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Immunology and Infection

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63554
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1, 1
1Centre for Host-Microbiome Interactions, King’s College London, 2Wellcome Trust Cell Therapies and Regenerative Medicine Ph.D. Programme, King’s College London, 3Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, Cambridge University
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per stabilire organoidi murini dell'intestino tenue, isolare le cellule linfoidi innate di tipo 1 dalla lamina propria dell'intestino tenue murino e stabilire co-colture tridimensionali (3D) tra entrambi i tipi di cellule per studiare le interazioni bidirezionali tra le cellule epiteliali intestinali e le cellule linfoidi innate di tipo 1.

Abstract

Complesse co-colture di organoidi con cellule immunitarie forniscono uno strumento versatile per interrogare le interazioni bidirezionali che sono alla base del delicato equilibrio dell'omeostasi della mucosa. Questi sistemi 3D e multicellulari offrono un modello riduzionista per affrontare le malattie multifattoriali e risolvere le difficoltà tecniche che sorgono quando si studiano tipi di cellule rare come le cellule linfoidi innate residenti nei tessuti (ILC). Questo articolo descrive un sistema murino che combina organoidi dell'intestino tenue e ILC di tipo 1 (ILC1) derivati dalla lamina propria dell'intestino tenue, che possono essere facilmente estesi ad altre POPOLAZIONI ILC o immunitarie. Le ILC sono una popolazione residente nei tessuti particolarmente arricchita nella mucosa, dove promuovono l'omeostasi e rispondono rapidamente a danni o infezioni. Le co-colture organoidi con ILC hanno già iniziato a far luce su nuovi moduli di segnalazione epiteliale-immunitaria nell'intestino, rivelando come diversi sottoinsiemi di ILC influiscono sull'integrità e sulla rigenerazione della barriera epiteliale intestinale. Questo protocollo consentirà ulteriori indagini sulle interazioni reciproche tra cellule epiteliali e immunitarie, che hanno il potenziale per fornire nuove informazioni sui meccanismi dell'omeostasi e dell'infiammazione della mucosa.

Introduction

La comunicazione tra l'epitelio intestinale e il sistema immunitario residente nell'intestino è fondamentale per il mantenimento dell'omeostasi intestinale1. Le interruzioni di queste interazioni sono associate a malattie sia locali che sistemiche, tra cui la malattia infiammatoria intestinale (IBD) e i tumori gastrointestinali2. Un esempio notevole di un regolatore critico dell'omeostasi descritto più di recente proviene dallo studio delle cellule linfoidi innate (ILC), che sono emerse come attori chiave nel panorama immunitario intestinale3. Le ILC sono un gruppo di cellule immunitarie innate eterogenee che regolano l'omeostasi intestinale e orchestrano l'infiammazione in gran parte attraverso la segnalazione mediata da citochine4.

Le ILC murine sono ampiamente suddivise in sottotipi basati sul fattore di trascrizione, sul recettore e sui profili di espressione delle citochine5. Le ILC di tipo 1, che includono cellule natural killer citotossiche (NK) e ILC di tipo 1 simili a helper (ILC1), sono definite dall'espressione del fattore di trascrizione (eomesodermi) Eomes e della proteina T-box espresse rispettivamente nelle cellule T (T-bet)6 e secernono citochine associate all'immunità T helper di tipo 1 (TH H1): interferone-γ (IFNγ) e fattore di necrosi tumorale (TNF), in risposta all'interleuchina (IL)-12, IL-15 e IL-187. Durante l'omeostasi, gli ILC1 residenti nei tessuti secernono β del fattore di crescita trasformante (TGF-β) per guidare la proliferazione epiteliale e il rimodellamento della matrice8. Le ILC di tipo 2 (ILC2) rispondono principalmente all'infezione da elminti attraverso la secrezione di citochine associate a T helper di tipo 2 (TH2): IL-4, IL-5 e IL-13 e sono caratterizzate dall'espressione del recettore orfano correlato all'acido retinoico (ROR) α (ROR-α)9 e della proteina legante GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . Nei topi, gli ILC2 "infiammatori" intestinali sono ulteriormente caratterizzati dall'espressione del recettore simile alla lectina delle cellule killer (sottofamiglia G membro 1, KLRG)13 dove rispondono a IL-2514,15 derivato dalle cellule del ciuffo epiteliali. Infine, le ILC di tipo 3, che includono cellule indurici del tessuto linfoide e ILC di tipo 3 simili a helper (ILC3), dipendono dal fattore di trascrizione ROR-γt16 e si raggruppano in gruppi che secernono il fattore stimolante la colonia di macrofagi dei granulociti (GM-CSF), IL-17 o IL-22 in risposta ai segnali locali IL-1β e IL-2317. Le cellule indurici del tessuto linfoide si raggruppano nei cerotti di Peyer e sono cruciali per lo sviluppo di questi organi linfoidi secondari durante lo sviluppo18, mentre gli ILC3 sono il sottotipo ILC più abbondante nella lamina propria dell'intestino tenue murino adulto. Uno dei primi sistemi di co-coltura di organoidi intestinali murini con ILC3 è stato sfruttato per separare l'impatto della citochina IL-22 sul trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT-3) mediato dalla ripetizione ricca di leucina contenente il recettore accoppiato alla proteina G 5 (Lgr5) + proliferazione delle cellule staminali intestinali19, un potente esempio di interazione rigenerativa ILC-epiteliale. Le ILC mostrano eterogeneità di impronta tra gli organi20,21 e mostrano plasticità tra i sottoinsiemi in risposta alle citochine polarizzanti22. Ciò che guida queste impronte tessuto-specifiche e le differenze di plasticità, e quale ruolo svolgono in malattie croniche come IBD23, rimangono argomenti interessanti che potrebbero essere affrontati utilizzando co-colture organoidiche.

Gli organoidi intestinali sono emersi come un modello di successo e affidabile per studiare l'epitelio intestinale24,25. Questi sono generati dalla coltivazione di cellule staminali Lgr5+ epiteliali intestinali, o intere cripte isolate, che includono le cellule di Paneth come fonte endogena del membro della famiglia Wnt 3A (Wnt3a). Queste strutture 3D sono mantenute in idrogel sintetici26 o in biomateriali che imitano la lamina propria basale, ad esempio la matrice extracellulare basale reticolante termica (TBEM), e sono ulteriormente integrate con fattori di crescita che imitano la nicchia circostante, in particolare il fattore di crescita epiteliale (EGF), l'inibitore della proteina morfogenetica ossea (BMP) Noggin e un Lgr5-ligando e Wnt-agonista R-Spondin127 . In queste condizioni, gli organoidi mantengono la polarità apico-basale epiteliale e ricapitolano la struttura cripto-villi dell'epitelio intestinale con cripte di cellule staminali in erba che si differenziano terminalmente in cellule assorbenti e secretorie al centro dell'organoide, che poi si riversano nello pseudolume interno da anoikis28. Sebbene gli organoidi intestinali da soli siano stati estremamente vantaggiosi come modelli riduzionisti di sviluppo e dinamica epiteliale in isolamento29,30, hanno un enorme potenziale futuro per capire come questi comportamenti sono regolati, influenzati o addirittura interrotti dal compartimento immunitario.

Nel seguente protocollo, viene descritto un metodo di co-coltura tra organoidi intestinali piccoli murini e ILC1 derivati dalla lamina propria, che è stato recentemente utilizzato per identificare come questa popolazione diminuisce inaspettatamente le firme intestinali dell'infiammazione e contribuisce invece ad aumentare la proliferazione epiteliale tramite TGF-β in questo sistema8.

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Protocol

Tutti gli esperimenti devono essere completati in conformità e conformità con tutte le linee guida normative e istituzionali pertinenti per l'uso animale. L'approvazione etica per lo studio descritto nel seguente articolo e video è stata acquisita in conformità e conformità con tutte le linee guida normative e istituzionali pertinenti per l'uso animale.

Tutti i topi sono stati abbattuti per lussazione cervicale secondo la procedura etica standard, condotta da individui addestrati. Prima del prelievo di organi e tessuti, l'affettamento dell'arteria femorale o la decapitazione sono stati condotti (a seconda del protocollo in questione) come valutazioni di conferma della morte. Gli animali sono stati alloggiati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (salvo diversa indicazione) presso un'unità commerciale accreditata e un'unità animale del King's College di Londra in conformità con il UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (UK Home Office Project License (PPL: 70/7869 a settembre 2018; P9720273E da settembre 2018).

1. Stabilire organoidi intestinali murini

NOTA: Questa sezione del protocollo descrive la generazione di organoidi intestinali dall'intestino tenue murino. Le cripte vengono prima isolate dal tessuto, risospese in TBEM e quindi incubate con mezzi contenenti EGF, Noggin e R-Spondin (ENR). Stabilire organoidi intestinali murini è stato anche ben descritto altrove 24,25,27.

  1. Posizionare TBEM su ghiaccio per scongelare (40 μL / pozzetto) e mettere una coltura tissutale standard trattata (si riferisce a piastre con una superficie idrofila e caricata negativamente) piastra a 24 pozzetti in un incubatore a 37 ° C per preriscaldare.
    NOTA: 500 μL di TBEM si scongelano in circa 2-4 ore; non lasciarlo a temperatura ambiente.
  2. Preparare ~ 4 mL o 550 mL per pozzetto di terreno ENR aggiungendo EGF, Noggin e R-Spondin al mezzo basale (Tabella 1) e metterlo in un incubatore a 37 °C.
  3. Abbattere un animale di 6-12 settimane e sezionare l'intestino tenue usando pinze e forbici da microdissezione. Metterlo in 15 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) sul ghiaccio.
  4. Usando lo stomaco e il cieco come punti di orientamento, isolare la regione desiderata dell'intestino tenue (duodeno, digiuno o ileo). In questo protocollo, l'ileo è isolato.
  5. Immergere l'intestino in PBS su una capsula di 10 cm2 Petri sul ghiaccio. Usando la pinza, rimuovere il grasso delicatamente, ma completamente, dall'intestino.
  6. Tagliare il tessuto longitudinalmente usando le forbici per microdissezione (preferibilmente con punte arrotondate per evitare perforazioni). Mantenere l'intestino immerso nella PBS, agitare per rimuovere la materia fecale e mantenere il lato mucoso fino a tracciare l'orientamento dei tessuti.
  7. Trasferire il tessuto sul coperchio asciutto di una capsula di Petri su ghiaccio, posizionando il lato mucoso / villus intestinale verso l'alto. Tenendo un'estremità dell'intestino con una pinza, raschiare delicatamente via il muco usando il bordo angolato di un vetrino pulito.
  8. Riempire la piastra con PBS ghiacciato e risciacquare il tessuto.
  9. Pre-rivestire un tubo da 50 mL con PBS2 (PBS + 2% FCS; vedi Tabella 1) per prevenire l'adesione del tessuto alla plastica e aggiungere 10 ml di PBS ghiacciato a questo tubo. Tagliare l'intestino in piccoli segmenti (~2 mm) e trasferirli nel tubo da 50 ml preverniciato con PBS2.
  10. Utilizzando una pipetta da 25 ml pre-rivestita con PBS2, pipettare i segmenti su e giù 5-10 volte per pulire i frammenti di tessuto.
  11. Lasciare che i segmenti si depositino per 15-30 s, rimuovere e scartare il surnatante PBS e ripetere i passaggi 1.10 e 1.11 fino a quando la soluzione è limpida (circa 3-4 volte).
  12. Lasciare che i segmenti si depositino e scartare il surnatante PBS. Aggiungere 30 ml di buffer di isolamento della cripta ghiacciata (Tabella 1).
  13. Posizionare i tubi su un rullo orizzontale o un bilanciere a 30-60 giri / min (o delicato) per 30 minuti a 4 ° C. Non incubare a velocità più elevate, temperature più elevate o durata più lunga poiché le cripte si sposteranno prematuramente e diventeranno singole cellule con minore vitalità e resa.
    NOTA: Da questa fase in poi, tutte le procedure devono essere condotte in un ambiente asettico utilizzando materiali e reagenti sterili.
  14. Lasciare che i segmenti intestinali si depositino alla base del tubo da 50 ml. Rimuovere il buffer di isolamento della cripta senza interrompere i segmenti stabilizzati e trasferirlo in un tubo da 50 ml sul ghiaccio.
    NOTA: se il processo di isolamento della cripta è stato troppo rigoroso, le cripte possono essere viste in questa frazione. Può quindi essere conservato come riserva, ma verrà scartato in modo ottimale alla fine del protocollo.
  15. Aggiungere 20 ml di PBS ghiacciato ai segmenti intestinali. Utilizzando una pipetta da 25 ml pre-rivestita con PBS2, pipetta segmenti intestinali su e giù 5-8 volte.
  16. Lascia che i segmenti si accontentino di 30 s. Pre-rivestire un tubo da 50 mL e una pipetta da 25 mL con PBS2. Usando questa pipetta, raccogliere il surnatante (frazione 1) nel tubo pre-rivestito da 50 ml e posizionare il tubo sul ghiaccio.
    NOTA: questa frazione serve a risciacquare il buffer di isolamento della cripta rimanente. Tuttavia, serve anche come ulteriore fase di controllo della qualità; se il pipettaggio è stato troppo vigoroso, le cripte saranno abbondanti in questa frazione di risciacquo, e se è stato troppo delicato, ci saranno pochissimi detriti in questa frazione. In modo ottimale, la frazione 1 viene scartata alla fine del protocollo, ma può essere utilizzata per produrre organoidi se sorgono problemi con le frazioni 2-4 ottenute di seguito.
  17. Ripetere i passaggi 1,15 e 1,16 ma aggiungere 10 ml di PBS ghiacciato anziché 20 ml e posizionare il surnatante in un tubo fresco da 50 ml preverniciato con PBS2 (frazione 2).
  18. Ripetere il passo 1,17 altre due volte, ma raggruppare il surnatante risultante con la frazione 2 (nello stesso tubo da 50 ml dal passaggio 1,17) per ottenere le frazioni 2-4. Questo singolo tubo da 50 ml dovrebbe contenere le cripte spostate in 30 ml di PBS ghiacciato.
  19. Rimuovere un'aliquota di 50 μL dalle 2-4 frazioni raggruppate e posizionarla su un coperchio. Valutare la presenza di cripte epiteliali utilizzando un microscopio a luce invertita.
    NOTA: se le cripte non sono presenti, ripetere i passaggi 1.17 e 1.18 utilizzando più forza durante il pipettaggio fino a quando le cripte non vengono rilasciate. Assicurarsi che le cripte non siano state spostate prematuramente nel buffer di isolamento della cripta dal passaggio 1.14 o nella frazione 1 dal passaggio 1.16.
  20. Pre-rivestire un filtro da 100 μm e un tubo da 50 ml con PBS2. Passare le frazioni di cripta raggruppate attraverso questo filtro e nel tubo pre-rivestito da 50 ml.
  21. Spin down frazioni di cripta tese a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
  22. Scartare il surnatante e risospendere le cripte in 10 ml di DMEM/F12 avanzato ghiacciato. Spostare le cripte in un tubo da 15 ml.
  23. Spin down cripte a 210 x g per 5 minuti a 4 °C per rimuovere singole cellule e linfociti.
  24. Cripte risospend in 1 mL di DMEM/F12 avanzato ghiacciato.
  25. Rimuovere un'aliquota da 10 μL e posizionarla su un coperchio. Utilizzando un microscopio a luce invertita, contare il numero di cripte per determinare la concentrazione della cripta.
  26. Calcola il volume richiesto per ~ 400 e ~ 1.500 cripte. Pre-rivestire una punta p1000 con PBS2 e utilizzare questa punta per pipettare i volumi richiesti (contenenti ~ 400 e ~ 1.500 cripte) in tubi separati da 1,5 ml.
  27. Girare le cripte a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
  28. Rimuovere il più possibile il surnatante e quindi risospesciare le cripte in 80 μL di TBEM posto su ghiaccio (punte di pipette pre-fredde a 4 °C per prevenire la gelificazione della matrice, che si verifica a 12 °C).
  29. Rimuovere la piastra a 24 pozzetti, posizionata nel passaggio 1.1, dall'incubatore. Pipettare delicatamente 40 μL di cripte nel centro di un pozzo in un movimento lento e circolare per formare una struttura a cupola piatta ma 3D, o in tre piccole cupole separate.
    NOTA: La vitalità degli organoidi è la più bassa al centro della cupola dove nutrienti e gas permeano meno efficacemente31; pertanto, massimizzare la superficie esposta ai supporti mantenendo chiare strutture 3D è fondamentale.
  30. Ripetere il passaggio 1.29 per creare un totale di due pozzi con una densità di ~ 200 cripte per pozzo e altri due pozzi con una densità di ~ 750 cripte per pozzetto. Posizionare direttamente la piastra in un incubatore (37 °C e 5% CO2) per 15-20 min, avendo cura di non disturbare le cupole viscose ma ancora a matrice liquida.
  31. Aggiungere 550 μL di mezzi ENR preriscaldati per pozzetto (dal punto 1.2) e incubare per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2. In questa fase, si suggerisce di integrare il mezzo ENR con 5 μM di agonista Wnt (CHIR 99021) e 5 μM di inibitore della Rho Chinasi (Y-27632) per le prime 24 ore di coltura post isolamento per migliorare la resa e l'efficienza della generazione di organoidi di cripte appena isolate dal tessuto.
    NOTA: le cripte dovrebbero chiudersi per formare strutture arrotondate entro 24 ore e le gemme della cripta dovrebbero apparire entro 2-4 giorni (Figura 1A).
  32. Sostituire con mezzo ENR fresco alla fine dell'incubazione nel passaggio 1.31, e poi ogni ~ 2 giorni o quando l'indicatore di pH fenolico nel terreno di coltura diventa arancione pallido ma prima che diventi giallo.

2. Mantenimento degli organoidi intestinali murini

NOTA: Questa sezione del protocollo descrive il mantenimento e il passaggio di organoidi intestinali murini. Gli organoidi vengono prima raccolti e poi interrotti meccanicamente usando una punta p1000 piegata. Questo processo rompe grandi organoidi costituiti da numerose cripte in più frammenti più piccoli per l'espansione e rilascia cellule morte che si sono accumulate nella pseudolumen. Il mantenimento degli organoidi intestinali murini è stato anche ben descritto altrove 24,25,27. Tutte le procedure devono essere condotte in un ambiente asettico utilizzando materiali e reagenti sterili. Passaggio o espansione degli organoidi una volta ogni 4-5 giorni, prima che lo scoppio degli organoidi avvenga da un sostanziale accumulo di detriti nel lume organoide. Gli organoidi possono essere passati con un rapporto di 1:2-1:3 a seconda della densità organoide, che sarà ottimamente compresa tra 100-200 organoidi per pozzetto.

  1. Come nei passaggi 1.1 e 1.2, scongelare TBEM sul ghiaccio (40 μL / pozzetto) e preparare il mezzo ENR (550 μL per pozzetto). Posizionare la piastra a 24 pozzetti trattata con coltura tissutale media e standard in un incubatore a 37 °C.
  2. Rimuovere la piastra contenente organoidi dall'incubatrice. Scartare i media dal pozzo per essere passati.
  3. Aggiungere 500 μL di DMEM/F12 avanzato ghiacciato al pozzo. Utilizzando una punta p1000 (pre-rivestita con media per evitare che gli organoidi si attacchino all'interno della punta), raccogliere gli organoidi in un tubo da 15 ml.
  4. Risciacquare il fondo del pozzo con 250-300 μL di Advanced DMEM/F12 ghiacciato assicurandosi che non rimangano organoidi nel pozzo e raggruppare nel tubo da 15 ml contenente organoidi raccolti dal passaggio 2.3. Ripetere i passaggi 2.3 e 2.4 quando si passano più pozzetti e raggruppare gli organoidi da più pozzi nello stesso tubo da 15 ml.
  5. Ridurre gli organoidi a 300 x g per 3 minuti a 4 °C.
  6. Al momento della centrifugazione, assicurarsi che ci siano quattro frazioni visibili: una frazione di base con organoidi sani, una frazione di matrice centrale e chiara, una frazione di matrice contenente cellule singole e morte e uno strato superiore di surnatante contenente cellule singole e morte. Rimuovere il surnatante, la frazione di detriti e il più possibile il frammento di matrice chiara senza interrompere il pellet di organoidi.
  7. Piegare delicatamente la punta di una punta della pipetta p1000 (curva di circa 2-5 mm). Pre-rivestire questa punta in PBS2 o Advanced DMEM/F12. Usando questa punta, pipettare gli organoidi su e giù 10-20 volte per interrompere meccanicamente gli organoidi e la matrice rimanente.
  8. Girare verso il basso a 210 x g per 3 minuti a 4 °C.
  9. Come nel passaggio 2.6, rimuovere il surnatante, la frazione di detriti e il maggior numero possibile di frammenti di matrice chiara senza interrompere il pellet delle cripte dissociate. Se cripte sane o piccoli organoidi non hanno formato un pellet trasparente, centrifugare di nuovo a 300 x g per 3 minuti a 4 °C.
  10. Calcolare il volume richiesto di TBEM (80-120 μL per pozzetto di organoidi raccolti a seconda che venga utilizzato un rapporto di passaggio 1:2 o 1:3).
  11. Risospesciare il pellet nel volume calcolato di TBEM e applicare 40 μL per pozzetto alla piastra preriscaldata a 24 pozzetti per formare una cupola. Posizionare direttamente la piastra nell'incubatore (37 °C; 5% CO2) per 15-20 min.
  12. Aggiungere 550 μL di mezzo ENR per pozzetto e incubare a 37 °C e 5% di CO2. Controllare le colture per la formazione di organoidi dopo 24 ore. Sostituire con ENR medio fresco ogni 2-3 giorni dopo il passaggio.

3. Isolamento delle cellule linfoidi innate della lamina propria dell'intestino tenue

NOTA: Questa sezione del protocollo descrive l'isolamento di ILC1 dalla lamina propria murina dell'intestino tenue dei topi reporter RORγtGFP. Ciò comporta la rimozione delle cellule epiteliali, la digestione dei tessuti, la separazione del gradiente di densità dei linfociti e l'isolamento ILC1 tramite smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). L'isolamento FACS seguendo la strategia di gating in Figura 2 richiede il mastermix di colorazione extracellulare (Tabella 4), con i controlli di colorazione aggiuntivi descritti nella Tabella 2 e nella Tabella 3 per la macchina (Tabella 2) e la gating (Tabella 3) impostati. I topi reporter RORγtGFP vengono utilizzati per isolare ILC1 vivo e puro e gate out RORγtGFP+ ILC3. L'elaborazione tissutale per l'isolamento dei linfociti della lamina propria è stata anche ben descritta altrove32.

  1. Lavorazione dei tessuti
    NOTA: il tessuto proveniente da singole repliche biologiche di animali è tenuto separato in questo protocollo. Questi campioni devono essere opportunamente etichettati e conservati sul ghiaccio ogni volta che è possibile. Tutti i reagenti ad eccezione degli enzimi digestivi devono essere autorizzati a raggiungere la temperatura ambiente per garantire una rapida digestione dei tessuti.
    1. Posizionare TBEM sul ghiaccio per scongelare (40 μL/pozzetto). Conservare una piastra standard a 24 pozzetti trattata con coltura tissutale in un incubatore a 37 °C per preriscaldare.
    2. Preparare un tampone fresco per la rimozione epiteliale e un tampone per la digestione (vedere Tabella 1). Preparare il mezzo isotonico a bassa densità di densità di viscosità (LVDGM) (90% LVDGM e 10% 10x PBS), il 40% isotonico LVDGM e l'80% isotonico LVDGM in tampone neutralizzante (Tabella 1).
    3. Abbattere un animale di 6-12 settimane, sezionare l'intestino tenue usando pinze e forbici da microdissezione e posizionare l'intestino in 15 ml di PBS sul ghiaccio.
    4. Immergere l'intestino in PBS su una capsula di 10 cm2 Petri sul ghiaccio e utilizzare una pinza per rimuovere il grasso delicatamente ma completamente dall'intestino.
    5. Rimuovere i cerotti di Peyer (~ 5-10; correndo in una linea opposta alla linea del tessuto adiposo) usando le forbici da microdissezione per esaurire le cellule indurici del tessuto linfoide e le cellule B.
      NOTA: le macchie di Peyer sono assenti in Rag-/- e in altri animali impoveriti di lignaggio. A differenza delle bolle d'aria, le patch di Peyer rimarranno al loro posto se spinte.
    6. Tagliare il tessuto longitudinalmente usando le forbici per microdissezione (preferibilmente con punte arrotondate per evitare perforazioni). Mantenendo l'intestino immerso nella PBS, agitare per rimuovere la materia fecale.
    7. Tagliare il tessuto in pezzi di 2-4 cm di lunghezza e trasferirli in un tubo da 50 ml.
    8. Aggiungere circa 20-40 ml di PBS ghiacciato e agitare vigorosamente per 5-15 s per rimuovere muco e detriti.
    9. Scartare il contenuto del tubo su una capsula di Petri fresca e sostituire i frammenti intestinali nello stesso tubo da 50 ml usando una pinza.
    10. Ripetere i passaggi 3.1.8 e 3.1.9 3-4 volte o fino a quando il PBS non è chiaro.
  2. Rimozione dell'epitelio
    1. Metti i frammenti intestinali in una capsula di Petri fresca sul ghiaccio. Usando una pinza, raccogli i segmenti intestinali e rimuovi il liquido in eccesso picchiettando su una superficie asciutta.
    2. Tagliare il tessuto in pezzi di ~ 0,75-1 cm e trasferirli in un tubo fresco da 50 ml. Aggiungere 5-7 ml di tampone di rimozione epiteliale (Tabella 1). Vortice del tubo e assicurarsi che tutti i segmenti intestinali siano immersi nel tampone.
    3. Incubare i campioni a 37 °C con dondolo (100-150 giri/min) per 12-15 min. Vortice il tubo per 20-30 s.
    4. Ripetere ancora una volta i passaggi 3.2.1-3.2.3, scartando il surnatante torbido (la frazione contiene cellule epiteliali e intraepiteliali) e sostituendolo con un tampone di rimozione epiteliale fresco.
  3. Digestione del tessuto
    1. Mancia il contenuto su una fresca capsula di Petri. Usando la pinza, raccogli i segmenti intestinali e tocca una superficie asciutta per scartare il liquido in eccesso. Metti i segmenti in una capsula di Petri fresca sul ghiaccio.
    2. Raggruppare i segmenti nel centro della capsula di Petri in una massa densa. Usando due bisturi o forbici affilate, triturare finemente il tessuto fino a raggiungere una consistenza viscosa che potrebbe passare attraverso una punta della pipetta p1000.
    3. Usando una pinzetta, posizionare il tessuto tritato in un tubo pulito da 50 ml. Risciacquare la capsula di Petri con 1-2 mL di tampone di digestione (Tabella 1) per raccogliere il tessuto rimanente e raggrupparlo nel tubo da 50 ml con il tessuto triturato.
    4. Aggiungere 5-7 ml di tampone di digestione al tessuto triturato e assicurarsi che tutto il tessuto sia raccolto sul fondo del tubo.
    5. Incubare i campioni a 37 °C, con dondolo medio (~100-150 giri/min) per 15 min. Vortice del tubo per 20-30 s ogni 5 minuti per aiutare la digestione.
    6. Mentre i campioni sono in incubazione, posizionare un filtro cellulare da 40 μm sopra una provetta fresca da 50 ml per ciascun campione. Rivestire i filtri con 1-2 mL di tampone neutralizzante (Tabella 1).
    7. Vortice i campioni per 20-30 s dopo che l'incubazione è terminata.
    8. Filtrare il tessuto parzialmente digerito attraverso il filtro rivestito da 40 μm nel tubo da 50 ml contenente tampone neutralizzante.
    9. Utilizzare una pinzetta per raccogliere il tessuto non digerito dal filtro da 40 μm e rimetterlo nel tubo da 50 ml in cui è stata eseguita la digestione, per il secondo ciclo di digestione. Rimuovere i filtri e risciacquarli con un tampone di digestione per rimuovere qualsiasi tessuto non digerito aderente al filtro.
    10. Una volta che il maggior numero possibile di tessuto non digerito è stato rimosso dal filtro e riposizionato nel tubo da 50 ml in cui è stata eseguita la digestione, sciacquare il filtro con un tampone neutralizzante da 1-2 ml sul tubo da 50 ml contenente il surnatante filtrato.
    11. Aggiungere 20-25 ml di tampone neutralizzante al surnatante filtrato e metterlo sul ghiaccio per mantenere la vitalità delle cellule isolate durante il secondo ciclo di digestione dei tessuti.
    12. Aggiungere altri 5-10 ml di tampone di digestione al tessuto non digerito e ripetere i passaggi 3.3.5-3.3.10, assicurandosi di filtrare il tessuto digerito nello stesso tubo utilizzato nel passaggio 3.3.8 (lo stesso filtro può anche essere riutilizzato). Risciacquare il filtro con tampone neutralizzante fino al raggiungimento della linea di 50 ml, quindi eliminare qualsiasi tessuto non digerito rimanente.
  4. Isolamento dei linfociti per gradiente di densità
    1. Ruotare i supernatanti raccolti per ogni replica biologica a 500 x g per 10 minuti.
    2. Durante il passaggio 3.4.1, aggiungere 5 mL di LVDGM isotonico all'80% a un tubo da 15 mL per ogni replica biologica.
    3. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante dal tessuto filtrato e digerito. Risospesciare il pellet in 10 ml di LVDGM isotonico al 40%, assicurando che il pellet sia ben omogeneizzato e che non rimangano pezzi di grandi dimensioni.
    4. Impostando l'aiuto della pipetta alla sua impostazione più lenta, inclinare il tubo da 15 ml contenente l'80% di LVDGM isotonico e sovrapporre molto delicatamente i 10 mL di sospensione cellulare in LVDGM isotonico al 40% assicurando che la sospensione cellulare non si mescoli con la frazione dell'80%.
      NOTA: Se le frazioni dovessero accidentalmente mescolarsi, distribuire rapidamente i linfociti che hanno raggiunto la frazione dell'80% tra due tubi da 50 ml riempiti con PBS e centrifugare per 10 minuti a 500 x g. Quindi, scartare il surnatante e ripetere i passaggi 3.4.3-3.4.4.
    5. Ruotare i tubi a 900 x g e 20 °C, con l'accelerazione e la deaccelerazione impostate sull'impostazione più bassa per garantire che le frazioni non vengano interrotte. Centrifuga per 20 minuti (escluso il tempo di pausa).
      NOTA: Tutte le procedure da questa fase in poi devono essere condotte in una cappa di coltura tissutale asettica utilizzando materiali e reagenti sterili.
    6. Pre-rivestire un tubo da 50 mL per ogni campione con PBS2 e aggiungere 45 mL di PBS ghiacciato.
    7. Dopo la centrifugazione, rimuovere delicatamente lo strato superiore di detriti dal tubo da 15 ml. Rivestire una punta p1000 con PBS2 e utilizzarla per raccogliere l'interfase carica di linfociti tra i gradienti del 40% -80% nel tubo da 50 ml contenente 45 ml di PBS ghiacciato.
    8. Ruotare i tubi a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
    9. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet in 500 μL di tampone FACS (PBS, 2% FCS, 0,5 mM EDTA e 10 mM HEPES; vedere Tabella 1). Pre-rivestire un filtro da 40 μm con tampone FACS e utilizzarlo per filtrare la sospensione cellulare in un tubo di flusso. Risciacquare il tubo da 50 mL con ulteriori 500 μL di tampone FACS e filtrare nello stesso tubo di flusso.
    10. Rimuovere un'aliquota di 10 μL dal risultante 1 mL di sospensione cellulare. Contare la resa dei linfociti utilizzando un contatore cellulare o un emocitometro e calcolare la concentrazione cellulare per ciascun campione.
  5. Preparazione del campione per la cernita - colorazione extracellulare
    NOTA: Gli anticorpi utilizzati nel mastermix di colorazione extracellulare, così come i reagenti per preparare il colorante di vitalità fissabile e la soluzione di blocco Fc, sono utilizzati in concentrazioni sufficienti per un massimo di 5 x 106 celle per 100 μL. I volumi devono essere regolati di conseguenza. Affinché la compensazione della macchina FACS per ordinare ILC1, sono necessari controlli monocolore per ciascuno dei fluorofori nel mastermix di colorazione extracellulare. Per gli anticorpi, possono essere utilizzate perle di compensazione che contengono una popolazione di perline leganti anticorpi positivi e una popolazione di perline non leganti anticorpali negativi. Per il controllo del colorante di vitalità fissabile ultravioletto (UV) a colore singolo, è possibile utilizzare perline di compensazione che contengono popolazioni ammino-reattive (per segnale positivo) e non reattive (per segnale negativo). Non è consigliabile utilizzare cellule dal RORγtGFPtopi reporter per il controllo del colorante di vitalità fissabile UV a colore singolo, poiché queste cellule conterranno un GFP+ segnale.
    1. Rimuovere una piccola aliquota di ~10 μL da ciascun campione e raggrupparla in un tubo di flusso separato contenente 250 μL di tampone FACS. Posizionare il tubo sul ghiaccio. Questo verrà utilizzato per il controllo non macchiato.
    2. Aggiungere 1 mL di PBS al volume rimanente nelle provette del campione. Centrifuga a 300-400 x g per 3-5 min.
    3. Preparare 200 μL di soluzione colorante di vitalità fissabile ai raggi UV per campione. Colorante di vitalità fissabile UV diluito (risospeso in DMSO seguendo le istruzioni del produttore) 1:500 in PBS (o seguendo le istruzioni del produttore).
    4. Scartare il surnatante e risospesciare i campioni in 200 μL di soluzione colorante di vitalità fissabile UV. Vorticare i tubi e incubare al buio a 4 °C per 10-15 min.
    5. Aggiungere 2 mL di tampone FACS ai tubi per spegnere il colorante di vitalità fissabile UV, vortice per 10 s e centrifugare i tubi a 300-400 x g per 3-5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante dai tubi centrifugati.
    6. Preparare 200 μL di soluzione di blocco Fc per campione (0,25 mg/mL di blocco Fc nel tampone FACS).
    7. Aggiungere 200 μL di soluzione di blocco Fc a ciascuno dei campioni dal punto 3.5.5, vortice per 10 s e incubare al buio a 4 °C per 10 minuti.
    8. Aggiungere 500 μL di tampone FACS a un tubo di flusso fresco. Rimuovere un'aliquota di 2-5 μL da ciascun campione e raggrupparla nel tubo per i controlli di fluorescenza meno uno (FMO).
    9. Ruotare il tubo FMO per 10 s e distribuirlo uniformemente (100 μL per tubo) in tubi a flusso fresco etichettati per ciascuno dei controlli FMO (Cocktail di linea FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO e NK1.1 FMO; vedere Tabella 3). Aggiungere tutti gli anticorpi tranne l'anticorpo di interesse per ciascun tubo (come descritto nella Tabella 3) e vortice per 10 s. Mettere da parte i comandi FMO al buio a 4 °C.
    10. Centrifugare i campioni (non controlli FMO) a 300-400 x g per 3-5 min a 4 °C.
    11. Preparare mastermix di colorazione extracellulare (200 μL per campione) con le diluizioni anticorpali finali come descritto nella Tabella 4. Regolare il volume di colorazione per la concentrazione cellulare appropriata (fino a 5 x 106 celle per 100 μL) in base al conteggio delle cellule dal passaggio 3.4.10.
    12. Aggiungere il mastermix di colorazione extracellulare ai campioni, vortice per 10 s e metterli da parte al buio a 4 °C.
    13. Preparare un nuovo controllo monocolore per ogni anticorpo destinato ad essere utilizzato nella strategia di gating (Figura 2). Perle di compensazione degli anticorpi Vortex per 20 s, aggiungere 1 goccia di perline a un tubo di flusso, macchiare con 0,5 μL di anticorpo (come mostrato nella Tabella 2 o seguendo le istruzioni del produttore) e vortice per 10 s.
    14. Preparare un controllo monocolore del colorante di vitalità fissabile ai raggi UV utilizzando un kit di perline di compensazione ammino-reattive. Perle di compensazione ammino-reattive al vortice per 20 s, aggiungere 1 μL di colorante UV vivo/morto (come mostrato nella Tabella 2 o seguendo le istruzioni del produttore) e vortice per 10 s.
    15. Incubare i campioni, gli FMO e i controlli monocolore al buio per 30 minuti a 4 °C.
    16. Durante questo periodo, preparare i tubi per raccogliere le cellule selezionate. Aggiungere 400-500 μL del 10% fbS in provette Advanced DMEM/F12 a 1,5 mL per ciascun campione.
    17. Dopo l'incubazione, aggiungere 2 ml di PBS2 a ciascuno dei campioni, ai controlli FMO e ai controlli a colore singolo.
    18. Centrifugare i campioni, i controlli FMO e i controlli monocolore a 300-400 x g per 3-5 minuti a 4 °C.
    19. Scartare il surnatante da tutti i tubi centrifugati. Sospendere i campioni e i controlli FMO in 250 μL di tampone FACS e vortice per 10 s.
    20. Sospendere i controlli a colore singolo in 250 μL di PBS2. Aggiungere 1 goccia di perline amminiche non reattive al solo controllo monocolore del colorante di vitalità fissabile UV. Vortex tutti i controlli per 10 s.
    21. Le celle sono ora pronte per essere ordinate. Mantenere campioni, controlli FMO e controlli a colore singolo sul ghiaccio al buio quando possibile per migliorare la vitalità cellulare e prevenire la perdita di segnale da fotosbiancamento.

4. Co-coltura di piccoli organoidi intestinali con cellule linfoidi innate

NOTA: Questa sezione descrive la co-coltura di ILC1 intestinale murino ordinato (isolato seguendo il protocollo di cui al paragrafo 3) con organoidi murini a piccoli intestinali (descritti nei paragrafi 1 e 2). Gli organoidi devono essere utilizzati in modo ottimale 1-2 giorni dopo il passaggio. La co-coltura comporta la raccolta degli organoidi, l'aggiunta del numero appropriato di ILC1, la centrifugazione agli organoidi a pellet e ILC1 insieme e la riesuspensione in TBEM. Completa questa sezione il prima possibile una volta che ILC1 è stato isolato. Tutte le procedure devono essere condotte in un ambiente asettico utilizzando materiali e reagenti sterili.

  1. Assicurarsi che TBEM dal passaggio 3.1.1 sia stato scongelato.
  2. Raccogli gli organoidi di 1-2 giorni come descritto nei passaggi 2.3 e 2.4.
  3. Sospendere il pellet organoide in 1 mL di DMEM/F12 avanzato freddo ghiacciato. Non piegare la punta p1000 come fatto durante il passaggio degli organoidi, poiché l'intenzione qui è quella di mantenere la struttura organoide per la co-coltura. Se necessario, posizionare gli organoidi in tubi separati da 1,5 ml rivestiti pbs2 su ghiaccio per un breve periodo da distribuire tra diverse condizioni di cocoltura.
    NOTA: iniziare la preparazione degli organoidi solo quando i campioni ILC sono pronti per la co-coltura; lavorare sul ghiaccio e rapidamente non appena gli organoidi sono stati raccolti per ridurre al minimo la morte delle cellule epiteliali.
  4. Pre-rivestire un tubo da 1,5 ml con PBS2 per campione di replica ILC. Distribuire ~ 100-200 organoidi (circa 1 pozzetto di una piastra a 24 pozzetti) in ciascun tubo.
  5. Pre-rivestire una punta p1000 in PBS2 e utilizzarla per valutare il volume di ILC1 dopo la purificazione FACS (250-300 μL + volume ordinato). Determinare la concentrazione di ILC1 per mL utilizzando il numero di celle registrate dall'ordinamento e determinare il volume richiesto.
  6. Utilizzando la stessa punta p1000 rivestita PBS2, aggiungere non meno di 500 ILC1 al tubo da 1,5 ml rivestito PBS2 contenente gli organoidi. Se il numero di ILC1 prodotti dal tipo è inferiore a 500, aggiungere l'organoide direttamente al tubo contenente il tipo originale per ridurre al minimo la perdita di cellule dal trasferimento.
  7. Spin down ILC1 e organoidi a 300 x g per 5 min a 4 °C. Se possibile, evitare centrifughe da tavolo di piccolo diametro, in quanto queste raggrupperanno le celle lungo il bordo dell'interno del tubo invece di creare un pellet sulla punta del tubo. Poiché i numeri di cella sono molto bassi, è imperativo ridurre al minimo la perdita di cellule durante questi passaggi.
  8. Rimuovere lentamente e delicatamente il più possibile il surnatante senza disturbare il pellet (che potrebbe non essere visibile a occhio, specialmente nei controlli senza organoidi solo ILC). Posizionare il campione sul ghiaccio.
  9. Sospendere il pellet freddo in 30 μL per pozzetto di TBEM. Tenendo il tubo su una superficie fredda (ad esempio, una piccola scatola di ghiaccio posta nella cappa di coltura del tessuto), mescolare gli organoidi e l'ILC almeno 10-15 volte per garantire una distribuzione uniforme. Triturare frequentemente ma delicatamente, per evitare di danneggiare gli organoidi e la formazione di bolle.
  10. Applicare 30 μL per pozzetto di organoidi ILC in TBEM su una piastra preriscaldata a 24 o 48 pozzetti per formare una singola cupola. Posizionare direttamente la piastra nell'incubatore (37 °C e 5% CO2) per 10-20 min.
    NOTA: si consiglia vivamente di impostare controlli solo ILC e solo organoidi per l'analisi a valle. Gli ILC1 sono rari, ma GFP-ILC2 può essere sostituito dai controlli di immunofluorescenza o di citometria a flusso FSC/SSC ove scientificamente appropriato.
  11. Aggiungere 550 μL (per pozzetto) di mezzo ILC1 completo (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-Mercaptoetanolo; vedere Tabella 1) con qualsiasi citochina sperimentale desiderata o anticorpi bloccanti e incubare a 37 °C e 5% CO2 per 24 ore.
  12. Dopo 24 ore, rimuovere delicatamente la piastra dall'incubatrice e lasciare che la piastra si sieda in una cappa di coltura tissutale per 1 minuto per garantire che i linfociti siano sistemati.
  13. Rimuovere 200-250 μL di media e metterlo in un pozzo vuoto di una piastra a 24 pozzetti. Controllare questo surnatante con un microscopio invertito per assicurarsi che non siano stati rimossi i linfociti.
    1. Se il surnatante è chiaro, aggiungere 300 μL di mezzo ILC1 fresco alla co-coltura nel pozzo originale. Se i linfociti sono presenti nel surnatante, centrifugare a 300-400 x g per 3-5 minuti a 4 °C e risospendere in 300 μL di mezzo ILC1 fresco e aggiungerlo ai restanti 200-250 μL di terreno nel pozzetto originale. Assicurarsi di ricostituire i supporti ogni 1-2 giorni o quando il supporto diventa arancione pallido / giallo.
      NOTA: non lasciare evaporare il supporto in misura sufficiente da non rompere la superficie del supporto da parte della punta della cupola della matrice. Assicurarsi sempre che la matrice sia completamente sommersa. L'evaporazione eccessiva può essere evitata utilizzando pozzi centrali nelle piastre di coltura tissutale e aggiungendo ~ 600 μL di PBS ai pozzi circostanti. Le co-colture con ILC adulto sono stabili per 1-4 giorni, dopo di che gli organoidi che sono stati seminati senza gravi interruzioni si romperanno e saranno riseminati come nuove cripte. Se si analizza l'epitelio, si raccomanda di analizzare le colture entro 1-4 giorni dalla creazione di co-colture.
    2. Eseguire analisi a valle utilizzando l'immunofluorescenza, la citometria a flusso o la purificazione FACS delle popolazioni bersaglio in tampone di lisi per l'analisi dell'espressione genica mediante RNA-seq o RT-qPCR a singola cellula o massa, come descritto nel riferimento8.

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Representative Results

Una volta completate con successo, le cripte appena isolate dovrebbero formare strutture di cripte in erba entro 2-4 giorni (Figura 1A). Le colture organoidi sane e robuste dovrebbero crescere attivamente e possono essere passate ed espanse come dettagliato nel protocollo.

Questo protocollo descrive l'isolamento dell'ILC1 dell'intestino tenue dalla linea di reporter transgenici murini RORγtGFP , che consente l'isolamento di ILC1 vivo mediante FACS (Figura 2). Utilizzando il protocollo qui descritto, l'intervallo di conteggio ILC1 previsto è di 350-3.500 celle isolate.

Dopo essere state seminate con organoidi, le co-colture possono essere visualizzate mediante immunocitochimica (Figura 3A-B). IlLC e cellule epiteliali possono anche essere analizzati mediante citometria a flusso, come dimostrato nella Figura 3C. ILC1 sovraregola l'epitelio CD44, come caratterizzato da citometria a flusso (Figura 4A-B) e immunocitochimica (Figura 4C). In particolare, ILC1 induce l'espressione della variante di giunzione CD44 v6 negli organoidi, come dimostrato da RT-qPCR (Figura 4D).

Tabella 1: Composizioni di supporti e buffer. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Controlli a colore singolo. Composizione di controlli monocolore per isolare la lamina propria ILC1 dell'intestino tenue utilizzando la strategia di gating definita nella Figura 2. I dettagli degli anticorpi utilizzati possono essere trovati nella Tabella dei materiali. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Mastermix di fluorescenza meno uno (FMO). Composizione di mastermix FMO per cocktail Lineage FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO e NK1.1 FMO. I mastermix FMO contengono tutti gli anticorpi utilizzati tranne l'anticorpo di interesse e sono utilizzati per colorare un'aliquota del campione. Il cocktail di lineage è definito come CD19, CD3e, CD5, Ly-6G / Ly-6C. I dettagli degli anticorpi utilizzati possono essere trovati nella Tabella dei materiali. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4: Mastermix di colorazione extracellulare. Le concentrazioni sono regolate per la colorazione fino a 5 x 106 cellule in 200 μL di tampone FACS. I dettagli degli anticorpi utilizzati possono essere trovati nella Tabella dei materiali. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Figure 1
Figura 1: Organoidi intestinali murini. Immagine rappresentativa di (A) organoidi intestinali generati con successo 2-3 giorni dopo il passaggio e (B) coltura infruttuosa. Barra della scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Strategia di Gating per isolare gli ILC1 dalla lamina propria dell'intestino tenue dei topi reporter transgenici RORγtGFP . Grafico citometrico a flusso rappresentativo dell'isolamento di ILC1 dalla lamina propria dell'intestino tenue dei topi reporter transgenici RORγtGFP di FACS. Gli ILC1 sono definiti live, CD45+, Lin- (CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORγt-, NKp46+ e NK1.1+. Rappresentante da N = >50 topi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Co-colture organoidi e ILC1. Immagini in campo luminoso (A), immagini al microscopio confocale (B) e grafici FACS (C) di organoidi intestinali piccoli (SIO) coltivati da soli (in alto) o con ILC1 (in basso) (rappresentativi di esperimenti con ILC1 da N = 3 topi). (B) La colorazione con CD45 illustra ILC1 e la proteina 1 (ZO-1) marca le cellule epiteliali negli organoidi. Barre della scala: 50 μm. (C) Precedentemente recintato su singole cellule vive. La molecola di adesione cellulare epiteliale (EpCAM) marca le cellule epiteliali intestinali (IEC) negli organoidi e CD45 marca ilC1. La figura è adattata dal riferimento8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Gli ILC1 in co-coltura con organoidi intestinali piccoli guidano l'upregulation di CD44 nelle cellule epiteliali intestinali. (A) Un grafico citometrico rappresentativo dell'espressione di CD44 in cellule epiteliali positive alla molecola di adesione cellulare epiteliale (EpCAM) (live, CD45-, EpCAM+) da piccoli organoidi intestinali (SIO) coltivati da soli (a sinistra) o con ILC1 per 4 giorni (a destra). (B) Quantificazione del flusso dell'espressione di CD44 in cellule epiteliali intestinali (IEC) (ILC1 da N = 5 topi). (C) Immagine rappresentativa al microscopio confocale della localizzazione di CD44 in d4 SIO da solo (a sinistra) o co-coltivato con ILC1 (a destra) (rappresentativo di N = 3 topi). Barre di scala: 50 μm. (D) RT-qPCR con primer specifici per esoni per le varianti di giunzione CD44 v4 e v6 (N = 3). Questa cifra è adattata dal riferimento8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo protocollo descrive i metodi per stabilire organoidi murini dell'intestino tenue, isolando il raro ILC1 riducendo al minimo la perdita di linfociti durante il protocollo di dissociazione intestinale e stabilendo co-colture tra questi due compartimenti. Ci sono molti passaggi per questo protocollo, e mentre alcuni sono specifici per ILC1, questo approccio può essere applicato ad altri tipi di cellule immunitarie intestinali e le configurazioni di co-coltura possono essere adattate in modo modulare per soddisfare le singole domande di ricerca. Diversi passaggi critici (da cui si consiglia di non deviare), nonché le linee guida per la risoluzione dei problemi per gli elementi tecnicamente più impegnativi di questo protocollo, sono evidenziati qui.

L'uso di organoidi intestinali murini da singole cellule staminali intestinali Lgr5+-eGFP sta diventando sempre più consolidato33,34; tuttavia, in questo protocollo, si suggerisce di isolare intere cripte intatte di Lieberkuehn da animali CD45.1. Non solo le cripte intatte recuperano più rapidamente delle singole cellule Lgr5+, ma l'uso di animali CD45.1 senza un reporter GFP assicura che nessun ILC CD45.2+ contaminante incrociato venga analizzato dalle co-colture organoidi ed è compatibile con l'uso di cellule immunitarie contenenti un reporter basato su GFP. Nell'esperienza degli autori, nessuna cellula mesenchimale o immunitaria si trasmette dopo 1-3 passaggi degli organoidi. L'uso di CD45.2 o di altri animali per la creazione di organoidi è quindi del tutto accettabile. Durante la costituzione degli organoidi, se le cripte non sono presenti al punto 1.1.19, può essere necessario uno scuotimento manuale più rigoroso per rimuovere le cripte intatte. Fattori ambientali come la temperatura ambiente (ad esempio, se la procedura viene eseguita in estate o in inverno) possono aggiungere una certa variabilità ai tempi di incubazione durante la dissociazione. La densità di semina delle cripte avrà un impatto sulla resa iniziale della formazione di organoidi; si raccomanda quindi di seminare un minimo di due diverse densità per garantire il successo (ad esempio, 200-750 suggerite qui, ma questa gamma può essere adattata in base alle esigenze individuali).

Una volta stabilite, le colture organoidi intestinali sono eterogenee sia tra le linee stabilite dallo stesso ceppo di topo, lungo il tratto gastrointestinale (ad esempio, duodeno contro ileo), sia all'interno dello stesso pozzo di colture organoidi35,36. Sebbene questo protocollo sia risultato robusto su molti lotti diversi di organoidi, questa eterogeneità potrebbe contribuire alla variabilità dei dati. È buona norma essere coerenti con la manutenzione degli organoidi (passaggio e modifiche dei fluidi) per ridurre il rumore tecnico derivante da dati fenotipicamente irrilevanti. Ciò include l'essere coerenti con la linea temporale di passaggio pre-semina e con la forza utilizzata per dissociare gli organoidi. Si raccomanda inoltre di utilizzare la stessa matrice basale per gli esperimenti da confrontare e per gli esperimenti da eseguire utilizzando repliche biologiche di organoidi derivati da animali diversi (quando finanziariamente e tecnicamente fattibili) per garantire che i risultati siano robustamente riproducibili.

Nello stabilire co-colture, il rapporto tra cellule immunitarie ed epiteliali è una considerazione critica che richiederà un'ottimizzazione basata sulle domande di ricerca. Se l'impatto delle cellule epiteliali sull'ILC viene interrogato, il numero di organoidi seminati dovrà essere sufficiente a saturare tutti gli ILC. Al contrario, quando si valuta l'impatto dell'ILC sull'epitelio, diversi rapporti ILC/epitelio possono determinare diversi output fenotipici, riflettendo gli stati differenziali dell'arricchimento del sottoinsieme ILC nella mucosa. La vitalità di ILC1 è ben mantenuta in coltura e la popolazione subirà una lieve espansione, con ~ 500 ILC1 e 100 piccoli organoidi intestinali (SIO) che subiscono un'espansione di 2-3 volte in media. Tuttavia, questa resa sarà influenzata da trattamenti aggiuntivi, con il miglioramento della neutralizzazione del TGF e l'inibizione della p38 che diminuirà il numero assoluto di ILC1 dopo la co-coltura8. Qualsiasi perdita imprevista di oltre il 50% dei numeri ILC1 seminati può essere il risultato di un rapporto squilibrato tra ILC1 e SIO (aumento del numero di cripte seminate), contaminazione DA SIO (assicurarsi che il cocktail antibiotico funzioni e testare il surnatante per il micoplasma) o di problemi di qualità negli stock di citochine, con ILC1 particolarmente sensibile alla mancanza di IL-2 o IL-15. I supernatanti di co-coltura da piastre concentrate a 96 o 48 pozzetti sono stati utilizzati con successo per gli ELISA. Quando si dissociano le co-colture, si raccomanda di incubare le cellule con DNasi dopo una sostituzione delicata della tripsina di 20 minuti o eseguire la dissociazione basata su EDTA a singole cellule per prevenire l'aggregazione cellulare da cellule epiteliali danneggiate.

Un punto di forza di questo protocollo è che bilancia le condizioni di coltura riduzioniste con tipi di cellule complessi. Tuttavia, i comportamenti di altri sottoinsiemi ILC in queste colture possono dipendere da fattori non presenti in questo particolare protocollo. Ad esempio, nel protocollo di Lindemans utilizzato per le co-colture ILC3, IL-23 è stato ulteriormente integrato in supporti di co-coltura per supportare la manutenzione e l'attivazione di ILC38. IL-15 è risultato essere particolarmente importante nel mantenimento di ILC1 nel sistema di co-coltura descritto in questo protocollo, che era congruente con le precedenti segnalazioni di ILC1 che richiedevano questa citochina per l'omeostasi, anche se non lo sviluppo6. Per attivare ILC o mantenere ILC2, il mezzo di crescita potrebbe richiedere un'ulteriore ottimizzazione. Inoltre, altri compartimenti cellulari nell'intestino, a parte l'epitelio, regolano gli ILC. Ad esempio, i neuroni intestinali sono noti per modulare ILC2 in parte attraverso l'attività dei neuropeptidisecreti 37. I fattori microbici influenzano anche il fenotipoILC 38. Questa limitazione potrebbe essere superata attraverso l'aggiunta di questi elementi, ad esempio citochine, peptidi o fattori microbici, nel sistema di co-coltura. Ciò potrebbe anche consentire l'interrogazione dell'interazione tra ILC e compartimenti cellulari multipli in un ambiente riduzionista. Seguendo questa logica, è fondamentale che i reagenti anti-biotici/anti-micotici siano aggiunti e frequentemente reintegrati ai mezzi organoidi prima di stabilire co-colture. È anche fondamentale che tutte le colture vengano eseguite in ambienti asettici perché qualsiasi contaminazione di coltura (ad esempio, crescita fungina o micoplasma) probabilmente attiverebbe l'antigene ILC non specifici, creando fenotipi significativi che potrebbero non essere presenti in colture non contaminate. Per questo motivo, il ritiro di reagenti antibiotici/micotici non è raccomandato, anche nelle co-colture, in quanto non è stato riscontrato che causino un impatto negativo sull'epitelio o sulle ILC.

Questo metodo fornisce un modo unico per caratterizzare i moduli di segnalazione tra ilPC e l'epitelio intestinale, consentendo di studiare la biologia di entrambi i compartimenti. Rispetto ad altri metodi in vitro costituiti da un singolo tipo di cellula, il sistema qui presentato è più paragonabile alla fisiologia in vivo e consente di interrogare molteplici meccanismi di segnalazione potenziali tra cellule epiteliali e ILC. Altri metodi di coltura ILC in vitro si basano prevalentemente su linee cellulari di alimentazione stromale, come OP9 o OP9-DL139. Questa linea è derivata dalla calvaria del topo appena nato, che non è rappresentativa dell'ambiente intestinale. Mentre questi hanno fornito il gold standard per il mantenimento delle ILC in vitro fino ad oggi, soffrono di limitazioni sostanziali nella loro applicazione alla comprensione dell'impatto dell'ILC sull'epitelio.

Il protocollo di co-coltura qui descritto tra organoidi intestinali piccoli murini e ILC derivati dalla lamina propria ha significative applicazioni di ricerca. Questo sistema di co-coltura è già stato utilizzato per determinare il ruolo del TGF-β derivato da ILC1 nell'espansione delle cripte epiteliali CD44+ 8, che contribuisce alla comprensione della dinamica epiteliale nella malattia infiammatoria intestinale. Questi studi contribuiscono a un crescente corpo di letteratura che sostiene l'importanza critica della segnalazione epiteliale-ILC nell'omeostasi intestinale e nell'infiammazione3.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

E.R. riconosce una borsa di dottorato dal Wellcome Trust (215027 / Z / 18 / Z). G.M.J. riconosce una borsa di dottorato dal Wellcome Trust (203757 / Z / 16 / A). D.C. riconosce un dottorato di ricerca. studentship dal NIHR GSTT BRC. J.F.N. riconosce una borsa di studio Marie Skłodowska-Curie, una borsa di studio King's Prize, una borsa di studio RCUK / UKRI Rutherford Fund (MR / R024812 / 1) e un Seed Award in Science dal Wellcome Trust (204394 / Z / 16 / Z). Ringraziamo anche il team principale della citometria a flusso BRC con sede presso il Guy's Hospital. I topi reporter Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 sono stati un generoso dono di G. Eberl (Institut Pasteur, Parigi, Francia). I topi CD45.1 C57BL/6 sono stati gentilmente somministrati da T. Lawrence (King's College London, Londra) e P. Barral (King's College London, Londra).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box - -
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice - -

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References

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Immunologia e infezione Numero 181
Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate
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