Method Article

Globale Quantifizierung von posttranslationalen Histonmodifikationen in einem 3D-Zellkulturmodell von Lebergewebe

DOI:

10.3791/63606

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May 5th, 2022

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1Department of Biochemistry, Albert Einstein College of Medicine

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll beschreibt, wie ein dreidimensionales Zellkultursystem verwendet werden kann, um Chromatinmodifikationen in einem nahezu physiologischen Zustand zu modellieren, zu behandeln und zu analysieren.

Abstract

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Flachkulturen von Säugetierzellen sind ein weit verbreiteter In-vitro-Ansatz zum Verständnis der Zellphysiologie, aber dieses System ist bei der Modellierung von festem Gewebe aufgrund der unnatürlich schnellen Zellreplikation begrenzt. Dies ist besonders schwierig bei der Modellierung von reifem Chromatin, da schnell replizierende Zellen häufig an der DNA-Replikation beteiligt sind und eine heterogene polyploide Population aufweisen. Im Folgenden finden Sie einen Workflow zum Modellieren, Behandeln und Analysieren von ruhenden Chromatinmodifikationen mit einem dreidimensionalen (3D) Zellkultursystem. Unter Verwendung dieses Protokolls werden hepatozelluläre Karzinomzelllinien als reproduzierbare 3D-Sphäroide in einem Inkubator gezüchtet, die eine aktive Nährstoffdiffusion und geringe Scherkräfte bieten. Die Behandlung mit Natriumbutyrat und Natriumsuccinat induzierte eine Zunahme der Histonacetylierung bzw. der Succinylierung. Erhöhungen der Histonacetylierung und Succinylierung sind mit einem offeneren Chromatinzustand verbunden. Sphäroide werden dann zur Isolierung von Zellkernen gesammelt, aus denen Histonproteine für die Analyse ihrer posttranslationalen Modifikationen extrahiert werden. Die Histonanalyse wird über die Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt, gefolgt von einer internen Rechenpipeline. Abschließend werden Beispiele für die Datendarstellung zur Untersuchung der Häufigkeit und des Auftretens kombinatorischer Histonspuren gezeigt.

Introduction

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Seit dem späten 19. Jahrhundert werden Zellkultursysteme als Modell verwendet, um das Wachstum und die Entwicklung von Zellen außerhalb des menschlichen Körpers zu untersuchen 1,2. Ihre Verwendung wurde auch erweitert, um zu untersuchen, wie Gewebe und Organe sowohl in gesunden als auch in kranken Kontexten funktionieren 1,3. Suspensionszellen (z.B. Blutzellen) wachsen in Petrischalen oder Kolben nahtlos und austauschbar, da sie sich nicht in vivo in dreidimensionalen (3D) Strukturen zusammensetzen. Zellen, die aus festen Organen gewonnen werden, können entweder in zweidimensionalen (2D) oder 3D-Kultursystemen wachsen. In der 2D-Kultur werden Zellen in einer Monoschicht gezüchtet, die an einer flachen Oberflächehaftet 2,4. 2D-Zellkultursysteme zeichnen sich durch exponentielles Wachstum und eine schnelle Verdopplungszeit aus, typischerweise 24 h bis zu einigen Tagen5. Zellen in 3D-Systemen wachsen zu komplizierten Zell-Zell-Interaktionen, die gewebeähnliche Konglomerate genauer modellieren, und sie zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, ein dynamisches Gleichgewicht zu erreichen, in dem ihre Verdopplungszeit 1 Monat oder länger erreichen kann5.

In diesem Artikel wird eine innovative Methodik zur Züchtung von 3D-Sphäroiden in rotierenden Zellkultursystemen vorgestellt, die eine reduzierte Schwerkraft simulieren6. Dies ist ein vereinfachtes Derivat eines Zellkultursystems, das von der NASA in den 1990er Jahren eingeführtwurde 7. Dieser Ansatz minimiert die Scherkräfte, die bei bestehenden Methoden wie Spinnkolben auftreten, und erhöht die Sphäroidreproduzierbarkeit6. Darüber hinaus erhöht der rotierende Bioreaktor die aktive Nährstoffdiffusion und minimiert die nekrotische Bildung, die in Systemen wie der hängenden Tropfenzellkultur auftritt, in der der Medienaustausch unpraktisch ist6. Auf diese Weise wachsen die Zellen weitgehend ungestört, was die Bildung struktureller und physiologischer Eigenschaften ermöglicht, die mit dem Wachstum von Zellen im Gewebe verbunden sind. Auf diese Weise kultivierte C3A-Hepatozyten (HepG2/C3A) hatten nicht nur ultrastrukturelle Organellen, sondern produzierten auch Mengen an ATP, Adenylatkinase, Harnstoff und Cholesterin, die mit den in vivo 1,2 beobachteten Spiegeln vergleichbar waren. Darüber hinaus weisen Zellen, die in 2D.3D im Vergleich zu Zellkultursystemen gezüchtet wurden, unterschiedliche Genexpressionsmusterauf 8. Die Genexpressionsanalyse von C3A-Hepatozyten, die als 3D-Sphäroide gezüchtet wurden, zeigte, dass diese Zellen eine breite Palette von leberspezifischen Proteinen sowie Gene exprimierten, die an Schlüsselwegen beteiligt sind, die die Leberfunktion regulieren8. Frühere Veröffentlichungen zeigten die Unterschiede zwischen Proteomen exponentiell wachsender Zellen in 2D-Kultur und Zellen im dynamischen Gleichgewicht in 3D-Sphäroidekulturen5. Zu diesen Unterschieden gehört der Zellstoffwechsel, der wiederum die Struktur, Funktion und Physiologie der Zelle beeinflusst5. Das Proteom von Zellen, die in 2D-Kultur gezüchtet wurden, war stärker mit Proteinen angereichert, die an der Zellreplikation beteiligt waren, während das Proteom von 3D-Sphäroiden in der Leberfunktionalitätangereichert war 5.

Die langsamere Replikationsrate von Zellen, die als 3D-Sphäroide gezüchtet werden, modelliert genauer spezifische Phänomene, die mit dem Chromatinzustand und Modifikationen verbunden sind (z. B. Histon-Clipping9). Histon-Clipping ist eine irreversible Histon-posttranslationale Modifikation (PTM), die eine proteolytische Spaltung eines Teils des Histon-N-terminalen Schweifs verursacht. Während seine biologische Funktion noch diskutiert wird10,11,12,13, ist es klar, dass seine Anwesenheit in Primärzellen und Lebergewebe von HepG2 / C3A-Zellen modelliert wird, die als Sphäroide gezüchtet wurden, aber nicht als flache Zellen9. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da der Chromatinzustand und die Modifikationen die DNA-Auslesung hauptsächlich durch Modulation der Zugänglichkeit zu Genen und damit ihrer Expressionregulieren 14. Histon-PTMs beeinflussen entweder den Chromatinzustand direkt, indem sie die Nettoladung der Nukleosomen beeinflussen, in denen Histone zusammengesetzt sind, oder indirekt durch die Rekrutierung von Chromatin-Schreibern, Lesern und Radiergummis14. Hunderte von Histon-PTMs wurden bis heute15 identifiziert, was die Hypothese verstärkt, dass Chromatin einen "Histon-Code" beherbergt, der von der Zelle zur Interpretation von DNA16 verwendet wird. Die Identifizierung einer Vielzahl von PTM-Kombinationen15 und die Entdeckung, dass Kombinationen von Histon-PTMs häufig andere biologische Funktionen haben als PTMs, die isoliert vorliegen (z. B. Fischle, et al.17), zeigen jedoch, dass mehr Arbeit erforderlich ist, um den "Histoncode" zu entschlüsseln.

Derzeit basiert die Histon-PTM-Analyse entweder auf Techniken, die Antikörper verwenden (z. B. westliche Flecken, Immunfluoreszenz oder Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Sequenzierung [ChIP-seq]) oder Massenspektrometrie (MS). Antikörper-basierte Techniken haben eine hohe Sensitivität und können detaillierte Informationen über die genomweite Lokalisierung von Histonmarkierungen liefern, sind jedoch häufig bei der Untersuchung seltener PTMs oder PTMs in Kombinationenbegrenzt 18,19,20. MS eignet sich besser für den Hochdurchsatz und die unvoreingenommene Identifizierung und Quantifizierung einzelner und koexistierender Proteinmodifikationen, insbesondere Histonproteine18,19,20. Aus diesen Gründen haben dieses und mehrere andere Labore die MS-Pipeline für die Analyse von Histonpeptiden (Bottom-up-MS), intakten Histonschwänzen (Middle-Down-MS) und Histonproteinen in voller Länge (Top-Down-MS) optimiert21,22,23.

Im Folgenden finden Sie einen Workflow für die Züchtung von HepG2/C3A-Sphäroiden und deren Vorbereitung für die Histonpeptidanalyse (Bottom-up-MS) mittels Nano-Flüssigkeitschromatographie, gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (nLC-MS/MS). Eine 2D-Zellkultur wurde gezüchtet und die Zellen wurden geerntet und in einen Bioreaktor gebracht, wo sie Sphäroide bilden würden (Abbildung 1). Nach 18 Tagen in Kultur wurden Sphäroide mit Natriumbutyrat oder Natriumsuccinat behandelt, um die relative Häufigkeit von Histonacetylierung und Succinylierung zu erhöhen. Insbesondere können 3D-Kulturen mit genotoxischen Verbindungen genauso gut behandelt werden wie ihre flachen Kulturäquivalente; Tatsächlich heben neuere Veröffentlichungen hervor, dass die toxikologische Reaktion von Zellen in 3D-Kultur dem Primärgewebe ähnlicher ist als die in 2D-Flachkultur24,25. Zellen wurden dann zu bestimmten Zeitpunkten gesammelt und eine nukleare Isolierung durchgeführt. Dann wurden Histone extrahiert und mit Propionanhydrid vor und nach der Trypsinverdauung nach einem Protokoll abgeleitet, das zuerst von Garcia et al.26 entwickelt wurde. Dieses Verfahren erzeugt Peptide in geeigneter Größe für die Online-Trennung mit Umkehrphasenchromatographie (C18) und den Nachweis mit MS. Schließlich wurden Histonpeptide identifiziert und quantifiziert, und die generierten Daten wurden auf vielfältige Weise für eine vollständigere biologische Interpretation dargestellt.

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Protocol

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1. Herstellung von Puffern und Reagenzien

  1. Zellwachstumsmedien (für HepG2/C3A-Zellen): Fügen Sie fötales Rinderserum (FBS) (10% v/v), nicht-essentielle Aminosäuren (1% v/v), L-Glutamin-Ergänzung (1% v/v) und Penicillin/Streptomycin (0,5% v/v) zu Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM, mit 4,5 g/L Glukose) hinzu. Wachstumsmedien werden bei 4 °C für maximal 2 Wochen gelagert.
  2. 200 mM Natriumbutyrat (NaBut)-Lösung: Zur Herstellung von 10 ml werden 220,18 mg NaBut in 10 ml ddH2O resuspendiert. 1 ml Aliquots bei -20 °C lagern. Vor der Zellbehandlung die Lösung mit einem 0,45-mm-Spritzenfilter filtrieren und 1 ml der gefilterten Lösung in 9 ml Zellwachstumsmedien für eine Arbeitskonzentration von 20 mM geben.
  3. 100 mM Natriumsuccinat (NaSuc)-Lösung: Zur Herstellung von 10 ml werden 162,05 mg NaSuc in 10 ml ddH2O resuspendiert. 1 mL Aliquots bei -20 °C lagern. Vor der Zellbehandlung wird die Lösung mit einem 0,45-mm-Spritzenfilter filtriert und 1 ml der filtrierten Lösung in 9 ml Zellwachstumsmedien für eine Arbeitskonzentration von 10 mM gegeben.
  4. Kalt 0,2 m H2SO 4: Um 1 L vorzubereiten, fügen Sie 10 ml konzentriertesH2 SO4 bis 990 ml HPLC-Wasser hinzu. Bei 4 °C lagern.
  5. Kaltes Aceton + 0,1% Salzsäure (HCl): Aceton wird konzentriertes HCl (0,1% v/v) zugesetzt. Bei 4 °C lagern.
  6. 100 mM NH 4 HCO3-Lösung, pH 8,0: Zur Herstellung von 1 L werden 7,91 g NH4HCO3 in 1 LHPLC-Wasser resuspendiert. Lagern Sie 50 ml Aliquots bei -20 °C.
  7. 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) Lösung: Fügen Sie konzentriertes TFA (0,1% v / v) zu HPLC-Wasser hinzu. Bei 4 °C lagern.
  8. 60% Acetonitril / 0,1% TFA-Lösung: Fügen Sie HPLC-Acetonitril (60% v / v) zu HPLC-Wasser hinzu. Dann fügen Sie dieser Lösung konzentriertes TFA (0,1% v/v) hinzu. Bei 4 °C lagern.
  9. 2% HPLC-Acetonitril + 0,1% Ameisensäure: Fügen Sie HPLC-Acetonitril (2% v / v) zu HPLC-Wasser hinzu. Dann fügen Sie dieser Lösung konzentrierte Ameisensäure (0,1% v/v) hinzu.
  10. 80% Acetonitril in HPLC-Qualität + 0,1% Ameisensäure: Fügen Sie HPLC-Acetonitril (80% v / v) zu HPLC-Wasser hinzu. Dann fügen Sie dieser Lösung konzentrierte Ameisensäure (0,1% v/v) hinzu.

2. Vorbereitung des 3D-Kultursystems

HINWEIS: Verschiedene Zellen, primäre oder immortalisierte, haben unterschiedliche Kultureigenschaften, so dass die Bildung von Sphäroiden zwischen den Zelltypen unterschiedlich sein kann. Dieses Protokoll wurde für die HepG2/C3A-Sphäroidbildung unter Verwendung von Bioreaktoren und einem innovativen 3D-Zellkultursystem etabliert.

  1. Züchten Sie Zellen mit Standard-Wachstumsmedien als Monolayer, bis sie zu 80% konfluent sind.
  2. Waschen Sie Zellen mit HBSS (5 ml für einen 75 cm 2 Kolben) und inkubieren Sie Zellen mit 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA, verdünnt in HBSS (1:2 Verdünnung) für 5 min bei 37 oC mit 5% CO2.
  3. Überprüfen Sie die Zellablösung unter einem Mikroskop und neutralisieren Sie Trypsin durch Zugabe von 3 ml fetalem Rinderserum (FBS) oder Wachstumsmedien (mit 5% -10% FBS).
  4. Zählen Sie die Anzahl der Zellen und verdünnen Sie die Zellsuspension, um 1 x 106 Zellen in einem maximalen Volumen von 1,5 ml zu erhalten.
  5. Gleichen Sie eine extrem niedrige 24-Well-Rundbodenplatte (die mehrere Mikrovertiefungen pro Vertiefung enthält) aus, indem Sie die Vertiefungen mit 0,5 ml Wachstumsmedien waschen. Zentrifen Sie die Platte für 5 min bei 3.000 x g, um Luftblasen von der Oberfläche des Bohrlochs zu entfernen.
  6. Die Zellsuspension für 3 min bei 120 x g in die Platte und Zentrifuge geben.
  7. Inkubieren Sie die Platte für 24 h bei 37 °C mit 5% CO2 zur Sphäroidbildung. In der Zwischenzeit gleichen Sie den Bioreaktor aus, indem Sie die Feuchtekammer mit 25 ml sterilem Wasser und die Zellkammer mit 9 ml Wachstumsmedien füllen.
  8. Inkubieren Sie den Bioreaktor, rotierend im Clinostat-Inkubator, für 24 h bei 37 °C mit 5% CO2.

3. Wachstum von Sphäroiden in Bioreaktoren

HINWEIS: Um die Struktur von Sphäroiden zu erhalten, werden breite Bohrungsspitzen für die Handhabung der 3D-Strukturen verwendet.

  1. Lösen Sie die Sphäroide von der extrem niedrigen Befestigungsplatte, indem Sie sie vorsichtig mit 1 ml breiten Bohrungsspitzen auf und ab pipettieren und in eine mit Gewebekultur behandelte Schale geben.
  2. Waschen Sie den Teller mit 0,5 ml vorgewärmten Wachstumsmedien und geben Sie ihn in dieselbe Schale.
  3. Bewerten Sie die Qualität von Sphäroiden durch Mikroskopie und wählen Sie ausreichend ausgebildete Sphäroide aus. Gute Qualität Sphäroide haben eine gleichmäßige Größe, Kompaktheit und Rundheit.
  4. Übertragen Sie Sphäroide in äquilibrierte Bioreaktoren, die mit 5 ml frischem Wachstumsmedium gefüllt sind. Nach dem Transfer der Sphäroide den Bioreaktor vollständig mit frischen Wachstumsmedien füllen.
  5. Platzieren Sie den Bioreaktor im Clinostat-Inkubator und stellen Sie die Drehzahl auf 10-11 U / min ein.
  6. Tauschen Sie Wachstumsmedien alle 2-3 Tage aus, indem Sie 10 ml alte Medien entfernen und durch 10 ml neue Medien ersetzen.
  7. Passen Sie die Rotationsgeschwindigkeit entsprechend dem Sphäroidwachstum an und nehmen Sie zu, wenn die Sphäroide an Größe und Anzahl zunehmen.
  8. Nach 18 Tagen in Kultur sind die Sphäroide bereit für die Behandlung und/oder Sammlung

4. Sphäroide Behandlung und Sammlung

HINWEIS: In diesem Protokoll werden HepG2 / C3A-Sphäroide mit Natriumbutyrat (NaBut) und Natriumsuccinat (NaSuc) behandelt, um die Konzentrationen von Histonmarkierungen zu bewerten, die Acetylierung bzw. Succinylierung enthalten.

  1. Bereiten Sie Wachstumsmedien mit der entsprechenden Arbeitskonzentration der Verbindung vor (z. B. 20 mM NaBut oder 10 mM NaSuc). Tauschen Sie die Medien im Bioreaktor mit den behandelten Medien aus.
    HINWEIS: Um eine Kontrollbedingung zu schaffen, sammeln Sie entweder genügend Sphäroide für Experimente, bevor Sie die Behandlung hinzufügen, oder bestimmen Sie einen Bioreaktor für unbehandelte Sphäroide.
  2. Sammeln Sie Sphäroide für die Proteomanalyse nach ausreichender Behandlungszeit (z. B. 48 h bis 1 Woche für die NaSuc-Behandlung oder 48-72 h für die NaSbut-Behandlung).
    HINWEIS: Für die Histonextraktion mit diesem Protokoll wurden sechs bis acht Sphäroide mit etwa 1 x 106 Zellen gesammelt.
    1. Entfernen Sie 3-5 ml Medien aus dem Bioreaktor durch den oberen Anschluss.
    2. Öffnen Sie den Frontanschluss und verwenden Sie eine 1 ml breite Bohrungsspitze, um Sphäroide zu entfernen und in Mikrozentrifugenröhrchen zu legen.
    3. Zentrifugieren Sie die Sphäroide bei 100 x g für 5 min und entsorgen Sie Medien.
      HINWEIS: Das Medium im Bioreaktor kann gewechselt werden und der Bioreaktor kann für zusätzliche Behandlungszeit oder Erholung in den Inkubator zurückgebracht werden.
    4. Waschen Sie Sphäroide mit 200 μL HBSS, um das FBS zu entfernen. 5 min bei 100 x g zentrifugieren und den Überstand entfernen.
      HINWEIS: Sphäroide können bis zur Verarbeitung bei -80 °C gelagert werden.

5. Histon-Extraktion

HINWEIS: Die vielen basischen Aminosäurereste, die in Histonen vorhanden sind, ermöglichen es ihnen, eng mit der DNA zu interagieren, die ein Phosphorsäure-Rückgrat hat. Da Histone zu den grundlegendsten Proteinen im Zellkern gehören, kommt es bei der Extraktion mit eiskalter Schwefelsäure (0,2 MH2SO 4) zu einer minimalen Kontamination. Die Nicht-Histon-Proteine fallen in starker Säure aus. Hochkonzentrierte Trichloressigsäure (TCA), die auf eine Endkonzentration von 33% verdünnt wird, wird anschließend verwendet, um die Histone aus der Schwefelsäure auszufällen. Bewahren Sie alle Proben, Röhrchen und Reagenzien während der gesamten Histonextraktion auf Eis auf.

  1. Fügen Sie fünf Volumina (~ 100 μL) kalte 0,2 M H2SO4 zum Zellpellet (~ 10-20 μL) hinzu und pipettieren Sie es auf und ab, um das Pellet zu stören und Histone freizusetzen.
  2. Inkubationsschläuche für bis zu 4 h bei konstanter Drehung oder Schütteln bei 4 °C.
    HINWEIS: Für resuspendierte Proben mit einem Volumen von mehr als 500 μL reicht eine Inkubation von 2 h aus, um Histone zu extrahieren (eine längere Inkubation kann zur Extraktion anderer basischer Kernproteine führen). Für resuspendierte Proben mit einem Volumen von weniger als 200 μL ist für eine bessere Ausbeute eine 4-stündige Inkubation erforderlich.
  3. Zentrifuge bei 3.400 x g für 5 min bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand in einer neuen Tube und entsorgen Sie das Pellet später.
  4. Fügen Sie kaltes konzentriertes TCA hinzu, so dass es ein letztes 25% -33% v / v (z. B. 40-60 μL kaltes TCA: 120 μL Überstand) ausmacht und mischen Sie, indem Sie das Rohr einige Male umkehren.
  5. Inkubationsschläuche für mindestens 1 h bei konstanter Rotation oder Schütteln bei 4 °C.
    HINWEIS: Für kleinere Startpelletgrößen wird eine Inkubation über Nacht empfohlen.
  6. Zentrifuge bei 3.400 x g für 5 min bei 4 °C. Überstände durch Pipettieren verwerfen. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab; Berühren Sie nicht die Seiten des Rohres oder des Pellets.
    HINWEIS: Histone lagern sich sowohl an den Seiten als auch am Boden des Rohres ab. Das weiße, unlösliche Pellet, das ganz unten im Rohr gebildet wird, enthält hauptsächlich Nicht-Histon-Proteine und andere Biomoleküle.
  7. Waschen Sie das Rohr (Wände und Pellets) mit kaltem Aceton + 0,1% HCl mit einer Pasteur-Pipette aus Glas (~ 500 μL / Röhrchen).
  8. Zentrifuge bei 3.400 x g für 5 min bei 4 °C. Überstand verwerfen, indem Sie das Röhrchen umdrehen.
  9. Waschen Sie das Rohr (Wände und Pellet) mit 100% kaltem Aceton mit einer Pasteur-Pipette aus Glas (~ 500 μL / Röhrchen). Zentrifuge bei 3.400 x g für 5 min bei 4 °C.
  10. Verwerfen Sie den Überstand, indem Sie die Röhre umdrehen und das verbleibende Aceton pipettieren. Öffnen Sie den Deckel und trocknen Sie die Probe auf der Bank für ~ 20 Minuten an der Luft.
  11. Fahren Sie mit der Propionylierung fort oder lagern Sie die Proben bis zur Verwendung in -80 °C.

6. Erste Runde der Derivatisierung

HINWEIS: Die Verwendung von Trypsin zur Verdauung von Histonproteinen führt zu übermäßig kleinen Peptiden, die mit herkömmlichen Proteomik-Setups schwer zu identifizieren sind. Aus diesem Grund wird Propionsäureanhydrid verwendet, um die ɛ-Aminogruppen von unmodifizierten und Monomethyllysinresten chemisch zu derivatisieren. Dies beschränkt die Trypsin-Proteolyse auf C-terminale Argininreste. Für Proben in 96-Well-Platten wird die Verwendung von Mehrkanalpipetten und Reservoirs für die Reagenzaufnahme empfohlen (Abbildung 2A). Die Derivatisierung wird auch nach der Verdauung durchgeführt, um die freien N-Termini der Peptide zu markieren, wodurch die Peptidhydrophobie und damit die chromatographische Retention der Umkehrphase erhöht wird.

  1. Resuspendieren Sie Proben in 20 μL von 15% -20% Acetonitril in 100 mM Ammoniumbicarbonat (pH 8,0). Wirbeln Sie für 15 s und drehen Sie sich dann bei 1.000 x g für 30 s nach unten.
  2. Wenn es acht oder mehr Proben gibt, übertragen Sie jede resuspendierte Probe in eine 96-Well-Platte.
    HINWEIS: Wenn die Proben nicht auf eine 96-Well-Platte übertragen wurden, kann eine Einkanalpipette in den Schritten 6.3-6.7, 7.1-7.5 und 8.1-8.5 verwendet werden.
  3. Unter der Haube 2 μL Propionanhydrid mit einer Mehrkanalpipette hinzufügen. Mischen Sie, indem Sie 5x nach oben und unten pipettieren.
  4. Fügen Sie schnell 10 μL Ammoniumhydroxid mit einer Mehrkanalpipette hinzu. Mischen Sie, indem Sie 5x nach oben und unten pipettieren.
    HINWEIS: Propionsäure ist ein Produkt der Reaktion zwischen Propionanhydrid und freien Aminen aus Peptiden und kann den pH-Wert der Probe senken. pH 8 kann durch Zugabe von Ammoniumhydroxid zur Probe in einem Verhältnis von 1:5 (v/v) wiederhergestellt werden.
  5. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert 8 beträgt, indem Sie pH-Testpapier verwenden. Wenn der pH-Wert 8 <, stellen Sie ihn durch Zugabe von 1 μL Ammoniumhydroxid ein. Wenn der pH-Wert 8 >, wird durch Zugabe von 1 μL Ameisen- oder Essigsäure eingestellt. Bei pH-> 10 ist die Markierung anderer Aminosäurereste mit höherem pKa möglich.
  6. Bei Raumtemperatur 10 min inkubieren.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 6.3 bis 6.6. Eine doppelte Runde Histonpropionylierung gewährleistet eine nahezu vollständige Reaktionseffizienz.
  8. Trocknen Sie die Platte im Geschwindigkeitsvakuum, bis alle Vertiefungen vollständig getrocknet sind (~ 9 h).
  9. Fahren Sie mit dem Trypsinaufschluss fort oder lagern Sie die Proben bis zur Verwendung bei -80 °C.

7. Histon-Verdauung

HINWEIS: Histone werden mit Trypsin, das an der Carboxylseite von Arginin- und Lysinresten schneidet, zu Peptiden verdaut. Da die Propionylierung jedoch Lysinreste modifiziert, werden nur Argininreste gespalten (Abbildung 2B).

  1. Es wird eine Trypsinlösung (25 ng/μL in 50 mM NH 4 HCO3, pH 8,0)hergestellt. 20 μL Trypsin (500 ng) zu jeder Probe geben.
    1. Zur Herstellung einer 50 mM NH 4HCO 3-Lösung verdünnen Sie 100 mM NH4HCO 3-Lösung1:1 v/v mit Wasser inHPLC-Qualität.
  2. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert 8 beträgt, indem Sie pH-Testpapier verwenden. Wenn der pH-Wert 8 <, stellen Sie ihn durch Zugabe von 1 μL Ammoniumhydroxid ein. Wenn der pH-Wert 8 >, wird durch Zugabe von 1 μL Ameisen- oder Essigsäure eingestellt.
  3. Bei Raumtemperatur über Nacht auflaufen lassen oder bei 37 °Cfür 6-8 h inkubieren.
  4. Wenn möglich, überprüfen Sie den pH-Wert nach ~ 3 h der Verdauung, da er möglicherweise abgenommen hat. Wenn der pH-Wert 8 <, stellen Sie ihn durch Zugabe von 1 μL Ammoniumhydroxid ein.
  5. Fügen Sie weitere 5 μL 50 ng/μL Trypsinlösung (250 ng) hinzu und setzen Sie die Verdauung fort.
  6. Fahren Sie mit der zweiten Runde der Propionylierung fort oder lagern Sie die Proben bei -80 °C bis zur Verwendung.

8. Derivatisierung von Peptid-N-Termini

HINWEIS: Die Propionylierung von Histonpeptiden an ihrem N-Terminus verbessert die Retention der kürzesten Peptide durch Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (z. B. Aminosäuren 3-8 von Histon H3), da die Propionylgruppe die Peptidhydrophobie erhöht.

  1. Unter der Haube 2 μL Propionanhydrid mit der Mehrkanalpipette hinzufügen. Mischen Sie, indem Sie 5x nach oben und unten pipettieren.
  2. Fügen Sie schnell 10 μL Ammoniumhydroxid mit der Mehrkanalpipette hinzu. Mischen Sie, indem Sie 5x nach oben und unten pipettieren.
    HINWEIS: Propionsäure ist ein Produkt der Reaktion zwischen Propionanhydrid und freien Aminen aus Peptiden und kann den pH-Wert der Probe senken. pH 8 kann durch Zugabe von Ammoniumhydroxid zur Probe in einem Verhältnis von 1:5 (v/v) wiederhergestellt werden.
  3. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert 8 beträgt, indem Sie pH-Testpapier verwenden. Wenn der pH-Wert 8 <, stellen Sie ihn durch Zugabe von 1 μL Ammoniumhydroxid ein. Wenn der pH-Wert 8 >, wird durch Zugabe von 1 μL Ameisen- oder Essigsäure eingestellt. Bei pH-> 10 ist die Markierung anderer Aminosäurereste mit höherem pKa möglich.
  4. Bei Raumtemperatur 10 min inkubieren.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 8.1 bis 8.4. Eine doppelte Runde Histonpropionylierung gewährleistet eine nahezu vollständige Reaktionseffizienz.
  6. Trocknen Sie die Platte im Geschwindigkeitsvakuum, bis alle Vertiefungen vollständig getrocknet sind (~ 9 h).
  7. Fahren Sie mit dem Entsalzungsschritt fort oder lagern Sie die Proben bei -80 °C bis zur Verwendung.

9. Entsalzen und Probenreinigung

HINWEIS: Salze, die in der Probe vorhanden sind, stören die massenspektrometrische Analyse. Salze werden auch während des Elektrosprays ionisiert und können Signale von Peptiden unterdrücken. Salze können ionische Addukte auf Peptiden bilden, die dazu führen, dass das adduktierte Peptid eine andere Masse hat. Dies reduziert die Signalintensität des Peptids und verhindert eine ordnungsgemäße Identifizierung und Quantifizierung. Der Aufbau für die Entsalzung ist in Abbildung 2C dargestellt.

  1. Beginnen Sie mit dem Mischen des HLB-Harzes (50 mg / ml in 100% Acetonitril) auf einer magnetischen Rührplatte.
  2. Stellen Sie sicher, dass sich unter der 96-Well-Polypropylen-Filterplatte eine 96-Well-Auffangplatte befindet, um den Durchfluss zu erfassen.
  3. Geben Sie 70 μL HLB-Suspension pro Vertiefung auf die Filterplatte. Schalten Sie das Vakuum vorsichtig ein, um ein Spritzen zu verhindern. Verwerfen Sie den Flow-Through.
  4. Waschen Sie das Harz mit 100 μL 0,1% TFA. Schalten Sie das Vakuum vorsichtig ein, um ein Spritzen zu verhindern. Verwerfen Sie den Flow-Through.
  5. Resuspendiert jede Probe in 100 μL von 0,1% TFA. Überprüfen Sie den pH-Wert; es sollte ~ 2-3 sein.
  6. Laden Sie jede Probe in jede Vertiefung. Schalten Sie den Staubsauger vorsichtig ein, um ein Spritzen zu verhindern. Verwerfen Sie den Flow-Through.
  7. Mit 100 μL 0,1% TFA waschen. Schalten Sie den Staubsauger vorsichtig ein, um ein Spritzen zu verhindern. Verwerfen Sie den Flow-Through.
  8. Ersetzen Sie die Sammelplatte durch eine neue Sammelplatte mit 96 Wells.
  9. Fügen Sie 60 μL 60% Acetonitril / 0,1% TFA pro Vertiefung hinzu. Schalten Sie den Staubsauger vorsichtig ein, um ein Spritzen zu verhindern. Sammeln Sie den Durchfluss und trocknen Sie ihn in einem Geschwindigkeitsvakuum.
  10. Fahren Sie mit LC-MS/MS fort oder lagern Sie die Proben bei -80 °C bis zur Verwendung.

10. Histonpeptidanalyse mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie

  1. Bereiten Sie die mobilen Phasen für die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) vor. Mobile Phase A (MPA): 2% HPLC-Acetonitril + 0,1% Ameisensäure. Mobile Phase B (MPB): 80% HPLC-Acetonitril + 0,1% Ameisensäure.
  2. Programmieren Sie die HPLC-Methode wie folgt: (1) 4%-34% MPB über 30 min; (2) 34%-90% MPB über 5 min; und (3) isokratische 90% MPB für 5 min. Verwenden Sie die folgenden empfohlenen Säuleneigenschaften: C18 3 μm Packmaterial, 75 μm Innendurchmesser, 20-25 cm Länge. Stellen Sie die Durchflussrate für Nanosäulen mit einem Innendurchmesser von 75 μm auf 250-300 nL/min ein.
    1. Für den Fall, dass die HPLC nicht so programmiert ist, dass sie die Säulengleichsetzung vor dem Laden der Proben automatisiert, schließen Sie (4) 90% -4% MPB über 1 min und (5) isokratische 4% MPB über 10 min ein.
  3. Programmieren Sie die MS-Akquisitionsmethode.
    1. Stellen Sie sicher, dass das Gerät zu Beginn jedes Tastzyklus einen vollständigen MS-Scan durchführt. Hochauflösende Instrumente (z. B. Orbitrap- oder Time-of-Flight-Analysatoren) werden aufgrund der Massengenauigkeit, die bei der Signalextraktion verwendet werden kann, empfohlen. Instrumentierung mit niedriger Auflösung kann jedoch auch wie zuvor beschriebenverwendet werden 27,28.
    2. Stellen Sie sicher, dass auf den vollständigen MS-Scan 16 MS/MS-Scanereignisse mit einer Isolationsbreite von jeweils 50 m/z folgen, die den m/z-Bereich von 300-1100 abdecken. Zum Beispiel sollte der erste Scan Signale bei 300-350 m/z isolieren, der zweite bei 350-400 m/z usw. Wenn möglich, erfassen Sie MS/MS-Scans auch in hoher Auflösung, aber eine geringere Auflösung im Vergleich zum vollständigen MS-Scan ist ausreichend (aufgrund der geringeren Massen von Fragmentionen im Vergleich zu intakten Ionen).
    3. Die HPLC-Methode erzeugt chromatographische Signale mit Spitzenbreiten von ~3-40 s; Um eine ordnungsgemäße Signalquantifizierung zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass das Massenspektrometer mindestens 10 Tastzyklen pro chromatographischem Peak ausführt (d. h. ein Tastverhältnis von 3 s oder schneller).
    4. Wenn Sie einen Massenanalysator im Übernahmestil (Orbitrap, Ionenfalle) verwenden, stellen Sie sicher, dass die Ioneninjektionszeitgrenze auf <200 ms eingestellt ist. Bei anderen Analysatoren (Quadrupol, Time-of-Flight) ist dies aufgrund ihrer schnelleren Scanzeit kein Problem. Möglicherweise ist ein Vortest erforderlich.
      HINWEIS: Weitere Einzelheiten zu MS-Methoden zur Histonpeptidanalyse finden Sie in den folgenden Referenzen27,28,29.
  4. Resuspendierte Probe in 10 μL MPA, was ~ 1 μg/μL verdauter Histonprobe entspricht. Die genaue Beladungsmenge ist nicht kritisch (auch nicht trivial zu beurteilen), wenn alle Proben in der Charge mit ähnlichen Verdünnungen und Volumina geladen werden.
  5. Laden Sie 1 μL Probe auf die HPLC-Säule.
  6. Führen Sie die in den Schritten 10.1-10.3 programmierte LC-MS/MS-Methode aus.

11. Datenanalyse

  1. Importieren Sie die MS-Rohdatendateien in eine Software, die für die Integration in Spitzenbereiche entwickelt wurde.
    HINWEIS: EpiProfile30,31 wird in der aktuellen Studie verwendet und wird allgemein empfohlen, da es für eine zuverlässige Peak-Area-Extraktion bekannter Histonpeptide optimiert ist. Es eignen sich jedoch auch andere frei verfügbare Software für die extrahierte Ionenchromatographie wie Skyline32,33.
  2. Berechnen Sie die relative Häufigkeit eines gegebenen (un)modifizierten Peptids als die Fläche eines einzelnen Peptids dividiert durch die Gesamtfläche des Peptids in all seinen modifizierten Formen. Software wie EpiProfile 30,31 enthält bereits Bibliotheken von Peptiden zur Signalextraktion. Andernfalls generieren Sie eine Bibliothek von Peptiden von Interesse, entweder manuell oder über die Peptididentifizierung unter Verwendung von Routine-Proteomik-Pipelines.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Protokoll wurden HepG2/C3A-Sphäroide mit 20 mM NaBut und 10 mM NaSuc behandelt, die beide die globalen Konzentrationen von Histon-PTMs beeinflussten (Abbildung 3A). Histon-PTMs wurden dann identifiziert und auf Einzelrückstandsebene mittels MS/MS-Erfassung quantifiziert (Abbildung 3B).

Wenn Stichproben in Replikaten ausgeführt werden, kann eine statistische Analyse durchgeführt werden, um die Anreicherung der Falten...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Analyse von Histon-PTMs unterscheidet sich grundlegend von der typischen Proteomik-Analysepipeline. Die meisten Histon-PTMs haben immer noch rätselhafte biologische Funktionen; Infolgedessen sind Annotationen wie Gene Ontology oder Pathway-Datenbanken nicht verfügbar. Es gibt mehrere Ressourcen, die Histonmodifikationen mit dem Enzym assoziieren, das für ihre Katalyse verantwortlich ist, oder mit Proteinen, die Domänen enthalten, die diese PTMs binden (z. B. HISTome36). Es ist auch möglich, üb...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Sidoli-Labor dankt der Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck und dem NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,05 % Trypsin-EDTA-LösungGibco25300054
0,5-20 & Mikro; L PipettenspitzenBRAND13-889-172 (Fisher Scientific)
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenBio-Rad2239480
10 & micro; L MehrkanalpipetteBRANDBR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL SpritzeHenke Sass Wolf14-817-31 (Fisher Scientific)Luer-Lock-Spitze, graduiert auf 12 mL
10, 20, 200 und 1000 µ L EinkanalpipettenEppendorf14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µ L PipettenspitzenRainin30389164
18 G SpritzennadelAir-Tite14-817-100 (Fisher Scientific)3" Länge, 0,05" Durchmesser
200 & Mikro; L MehrkanalpipetteCorning4082
2-200 µ L PipettenspitzenMARKEZ740118 (Millipore Sigma)
24-Well-Mikrotiterplatte mit ultraniedrigem AufsatzCorning07-200-602
75 cm2  U-förmiger ZellkulturkolbenCorning461464UUnbehandelt, mit Entlüftungskappe
96-Well-Platte mit RandAxygenPCR-96-FS-C (Corning)
AcetonFisher ScientificA949-1Aceton sollte kalt verwendet werden
Ammoniumbicarbonat (NH4HCO3)Sigma-AldrichA6141-25G
Ammoniumhydroxid LösungFisher ScientificAC423300250
ZellkulturqualitätCorning25-055-CV
ClinoReactorCelVivo10004-12Bioreaktor für 3D-Zellkulturen
ClinoStarCelVivoN/AClinostat CO2 Inkubator für 3D-Zellkultur
SteuereinheitCelVivoN/ATablet für ClinoStar Einstellungen
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning17-205-CV1X Lösung mit 4,5 g/L Glukose und Natriumpyruvat, ohne L-Glutamin und Phenolrot
Fötales Rinderserum (FBS)Corning35-010-CV
AmeisensäureThermo Scientific28905
AbzugMottN/AModell 7121000
Glas PasteurpipetteFisher Scientific13-678-8B9", mit Baumwollstecker, Borosilikatglas, unsteriles
Glutagro-PräparatCorning25-015-CI200 mM L-Ananyl-L-Glutamin
Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV1X Lösung ohne Calcium-, Magnesium- und Phenolrot
HPLC-Qualität AcetonitrilFisher ScientificA955-4
Wasser in HPLC-QualitätFisher ScientificW6-1
Salzsäure (HCl)Fisher ScientificA481-212
EisN/AN/A
MEM nicht-essentielle AminosäurenCorning25-025-CI100X Lösung
Oasis HLB-HarzWässer186007549Hydrophil-Lipophil-Balanced (HLB) Harz mit 30&Mikro; m Partikelgröße
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MassenspektrometerThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBMBHQHochauflösendes Massenspektrometer
Oro-Flex I Polypropylen-FilterplatteOrochemOF110096-Well-Polypropylen-Filterplatte mit 10 & Mikro; M PE-Fritte
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI100X Lösung
pH-PapierHydrionZ111848 (Sigma-Aldrich)0-13 pH-Testpapier
PipettenpistoleEppendorfZ666467 (Millipore Sigma)
Polymikro-KapillareMolex50-110-7740 (Fisher Scientific)Flexibler Kapillarschlauch aus Quarzglas mit Polymidbeschichtung, 75 & Mikro; M ID x 363 & Mikro; M OD
Polystyrol 10 mL serologische Pipetten, sterilFisher Scientific1367549
PropionsäureanhydridSigma-Aldrich240311-50G
KühlzentrifugeThermo Scientific75-217-420
Reprosil-Pur HarzMSWILR13. AQ.0003120 & Aring; Porengröße, C18-AQ-Phase, 3 & Mikro; M Bead Size
Rotator Clay Adams25477 (American Laboratory Trading)Nutator Mixer 1105
Modifiziertes Trypsin in SequenzierqualitätPromegaV5111
NatriumbutyratThermo ScientificA11079
Natriumsuccinat zweibasischSigma-Aldrich14160-100G
SpeedVac Vakuumkonzentrator (1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen)Savant20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac Vakuumkonzentrator (96 Well)Thermo Scientific15308325Savant SPD1010
SterilhaubeThermo Scientific1375Klasse II, Typ A2
Schwefelsäure (H2SO4)Fisher Scientific02-004-375Baker Analysiertes ACS-Reagenz
Mit Gewebekulturen behandelte Schale 100 mm x 20 mmFisher Scientific08-772-23
Trichloressigsäure (TCA)Thermo ScientificAC421451000Resuspendierung 100 % w/v in Wasser in HPLC-Qualität
Trifluoressigsäure (TFA)Fisher ScientificPI28904Sequenzierqualität
Vakuumverteiler 96-Well-MilliporeMAVM0960R
VortexSigma-AldrichZ258415
WasserbadFisher ScientificFSGPD10
Pipettenspitzen mit breiter Bohrung 1000 & Mikro; LAxygen14-222-703 (Fisher Scientific)
Pipettenspitzen mit breiter Bohrung 200 & Mikro; LAxygen14-222-730 (Fisher Scientific)
Wasser in

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  3. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  4. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
  5. Wrzesinski, K., et al. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973(2014).
  6. Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel). 5 (1), 22(2018).
  7. Gonda, S. R., et al. Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment. Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).
  8. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  9. Tvardovskiy, A., et al. Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).
  10. Azad, G. K., et al. Modifying chromatin by histone tail clipping. Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).
  11. Kragesteen, B. K., Amit, I. Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity. Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).
  12. Dhaenens, M. Histone clipping: the punctuation in the histone code. EMBO Reports. 22 (8), 53440(2021).
  13. Anderson, L. C., et al. Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments. Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).
  14. Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation. Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).
  15. Chan, J. C., Maze, I. Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function. Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).
  16. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  17. Fischle, W., et al. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).
  18. Onder, O., et al. Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations. Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).
  19. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).
  20. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  21. Moradian, A., et al. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
  22. Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).
  23. Sidoli, S., Garcia, B. A. Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology. Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).
  24. Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255(2021).
  25. Calitz, C., et al. Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures. Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).
  26. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
  27. Sidoli, S., et al. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).
  28. Sidoli, S., et al. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).
  29. Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry. Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).
  30. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).
  31. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  32. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  33. Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
  34. Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics. Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).
  35. Lex, A., et al. UpSet: Visualization of intersecting sets. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).
  36. Shah, S. G., et al. HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs. Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31(2020).
  37. Xie, Z., et al. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).
  38. Liu, J., et al. Histone succinylation and its function on the nucleosome. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).
  39. Howe, F. S., et al. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).
  40. Nicetto, D., Zaret, K. S. Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance. Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).
  41. Wojcik, J. B., et al. Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss. Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).
  42. Sellers, W. R., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
  43. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  44. Farrelly, L. A., et al. Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3. Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).
  45. Chen, Q., et al. ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair. The EMBO Journal. 40 (2), 104542(2021).
  46. Zheng, Q., et al. Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communications. 10 (1), 1289(2019).

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