Methodenartikel

Herstellung und Charakterisierung von Graphen-basierter 3D-Biohybrid-Hydrogel-Biotinte für das periphere Neuroengineering

DOI:

10.3791/63622

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16. Mai 2022

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1Vocational School of Health Services, Istinye University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell, and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Vocational School of Health Services, Altinbas University, 7The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 8Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Manuskript demonstrieren wir die Herstellung einer biohybriden Hydrogel-Biotinte, die Graphen für den Einsatz im peripheren Tissue Engineering enthält. Unter Verwendung dieses 3D-Biohybridmaterials wird das neuronale Differenzierungsprotokoll von Stammzellen durchgeführt. Dies kann ein wichtiger Schritt sein, um ähnliche Biomaterialien in die Klinik zu bringen.

Zusammenfassung

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Periphere Neuropathien können als Folge einer axonalen Schädigung und gelegentlich aufgrund von demyelinisierenden Erkrankungen auftreten. Periphere Nervenschäden sind ein globales Problem, das bei 1,5 % bis 5 % der Notfallpatienten auftritt und zu erheblichen Arbeitsplatzverlusten führen kann. Heute sind auf Tissue Engineering basierende Ansätze, die aus Gerüsten, geeigneten Zelllinien und Biosignalen bestehen, mit der Entwicklung dreidimensionaler (3D) Bioprinting-Technologien anwendbarer geworden. Die Kombination verschiedener Hydrogel-Biomaterialien mit Stammzellen, Exosomen oder Biosignalmolekülen wird häufig untersucht, um die bestehenden Probleme bei der peripheren Nervenregeneration zu überwinden. Dementsprechend hat die Herstellung von injizierbaren Systemen, wie z.B. Hydrogelen, oder implantierbaren Conduit-Strukturen, die durch verschiedene Bioprinting-Methoden gebildet werden, im peripheren Neuro-Engineering an Bedeutung gewonnen. Unter normalen Bedingungen sind Stammzellen die regenerativen Zellen des Körpers, und ihre Anzahl und Funktionen nehmen mit der Zeit nicht ab, um ihre Populationen zu schützen. Dabei handelt es sich nicht um spezialisierte Zellen, sondern sie können sich bei entsprechender Stimulation als Reaktion auf eine Verletzung differenzieren. Das Stammzellsystem steht unter dem Einfluss seiner Mikroumgebung, der sogenannten Stammzellnische. Bei peripheren Nervenverletzungen, insbesondere bei Neurotmesis, kann dieses Mikromilieu auch nach chirurgischer Bindung durchtrennter Nervenenden nicht vollständig gerettet werden. Der Ansatz von Verbundbiomaterialien und kombinierten zellulären Therapien erhöht die Funktionalität und Anwendbarkeit von Materialien in Bezug auf verschiedene Eigenschaften wie biologische Abbaubarkeit, Biokompatibilität und Verarbeitbarkeit. Dementsprechend zielt diese Studie darauf ab, die Herstellung und Verwendung von Graphen-basiertem biohybridem Hydrogel-Patterning zu demonstrieren und die Differenzierungseffizienz von Stammzellen zu Nervenzellen zu untersuchen, was eine effektive Lösung bei der Nervenregeneration sein kann.

Einleitung

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Das Nervensystem, der Mechanismus, der die innere Struktur des Organismus und die Umwelt verbindet, ist in zwei Teile unterteilt: das zentrale und das periphere Nervensystem. Periphere Nervenschäden sind ein globales Problem, das 1,5 % bis 5 % der Patienten ausmacht, die sich in der Notaufnahme vorstellen und sich aufgrund verschiedener Traumata entwickeln, was zu einem erheblichen Verlust des Arbeitsplatzes führt 1,2,3.

Heute sind zelluläre Ansätze des peripheren Neuro-Engineerings von großem Interesse. Stammzellen stehen bei diesen Ansätzen an er....

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Protokoll

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1. Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees

  1. Nehmen Sie die mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees (WJ-MSCs, aus ATCC) aus einem −80 °C heißen Gefrierschrank. Kultivieren Sie WJ-MSCs in DMEM-F12-Medium, das 10 % fetales Kälberserum (FBS), 1 % Pen-Streptokokken und 1 % L-Glutamin enthält, in einem sterilen laminaren Fluss bei Raumtemperatur, wie in Yurie et al.20 beschrieben.
  2. Kryokonservieren Sie einige der Zellen bei 1 x 106 Zellen/ml mit einem Gefriermedium, das 35 % FBS, 55 % DMEMF-12 und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält. Zählen Sie dazu 1 x 106 Zellen au....

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Ergebnisse

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Graphen-Toxizität und 2D-Bildgebung
Die statistische Analyse der erhaltenen MTT-Ergebnisse wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Tukey-Test in einer statistischen Analysesoftware durchgeführt, und die erhaltene Grafik ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Graphenanteil im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte nur für die Graphenkonzentration von 0,001 % (**p < 0,01) eine signifikante Abnahme. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den anderen Gru.......

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Diskussion

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Die Vorteile von Behandlungen, die mit technischen 3D-Gerüsten gegenüber herkömmlichen 2D-Methoden angewendet werden, werden von Tag zu Tag deutlicher. Stammzellen, die allein in diesen Therapien oder zusammen mit Gerüsten aus verschiedenen Biomaterialien mit geringer Biokompatibilität und biologischer Abbaubarkeit hergestellt werden, sind in der Regel unzureichend für die periphere Nervenregeneration. Die mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees (WJ-MSCs) scheinen eine geeignete Kandidatenzelllinie zu sein, insbeson.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht. Das Projekt wurde in Zusammenarbeit mit HD Bioink, dem Entwickler der 3D-Bioprinting-Technologie, durchgeführt.

Danksagungen

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Das in dieser Studie verwendete Graphen wurde an der Kirklareli University, Fakultät für Maschinenbau, entwickelt. Es wurde von Dr. Karabeyoğlu gespendet. Finanziert wurde der Graphen-Toxizitätstest durch das Projekt "Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks" (Antrags-Nr.: 1139B411802273), das im Rahmen des TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program durchgeführt wurde. Der andere Teil der Studie wurde durch den Forschungsfonds der Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713) unterstützt. Mesenchymale Stammzellen mit GFP, die in der Zeitraffer-Bildgebung v....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare

Zentrifugal		HitachiWird in Zellkulturen und Biomaterialien Schritt
0,1N CaCl2HD Bioinkverwendet für Vernetzer
0,22 &; Mikro; m MembranfilterAι sι moWird für die Sterilisation
0,45 & Mikro verwendet; m SpritzenvorsatzfilterAι sι moWird für die Sterilisation
verwendet 1,5 ml konisches RöhrchenEppendorfaWird für Biotintentropfen
verwendet 15 ml Falcon RöhrchenNestWird in Zellkulturschritten
verwendet 25 cm2 Zellkulturflaschen (Falcon, TPP GewebekulturkolbenNestWird für Zellkulturen
verwendet 3D BioprintingAxolotl Biosystems Bio A2 (Türkei)Bioprinting Schritt
50 mL Falcon TubeNestWird in Zellkultur-Step-6
/24/48/96-Well-Platten verwendet (Falcon, TPP-Mikrotiterplatten)Merck MilliporeWird in Zellkultur-Steps
75 cm2 Zellkulturflaschen verwendet (Falcon, TPP-GewebekulturflaschenNestWird für Zellkulturen
verwendet Anti-Maus-IgG-FTIC-KaninchenSanta Cruz BiotechnologyJ1514Seconder-Antikörper, wird für Farbstoffe verwendet
Anti-Maus IgG-SC2781-ZiegeSanta Cruz BiotechnologieC3109Seconder-Antikörper, verwendet für
Farbstoff-Au-Beschichtungsgerät EM ACE600Leicafür die Vergoldung von Biomaterialschnitt vor der REM-Bildgebung
AutoklavNUVE-OT 90LWird für den Sterilisationsprozess verwendet.
AutoklavNUVE-OT 90LWird für den Sterilisationsprozess verwendet.
Cell Cultre CabineHera Safe KSWird für den Zellkulturprozess
verwendet Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12SigmaRNBJ7249Wird als Zellkulturmedium
verwendet FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEMQuanta FEG450für SEM
Fetal Bovine Serum-FBSCapricornFBS-16AEs wurde durch Zugabe zum Zellkulturmedium verwendet.
Gefrierschrank -80°; CPanasonicMDF-U5386S-PEWir wurden zur Lagerung von Zellen und den daraus resultierenden Exosomen verwendet
Gelatine-Alginat-BiotintenpulverHD BioinkWird für die Herstellung von Biotinte verwendet
Schritt GFP markiert-WJ-MSCsVirostemWird für die Bildgebung der Zell-Biotinte-Wechselwirkung verwendet
Graphen-Nanoplättchen (Graphen-IGP2)Grafen Chemical Industries Co.Wird für die Herstellung von 3D-G-Biotinte
Immunfluoreszenz-Antikörper (N-CAD; β-III Tubulin)Zellsignalisierung und Santa CruzWird für den Farbstoff
JASCO 6600Tetrafür FTIR
MTT Assayverwendet SigmaViabilitätstests
Penicilin/Streptomycin LösungCapricornPB-SEs wurde dem Medium zugesetzt, um eine Kontamination zu verhindern in Zellkultur.
Thoma ObjektträgerIsolabWird zur Zählung der Zelle
verwendet Zeitraffer-BildgebungssystemZeiss Axio.Observer.Z1Bildgebung
Tripsin-EDTAMulticellDer Kolben wurde verwendet, um die Zellen zu entfernen, die die Oberfläche bedecken.
VorteksBiobaseFür die Herstellung von Biotinte
Schritt WJ-MSCsATCCWird für den Zellkulturprozess verwendet
verwendet

Referenzen

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  1. Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, Vize Publishing, Istanbul. (2019).
  2. Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Graphen Hydrogel Bioink3D BioprintingStammzelldifferenzierungneurale RegenerationSph roidbildungmesenchymale StammzellenImmunf rbungZell Ger st Interaktion

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