר כדי להבטיח שהשברים לא יופרעו. צנטריפוגה למשך 20 דקות (לא כולל זמן הפסקה).
      הערה: כל ההליכים משלב זה ואילך צריכים להתבצע במכסה תרבית רקמה אספטית באמצעות חומרים וריאגנטים סטריליים.
    6. ציפו מראש צינור 50 מ"ל לכל דגימה עם PBS2 והוסיפו 45 מ"ל של PBS קר כקרח.
    7. לאחר צנטריפוגה, הסר בעדינות את שכבת הפסולת העליונה מצינור 15 מ"ל. מצפים קצה p1000 עם PBS2 ומשתמשים בו כדי לאסוף את האינטרפאזה עמוסת הלימפוציטים בין שיפועים של 40%-80% לתוך צינור 50 מ"ל המכיל 45 מ"ל של PBS קר כקרח.
    8. סובב את הצינורות ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    9. יש להשליך את ה-supernatant ולהחזיר את הכדור ב-500 μL של מאגר FACS (PBS, 2% FCS, 0.5 mM EDTA ו-10 mM HEPES; ראו טבלה 1). ציפו מראש מסנן של 40 מיקרומטר עם מאגר FACS והשתמשו בו כדי לסנן את מתלה התא לצינור זרימה. שטפו את צינור ה-50 מ"ל עם תוספת של 500 μL של מאגר FACS וסננו לאותו צינור זרימה.
    10. הסר 10 μL aliquot מן 1 mL של תרחיף התא וכתוצאה מכך. ספרו את תפוקת הלימפוציטים באמצעות מונה תאים או המוציטומטר וחשבו את ריכוז התא עבור כל דגימה.
  5. הכנה לדוגמה למיון - צביעה חוץ-תאית
    הערה: הנוגדנים המשמשים ב-mastermix הכתם החוץ-תאי, כמו גם הריאגנטים להכנת צבע הכדאיות הניתן לתיקון ותמיסת בלוק Fc, משמשים בריכוזים המספיקים עד 5 x 106 תאים לכל 100 μL. יש להתאים את אמצעי האחסון בהתאם. כדי שהתגמול של מכונת FACS למיון ILC1, נדרשים בקרות בצבע יחיד עבור כל אחד מהפלואורופורים במאסטרמיקס הכתם החוץ-תאי. עבור הנוגדנים, ניתן להשתמש בחרוזי פיצוי המכילים אוכלוסיית חרוזים מקשרת נוגדנים חיובית ואוכלוסיית חרוזים לא מחייבת נוגדן שלילי. עבור הכדאיות האולטרה סגולה (UV) הניתנת לקיבוע של בקרת צבע יחיד, ניתן להשתמש בחרוזי פיצוי המכילים אוכלוסיות תגובתיות אמין (עבור אות חיובי) ולא תגובתיות (עבור אות שלילי). לא מומלץ להשתמש בתאים מתוך RORγtGFPעכברי כתבים עבור בקרת צבע צבע אחידה של הכדאיות הניתנת לתיקון UV, מכיוון שתאים אלה יכילו GFP+ אות.
    1. הסר aliquot קטן של ~ 10 μL מכל דגימה ואגד אותו לתוך צינור זרימה נפרד המכיל 250 μL של מאגר FACS. הניחו את הצינור על קרח. זה ישמש עבור השליטה הלא מוכתמת.
    2. הוסף 1 מ"ל של PBS לנפח הנותר בצינורות הדגימה. צנטריפוגה ב 300-400 x g במשך 3-5 דקות.
    3. הכן 200 μL של תמיסת צבע לכדאיות הניתנת לתיקון UV לכל מדגם. דילול צבע הכדאיות הניתן לתיקון UV (הועתק ב-DMSO בהתאם להוראות היצרן) 1:500 ב-PBS (או בהתאם להוראות היצרן).
    4. יש להשליך את הסופרנטנט ולהחיות את הדגימות ב-200 μL של תמיסת צבע הכדאיות הניתנת לתיקון UV. מערבולת הצינורות ואינקובצים בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
    5. הוסף 2 מ"ל של חיץ FACS לצינורות כדי להרוות את צבע הכדאיות הניתן לתיקון UV, מערבולת במשך 10 שניות, וצנטריפוגה של הצינורות ב 300-400 x g למשך 3-5 דקות ב 4 °C (6 °F). השליכו את ה-supernatant מהצינורות הצנטריפוגיים.
    6. הכן 200 μL של תמיסת בלוק Fc לכל מדגם (0.25 מ"ג /מ"ל של בלוק Fc במאגר FACS).
    7. הוסף 200 μL של תמיסת בלוק Fc לכל אחת מהדגימות משלב 3.5.5,5, מערבולת במשך 10 שניות, ודגירה בחושך בטמפרטורה של 4 °C (74 °F) למשך 10 דקות.
    8. הוסף 500 μL של מאגר FACS לצינור זרימה טרי. הסר אליקוט של 2-5 μL מכל דגימה ואגד אותו לתוך הצינור עבור פקדי הפלואורסצנציה מינוס אחד (FMO).
    9. מערבולת את צינור ה-FMO במשך 10 שניות וחלוקה שווה (100 μL לכל צינור) לצינורות זרימה טריים המסומנים עבור כל אחת מפקדי ה-FMO (קוקטייל שושלת FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO ו-NK1.1 FMO; ראו טבלה 3). הוסף את כל הנוגדנים למעט הנוגדן המעניין לכל צינור (כמתואר בטבלה 3) ומערבולת במשך 10 שניות. הניחו את פקדי ה-FMO בצד בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    10. צנטריפוגה את הדגימות (לא בקרות FMO) ב 300-400 x g במשך 3-5 דקות ב 4 °C (74 °F).
    11. הכינו מאסטרמיקס מכתים חוץ-תאיים (200 μL לדגימה) עם דילול הנוגדנים הסופי כמתואר בטבלה 4. התאם את נפח ההכתמה לריכוז התא המתאים (עד 5 x 106 תאים לכל 100 μL) בהתאם לספירת התאים משלב 3.4.10.
    12. מוסיפים מאסטרמיקס מכתים חוץ-תאיים לדגימות, מערבולת במשך 10 שניות ומניחים אותם בצד בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    13. הכינו בקרת צבע בודדת טרייה לכל נוגדן המיועד לשימוש באסטרטגיית הגטינג (איור 2). חרוזי פיצוי נוגדני וורטקס במשך 20 שניות, מוסיפים טיפה אחת של חרוזים לצינור זרימה, מכתימים ב-0.5 μL של נוגדן (כפי שמוצג בטבלה 2, או בהתאם להוראות היצרן), ומערבולת במשך 10 שניות.
    14. הכינו בקרת צבע בצבע יחיד הכדאיות הניתנת לתיקון UV באמצעות ערכת חרוזי פיצוי תגובתי לאמין. חרוזי פיצוי תגובתי לוורטקס אמין במשך 20 שניות, הוסיפו 1 μL של צבע UV חי/מת (כפי שמוצג בטבלה 2, או בהתאם להוראות היצרן) ומערבולת במשך 10 שניות.
    15. דגירה של הדגימות, ה- FMOs ופקדי הצבע הבודדים בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    16. במהלך תקופה זו, להכין צינורות כדי לאסוף את התאים הממוינים. הוסף 400-500 μL של 10% FBS בצינורות DMEM/F12 מתקדמים עד 1.5 מ"ל עבור כל דגימה.
    17. לאחר הדגירה, הוסף 2 מ"ל של PBS2 לכל אחת מהדגימות, פקדי FMO ובקרות צבע בודדות.
    18. צנטריפוגה הדגימות, פקדי FMO ובקרות צבע בודדות ב 300-400 x g במשך 3-5 דקות ב 4 °C (74 °F).
    19. השליכו את ה-supernatant מכל הצינורות הצנטריפוגיים. בצעו שימוש חוזר בדגימות ובקרות FMO ב-250 μL של מאגר FACS ומערבולת במשך 10 שניות.
    20. השתמש שוב בפקדי הצבע הבודד ב- 250 μL של PBS2. הוסיפו טיפה אחת של חרוזי אמין שאינם תגובתיים לצביעת הכדאיות הניתנת לתיקון UV לצבע צבע יחיד בלבד. וורטקס כל הבקרות במשך 10 שניות.
    21. התאים מוכנים כעת למיון. שמור דגימות, פקדי FMO ובקרות צבע בודדות על קרח בחושך במידת האפשר כדי לשפר את הכדאיות של התא ולמנוע אובדן אות מהלבנת תמונות.

4. תרבית משותפת של אורגנואידים במעיים קטנים עם תאי לימפואידים מולדים

הערה: סעיף זה מתאר את התרבית המשותפת של ILC1 של מעיים דקים ממוינים של מורין (מבודדים בעקבות הפרוטוקול בסעיף 3) עם אורגנואידים של מעיים קטנים של מורין (המתוארים בסעיפים 1 ו-2). יש להשתמש באורגנואידים בצורה אופטימלית 1-2 ימים לאחר המעבר. תרבית משותפת כוללת קצירת האורגנואידים, הוספת המספר המתאים של ILC1, צנטריפוגה לאורגנואידים כדוריים ו- ILC1 יחד, והחזרת TBEM. השלם סעיף זה בהקדם האפשרי לאחר בידוד ILC1. כל ההליכים צריכים להתבצע בסביבה אספטית באמצעות חומרים סטריליים וריאגנטים.

  1. ודא ש- TBEM משלב 3.1.1 הופשר.
  2. קציר אורגנואידים בני 1-2 ימים כמתואר בשלבים 2.3 ו-2.4.
  3. בצעו החייאה של הכדור האורגנואידי ב-1 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם קר כקרח- קר כקרח. אין לכופף את קצה p1000 כפי שנעשה בעת העברת האורגנואידים, שכן הכוונה כאן היא לשמור על המבנה האורגנואידי לתרבית משותפת. במידת הצורך, הניחו את האורגנואידים בצינורות PBS2 נפרדים המצופים ב-1.5 מ"ל על קרח לתקופה קצרה כדי להתפלג בין תנאי תרבית משותפת שונים.
    הערה: התחל בהכנת אורגנואידים רק לאחר שדגימות ILC מוכנות לתרבית משותפת; לעבוד על קרח ובמהירות ברגע שאורגנואידים נקטפו כדי למזער את המוות של תאי אפיתל.
  4. ציפוי מראש של צינור אחד בגודל 1.5 מ"ל עם PBS2 לכל דגימת שכפול ILC. פזרו כ-100-200 אורגנואידים (כבאר אחת של צלחת של 24 בארות) לכל צינור.
  5. ציפו מראש קצה p1000 ב-PBS2 והשתמשו בו כדי להעריך את נפח ה-ILC1s לאחר טיהור FACS (250-300 μL + נפח ממוין). קבע את הריכוז של ILC1 למ"ל באמצעות מספר התאים שנרשמו מהמיון וקבע את הנפח הנדרש.
  6. באמצעות אותו קצה PBS2 המצופה p1000, הוסף לא פחות מ-500 ILC1s לצינור PBS2 המצופה 1.5 מ"ל המכיל את האורגנואידים. אם מספר ה-ILC1s המופקים מהסוג הוא פחות מ-500, הוסף את האורגנואיד ישירות לצינור המכיל את המיון המקורי כדי למזער את אובדן התאים מההעברה.
  7. סובב את ILC1 ואורגנואידים ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (6 °F). במידת האפשר, הימנעו מצנטריפוגות שולחניות בקוטר קטן, שכן אלה יאגדו את התאים לאורך קצה פנים הצינור בניגוד ליצירת כדור בקצה הצינור. מאחר שמספרי התאים נמוכים מאוד, חובה למזער את אובדן התאים במהלך שלבים אלה.
  8. מסירים לאט ובעדינות כמה שיותר מהסופרנטנט מבלי להפריע לכדור (שייתכן שלא ניתן לראותו בעין, במיוחד בבקרות ILC ללא אורגנואידים בלבד). הניחו את הדגימה על קרח.
  9. בצעו החייאה של הכדור הקר ב-30 מיקרול'ל לכל באר של TBEM. בעת החזקת הצינור על משטח קר (למשל, קופסה קטנה של קרח המונחת במכסה המנוע של תרבית הרקמה), מערבבים את האורגנואידים וה-ILC לפחות 10-15 פעמים כדי להבטיח חלוקה אחידה. טריטורטים לעתים קרובות אך בעדינות, כדי למנוע פגיעה באורגנואידים ובהיווצרות בועות.
  10. יש למרוח 30 μL לכל באר של אורגנואידים מסוג ILC ב-TBEM על לוחית מחוממת מראש של 24 או 48 בארות כדי ליצור כיפה אחת. הניחו ישירות את הצלחת באינקובטור (37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2) למשך 10-20 דקות.
    הערה: מומלץ מאוד להגדיר בקרות ILC בלבד ואורגנואידים בלבד לניתוח במורד הזרם. ILC1 הם נדירים, אך ניתן להחליף את GFP- ILC2 בבקרות אימונופלואורסצנציה או ציטומטריית זרימה של FSC/SSC היכן שמתאים מבחינה מדעית.
  11. הוסף 550 μL (לכל באר) של מדיום ILC1 שלם (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-Mercaptoethanol; ראה טבלה 1) עם כל הציטוקינים הניסיוניים הרצויים או נוגדנים חוסמים ודגירה ב-37 °C ו-5% CO2 למשך 24 שעות.
  12. לאחר 24 שעות, הסר בעדינות את הצלחת מהאינקובטור ואפשר לצלחת לשבת במכסה תרבית רקמה במשך דקה אחת כדי להבטיח שהלימפוציטים יתיישבו.
  13. הסר 200-250 μL של מדיה והנח אותה בבאר ריקה של צלחת של 24 באר. בדוק את חומר העל הזה עם מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שלא הוסרו לימפוציטים.
    1. אם ה-supernatant ברור, הוסיפו 300 μL של מדיום ILC1 טרי לתרבות המשותפת בבאר המקורית. אם לימפוציטים נמצאים בסופרנאטנט, צנטריפוגה ב 300-400 x g במשך 3-5 דקות ב 4 °C ו resuspend ב 300 μL של מדיום ILC1 טרי ולהוסיף את זה הנותרים 200-250 μL של מדיה בבאר המקורית. הקפידו לחדש את מלאי המדיה כל 1-2 ימים או כאשר המדיה הופכת לכתומה/צהובה בהירה.
      הערה: אין לאפשר למדיה להתאדות במידה מספקת עד שקצה כיפת המטריצה ישבור את פני השטח של המדיה. ודא תמיד שהמטריצה שקועה לחלוטין. ניתן להימנע מאידוי עודף על ידי שימוש בבארות מרכזיות בלוחות תרביות הרקמה והוספת כ-600 μL של PBS לבארות שמסביב. תרביות משותפות עם ILC למבוגרים יציבות במשך 1-4 ימים, ולאחר מכן האורגנואידים שנזרעו ללא הפרעה משמעותית ייקרעו ויוזרעו מחדש כקריפטות חדשות. אם מנתחים את האפיתל, מומלץ לנתח תרבויות תוך 1-4 ימים מהקמת תרבויות משותפות.
    2. בצע ניתוח במורד הזרם באמצעות אימונופלואורסצנציה, ציטומטריה של זרימה או טיהור FACS של אוכלוסיות מטרה למאגר ליזה לצורך ניתוח ביטוי גנים על ידי תא בודד או RNA-seq בתפזורת או RT-qPCR, כמתואר בהתייחסות8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאשר הם הושלמו בהצלחה, קריפטות מבודדות טריות אמורות ליצור מבני קריפטה ניצנים תוך 2-4 ימים (איור 1A). תרביות אורגנואידים בריאות וחזקות צריכות לגדול באופן פעיל וניתן להעבירן ולהרחיבן כמפורט בפרוטוקול.

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של ILC1 של המעי הדק מקו הכתבים המהונדסים RORγtGFP murine, המאפשר בידוד של ILC1 חי על ידי FACS (איור 2). באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, טווח הספירה הצפוי של ILC1 הוא 350-3,500 תאים מבודדים.

לאחר שנזרעו עם אורגנואידים, ניתן לדמיין תרביות משותפות על ידי אימונוציטוכימיה (איור 3A-B). ניתן לנתח את ה-ILCs ותאי האפיתל גם על-ידי ציטומטריה של זרימה, כפי שהודגם באיור 3C. ILC1 מעלה את האפיתל CD44, כפי שהוא מאופיין בציטומטריה של זרימה (איור 4A-B) ובאימונוציטוכימיה (איור 4C). באופן ספציפי, ILC1 משרה ביטוי של וריאנט שחבור CD44 v6 באורגנואידים, כפי שהודגם על-ידי RT-qPCR (איור 4D).

טבלה 1: קומפוזיציות מדיה ומאגר. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: פקדי צבע יחיד. הרכב של בקרות צבע בודדות לבידוד המעי הדק למינה פרופריה ILC1 באמצעות אסטרטגיית ההגרלה שהוגדרה באיור 2. פרטים על נוגדנים המשמשים ניתן למצוא בטבלת החומרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3: פלואורסצנציה מינוס מאסטרמיקס אחד (FMO). הרכב של מאסטרמיקסים של FMO עבור שושלת קוקטייל FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO, ו- NK1.1 FMO. מאסטרמיקסים של FMO מכילים את כל הנוגדנים המשמשים למעט הנוגדן המעניין ומשמשים להכתמת מדגם aliquot. קוקטייל שושלת מוגדר כ- CD19, CD3e, CD5, Ly-6G / Ly-6C. פרטים על נוגדנים המשמשים ניתן למצוא בטבלת החומרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 4: מאסטרמיקס מכתים חוץ-תאיים. הריכוזים מותאמים לצביעה של עד 5 x 106 תאים ב-200 μL של מאגר FACS. פרטים על נוגדנים המשמשים ניתן למצוא בטבלת החומרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Figure 1
איור 1: אורגנואידים של מעיים קטנים של מורין. תמונה מייצגת של (A) שנוצרה בהצלחה אורגנואידים במעיים קטנים 2-3 ימים לאחר המעבר ו-(B) תרבות לא מוצלחת. סרגל קנה מידה: 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: אסטרטגיית Gating לבידוד ILC1s מהמעי הדק למינה פרופריה של עכברי ה-GFP המהונדסים RORγt. תרשים ציטומטרי של זרימה מייצגת של בידוד ILC1 מהמעי הדק למינה פרופריה של עכברי הכתבים המהונדסים RORγtGFP על ידי FACS. ILC1s מוגדרים כ-live, CD45+, Lin- (CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORγt-, NKp46+, ו-NK1.1+. נציג מ- N = >50 עכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תרבויות אורגנואידיות ו-ILC1. תמונות שדה בהיר (A), תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית (B) וחלקות FACS (C) של אורגנואידים במעיים קטנים (SIO) מתורבתים לבד (למעלה) או עם ILC1s (למטה) (המייצגים ניסויים עם ILC1s מ- N = 3 עכברים). (B) צביעה ב-CD45 ממחישה את ה-ILC1s ו-Zonula occludens של חלבון 1 (ZO-1) מסמנת תאי אפיתל באורגנואידים. סרגלי קנה מידה: 50 מיקרומטר( C) בעבר מגודרים על תאים בודדים וחיים. מולקולת הידבקות תאית אפיתליאלית (EpCAM) מסמנת תאי אפיתל במעיים (IEC) באורגנואידים ומסימני CD45 ILC1s. האיור מותאם מתוך הפניה8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: ILC1s בתרבית משותפת עם אורגנואידים של מעיים קטנים גורמים לוויסות של CD44 בתאי אפיתל במעיים. (A) חלקה ציטומטרית מייצגת של ביטוי CD44 במולקולת הידבקות תאית אפיתליאלית (EpCAM) בתאי אפיתל חיוביים (חיים, CD45-, EpCAM+) מאורגנואידים במעיים קטנים (SIO) מתורבתים לבד (משמאל) או עם ILC1s במשך 4 ימים (מימין). (B) כימות זרימה של ביטוי CD44 בתאי אפיתל במעיים (IEC) (ILC1s מ-N = 5 עכברים). (C) תמונת מיקרוסקופיה קונפוקלית מייצגת של לוקליזציה CD44 ב-d4 SIO בלבד (משמאל) או מתורבתת במשותף עם ILC1s (מימין) (המייצגת N = 3 עכברים). סרגלי קנה מידה: 50 μm. (D) RT-qPCR עם פריימרים ספציפיים לאקסון עבור גרסאות שחבור CD44 v4, ו- v6 (N = 3). נתון זה מותאם מתוך הפניה8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את השיטות לביסוס אורגנואידים של המעי הדק של מורין, בידוד ILC1 נדיר על ידי מזעור אובדן לימפוציטים במהלך פרוטוקול דיסוציאציה במעיים, ויצירת תרביות משותפות בין שני תאים אלה. ישנם שלבים רבים לפרוטוקול זה, ובעוד שחלקם ספציפיים ל- ILC1s, ניתן ליישם גישה זו על סוגים אחרים של תאי חיסון במעיים, וניתן להתאים באופן מודולרי את הגדרות התרבית המשותפת כך שיתאימו לשאלות מחקר בודדות. מספר שלבים קריטיים (שמומלץ לא לסטות מהם), כמו גם הנחיות לפתרון בעיות עבור האלמנטים המאתגרים יותר מבחינה טכנית של פרוטוקול זה, מודגשים כאן.

השימוש באורגנואידים של מעיים קטנים של מורין מתאי גזע מעיים בודדים מסוג Lgr5+-eGFP הופך להיות מבוסס יותר ויותר33,34; עם זאת, בפרוטוקול זה, מוצע לבודד קריפטות שלמות ושלמות של ליברקוהן מחיות CD45.1. לא רק שקריפטות שלמות מתאוששות מהר יותר מתאי Lgr5+ בודדים, אלא שהשימוש בחיות CD45.1 ללא כתב GFP מבטיח ששום CD45.2+ ILC מזוהם צולב לא ינותח מתרביות האורגנואידים המשותפות והוא תואם את השימוש בתאי חיסון המכילים כתב מבוסס GFP. מניסיונם של המחברים, אף תא מזנכימלי או תאי חיסון לא מתנשאים לאחר 1-3 מעברים של האורגנואידים. השימוש ב- CD45.2 או בבעלי חיים אחרים להקמת אורגנואידים מקובל אפוא לחלוטין. במהלך הקמת אורגנואידים, אם קריפטות אינן קיימות בשלב 1.1.19, ייתכן שיהיה צורך ברעידות ידניות קפדניות יותר כדי לעקור את הקריפטות השלמות. גורמים סביבתיים כגון טמפרטורת החדר בסביבה (למשל, האם ההליך מתבצע בקיץ או בחורף) עשויים להוסיף שונות מסוימת לתזמון הדגירה במהלך הדיסוציאציה. צפיפות הזריעה של קריפטות תשפיע על תפוקת היווצרות האורגנואידים הראשונית; לכן מומלץ לזרוע מינימום של שתי צפיפויות שונות כדי להבטיח הצלחה (למשל, 200-750 שהוצעו כאן, אך ניתן להתאים טווח זה בהתאם לצרכים האישיים).

לאחר התבססותן, תרביות האורגנואידים במעיים הן הטרוגניות הן בין קווים הנוצרים מאותו זן עכברי, לאורך מערכת העיכול (למשל, תריסריון לעומת איליאום), ואפילו בתוך אותה באר של תרביות אורגנואידיות35,36. למרות שפרוטוקול זה נמצא חזק על פני קבוצות רבות ושונות של אורגנואידים, הטרוגניות זו עשויה לתרום לשונות הנתונים. מומלץ להיות עקביים עם תחזוקה אורגנואידית (שינויי מעבר ומדיה) כדי להפחית רעש טכני מנתונים לא רלוונטיים מבחינה פנוטיפית. זה כולל עקביות עם ציר הזמן של קדם הזריעה ועם הכוח המשמש לניתוק אורגנואידים. כמו כן, מומלץ להשתמש באותה מטריצה בסיסית לניסויים המושווים, ולניסויים שיבוצעו באמצעות שכפולים ביולוגיים של אורגנואידים שמקורם בבעלי חיים שונים (כאשר הדבר אפשרי מבחינה כלכלית וטכנית) כדי להבטיח שהתוצאות ניתנות לשחזור בחוזקה.

בביסוס תרביות משותפות, היחס בין תאי חיסון לתאי אפיתל הוא שיקול קריטי שידרוש אופטימיזציה על סמך שאלות המחקר. אם נחקרת ההשפעה של תאי אפיתל על ILC, מספר האורגנואידים שנזרעו יצטרך להספיק כדי להרוות את כל ה-ILC. לעומת זאת, כאשר מעריכים את ההשפעה של ILC על האפיתל, יחסי ILC/אפיתל שונים עשויים לגרום לתפוקות פנוטיפיות שונות, המשקפות מצבים דיפרנציאליים של העשרת תת-קבוצות ILC ברירית. הכדאיות של ILC1 מתוחזקת היטב בתרבית, והאוכלוסייה תעבור התרחבות קלה, כאשר כ-500 ILC1 ו-100 אורגנואידים של מעיים קטנים (SIO) יעברו הרחבה של פי 2-3 בממוצע. עם זאת, תפוקה זו תושפע מטיפולים נוספים, כאשר נטרול TGF ישתפר ועיכוב p38 יפחית את המספר האבסולוטי של ILC1 לאחר תרבית משותפת8. כל אובדן בלתי צפוי של יותר מ-50% ממספרי ה-ILC1 הזורעים עשוי להיות תוצאה של יחס לא מאוזן של ILC1 ל-SIO (עלייה במספר הקריפטות שנזרעו), זיהום SIO (ודא שקוקטייל האנטיביוטיקה מתפקד ובדוק את ה-supernatant לאיתור מיקופלסמה), או של בעיות איכות במלאי הציטוקינים, כאשר ILC1 רגיש במיוחד להיעדר IL-2 או IL-15. לוחות-על מרוכזים של 96 או 48 בארות שימשו בהצלחה עבור ELISAs. בעת ניתוק תרביות משותפות, מומלץ לדגום תאים עם DNase לאחר החלפת טריפסין עדינה של 20 דקות או לבצע דיסוציאציה מבוססת EDTA לתאים בודדים כדי למנוע גוש תאים מתאי אפיתל פגומים.

חוזקה של פרוטוקול זה היא בכך שהוא מאזן תנאי תרבית רדוקציוניסטיים עם סוגי תאים מורכבים. עם זאת, ההתנהגויות של תת-קבוצות ILC אחרות בתרבויות אלה עשויות להיות תלויות בגורמים שאינם קיימים בפרוטוקול מסוים זה. לדוגמה, בפרוטוקול של Lindemans המשמש לתרביות משותפות של ILC3, IL-23 הושלם בנוסף למדיה של תרבות משותפת כדי לתמוך בתחזוקה והפעלה של ILC38. IL-15 נמצא חשוב במיוחד בתחזוקת ILC1 במערכת התרבית המשותפת המתוארת בפרוטוקול זה, אשר עלתה בקנה אחד עם דיווחים קודמים של ILC1 הדורשים ציטוקין זה להומאוסטזיס, אם כי לא פיתוח6. כדי להפעיל ILC, או כדי לשמור על ILC2s, מדיום הצמיחה עשוי לדרוש אופטימיזציה נוספת. יתר על כן, תאים תאיים אחרים במעי, מלבד האפיתל, לווסת ILCs. לדוגמה, נוירונים במעיים ידועים בכך שהם מווסתים ILC2s באופן חלקי באמצעות פעילות של נוירופפטידים מופרשים37. גורמים מיקרוביאליים משפיעים גם על פנוטיפ ILC38. ניתן להתגבר על מגבלה זו באמצעות הוספה של יסודות אלה, למשל ציטוקינים, פפטידים או גורמים מיקרוביאליים, למערכת התרביות המשותפות. זה יכול אפילו לאפשר חקירה של האינטראקציה בין ILCs לבין תאים סלולריים מרובים בסביבה רדוקציוניסטית. בעקבות היגיון זה, חיוני להוסיף ריאגנטים אנטי-ביוטיים/אנטי-מיקוטיים ולחדש אותם לעתים קרובות למדיה האורגנואידית לפני הקמת תרבויות משותפות. זה גם קריטי שכל התרבויות יבוצעו בסביבות אספטיות מכיוון שכל זיהום תרבית (למשל, גדילה פטרייתית או מיקופלסמה) יפעיל ככל הנראה את ה- ILCs הלא ספציפיים של האנטיגן, ויצור פנוטיפים משמעותיים שאולי לא יהיו קיימים בתרביות שאינן מזוהמות. מסיבה זו, נסיגה של ריאגנטים אנטי-ביוטיים/מיקוטיים אינה מומלצת, אפילו בתרביות המשותפות, מכיוון שלא נמצא שהם גורמים להשפעה שלילית על האפיתל או ה-ILCs.

שיטה זו מספקת דרך ייחודית לאפיין מודולי איתות בין ILCs לאפיתל המעיים, ומאפשרת לחקור את הביולוגיה של שני התאים. בהשוואה לשיטות אחרות במבחנה המורכבות מסוג תא יחיד, המערכת המוצגת כאן דומה יותר לפיזיולוגיה in vivo ומאפשרת לחקור מנגנוני איתות פוטנציאליים מרובים בין תאי אפיתל ו- ILCs. שיטות אחרות של תרבית ILC במבחנה מסתמכות בעיקר על קווי תאי הזנה סטרומליים, כגון OP9 או OP9-DL139. קו זה נגזר מקלבריה של עכבר שזה עתה נולד, שאינו מייצג את סביבת המעיים. בעוד אלה סיפקו את תקן הזהב לשמירה על ILCs במבחנה עד כה, הם סובלים ממגבלות משמעותיות ביישומם להבנת ההשפעה של ILC על האפיתל.

פרוטוקול התרבית המשותפת המתואר כאן בין אורגנואידים של מעיים קטנים של מורין לבין ILCs שמקורם במינה פרופריה הוא בעל יישומי מחקר משמעותיים. מערכת זו של תרבות משותפת כבר שימשה לקביעת התפקיד של TGF-β הנגזר מ-ILC1 בהרחבת קריפטות אפיתל CD44+ 8, מה שתורם להבנת הדינמיקה של אפיתל במחלות מעי דלקתיות. מחקרים אלה תורמים לגוף הולך וגדל של ספרות המבססת את החשיבות הקריטית של איתות אפיתל-ILC בהומאוסטזיס במעיים ובדלקת3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

א.ר. מכיר במלגת דוקטור מטעם קרן Wellcome (215027/Z/18/Z). G.M.J. מכיר במלגת דוקטורט מקרן Wellcome (203757/Z/16/A). D.C. מכיר בתואר דוקטורנט מה-NIHR GSTT BRC. J.F.N. מכיר במלגת מארי סקלודובסקה-קירי, מלגת פרס קינגס, מלגת קרן רתרפורד של RCUK/UKRI (MR/R024812/1) ופרס זרעים במדע מטעם קרן Wellcome (204394/Z/16/Z). אנו מודים גם לצוות הליבה של ציטומטריית זרימת BRC שבסיסו בבית החולים גיא. עכברי הכתבים Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 היו מתנה נדיבה מ-G. Eberl (מכון פסטר, פריז, צרפת). עכברי CD45.1 C57BL/6 ניתנו בחביבות על ידי ט' לורנס (קינגס קולג' לונדון, לונדון) ופ' בראל (קינגס קולג' לונדון, לונדון).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box - -
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
  3. Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
  4. Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
  5. Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
  6. Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
  7. Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
  8. Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
  9. Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
  10. Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
  11. Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
  12. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  13. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
  14. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
  15. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
  16. Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
  17. Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
  18. Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
  19. Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
  20. Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
  21. Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
  22. Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
  23. Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  26. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  27. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2012).
  28. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
  29. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  30. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  31. Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
  32. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
  33. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  34. O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  35. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
  36. Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
  37. Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
  38. Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
  39. Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 181
תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Read, E., Jowett, G. M., Coman, D.,… More

Read, E., Jowett, G. M., Coman, D., Neves, J. F. Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells. J. Vis. Exp. (181), e63554, doi:10.3791/63554 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter