Digitales räumliches Profiling zur Charakterisierung der Mikroumgebung bei diffus infiltrierenden Gliomen im Erwachsenentyp

Zusammenfassung

Proteomische Dysregulation spielt eine wichtige Rolle bei der Ausbreitung diffus infiltrierender Gliome, aber mehrere relevante Proteine bleiben unidentifiziert. Digital Spatial Processing (DSP) bietet einen effizienten Hochdurchsatzansatz zur Charakterisierung der differentiellen Expression von Kandidatenproteinen, die zur Invasion und Migration infiltrativer Gliome beitragen können.

Zusammenfassung

Diffus infiltrierende Gliome sind aufgrund der infiltrativen Natur der Tumorausbreitung mit hoher Morbidität und Mortalität verbunden. Sie sind morphologisch komplexe Tumoren mit einem hohen Grad an proteomischer Variabilität sowohl über den Tumor selbst als auch über seine heterogene Mikroumgebung. Das bösartige Potenzial dieser Tumoren wird durch die Dysregulation von Proteinen verstärkt, die an mehreren Schlüsselwegen beteiligt sind, einschließlich Prozessen, die die zelluläre Stabilität aufrechterhalten und die strukturelle Integrität der Mikroumgebung bewahren. Obwohl es zahlreiche Massen- und Einzelzell-Gliomanalysen gab, gibt es einen relativen Mangel an räumlicher Schichtung dieser proteomischen Daten. Das Verständnis der Unterschiede in der räumlichen Verteilung von tumorigenen Faktoren und Immunzellpopulationen zwischen dem intrinsischen Tumor, dem invasiven Rand und der Mikroumgebung bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die der Tumorproliferation und -ausbreitung zugrunde liegen. Digital Spatial Profiling (DSP) stellt eine leistungsstarke Technologie dar, die die Grundlage für diese wichtigen Mehrschichtanalysen bilden kann.

DSP ist eine Methode, die die Proteinexpression innerhalb benutzerdefinierter räumlicher Regionen in einer Gewebeprobe effizient quantifiziert. DSP ist ideal für die Untersuchung der differentiellen Expression mehrerer Proteine innerhalb und zwischen Regionen der Unterscheidung und ermöglicht mehrere Ebenen der quantitativen und qualitativen Analyse. Das DSP-Protokoll ist systematisch und benutzerfreundlich und ermöglicht eine maßgeschneiderte räumliche Analyse von Proteomdaten. In diesem Experiment werden Gewebe-Microarrays aus archivierten Glioblastom-Kernbiopsien konstruiert. Als nächstes wird ein Panel von Antikörpern ausgewählt, die auf Proteine von Interesse in der Probe abzielen. Die Antikörper, die an UV-photospaltbare DNA-Oligonukleotide vorkonjugiert werden, werden dann über Nacht mit der Gewebeprobe inkubiert. Unter fluoreszenzmikroskopischer Visualisierung der Antikörper werden mit den Proben Interessengebiete (ROIs) definiert, innerhalb derer die Proteinexpression quantifiziert werden kann. UV-Licht wird dann auf jeden ROI gerichtet und spaltet die DNA-Oligonukleotide. Die Oligonukleotide werden mikroaspiriert und innerhalb jedes ROI gezählt, wobei das entsprechende Protein auf räumlicher Basis quantifiziert wird.

Einleitung

Diffus infiltrierende Gliome sind die häufigste Form von bösartigen Hirntumoren bei Erwachsenen und sind ausnahmslos tödlich. Die Neigung von Gliomzellen, extensiv im Gehirn zu wandern, ist eine große therapeutische Herausforderung. Der Mechanismus, durch den sie sich ausbreiten, beinhaltet gezielte Migration und unkontrollierte Invasion. Es wurde gezeigt, dass invasive Gliomzellen Tropismus und Migration entlang der Bahnen der weißen Substanz aufweisen¹, wobei neuere Forschungen die Demyelinisierung dieser Trakte als aktives, protumorigenes Merkmal implizieren². Die Invasion wird durch einen epithelialen zu mesenchymale....

Protokoll

Das unten beschriebene Protokoll folgt den Richtlinien des Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Die Einwilligungserklärung wurde von den Patienten eingeholt, deren Gewebeproben in diese Studie eingeschlossen wurden. Weitere Informationen zu allen Materialien, Reagenzien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie im Abschnitt Materialtabelle .

1. Objektträgervorbereitung¹⁷

1. Gewinnung oder Vorbereitung von formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe aus diffus infiltrierenden Gliomen des menschlichen Erwachsenentyps.
   HINW....

Ergebnisse

Abbildung 4 zeigt die repräsentativen Ergebnisse eines DSP-Experiments, das an Proben von Glioblastomen durchgeführt wurde. Es wird eine Heatmap vorgestellt, die eine der Methoden zur visuellen Erfassung von Daten mit der DSP-Software veranschaulicht. Zeilen stellen Proteinziele dar, und jede Spalte entspricht einer Region von Interesse. Ein Farbbereich von Blau bis Rot bedeutet einen niedrigen bzw. hohen Ausdruck. Die Variabilität der Farbe innerhalb einer Reihe spiegelt die regionale Prote.......

Diskussion

Angesichts der Vielfalt der Proteine, die möglicherweise die Aggressivität von Gliomen beeinflussen könnten, und der Vorstellung, dass mehrere dieser Proteine unentdeckt bleiben, ist eine Hochdurchsatz-Proteinquantifizierungsmethode ein idealer technologischer Ansatz. Da räumliche Daten in onkologischen Proben häufig mit der differentiellen Expression^{korrelieren 18}, ermöglicht die Einbeziehung räumlicher Profile in den Proteinquantifizierungsansatz eine effektivere Analyse.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BOND Research Detektionssystem	Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland	DS9455	Offenes Detektionssystem mit offenen Behältern in einer Reagenzienwanne
BOND Wash	Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland	AR950	10X konzentrierte Pufferlösung zum Waschen von fixiertem Gewebe
Buffer W	NanoString, Seattle, WA	Kontakt Unternehmen	Blockierungsreagenz
Cy3 Konjugationskit	Abcam, Cambridge, UK	AB188287	Cy3 Fluoreszenz-Antikörper-Konjugationskit
GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)	NanoString, Seattle, WA	Unternehmen kontaktieren	System zur Bildgebung und Charakterisierung von Protein- und RNA-Zielen
GeoMx DSP Instrument BufferKit	NanoString, Seattle, WA	100471	Pufferkit für GeoMX DSP (einschließlich Puffer für die Probenverarbeitung und -vorbereitung)
GeoMx Hyb Code Pack_Protein	NanoString, Seattle, WA	121300401	Steuerungen für die Ausführung von GeoMX DSP Experiemtns
GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300101	Proteinmodul mit Targets für humane Immunzellen und immunonkologische Targets
GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs)	NanoString, Seattle, WA	121300105	Proteinmodul mit Targets für mehrere humane Tumorarten und für Marker des epithelial-mesenchymalen Übergangs
GeoMx Protein Slide Prep FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	Reagenzien für die Probenvorbereitung für die GeoMX DSP Proteinanalyse
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland	Unternehmen kontaktieren	Vollautomatischer IHC-Färber
Master Kit - 12 Reaktionen	NanoString, Seattle, WA	100052	Materialien und Reagenzien für die Verwendung mit dem nCounter Analysis System
nCounter Analysis System	NanoString, Seattle, WA	Unternehmen kontaktieren	Automatisiertes System zur Quantifizierung der Multiplex-Zielexpression (zur Verwendung mit GeoMx DSP)
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Ungarn		Zur Erstellung des Gewebe-Microarray-Blocks