Globale Quantifizierung von posttranslationalen Histonmodifikationen in einem 3D-Zellkulturmodell von Lebergewebe

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein dreidimensionales Zellkultursystem verwendet werden kann, um Chromatinmodifikationen in einem nahezu physiologischen Zustand zu modellieren, zu behandeln und zu analysieren.

Abstract

Flachkulturen von Säugetierzellen sind ein weit verbreiteter In-vitro-Ansatz zum Verständnis der Zellphysiologie, aber dieses System ist bei der Modellierung von festem Gewebe aufgrund der unnatürlich schnellen Zellreplikation begrenzt. Dies ist besonders schwierig bei der Modellierung von reifem Chromatin, da schnell replizierende Zellen häufig an der DNA-Replikation beteiligt sind und eine heterogene polyploide Population aufweisen. Im Folgenden finden Sie einen Workflow zum Modellieren, Behandeln und Analysieren von ruhenden Chromatinmodifikationen mit einem dreidimensionalen (3D) Zellkultursystem. Unter Verwendung dieses Protokolls werden hepatozelluläre Karzinomzelllinien als reproduzierbare 3D-Sphäroide in einem Inkubator gezüchtet, die eine aktive Nährstoffdiffusion und geringe Scherkräfte bieten. Die Behandlung mit Natriumbutyrat und Natriumsuccinat induzierte eine Zunahme der Histonacetylierung bzw. der Succinylierung. Erhöhungen der Histonacetylierung und Succinylierung sind mit einem offeneren Chromatinzustand verbunden. Sphäroide werden dann zur Isolierung von Zellkernen gesammelt, aus denen Histonproteine für die Analyse ihrer posttranslationalen Modifikationen extrahiert werden. Die Histonanalyse wird über die Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt, gefolgt von einer internen Rechenpipeline. Abschließend werden Beispiele für die Datendarstellung zur Untersuchung der Häufigkeit und des Auftretens kombinatorischer Histonspuren gezeigt.

Introduction

Seit dem späten 19. Jahrhundert werden Zellkultursysteme als Modell verwendet, um das Wachstum und die Entwicklung von Zellen außerhalb des menschlichen Körpers zu untersuchen ^1,2. Ihre Verwendung wurde auch erweitert, um zu untersuchen, wie Gewebe und Organe sowohl in gesunden als auch in kranken Kontexten funktionieren ^1,3. Suspensionszellen (z.B. Blutzellen) wachsen in Petrischalen oder Kolben nahtlos und austauschbar, da sie sich nicht in vivo in dreidimensionalen (3D) Strukturen zusammensetzen. Zellen, die aus festen Organen ge....

Protocol

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien

1. Zellwachstumsmedien (für HepG2/C3A-Zellen): Fügen Sie fötales Rinderserum (FBS) (10% v/v), nicht-essentielle Aminosäuren (1% v/v), L-Glutamin-Ergänzung (1% v/v) und Penicillin/Streptomycin (0,5% v/v) zu Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM, mit 4,5 g/L Glukose) hinzu. Wachstumsmedien werden bei 4 °C für maximal 2 Wochen gelagert.
2. 200 mM Natriumbutyrat (NaBut)-Lösung: Zur Herstellung von 10 ml werden 220,18 mg NaBut in 10 ml ddH₂O resuspendiert. 1 ml Aliquots bei -20 °C lagern. Vor der Zellbehandlung die Lösung mit einem 0,45-mm-Spritzenfilter filtrieren und 1 ml der gefiltert....

Results

In diesem Protokoll wurden HepG2/C3A-Sphäroide mit 20 mM NaBut und 10 mM NaSuc behandelt, die beide die globalen Konzentrationen von Histon-PTMs beeinflussten (Abbildung 3A). Histon-PTMs wurden dann identifiziert und auf Einzelrückstandsebene mittels MS/MS-Erfassung quantifiziert (Abbildung 3B).

Wenn Stichproben in Replikaten ausgeführt werden, kann eine statistische Analyse durchgeführt werden, um die Anreicherung der Falten.......

Discussion

Die Analyse von Histon-PTMs unterscheidet sich grundlegend von der typischen Proteomik-Analysepipeline. Die meisten Histon-PTMs haben immer noch rätselhafte biologische Funktionen; Infolgedessen sind Annotationen wie Gene Ontology oder Pathway-Datenbanken nicht verfügbar. Es gibt mehrere Ressourcen, die Histonmodifikationen mit dem Enzym assoziieren, das für ihre Katalyse verantwortlich ist, oder mit Proteinen, die Domänen enthalten, die diese PTMs binden (z. B. HISTome³⁶). Es ist auch möglich, üb.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05 % Trypsin-EDTA-Lösung	Gibco	25300054
0,5-20 & Mikro; L Pipettenspitzen	BRAND	13-889-172 (Fisher Scientific)
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Bio-Rad	2239480
10 & micro; L Mehrkanalpipette	BRAND	BR7059000 (Millipore Sigma)
10 mL Spritze	Henke Sass Wolf	14-817-31 (Fisher Scientific)	Luer-Lock-Spitze, graduiert auf 12 mL
10, 20, 200 und 1000 µ L Einkanalpipetten	Eppendorf	14-285-904 (Fisher Scientific)
1000 µ L Pipettenspitzen	Rainin	30389164
18 G Spritzennadel	Air-Tite	14-817-100 (Fisher Scientific)	3" Länge, 0,05" Durchmesser
200 & Mikro; L Mehrkanalpipette	Corning	4082
2-200 µ L Pipettenspitzen	MARKE	Z740118 (Millipore Sigma)
24-Well-Mikrotiterplatte mit ultraniedrigem Aufsatz	Corning	07-200-602
75 cm2  U-förmiger Zellkulturkolben	Corning	461464U	Unbehandelt, mit Entlüftungskappe
96-Well-Platte mit Rand	Axygen	PCR-96-FS-C (Corning)
Aceton	Fisher Scientific	A949-1	Aceton sollte kalt verwendet werden
Ammoniumbicarbonat (NH4HCO3)	Sigma-Aldrich	A6141-25G
Ammoniumhydroxid Lösung	Fisher Scientific	AC423300250
Zellkulturqualität	Corning	25-055-CV
ClinoReactor	CelVivo	10004-12	Bioreaktor für 3D-Zellkulturen
ClinoStar	CelVivo	N/A	Clinostat CO2 Inkubator für 3D-Zellkultur
Steuereinheit	CelVivo	N/A	Tablet für ClinoStar Einstellungen
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	17-205-CV	1X Lösung mit 4,5 g/L Glukose und Natriumpyruvat, ohne L-Glutamin und Phenolrot
Fötales Rinderserum (FBS)	Corning	35-010-CV
Ameisensäure	Thermo Scientific	28905
Abzug	Mott	N/A	Modell 7121000
Glas Pasteurpipette	Fisher Scientific	13-678-8B	9", mit Baumwollstecker, Borosilikatglas, unsteriles
Glutagro-Präparat	Corning	25-015-CI	200 mM L-Ananyl-L-Glutamin
Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV	1X Lösung ohne Calcium-, Magnesium- und Phenolrot
HPLC-Qualität Acetonitril	Fisher Scientific	A955-4
Wasser in HPLC-Qualität	Fisher Scientific	W6-1
Salzsäure (HCl)	Fisher Scientific	A481-212
Eis	N/A	N/A
MEM nicht-essentielle Aminosäuren	Corning	25-025-CI	100X Lösung
Oasis HLB-Harz	Wässer	186007549	Hydrophil-Lipophil-Balanced (HLB) Harz mit 30&Mikro; m Partikelgröße
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Massenspektrometer	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	Hochauflösendes Massenspektrometer
Oro-Flex I Polypropylen-Filterplatte	Orochem	OF1100	96-Well-Polypropylen-Filterplatte mit 10 & Mikro; M PE-Fritte
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI	100X Lösung
pH-Papier	Hydrion	Z111848 (Sigma-Aldrich)	0-13 pH-Testpapier
Pipettenpistole	Eppendorf	Z666467 (Millipore Sigma)
Polymikro-Kapillare	Molex	50-110-7740 (Fisher Scientific)	Flexibler Kapillarschlauch aus Quarzglas mit Polymidbeschichtung, 75 & Mikro; M ID x 363 & Mikro; M OD
Polystyrol 10 mL serologische Pipetten, steril	Fisher Scientific	1367549
Propionsäureanhydrid	Sigma-Aldrich	240311-50G
Kühlzentrifuge	Thermo Scientific	75-217-420
Reprosil-Pur Harz	MSWIL	R13. AQ.0003	120 & Aring; Porengröße, C18-AQ-Phase, 3 & Mikro; M Bead Size
	Rotator Clay Adams	25477 (American Laboratory Trading)	Nutator Mixer 1105
Modifiziertes Trypsin in Sequenzierqualität	Promega	V5111
Natriumbutyrat	Thermo Scientific	A11079
Natriumsuccinat zweibasisch	Sigma-Aldrich	14160-100G
SpeedVac Vakuumkonzentrator (1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen)	Savant	20249 (American Laboratory Trading)
SpeedVac Vakuumkonzentrator (96 Well)	Thermo Scientific	15308325	Savant SPD1010
Sterilhaube	Thermo Scientific	1375	Klasse II, Typ A2
Schwefelsäure (H2SO4)	Fisher Scientific	02-004-375	Baker Analysiertes ACS-Reagenz
Mit Gewebekulturen behandelte Schale 100 mm x 20 mm	Fisher Scientific	08-772-23
Trichloressigsäure (TCA)	Thermo Scientific	AC421451000	Resuspendierung 100 % w/v in Wasser in HPLC-Qualität
Trifluoressigsäure (TFA)	Fisher Scientific	PI28904	Sequenzierqualität
Vakuumverteiler 96-Well-Millipore		MAVM0960R
Vortex	Sigma-Aldrich	Z258415
Wasserbad	Fisher Scientific	FSGPD10
Pipettenspitzen mit breiter Bohrung 1000 & Mikro; L	Axygen	14-222-703 (Fisher Scientific)
Pipettenspitzen mit breiter Bohrung 200 & Mikro; L	Axygen	14-222-730 (Fisher Scientific)