Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Co-kultur av murine tynntarmen epitelial organoider med medfødte lymfoide celler

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63554
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1, 1
1Centre for Host-Microbiome Interactions, King’s College London, 2Wellcome Trust Cell Therapies and Regenerative Medicine Ph.D. Programme, King’s College London, 3Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, Cambridge University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen gir detaljerte instruksjoner for å etablere murine tynntarmen organoider, isolere type-1 medfødte lymfoidceller fra murine tynntarmen lamina propria, og etablere 3-dimensjonale (3D) kokulturer mellom begge celletyper for å studere toveis interaksjoner mellom intestinale epitelceller og type-1 medfødte lymfoidceller.

Abstract

Komplekse kokulturer av organoider med immunceller gir et allsidig verktøy for å forhøre de toveis interaksjonene som underbygger den delikate balansen mellom mucosal homeostase. Disse 3D-, multicellulære systemene tilbyr en reduksjonistisk modell for å håndtere flerfaktorielle sykdommer og løse tekniske vanskeligheter som oppstår når man studerer sjeldne celletyper som vevsboende medfødte lymfoidceller (ILCer). Denne artikkelen beskriver et murinsystem som kombinerer tynntarmen organoider og tynntarmen lamina propria avledet helper-lignende type-1 ILCs (ILC1s), som lett kan utvides til andre ILC eller immunpopulasjoner. ILCer er en vevsbeboende befolkning som er spesielt beriket i slimhinnen, hvor de fremmer homeostase og raskt reagerer på skade eller infeksjon. Organoide samkulturer med ILCer har allerede begynt å kaste lys over nye epitel-immunsignalmoduler i tarmen, og avslører hvordan forskjellige ILC-undergrupper påvirker intestinal epitelial barriereintegritet og regenerering. Denne protokollen vil muliggjøre ytterligere undersøkelser av gjensidige interaksjoner mellom epitelceller og immunceller, som har potensial til å gi ny innsikt i mekanismene for mucosal homeostase og betennelse.

Introduction

Kommunikasjon mellom tarmepitelet og tarmboende immunsystem er sentralt for vedlikehold av intestinal homeostase1. Forstyrrelser i disse interaksjonene er forbundet med både lokale og systemiske sykdommer, inkludert inflammatorisk tarmsykdom (IBD) og gastrointestinal kreft2. Et bemerkelsesverdig eksempel på en nylig beskrevet kritisk regulator av homeostase kommer fra studiet av medfødte lymfoide celler (ILCer), som har dukket opp som nøkkelspillere i tarmimmunitetslandskapet3. ILCer er en gruppe heterogene medfødte immunceller som regulerer intestinal homeostase og orkestrerer betennelse i stor grad gjennom cytokinmediert signal4.

Murine ILCer er bredt delt inn i undertyper basert på transkripsjonsfaktor, reseptor og cytokinuttrykksprofiler5. Type-1 ILCer, som inkluderer cytotoksiske natural killer (NK)-celler og hjelperlignende type-1 ILCer (ILC1s), defineres ved uttrykk for transkripsjonsfaktoren (eomesodermin) Eomes og T-box protein uttrykt i T-celler (T-bet)6, henholdsvis, og utskille cytokiner assosiert med T-hjelper type-1 (TH1) immunitet: interferon-γ (IFNγ) og tumornekrosefaktor (TNF), som svar på interleukin (IL)-12, IL-15 og IL-187. Under homeostase utskiller vevsboende ILC1s Transforming Growth Factor β (TGF-β) for å drive epitelproliferasjon og matrise ombygging8. Type-2 ILCer (ILC2s) reagerer primært på helminthinfeksjon via sekresjon av T-hjelper type 2 (TH2) assosierte cytokiner: IL-4, IL-5, og IL-13, og er preget av uttrykk for retinoinsyrerelatert foreldreløs reseptor (ROR) α (ROR-α)9 og GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 . Hos mus er intestinale "inflammatoriske" ILC2s ytterligere preget av uttrykk for Killer celle lectin-lignende reseptor (underfamilie G medlem 1, KLRG)13 hvor de reagerer på epitelial tuft-celle avledet IL-2514,15. Til slutt skriver du inn-3 ILCer, som inkluderer lymfoide vevs induserceller og hjelperlignende type-3 ILCer (ILC3s), er avhengige av transkripsjonsfaktoren ROR-γt16, og klynger seg inn i grupper som skiller ut enten Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), IL-17 eller IL-22 som svar på lokale IL-1β og IL-23 signaler17. Lymfoide vevsinduserceller klynger seg i Peyers flekker og er avgjørende for utviklingen av disse sekundære lymfoide organene under utvikling18, mens ILC3s er den mest tallrike ILC-subtypen i den voksne murine tynntarmen lamina propria. Et av de tidligste murin intestinale organoid-kokultursystemene med ILC3s ble utnyttet til å erte fra hverandre virkningen av cytokin IL-22 på signaltransduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT-3) mediert Leucine-Rich Repeat som inneholder G Protein Coupled Receptor 5 (Lgr5)+ intestinal stamcelleproliferasjon19, et kraftig eksempel på en regenerativ ILC-epitelinteraksjon. ILCer viser avtrykk-heterogenitet mellom organer 20,21 og utviser plastisitet mellom delsett som svar på polariserende cytokiner22. Hva som driver disse vevsspesifikke avtrykkene og plastisitetsforskjellene, og hvilken rolle de spiller i kroniske sykdommer som IBD23, forblir spennende emner som kan tas opp ved hjelp av organoide samkulturer.

Intestinale organoider har dukket opp som en vellykket og pålitelig modell for å studere tarmepitelet 24,25. Disse genereres ved å dyrke intestinale epiteliale Lgr5+ stamceller, eller hele isolerte krypter, som inkluderer Paneth-celler som en endogene kilde til Wnt Family Member 3A (Wnt3a). Disse 3D-strukturene opprettholdes enten i syntetiske hydrogeler26 eller i biomaterialer som etterligner basal lamina propria, for eksempel Termisk-krysskobling Basal Extracellular Matrix (TBEM), og er ytterligere supplert med vekstfaktorer som etterligner den omkringliggende nisjen, spesielt Epithelial Growth Factor (EGF), Bone Morphogenetic Protein (BMP)-inhibitor Noggin, og en Lgr5-ligand og Wnt-agonist R-Spondin127 . Under disse forholdene opprettholder organoider epitelial apico-basal polaritet og rekapitulerer krypt-villi-strukturen i tarmepitelet med spirende stamcellekrypter som terminalt skiller seg ut i absorptive og sekretoriske celler i midten av organoiden, som deretter kaster inn i den indre pseudolumen av anoikis28. Selv om intestinale organoider alene har vært enormt fordelaktige som reduksjonistiske modeller for epitelutvikling og dynamikk isolertsett 29,30, har de et enormt fremtidig potensial for å forstå hvordan disse atferdene reguleres, påvirkes eller til og med forstyrres av immunrommet.

I følgende protokoll beskrives en metode for samkultur mellom murin små intestinale organoider og lamina propria avledet ILC1s, som nylig ble brukt til å identifisere hvordan denne befolkningen uventet reduserer tarmsignaturer av betennelse og i stedet bidrar til økt epitelial spredning via TGF-β i dette systemet8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter må gjennomføres i samsvar med og overholde alle relevante regulatoriske og institusjonelle retningslinjer for dyrebruk. Etisk godkjenning for studien beskrevet i følgende artikkel og video ble innhentet i samsvar med og overholdelse av alle relevante regulatoriske og institusjonelle retningslinjer for dyrebruk.

Alle mus ble kastet av cervical dislokasjon i henhold til standard etisk prosedyre, utført av trente individer. Før organ- og vevshøsting ble kutting av lårarterien eller halshugging utført (etter behov for protokollen i hånden) som bekreftende vurderinger av døden. Dyr ble plassert under spesifikke patogenfrie forhold (med mindre annet er oppgitt) på en akkreditert kommersiell enhet og King's College London dyreenhet i samsvar med UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (UK Home Office Project License (PPL:70/7869 til september 2018; P9720273E fra september 2018).

1. Etablering av murin små intestinale organoider

MERK: Denne delen av protokollen beskriver genereringen av intestinale organoider fra murin tynntarmen. Krypter isoleres først fra vev, brukes på nytt i TBEM, og inkuberes deretter med medier som inneholder EGF, Noggin og R-Spondin (ENR). Etablering av murin små intestinale organoider har også vært godt beskrevet andre steder 24,25,27.

  1. Plasser TBEM på isen for å tine (40 μL/brønn) og legg en standard vevskultur behandlet (refererer til plater med en hydrofil og negativt ladet overflate) 24-brønnsplate i en 37 °C inkubator for å forvarme.
    MERK: 500 μL TBEM vil tine i ca. 2-4 timer; Ikke la den stå ved romtemperatur.
  2. Forbered ~4 ml eller 550 ml per brønn med ENR-medium ved å tilsette EGF, Noggin og R-Spondin i basalmedium (tabell 1) og plasser i en inkubator på 37 °C.
  3. Cull et 6-12 uker gammelt dyr og disseker ut tynntarmen ved hjelp av tang og mikrodeseksjon saks. Plasser den i 15 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) på is.
  4. Bruk magen og caecum som orienteringspunkter, isoler ønsket region av tynntarmen (tolvfingertarmen, jejunum eller ileum). I denne protokollen er ileum isolert.
  5. Senk tarmen i PBS på en 10 cm2 Petri-tallerken på is. Bruk tang, fjern fett forsiktig, men helt, fra tarmen.
  6. Klipp vevet langsgående ved hjelp av mikrodesisseksjonssaks (helst med avrundede spisser for å unngå perforering). Holde tarmen nedsenket i PBS, riste for å fjerne fekal materie, og opprettholde slimete siden opp for å spore vev orientering.
  7. Overfør vev til det tørre lokket på en Petri-tallerken på is, og plasser tarmens slimete / villus side opp. Hold den ene enden av tarmen med tang, skrap forsiktig bort slim ved hjelp av den vinklede kanten av en ren glasssklie.
  8. Fyll platen med iskald PBS og skyll vevet.
  9. Forbelegg et 50 ml rør med PBS2 (PBS + 2% FCS; se tabell 1) for å forhindre vedheft av vevet til plasten og tilsett 10 ml iskald PBS til dette røret. Skjær tarmen i små (~2 mm) segmenter og overfør dem til 50 ml-røret forhåndsbelagt med PBS2.
  10. Bruk en 25 ml pipette forhåndsbelagt med PBS2, pipette segmentene opp og ned 5-10 ganger for å rengjøre vevsfragmentene.
  11. La segmentene slå seg til ro med 15-30 s, fjern og kast PBS-supernatanten, og gjenta trinn 1.10 og 1.11 til løsningen er klar (ca. 3-4 ganger).
  12. La segmentene slå seg ned og kaste PBS-supernatanten. Tilsett 30 ml iskald kryptisolasjonsbuffer (tabell 1).
  13. Plasser rørene på en horisontal rulle eller vippe ved 30-60 o/min (eller skånsom) i 30 min ved 4 °C. Ikke inkuber ved raskere hastigheter, høyere temperaturer eller lengre varighet, da kryptene for tidlig vil løsne og bli enkeltceller med lavere levedyktighet og utbytte.
    MERK: Fra dette stadiet og fremover bør alle prosedyrer utføres i et aseptisk miljø ved hjelp av sterile materialer og reagenser.
  14. La tarmsegmenter slå seg ned ved foten av 50 ml-røret. Fjern kryptisolasjonsbufferen uten å forstyrre de avgjorte segmentene og overfør den til et 50 ml rør på is.
    MERK: Hvis kryptisolasjonsprosessen var for streng, kan krypter ses i denne brøkdelen. Det kan derfor holdes som reserve, men vil optimalt bli forkastet på slutten av protokollen.
  15. Tilsett 20 ml iskald PBS til tarmsegmenter. Ved hjelp av en 25 ml pipette forhåndsbelagt med PBS2, pipette tarmsegmenter opp og ned 5-8 ganger.
  16. La segmentene nøye seg med 30 s. Forbelegg et 50 ml rør og 25 ml pipette med PBS2. Bruk denne pipetten til å samle supernatanten (brøkdel 1) inn i det forhåndsbelagte 50 ml-røret og legg røret på is.
    MERK: Denne fraksjonen tjener til å skylle bort den gjenværende kryptisolasjonsbufferen. Imidlertid fungerer det også som et ekstra kvalitetskontrolltrinn; Hvis pipettering var for kraftig, vil krypter være rikelig i denne skyllefraksjonen, og hvis den var for mild, vil det være svært lite rusk i denne fraksjonen. Optimalt kastes brøkdel 1 på slutten av protokollen, men den kan brukes til å lage organoider hvis det oppstår problemer med fraksjoner 2-4 oppnådd nedenfor.
  17. Gjenta trinn 1,15 og 1,16, men tilsett 10 ml iskald PBS i stedet for 20 ml og legg supernatanten i et friskt 50 ml rør forhåndsbelagt med PBS2 (brøkdel 2).
  18. Gjenta trinn 1.17 to ganger mer, men samle den resulterende supernatanten med brøkdel 2 (inn i samme 50 ml rør fra trinn 1.17) for å få brøkdeler 2-4. Dette enkle 50 ml røret skal inneholde de løsnede kryptene i 30 ml iskald PBS.
  19. Fjern en 50 μL aliquot fra de samlede 2-4 fraksjonene og legg den på en dekslelip. Vurder for tilstedeværelse av epitelkrypter ved hjelp av et invertert lysmikroskop.
    MERK: Hvis det ikke finnes krypter, gjentar du trinn 1.17 og 1.18 med mer kraft under pipettering til kryptene slippes. Kontroller at krypter ikke ble løsnet for tidlig i kryptisolasjonsbufferen fra trinn 1.14 eller i brøkdel 1 fra trinn 1.16.
  20. Forbelegg en 100 μm sil og 50 ml rør med PBS2. Før de samlede kryptfraksjonene gjennom denne silen og inn i det forhåndsbelagte 50 ml-røret.
  21. Spinn ned anstrengte kryptfraksjoner ved 300 x g i 5 min ved 4 °C.
  22. Kast supernatanten og resuspender kryptene i 10 ml iskald Avansert DMEM/F12. Flytt kryptene til et 15 ml rør.
  23. Spinn ned krypter ved 210 x g i 5 min ved 4 °C for å fjerne enkeltceller og lymfocytter.
  24. Resuspend krypter i 1 ml iskald Avansert DMEM/F12.
  25. Fjern en 10 μL aliquot og legg den på en coverlip. Bruk et invertert lysmikroskop og tell antall krypter for å bestemme kryptkonsentrasjonen.
  26. Beregn volumet som kreves for kryptene ~400 og ~1500. Forhåndsbelegg en p1000-spiss med PBS2 og bruk denne spissen til å pipette de nødvendige volumene (som inneholder ~400 og ~1500 krypter) i separate 1,5 ml rør.
  27. Spinn ned kryptene ved 300 x g i 5 min ved 4 °C.
  28. Fjern så mye supernatant som mulig, og bruk deretter kryptene på nytt i 80 μL TBEM plassert på is (forkjøl pipettespisser ved 4 °C for å forhindre matrisegelasjon, som oppstår ved 12 °C).
  29. Fjern 24-brønnsplaten, plassert i trinn 1.1, fra inkubatoren. Forsiktig pipette 40 μL krypter inn i midten av en brønn i en langsom, sirkulær bevegelse for å danne en flat, men 3D-kuppelstruktur, eller i tre separate små kupler.
    MERK: Organoidenes levedyktighet er den laveste i midten av kuppelen der næringsstoffer og gasser gjennomsyrer mindre effektivt31; Dermed er det avgjørende å maksimere overflatearealet som er utsatt for medier, samtidig som klare 3D-strukturer opprettholdes.
  30. Gjenta trinn 1.29 for å skape totalt to brønner med en tetthet på ~ 200 krypter per brønn og to brønner til med en tetthet på ~ 750 krypter per brønn. Plasser platen direkte i en inkubator (37 °C og 5 % CO2) i 15–20 minutter, og pass på at du ikke forstyrrer de viskøse, men likevel flytende matrisekuplene.
  31. Tilsett 550 μL forhåndsvarmede ENR-medier per brønn (fra trinn 1.2) og inkuber i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2. På dette stadiet foreslås det å supplere ENR-medium med 5 μM Wnt agonist (CHIR 99021) og 5 μM Rho Kinase-hemmer (Y-27632) for de første 24 h kulturpostisolasjonen for å forbedre utbyttet og effektiviteten til organoidgenerering av krypter som er fersk isolert fra vev.
    MERK: Krypter bør nærme seg å danne avrundede strukturer innen 24 timer, og kryptknopper skal vises innen 2-4 dager (figur 1A).
  32. Bytt ut med friskt ENR-medium på slutten av inkubasjonen i trinn 1.31, og deretter hver ~ 2 dager eller når fenol pH-indikatoren i kulturmediet blir blek oransje, men før den blir gul.

2. Vedlikehold av murin små intestinale organoider

MERK: Denne delen av protokollen beskriver vedlikehold og passaging av murine små intestinale organoider. Organoider høstes først, og deretter mekanisk forstyrres ved hjelp av en bøyd p1000-spiss. Denne prosessen bryter store organoider som består av mange krypter i flere mindre fragmenter for utvidelse og frigjør døde celler som har akkumulert i pseudolumen. Murine lite intestinal organoid vedlikehold har også vært godt beskrevet andre steder 24,25,27. Alle prosedyrer bør utføres i et aseptisk miljø ved hjelp av sterile materialer og reagenser. Passasje eller utvide organoider en gang hver 4-5 dager, før sprengning av organoider oppstår fra betydelig opphopning av rusk i organoid lumen. Organoider kan passeres i et forhold på 1:2-1:3 avhengig av organoid tetthet, som optimalt vil være mellom 100-200 organoider per brønn.

  1. Som i trinn 1.1 og 1.2, tine TBEM på is (40 μL / brønn) og forberede ENR medium (550 μL per brønn). Plasser den middels og standard vevskulturen behandlet 24-brønnsplate i en 37 °C inkubator.
  2. Fjern platen som inneholder organoider fra inkubatoren. Kast mediet fra brønnen som skal passeres.
  3. Tilsett 500 μL iskald Avansert DMEM/F12 i brønnen. Bruk en p1000-spiss (forhåndsbelagt med medier for å unngå at organoid stikker til spissens interiør), høst organoidene inn i et 15 ml rør.
  4. Skyll bunnen av brønnen med 250-300 μL iskald Avansert DMEM/F12 sikrer at det ikke forblir organoider i brønnen, og basseng inn i 15 ml-røret som inneholder høstede organoider fra trinn 2.3. Gjenta trinn 2,3 og 2,4 ved passering av flere brønner og samle organoidene fra flere brønner i samme 15 ml rør.
  5. Spinn ned organoider ved 300 x g i 3 min ved 4 °C.
  6. Ved sentrifugering, sørg for at det er fire synlige fraksjoner: en basefraksjon med sunne organoider, en sentral og klar matrisefraksjon, en matrisefraksjon som inneholder enkle og døde celler, og et øvre supernatantlag som inneholder enkle og døde celler. Fjern supernatanten, ruskfraksjonen og så mye av det klare matrisefragmentet som mulig uten å forstyrre pellets av organoider.
  7. Bøy forsiktig spissen på en p1000 pipettespiss (ca. 2-5 mm bøyning). Forhåndsbelegg dette tipset i PBS2 eller Avansert DMEM/F12. Bruk dette tipset til å pipette organoidene opp og ned 10-20 ganger for å forstyrre organoidene og den gjenværende matrisen mekanisk.
  8. Spinn ned ved 210 x g i 3 min ved 4 °C.
  9. Som i trinn 2.6, fjern supernatanten, ruskfraksjonen og så mye av det klare matrisefragmentet som mulig uten å forstyrre pellet av dissosierte krypter. Hvis sunne krypter eller små organoider ikke har dannet en klar pellets, sentrifugerer igjen ved 300 x g i 3 min ved 4 °C.
  10. Beregn det nødvendige volumet av TBEM (80-120 μL per brønn av høstede organoider avhengig av om et passasjeforhold på 1:2 eller 1:3 brukes).
  11. Resuspend pellet i det beregnede volumet av TBEM og påfør 40 μL per brønn på den forvarmede 24-brønnsplaten for å danne en kuppel. Plasser platen direkte i inkubatoren (37 °C; 5 % CO2) i 15–20 minutter.
  12. Tilsett 550 μL ENR medium per brønn og inkuber ved 37 °C og 5 % CO2. Kontroller kulturer for organoiddannelse etter 24 timer. Skift ut med frisk ENR medium hver 2-3 dager etter passering.

3. Isolering av små intestinal lamina propria medfødte lymfoide celler

MERK: Denne delen av protokollen beskriver isolering av ILC1 fra murin tynntarmen lamina propria av RORγtGFP reporter mus. Dette innebærer epitelcellefjerning, vevsfordøyelse, tetthetsgradientseparasjon av lymfocytter og ILC1-isolasjon via fluorescensaktivert cellesortering (FACS). FACS-isolasjon etter gatingstrategien i figur 2 krever den ekstracellulære fargingsmestermixen (tabell 4), med de ekstra fargekontrollene beskrevet i tabell 2 og tabell 3 for maskinen (tabell 2) og gating (tabell 3) som er satt opp. RORγtGFP-reportermusene brukes til å isolere levende, ren ILC1 og gate ut RORγtGFP + ILC3. Vevsbehandling for isolering av lamina propria lymfocytter har også blitt godt beskrevet andre steder32.

  1. Vev behandling
    MERK: Vev fra individuelle biologiske animalske replikeringer holdes atskilt i denne protokollen. Disse prøvene skal merkes og oppbevares på is når det er mulig. Alle reagenser unntatt fordøyelsesenzymer bør få lov til å nå romtemperatur for å sikre rask vevsfordøyelse.
    1. Plasser TBEM på isen for å tine (40 μL/brønn). Oppbevar en standard vevskulturbehandlet 24-brønnsplate i en 37 °C inkubator for å forvarte.
    2. Klargjør fersk epitelfjerningsbuffer og fordøyelsesbuffer (se tabell 1). Klargjør isotonisk lav viskositetstetthetsgradientmedium (LVDGM) (90 % LVDGM og 10 % 10x PBS), 40 % isotonisk LVDGM og 80 % isotonisk LVDGM i nøytraliserende buffer (tabell 1).
    3. Cull et 6-12 uker gammelt dyr, disseker ut tynntarmen ved hjelp av tang og mikrodesisseksjon saks, og legg tarmen i 15 ml PBS på is.
    4. Senk tarmen i PBS på en 10 cm2 Petri-tallerken på is og bruk tang for å fjerne fett forsiktig, men helt fra tarmen.
    5. Fjern Peyers flekker (~5-10; kjører i en linje motsatt av fettvevslinjen) ved hjelp av mikrodesisseksjonssaks for å tømme lymfoide vevsinduserceller og B-celler.
      MERK: Peyers flekker er fraværende i Rag-/- og andre lineage-utarmede dyr. I motsetning til luftbobler, vil Peyers flekker forbli på plass hvis de nudges.
    6. Klipp vevet langsgående ved hjelp av mikrodesisseksjonssaks (helst med avrundede spisser for å unngå perforering). Hold tarmen nedsenket i PBS, rist for å fjerne fekal materie.
    7. Skjær vevet i 2-4 cm lange stykker og overfør dem til et 50 ml rør.
    8. Tilsett ca. 20-40 ml iskald PBS og rist kraftig i 5-15 s for å fjerne slim og rusk.
    9. Kast innholdet i røret på en fersk Petri-tallerken og erstatt tarmfragmenter i samme 50 ml rør ved hjelp av tang.
    10. Gjenta trinn 3.1.8 og 3.1.9 3-4 ganger, eller til PBS er klar.
  2. Fjerning av epitel
    1. Legg tarmfragmenter i en fersk Petri-tallerken på is. Bruk tang, plukk opp tarmsegmenter og fjern overflødig væske ved å trykke på en tørr overflate.
    2. Skjær vevet i ~0,75-1 cm stykker og overfør dem til et friskt 50 ml rør. Tilsett 5-7 ml epitelfjerningsbuffer (tabell 1). Virvel røret og sørg for at alle tarmsegmentene er nedsenket i bufferen.
    3. Inkuber prøvene ved 37 °C med gynging (100-150 o/min) i 12-15 min. Virvel røret i 20-30 s.
    4. Gjenta trinn 3.2.1-3.2.3 en gang til, kast den overskyete supernatanten (brøk inneholder epitelceller og intraeptelceller) og erstatt den med fersk epitelial fjerningsbuffer.
  3. Fordøyelse av vevet
    1. Tips innholdet på en fersk Petri-tallerken. Bruk tang, plukk opp tarmsegmentene og trykk på en tørr overflate for å kaste overflødig væske. Legg segmentene i en fersk Petri-tallerken på is.
    2. Klynge segmentene inn i midten av Petri parabolen i en tett masse. Ved hjelp av enten to skalpeller eller skarp saks, makuler vevet fint til det når en viskøs konsistens som kan passere gjennom en p1000 pipettespiss.
    3. Bruk pinsett, plasser hakket vev i et rent 50 ml rør. Skyll Petri-retten med 1-2 ml fordøyelsesbuffer (tabell 1) for å samle eventuelt gjenværende vev og samle det i 50 ml-røret med det ristede vevet.
    4. Tilsett 5-7 ml fordøyelsesbuffer til det ristede vevet og sørg for at alt vev samles på bunnen av røret.
    5. Inkuber prøvene ved 37 °C, med middels gynging (~100-150 o/min) i 15 minutter. Virvel røret i 20-30 s hver 5 min for å hjelpe fordøyelsen.
    6. Mens prøvene inkuberer, plasser en 40 μm cellesil på toppen av et friskt 50 ml rør for hver prøve. Belegge filtrene med 1-2 ml nøytraliserende buffer (tabell 1).
    7. Virvel prøvene i 20-30 s etter at inkubasjonen er ferdig.
    8. Filtrer det delvis fordøyde vevet gjennom det belagte 40 μm-filteret i 50 ml-røret som inneholder nøytraliserende buffer.
    9. Bruk pinsett til å samle ufordøyd vev fra 40 μm-filteret og legg det tilbake i 50 ml-røret som fordøyelsen ble utført i, for andre fordøyelsesrunde. Fjern filtre og skyll dem med fordøyelsesbuffer for å løsne ufordøyd vev som holder seg til filteret.
    10. Når så mye ufordøyd vev som mulig er fjernet fra filteret og plassert tilbake i 50 ml-røret som fordøyelsen ble utført i, skyll filteret med 1-2 ml nøytraliserende buffer over 50 ml-røret som inneholder det filtrerte supernatanten.
    11. Tilsett 20-25 ml nøytraliserende buffer til den filtrerte supernatanten og legg den på is for å opprettholde levedyktigheten til isolerte celler under andre runde med vevsfordøyelse.
    12. Tilsett ytterligere 5-10 ml fordøyelsesbuffer til det ufordøyde vevet og gjenta trinn 3.3.5-3.3.10, og sørg for å filtrere det fordøyde vevet i samme rør som brukt i trinn 3.3.8 (det samme filteret kan også gjenbrukes). Skyll filteret med nøytraliserende buffer til 50 ml-linjen er nådd, og kast deretter eventuelt gjenværende ufordøyd vev.
  4. Lymfocyttisolasjon ved tetthetsgradient
    1. Spinn de oppsamlede supernatantene for hver biologiske replikering ved 500 x g i 10 min.
    2. I trinn 3.4.1, tilsett 5 ml 80% isotonisk LVDGM til et 15 ml rør for hver biologiske replikering.
    3. Etter sentrifugering, kast supernatanten fra det filtrerte, fordøyde vevet. Resuspend pellet i 10 ml av 40% isotonisk LVDGM, og sørg for at pellet er godt homogenisert, og ingen store biter gjenstår.
    4. Innstilling av pipettehjelpen til den tregeste innstillingen, vipp 15 ml-røret som inneholder 80% isotonisk LVDGM, og legg forsiktig over 10 ml cellefjæring i 40% isotonisk LVDGM, slik at celleopphenget ikke blandes med 80% fraksjonen.
      MERK: Hvis fraksjonene skulle blandes ved et uhell, fordeler du raskt lymfocytter som nådde 80% brøkdel mellom to 50 ml rør fylt med PBS, og sentrifuger i 10 min ved 500 x g. Deretter kaster du supernatanten og gjentar trinn 3.4.3-3.4.4.
    5. Snurr rørene ved 900 x g og 20 °C, med akselerasjonen og deacceleration satt til laveste innstilling for å sikre at fraksjonene ikke blir forstyrret. Sentrifuge i 20 min (ikke inkludert pausetid).
      MERK: Alle prosedyrene fra dette trinnet og fremover bør utføres i en aseptisk vevskulturhette ved hjelp av sterile materialer og reagenser.
    6. Forbelegg et 50 ml rør for hver prøve med PBS2 og tilsett 45 ml iskald PBS.
    7. Etter sentrifugering fjerner du forsiktig det øvre rusklaget fra 15 ml-røret. Belegge en p1000-spiss med PBS2 og bruk den til å samle den lymfocyttbelastede interfasen mellom de 40% -80% gradientene i 50 ml-røret som inneholder 45 ml iskald PBS.
    8. Snurr rørene på 300 x g i 5 min ved 4 °C.
    9. Kast den supernatante og resuspend pellet i 500 μL FACS buffer (PBS, 2% FCS, 0,5 mM EDTA og 10 mM HEPES; se tabell 1). Pre-coat et 40 μm filter med FACS buffer og bruke den til å filtrere cellen suspensjon i et strømningsrør. Skyll 50 ml-røret med ytterligere 500 μL FACS-buffer og filtrer inn i samme strømningsrør.
    10. Fjern en 10 μL aliquot fra den resulterende 1 ml cellefjæring. Tell lymfocyttutbyttet ved hjelp av en celleteller eller hemocytometer og beregn cellekonsentrasjonen for hver prøve.
  5. Prøvepreparering for sortering - ekstracellulær farging
    MERK: Antistoffene som brukes i den ekstracellulære farging mastermix, samt reagensene for å forberede fikserbar levedyktighet fargestoff og Fc blokk løsning, brukes i konsentrasjoner nok for opptil 5 x 106 celler per 100 μL. Volumer bør justeres tilsvarende. For at FACS-maskinkompensasjon skal sortere ILC1, kreves enfarget kontroller for hver av fluoroforene i den ekstracellulære fargingsmestermixen. For antistoffene kan kompensasjonsperler som inneholder en positiv antistoffbindende perlepopulasjon og en negativ antistoff ikke-bindende perlepopulasjon brukes. For ultrafiolett (UV) fikserbar levedyktighet fargestoff enkelt fargekontroll, kompensasjon perler som inneholder amine-reaktive (for positivt signal) og ikke-reaktive (for negativ signal) populasjoner kan brukes. Det anbefales ikke å bruke celler fra RORγtGFPreporter mus for UV fikserbar levedyktighet fargestoff enkelt fargekontroll, som disse cellene vil inneholde en GFP+ signal.
    1. Fjern en liten aliquot på ~ 10 μL fra hver prøve og samle den i et eget strømningsrør som inneholder 250 μL FACS-buffer. Plasser røret på isen. Dette vil bli brukt for den ubegrunnete kontrollen.
    2. Tilsett 1 ml PBS til det gjenværende volumet i prøverørene. Sentrifuge ved 300-400 x g i 3-5 min.
    3. Forbered 200 μL UV-fikserbar levedyktighetsfargeoppløsning per prøve. Fortynn UV-fikserbar levedyktighetsfargestoff (resuspendert i DMSO i henhold til produsentens instruksjoner) 1:500 i PBS (eller etter produsentens instruksjoner).
    4. Kast supernatanten og resuspend prøvene i 200 μL UV-fikserbar levedyktighetsfargeoppløsning. Virvel rørene og inkuber i mørket ved 4 °C i 10-15 min.
    5. Tilsett 2 ml FACS-buffer i rørene for å slukke UV-fikserbar levedyktighetsfarge, virvel i 10 s og sentrifuger rørene ved 300-400 x g i 3-5 min ved 4 °C. Kast supernatanten fra sentrifugede rørene.
    6. Forbered 200 μL fc blokkløsning per prøve (0,25 mg/ml Fc-blokk i FACS-bufferen).
    7. Tilsett 200 μL fc blokkløsning til hver av prøvene fra trinn 3.5.5, virvel i 10 s, og inkuber i mørket ved 4 °C i 10 minutter.
    8. Tilsett 500 μL FACS-buffer i et nytt strømningsrør. Fjern en 2-5 μL aliquot fra hver prøve og samle den i røret for fluorescens minus en (FMO) kontroller.
    9. Virvel FMO-røret i 10 s og fordel jevnt (100 μL per rør) i ferskvannsrør merket for hver av FMO-kontrollene (Lineage cocktail FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO og NK1.1 FMO; se tabell 3). Tilsett alle antistoffene unntatt antistoffet av interesse for hvert rør (som beskrevet i tabell 3) og virvel i 10 s. Plasser FMO-kontrollene til side i mørket ved 4 °C.
    10. Sentrifuger prøvene (ikke FMO-kontroller) ved 300-400 x g i 3-5 min ved 4 °C.
    11. Forbered ekstracellulær farging mastermix (200 μL per prøve) med de endelige antistofffortynningene som beskrevet i tabell 4. Juster fargevolumet for riktig cellekonsentrasjon (opptil 5 x 106 celler per 100 μL) avhengig av celleantallet fra trinn 3.4.10.
    12. Tilsett ekstracellulær farging mastermix til prøvene, virvel i 10 s, og legg dem til side i mørket ved 4 °C.
    13. Forbered en ny fargekontroll for hvert antistoff som er ment å brukes i gatingstrategien (figur 2). Vortex antistoffkompensasjon perler i 20 s, tilsett 1 dråpe perler til et strømningsrør, flekk med 0,5 μL antistoff (som vist i tabell 2, eller følg produsentens instruksjoner) og virvel i 10 s.
    14. Forbered en UV fikserbar levedyktighet fargestoff enkelt fargekontroll ved hjelp av en amin-reaktiv kompensasjon perle kit. Vortex aminreaktive kompensasjonsperler i 20 s, tilsett 1 μL Live/Dead UV-fargestoff (som vist i tabell 2, eller følg produsentens instruksjoner) og virvel i 10 s.
    15. Inkuber prøvene, FMOene og enkeltfargekontrollene i mørket i 30 minutter ved 4 °C.
    16. I løpet av denne tiden forbereder du rør for å samle de sorterte cellene. Tilsett 400-500 μL 10% FBS i avanserte DMEM / F12 til 1,5 ml rør for hver prøve.
    17. Etter inkubasjonen legger du til 2 ml PBS2 i hver av prøvene, FMO-kontrollene og enkeltfargekontrollene.
    18. Sentrifuger prøvene, FMO-kontrollene og enkeltfargekontrollene ved 300-400 x g i 3-5 min ved 4 °C.
    19. Kast supernatanten fra alle sentrifugede rør. Bruk prøvene og FMO-kontrollene på nytt i 250 μL FACS-buffer og virvel i 10 s.
    20. Resuspend enkeltfargekontrollene i 250 μL PBS2. Tilsett 1 dråpe amin ikke-reaktive perler til UV fikserbar levedyktighet fargestoff enkelt fargekontroll bare. Virvel alle kontroller for 10 s.
    21. Cellene er nå klare til å sorteres. Hold prøver, FMO-kontroller og enkeltfargekontroller på is i mørket når det er mulig for å forbedre celle levedyktigheten og forhindre tap av signal fra fotobleaching.

4. Samkultur av små intestinale organoider med medfødte lymfoidceller

MERK: Denne delen beskriver samkulturen av sortert murin liten tarm ILC1 (isolert etter protokollen i avsnitt 3) med murin små intestinale organoider (beskrevet i avsnitt 1 og 2). Organoider bør brukes optimalt 1-2 dager etter passasjen. Samkultur innebærer høsting av organoider, tilsetning av riktig antall ILC1, sentrifugering til pelletsorganoider og ILC1 sammen, og resuspending i TBEM. Fullfør denne delen så snart som mulig når ILC1 er isolert. Alle prosedyrene skal utføres i et aseptisk miljø ved hjelp av sterile materialer og reagenser.

  1. Kontroller at TBEM fra trinn 3.1.1 er tint.
  2. Høst 1-2-dagers gamle organoider som beskrevet i trinn 2.3 og 2.4.
  3. Resuspender den organoide pelletsen i 1 ml kald iskald Avansert DMEM/F12. Ikke bøy p1000-spissen som gjort når du passerer organoidene, da intensjonen her er å opprettholde organoidstrukturen for samkultur. Plasser om nødvendig organoidene i separate PBS2-belagte 1,5 ml rør på is i en kort periode som skal fordeles mellom ulike samkulturforhold.
    MERK: Begynn bare forberedelsen av organoider når ILC-prøver er klare for samkultur; arbeid på is og raskt så snart organoider har blitt høstet for å minimere epitelcelledød.
  4. Pre-coat ett 1,5 ml rør med PBS2 per ILC-replikeringsprøve. Fordel ~100-200 organoider (ca. 1 brønn av en 24-brønns plate) inn i hvert rør.
  5. Pre-coat en p1000 tips i PBS2 og bruke den til å vurdere volumet av ILC1s etter FACS rensing (250-300 μL + sortert volum). Bestem konsentrasjonen av ILC1 per ml ved hjelp av antall celler som er registrert fra sorteringen, og bestem ønsket volum.
  6. Bruk den samme PBS2-belagte p1000-spissen, tilsett ikke mindre enn 500 ILC1s til PBS2-belagt 1,5 ml rør som inneholder organoidene. Hvis antallet ILC1-er som er gitt fra sorteringen er mindre enn 500, legger du organoiden direkte til røret som inneholder den opprinnelige sorteringen for å minimere tap av celler fra overføringen.
  7. Spinn ned ILC1 og organoider ved 300 x g i 5 min ved 4 °C. Hvis det er mulig, unngå sentrifuger med liten diameter, da disse vil samle cellene langs kanten av rørinteriøret i motsetning til å skape en pellet på tuppen av røret. Siden celletallene er svært lave, er det viktig å minimere tap av celler i løpet av disse trinnene.
  8. Fjern sakte og forsiktig så mye av supernatanten som mulig uten å forstyrre pelletsen (som kanskje ikke er synlig for øyet, spesielt i ikke-organoide ILC-bare kontroller). Plasser prøven på is.
  9. Resuspend den kalde pellets i 30 μL per brønn av TBEM. Mens du holder røret på en kald overflate (f.eks. en liten boks med is plassert i vevskulturhetten), bland organoidene og ILC minst 10-15 ganger for å sikre jevn distribusjon. Triturat ofte, men forsiktig, for å unngå å skade organoidene og dannelsen av bobler.
  10. Påfør 30 μL per brønn av ILC-organoider i TBEM på en forvarmet 24- eller 48-brønnsplate for å danne en enkelt kuppel. Plasser platen direkte i inkubatoren (37 °C og 5 % CO2) i 10–20 minutter.
    MERK: Det anbefales på det sterkeste at bare ILC- og organoidkontroller er satt opp for nedstrømsanalyse. ILC1 er sjeldne, men GFP- ILC2 kan erstattes med immunfluorescens eller FSC/SSC-strømningscytometrikontroller der det er vitenskapelig hensiktsmessig.
  11. Tilsett 550 μL (per brønn) med komplett ILC1-medium (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-Mercaptoethanol; se tabell 1) med ønskede eksperimentelle cytokiner eller blokkering av antistoffer og inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer.
  12. Etter 24 timer, fjern platen forsiktig fra inkubatoren og la platen sitte i en vevskulturhette i 1 min for å sikre at lymfocyttene er avgjort.
  13. Fjern 200-250 μL medier og legg det i en tom brønn på en 24-brønns plate. Kontroller denne supernatanten med et invertert mikroskop for å sikre at ingen lymfocytter ble fjernet.
    1. Hvis supernatanten er klar, tilsett 300 μL ferskt ILC1-medium til samkulturen i den opprinnelige brønnen. Hvis lymfocytter er til stede i supernatanten, sentrifuge ved 300-400 x g i 3-5 min ved 4 °C og resuspend i 300 μL ferskt ILC1-medium og legg dette til de resterende 200-250 μL medier i den opprinnelige brønnen. Sørg for å fylle opp medier hver 1-2 dag eller når mediene blir blek-oransje/gule.
      MERK: Ikke la medier fordampe tilstrekkelig til at spissen av matrisekuppelen bryter overflaten på mediet. Sørg alltid for at matrisen er helt nedsenket. Overflødig fordampning kan unngås ved å bruke sentrale brønner i vevskulturplatene og tilsette ~ 600 μL PBS til de omkringliggende brønnene. Samkulturer med voksen ILC er stabile i 1-4 dager, hvoretter organoidene som ble sådd uten store forstyrrelser vil briste og reseed som nye krypter. Hvis du analyserer epitelet, anbefales det at kulturer analyseres innen 1-4 dager etter etablering av samkulturer.
    2. Utfør nedstrømsanalyse ved hjelp av immunfluorescens, strømningscytometri eller FACS-rensing av målpopulasjoner i lysisbuffer for genuttrykksanalyse ved encellet eller bulk RNA-seq eller RT-qPCR, som beskrevet i referanse8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når de er fullført, skal nyisolerte krypter danne spirende kryptstrukturer innen 2-4 dager (figur 1A). Sunne og robuste organoidkulturer bør vokse aktivt og kan passeres og utvides som beskrevet i protokollen.

Denne protokollen beskriver isolering av liten intestinal ILC1 fra RORγtGFP murine transgen reporterlinje, som tillater isolering av levende ILC1 av FACS (figur 2). Ved hjelp av protokollen som er skissert her, er det forventede ILC1-telleområdet 350-3500 isolerte celler.

Etter å ha blitt sådd med organoider, kan samkulturer visualiseres ved immunocytokjemi (figur 3A-B). ILCer og epitelceller kan også analyseres ved strømningscytometri, som vist i figur 3C. ILC1 upregulate epitelial CD44, som karakterisert ved strømningcytometri (figur 4A-B) og immunocytokjemi (figur 4C). Spesielt induserer ILC1 uttrykket for CD44 v6 skjøtevarianten i organoider, som vist av RT-qPCR (figur 4D).

Tabell 1: Medie- og buffersammensetninger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Kontroller med én farge. Sammensetning av enkeltfargede kontroller for å isolere tynntarmen lamina propria ILC1 ved hjelp av gating strategien definert i figur 2. Detaljer om antistoffer som brukes finnes i materialtabellen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Fluorescens minus en (FMO) mastermixes. Sammensetning av FMO mastermixes for Lineage cocktail FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO og NK1.1 FMO. FMO mastermixes inneholder alle antistoffene som brukes bortsett fra antistoffet av interesse og brukes til å flekke en prøve aliquot. Avledningscocktail er definert som CD19, CD3e, CD5, Ly-6G/Ly-6C. Detaljer om antistoffer som brukes finnes i materialtabellen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Ekstracellulær farging mastermix. Konsentrasjonene justeres for farging av opptil 5 x 106 celler i 200 μL FACS-buffer. Detaljer om antistoffer som brukes finnes i materialtabellen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 1
Figur 1: Murine små intestinale organoider. Representativt bilde av (A) vellykket generert små intestinale organoider 2-3 dager etter passasje og (B) mislykket kultur. Skalalinje: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Gating strategi for å isolere ILC1s fra tynntarmen lamina propria av transgene RORγtGFP reporter mus. Representativ strømning cytometrisk plott av ILC1 isolasjon fra tynntarmen lamina propria av transgene RORγtGFP reporter mus av FACS. ILC1 er definert som live, CD45+, Lin- (CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORγt-, NKp46+ og NK1.1+. Representant fra N = >50 mus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Organoide og ILC1-medkulturer. Lysfeltbilder (A), konfokale mikroskopibilder (B) og FACS-plott (C) av små tarmorganoider (SIO) dyrket alene (øverst) eller med ILC1s (bunn) (representant for eksperimenter med ILC1s fra N = 3 mus). (B) Farging med CD45 illustrerer ILC1s og Zonula occludens protein 1 (ZO-1) markerer epitelceller i organoider. Skalastenger: 50 μm. (C) Tidligere inngjerdet på enkle, levende celler. Epitelial cellulært adhesjonsmolekyl (EpCAM) markerer intestinale epitelceller (IEC) i organoider og CD45 merker ILC1s. Figuren er tilpasset fra referanse8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: ILC1s i samkultur med små tarmorganoider driver oppregulering av CD44 i tarmepitelceller. (A) En representativ cytometrisk plott av CD44-uttrykk i epitelial cellulære adhesjonsmolekyl (EpCAM) positive epitelceller (levende, CD45-, EpCAM+) fra små intestinale organoider (SIO) dyrket alene (venstre) eller med ILC1s i 4 dager (høyre). (B) Strømnings kvantifisering av CD44-uttrykk i tarmepitelceller (IEC) (ILC1s fra N = 5 mus). (C) Representativt konfokalt mikroskopibilde av CD44-lokalisering i d4 SIO alene (venstre) eller samkulturert med ILC1s (høyre) (representant for N = 3 mus). Skalastenger: 50 μm. (D) RT-qPCR med exon-spesifikke primere for CD44 skjøtevarianter v4 og v6 (N = 3). Dette tallet er tilpasset fra referanse8. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver metodene for å etablere murin tynntarmen organoider, isolere sjeldne ILC1 ved å minimere tap av lymfocytter under tarmdissosiasjonsprotokollen, og etablere samkulturer mellom disse to rommene. Det er mange trinn i denne protokollen, og selv om noen er spesifikke for ILC1s, kan denne tilnærmingen brukes på andre tarmimmuncelletyper, og samkulturoppsett kan tilpasses modulært for å passe individuelle forskningsspørsmål. Flere kritiske trinn (som anbefales å ikke avvike fra), samt retningslinjer for feilsøking for de mer teknisk utfordrende elementene i denne protokollen, fremheves her.

Bruken av murin små intestinale organoider fra enkelt Lgr5 + eGFP tarmstammeceller blir stadig mer veletablert33,34; Men i denne protokollen foreslås det å isolere intakt, hele krypter av Lieberkuehn fra CD45.1 dyr. Ikke bare gjenoppretter intakte krypter raskere enn enkle Lgr5 + -celler, men bruken av CD45.1-dyr uten en GFP-reporter sikrer at ingen krysskontaminerende CD45.2 + ILC analyseres fra organoid-kokulturene og er kompatibel med bruk av immunceller som inneholder en GFP-basert reporter. Etter forfatternes erfaring overføres ingen mesenchymale eller immunceller etter 1-3 passasjer av organoidene. Bruken av CD45.2 eller andre dyr for å etablere organoider er derfor helt akseptabelt. Under organoid etablering, hvis krypter ikke er til stede i trinn 1.1.19, kan det være nødvendig med strengere manuell risting for å løsne de intakte kryptene. Miljøfaktorer som omgivelsestemperatur (f.eks. om prosedyren utføres om sommeren eller vinteren) kan gi noe variasjon i inkubasjonstidspunkt under dissosiasjon. Såddtettheten til krypter vil påvirke det opprinnelige organoiddannelsesutbyttet; Det anbefales derfor å så minst to forskjellige tettheter for å sikre suksess (f.eks. 200-750 foreslått her, men dette området kan tilpasses basert på individuelle behov).

Når de er etablert, er intestinale organoidkulturer heterogene både mellom linjer etablert fra samme musestamme, langs mage-tarmkanalen (f.eks. tolvfingertarmen versus ileum), og til og med innenfor samme brønn av organoidkulturer35,36. Selv om denne protokollen ble funnet å være robust over mange forskjellige grupper av organoider, kunne denne heterogeniteten bidra til datavariabilitet. Det er god praksis å være i samsvar med organoid vedlikehold (passaging og medieendringer) for å redusere teknisk støy fra fenotypisk irrelevante data. Dette inkluderer å være i samsvar med pre-seeding passaging tidslinjen og med kraften som brukes til å dissosiere organoider. Det anbefales også å bruke den samme basalmatrisen for eksperimenter som sammenlignes, og for eksperimenter som skal utføres ved hjelp av biologiske replikeringer av organoider avledet fra forskjellige dyr (når økonomisk og teknisk mulig) for å sikre at resultatene er robust reproduserbare.

Ved etablering av samkulturer er forholdet mellom immun og epitelceller et kritisk hensyn som vil kreve optimalisering basert på forskningsspørsmålene. Hvis effekten av epitelceller på ILC blir forhørt, må antall organoider frø være tilstrekkelig til å mette all ILC. Motsatt, når man vurderer effekten av ILC på epitelet, kan forskjellige ILC / epitelforhold resultere i forskjellige fenotypiske utganger, noe som reflekterer differensialtilstander for ILC-delsettberikelse i slimhinnen. ILC1 levedyktighet er godt vedlikeholdt i kulturen, og befolkningen vil gjennomgå mild ekspansjon, med ~ 500 ILC1 og 100 små intestinale organoider (SIO) gjennomgår en 2-3 ganger utvidelse i gjennomsnitt. Dette utbyttet vil imidlertid bli påvirket av ytterligere behandlinger, med TGF-nøytralisering bedre og p38-hemming redusere absolutt antall ILC1 etter co-kultur8. Ethvert uforutsett tap på mer enn 50% av frøet ILC1-tallene kan være et resultat av enten et ubalansert forhold mellom ILC1 og SIO (øke antall frøkrypter), SIO-forurensning (sikre at antibiotikacocktail fungerer og teste supernatanten for mykoplasma), eller av kvalitetsproblemer i cytokinbestandene, der ILC1 er spesielt følsom for mangel på IL-2 eller IL-15. Samkultur supernatanter fra konsentrerte 96- eller 48-brønnsplater har blitt brukt til ELISAer. Når du dissosierer samkulturer, anbefales det å inkubere celler med DNase etter en 20 min mild trypsinerstatning eller utføre EDTA-basert dissosiasjon til enkeltceller for å forhindre cellekumping fra skadede epitelceller.

En styrke ved denne protokollen er at den balanserer reduksjonistiske kulturforhold med komplekse celletyper. Virkemåten til andre ILC-delsett i disse kulturene kan imidlertid være avhengig av faktorer som ikke finnes i denne bestemte protokollen. I Lindemans' protokoll som ble brukt til ILC3-samkulturer, ble IL-23 i tillegg supplert med samkulturmedier for å støtte ILC3-vedlikehold og aktivering8. IL-15 ble funnet å være spesielt viktig i vedlikeholdet av ILC1 i samkultursystemet beskrevet i denne protokollen, som var kongruent med tidligere rapporter om ILC1 som krevde denne cytokinen for homeostase, men ikke utvikling6. For å aktivere ILC, eller for å opprettholde ILC2s, kan vekstmediet kreve ytterligere optimalisering. Videre regulerer andre cellulære rom i tarmen, bortsett fra epitelet, ILCer. For eksempel er intestinale nevroner kjent for å modulere ILC2s delvis gjennom aktiviteten til utskilte nevropeptider37. Mikrobielle faktorer påvirker også ILC-fenotype38. Denne begrensningen kan overvinnes ved å legge til disse elementene, for eksempel cytokiner, peptider eller mikrobielle faktorer, i kokultursystemet. Dette kan til og med tillate avhør av samspillet mellom ILCer og flere cellulære rom i en reduksjonistisk setting. Etter denne logikken er det kritisk at antibiotiske/anti-mykotiske reagenser tilsettes og etterfylles ofte til organoide medier før de etablerer medkulturer. Det er også kritisk at alle kulturer utføres i aseptiske miljøer fordi enhver kulturforurensning (f.eks. soppvekst eller mykoplasma) sannsynligvis vil aktivere antigenet ikke-spesifikke ILCer, og skape betydelige fenotyper som kanskje ikke er til stede i ikke-forurensede kulturer. Av denne grunn anbefales ikke tilbaketrekking av antibiotiske / mykotiske reagenser, selv i medkulturene, da de ikke ble funnet å forårsake en negativ innvirkning på epitelet eller ILC-ene.

Denne metoden gir en unik måte å karakterisere signalmoduler mellom ILCer og tarmepitelet, slik at biologien til begge rommene kan undersøkes. Sammenlignet med andre in vitro-metoder som består av en enkelt celletype, er systemet som presenteres her mer sammenlignbart med in vivo fysiologi og gjør det mulig å avhøre flere potensielle signalmekanismer mellom epitelceller og ILCer. Andre metoder for in vitro ILC-kultur er hovedsakelig avhengige av stromale matercellelinjer, for eksempel OP9 eller OP9-DL139. Denne linjen er avledet fra nyfødt mus calvaria, som ikke er representativ for tarmmiljøet. Selv om disse har gitt gullstandarden for å opprettholde ILCs in vitro til dags dato, lider de betydelige begrensninger i søknaden om å forstå effekten av ILC på epitelet.

Samkulturprotokollen som er beskrevet her mellom murin små tarmorganoider og lamina propria-avledede ILCer, har betydelige forskningsapplikasjoner. Dette system av samkultur har allerede blitt brukt til å bestemme rollen til ILC1 avledet TGF-β i utvidelsen av CD44 + epitel krypterer8, noe som bidrar til forståelsen av epiteldynamikk i inflammatorisk tarmsykdom. Disse studiene bidrar til en økende litteratur som underbygger den kritiske betydningen av epitel-ILC-signalering i intestinal homeostase og betennelse3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

E.R. anerkjenner et ph.d.-stipendiat fra Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. anerkjenner et ph.d.-stipend fra Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. anerkjenner et ph.d.-studentstipend fra NIHR GSTT BRC. J.F.N. anerkjenner et Marie Skłodowska-Curie Fellowship, et king's Prize fellowship, et RCUK/UKRI Rutherford Fund fellowship (MR/R024812/1), og en Seed Award in Science fra Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Vi takker også BRC flow cytometry core team basert på Guy's Hospital. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 reportermus var en sjenerøs gave fra G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, Frankrike). CD45.1 C57BL/6 mus ble vennlig gitt av T. Lawrence (King's College London, London) og P. Barral (King's College London, London).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box - -
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice - -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14, 141-153 (2014).
  3. Diefenbach, A., Gnafakis, S., Shomrat, O. Innate lymphoid cell-epithelial cell modules sustain intestinal homeostasis. Immunity. 52 (3), 452-463 (2020).
  4. Ebbo, M., Crinier, A., Vély, F., Vivier, E. Innate lymphoid cells: major players in inflammatory diseases. Nature Reviews Immunology. 17 (11), 665-678 (2017).
  5. Vivier, E., et al. Innate lymphoid cells: 10 years on. Cell. 174 (5), 1054-1066 (2018).
  6. Klose, C. S. N., et al. Differentiation of type 1 ILCs from a common progenitor to all helper-like innate lymphoid cell lineages. Cell. 157 (2), 340-356 (2014).
  7. Bernink, J. H., et al. Interleukin-12 and -23 control plasticity of CD127+ group 1 and group 3 innate lymphoid cells in the intestinal lamina propria. Immunity. 43 (1), 146-160 (2015).
  8. Jowett, G. M., et al. ILC1 drive intestinal epithelial and matrix remodelling. Nature Materials. 20 (2), 250-259 (2020).
  9. Wong, S. H., et al. Transcription factor RORα is critical for nuocyte development. Nature Immunology. 13, 229-236 (2012).
  10. Neill, D. R., et al. Nuocytes represent a new innate effector leukocyte that mediates type-2 immunity. Nature. 464, 1367-1370 (2010).
  11. Mjösberg, J., et al. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 649-659 (2012).
  12. Hoyler, T., et al. The transcription factor GATA-3 controls cell fate and maintenance of type 2 innate lymphoid cells. Immunity. 37 (4), 634-648 (2012).
  13. Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1hi cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16, 161-169 (2014).
  14. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529, 221-225 (2016).
  15. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529, 226-230 (2016).
  16. Eberl, G., et al. An essential function for the nuclear receptor RORgamma(t) in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells. Nature Immunology. 5, 64-73 (2004).
  17. Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nature Reviews Immunology. 13, 145-149 (2013).
  18. Mebius, R. E., Rennert, P., Weissman, I. L. Developing lymph nodes collect CD4+CD3- LTbeta+ cells that can differentiate to APC, NK cells, and follicular cells but not T or B cells. Immunity. 7 (4), 493-504 (1997).
  19. Lindemans, C. A., et al. Interleukin-22 promotes intestinal-stem-cell-mediated epithelial regeneration. Nature. 528 (7583), 560-564 (2015).
  20. Meininger, I., et al. Tissue-specific features of innate lymphoid cells. Trends in Immunology. 41 (10), 902-917 (2020).
  21. Dutton, E. E., et al. Characterisation of innate lymphoid cell populations at different sites in mice with defective T cell immunity. Wellcome Open Research. 2, 117 (2018).
  22. Bal, S. M., Golebski, K., Spits, H. Plasticity of innate lymphoid cell subsets. Nature Reviews Immunology. 20, 552-565 (2020).
  23. Bernink, J. H., et al. Human type 1 innate lymphoid cells accumulate in inflamed mucosal tissues. Nature Immunology. 14, 221-229 (2013).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
  26. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  27. Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2012).
  28. Date, S., Sato, T. Mini-gut organoids: reconstitution of the stem cell niche. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 269-289 (2015).
  29. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  30. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  31. Tallapragada, N. P., et al. Inflation-collapse dynamics drive patterning and morphogenesis in intestinal organoids. Cell Stem Cell. 28 (9), 1516-1532 (2021).
  32. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57281 (2018).
  33. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  34. O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells. Bio-protocol. 6 (4), 1733 (2016).
  35. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569 (7754), 66-72 (2019).
  36. Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
  37. Cardoso, V., et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 549 (7671), 277-281 (2017).
  38. Gury-BenAri, M., et al. The spectrum and regulatory landscape of intestinal innate lymphoid cells are shaped by the microbiome. Cell. 166 (5), 1231-1246 (2016).
  39. Seehus, C., Kaye, J. In vitro differentiation of murine innate lymphoid cells from common lymphoid progenitor cells. Bio-protocol. 6 (6), 1770 (2016).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 181
Co-kultur av murine tynntarmen epitelial organoider med medfødte lymfoide celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Read, E., Jowett, G. M., Coman, D.,… More

Read, E., Jowett, G. M., Coman, D., Neves, J. F. Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells. J. Vis. Exp. (181), e63554, doi:10.3791/63554 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter