Methodenartikel

Herstellung und Charakterisierung von Graphen-basierter 3D-Biohybrid-Hydrogel-Biotinte für das periphere Neuroengineering

DOI:

10.3791/63622

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16. Mai 2022

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1Vocational School of Health Services, Istinye University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell, and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Vocational School of Health Services, Altinbas University, 7The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 8Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Manuskript demonstrieren wir die Herstellung einer biohybriden Hydrogel-Biotinte, die Graphen für den Einsatz im peripheren Tissue Engineering enthält. Unter Verwendung dieses 3D-Biohybridmaterials wird das neuronale Differenzierungsprotokoll von Stammzellen durchgeführt. Dies kann ein wichtiger Schritt sein, um ähnliche Biomaterialien in die Klinik zu bringen.

Zusammenfassung

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Periphere Neuropathien können als Folge einer axonalen Schädigung und gelegentlich aufgrund von demyelinisierenden Erkrankungen auftreten. Periphere Nervenschäden sind ein globales Problem, das bei 1,5 % bis 5 % der Notfallpatienten auftritt und zu erheblichen Arbeitsplatzverlusten führen kann. Heute sind auf Tissue Engineering basierende Ansätze, die aus Gerüsten, geeigneten Zelllinien und Biosignalen bestehen, mit der Entwicklung dreidimensionaler (3D) Bioprinting-Technologien anwendbarer geworden. Die Kombination verschiedener Hydrogel-Biomaterialien mit Stammzellen, Exosomen oder Biosignalmolekülen wird häufig untersucht, um die bestehenden Probleme bei der peripheren Nervenregeneration zu überwinden. Dementsprechend hat die Herstellung von injizierbaren Systemen, wie z.B. Hydrogelen, oder implantierbaren Conduit-Strukturen, die durch verschiedene Bioprinting-Methoden gebildet werden, im peripheren Neuro-Engineering an Bedeutung gewonnen. Unter normalen Bedingungen sind Stammzellen die regenerativen Zellen des Körpers, und ihre Anzahl und Funktionen nehmen mit der Zeit nicht ab, um ihre Populationen zu schützen. Dabei handelt es sich nicht um spezialisierte Zellen, sondern sie können sich bei entsprechender Stimulation als Reaktion auf eine Verletzung differenzieren. Das Stammzellsystem steht unter dem Einfluss seiner Mikroumgebung, der sogenannten Stammzellnische. Bei peripheren Nervenverletzungen, insbesondere bei Neurotmesis, kann dieses Mikromilieu auch nach chirurgischer Bindung durchtrennter Nervenenden nicht vollständig gerettet werden. Der Ansatz von Verbundbiomaterialien und kombinierten zellulären Therapien erhöht die Funktionalität und Anwendbarkeit von Materialien in Bezug auf verschiedene Eigenschaften wie biologische Abbaubarkeit, Biokompatibilität und Verarbeitbarkeit. Dementsprechend zielt diese Studie darauf ab, die Herstellung und Verwendung von Graphen-basiertem biohybridem Hydrogel-Patterning zu demonstrieren und die Differenzierungseffizienz von Stammzellen zu Nervenzellen zu untersuchen, was eine effektive Lösung bei der Nervenregeneration sein kann.

Einleitung

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Das Nervensystem, der Mechanismus, der die innere Struktur des Organismus und die Umwelt verbindet, ist in zwei Teile unterteilt: das zentrale und das periphere Nervensystem. Periphere Nervenschäden sind ein globales Problem, das 1,5 % bis 5 % der Patienten ausmacht, die sich in der Notaufnahme vorstellen und sich aufgrund verschiedener Traumata entwickeln, was zu einem erheblichen Verlust des Arbeitsplatzes führt 1,2,3.

Heute sind zelluläre Ansätze des peripheren Neuro-Engineerings von großem Interesse. Stammzellen stehen bei diesen Ansätzen an erster Stelle. Unter normalen Bedingungen sind Stammzellen die regenerativen Zellen des Körpers, und ihre Anzahl und Funktionen nehmen mit der Zeit nicht ab, um ihre Populationen zu schützen. Diese Zellen sind spezialisiert, können sich aber bei entsprechender Stimulation als Reaktion auf eine Verletzung differenzieren 4,5. Nach der Stammzellhypothese steht das Stammzellsystem unter dem Einfluss seiner Mikroumgebung, der sogenannten Stammzellnische. Die Konservierung und Differenzierung von Stammzellen ist ohne das Vorhandensein ihrer Mikroumgebung6 nicht möglich, die durch Tissue Engineering mit Hilfe von Zellen und Scaffolds7 rekonstituiert werden kann. Tissue Engineering ist ein multidisziplinäres Gebiet, das sowohl ingenieurwissenschaftliche als auch biologische Prinzipien umfasst. Tissue Engineering bietet Werkzeuge für die Herstellung von künstlichem Gewebe, das lebendes Gewebe ersetzen kann und bei der Regeneration dieses Gewebes verwendet werden kann, indem das beschädigte Gewebe entfernt und funktionsfähiges Gewebe bereitgestellt wird8. Gewebegerüste, einer der drei Eckpfeiler des Tissue Engineering, werden mit unterschiedlichen Methoden aus natürlichen und synthetischen Materialien hergestellt9. Der dreidimensionale (3D) Druck ist eine aufstrebende additive Fertigungstechnologie, die häufig eingesetzt wird, um defektes Gewebe durch die einfache, aber vielseitige Herstellung komplexer Formen mit verschiedenen Methoden zu ersetzen oder wiederherzustellen. Bioprinting ist ein additives Fertigungsverfahren, das die Koexistenz von Zellen und Biomaterialien ermöglicht, sogenannte Biotinten10. Unter Berücksichtigung der Interaktion von Nervenzellen untereinander haben sich die Studien auf leitfähige Biomaterialkandidaten wie Graphen verlagert. Graphen-Nanoplatten, die Eigenschaften wie flexible Elektronik, Superkondensatoren, Batterien, Optiken, elektrochemische Sensoren und Energiespeicherung aufweisen, sind ein bevorzugtes Biomaterial im Bereich des Tissue Engineering11. Graphen wurde in Studien verwendet, in denen die Proliferation und Regeneration von geschädigten Geweben und Organen durchgeführt wurde12,13.

Tissue Engineering besteht aus drei Grundbausteinen: Gerüst, Zellen und Biosignalmoleküle. Es gibt Defizite in den Studien zur peripheren Nervenschädigung in Bezug auf die vollständige Bereitstellung dieser drei Strukturen. Bei den in den Studien hergestellten und verwendeten Biomaterialien sind verschiedene Probleme aufgetreten, wie z. B. dass sie nur Stammzellen oder Biosignalmoleküle enthalten, das Fehlen eines bioaktiven Moleküls, das die Differenzierung von Stammzellen ermöglicht, die mangelnde Biokompatibilität des verwendeten Biomaterials und die geringe Auswirkung auf die Proliferation von Zellen in der Gewebenische. und somit wird die Nervenleitung nicht vollständig realisiert 2,13,14,15,16. Dies erfordert die Optimierung der Nervenregeneration, die Verringerung des Muskelschwunds 17,18 und die Schaffung der notwendigen Zielsuche19 mit Wachstumsfaktoren gegen solche Probleme. An dieser Stelle ist die Charakterisierung und Analyse der Neuroaktivität eines chirurgischen Biomaterial-Prototyps, der in die Klinik übertragen werden soll, sehr wichtig.

Dementsprechend untersucht diese Methodenstudie die Biotinten-Hydrogel-Strukturierung mit Graphen-Nanoplatten, die von einem 3D-Biodrucker gebildet werden, und ihre Wirksamkeit auf die neurogene Differenzierung der darin enthaltenen Stammzellen. Außerdem werden die Auswirkungen von Graphen auf die Bildung und Differenzierung von Neurosphären untersucht.

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Protokoll

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1. Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees

  1. Nehmen Sie die mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees (WJ-MSCs, aus ATCC) aus einem −80 °C heißen Gefrierschrank. Kultivieren Sie WJ-MSCs in DMEM-F12-Medium, das 10 % fetales Kälberserum (FBS), 1 % Pen-Streptokokken und 1 % L-Glutamin enthält, in einem sterilen laminaren Fluss bei Raumtemperatur, wie in Yurie et al.20 beschrieben.
  2. Kryokonservieren Sie einige der Zellen bei 1 x 106 Zellen/ml mit einem Gefriermedium, das 35 % FBS, 55 % DMEMF-12 und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) enthält. Zählen Sie dazu 1 x 106 Zellen auf einem Thoma-Zellzählobjektträger und geben Sie die Gefrierlösung tropfenweise hinzu. Übertragen Sie den Objektträger schnell in einen Flüssigstickstoffbehälter.
  3. Wenn die kultivierten Zellen im Kolben zu 80 % konfluent sind, gießen Sie das Medium aus und waschen Sie es mit 5 ml PBS. Fügen Sie 5 ml 0,25%iges Trypsin und 2,21 mM EDTA-4Na hinzu. Im Inkubator bei 37 °C 5 min inkubieren.
  4. Geben Sie 10 ml DMEM-F12-Medium mit 10 % FBS zu den aus dem Inkubator entnommenen Zellen. Hängen Sie es gut auf, sammeln Sie das Medium und füllen Sie das Medium in ein Zentrifugenröhrchen.
  5. Bei einer Drehzahl von 101 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und säen Sie die Zellen in neuen Kolben mit frischem Nährmedium, das 10 % FBS enthält.
    HINWEIS: Kommerzielle WJ-MSCs, die mit dem GFP-Gen durch die Transduktionsmethode markiert sind, können verwendet werden, um die herzustellenden Biomaterial-Zell-Interaktionen besser sichtbar zu machen21. Die Gruppen, die bei dieser Methode verwendet werden sollen, können wie in Tabelle 1 dargestellt erstellt werden.

Erstellte GruppenGründe für die ErstellungAnzahl der Wiederholungen
2D WJ-MSCs (2D-C)2D-Steuerungx 5
2D WJ-MSCs &; Graphen (2D-G)Bestimmung der toxischen Dosis von Graphen in 2Dx 5 Wiederholungen mit jeweils unterschiedlichen Konzentrationen
WJ-MSCs sind in Biotinten (3D-B) enthalten3D-Steuerungx 3
WJ-MSCs & 0,1% Graphen sind in Biotinten enthalten (3D-G )3D-Graphen-Bioink-Biohybrid-Gruppex 3
WJ-MSCs liegen in Sphäroidform auf den Biotinten vor (3D-BS )3D-Kontrolle der Sphäroidformx 3
WJ-MSCs &; 0,1% Graphen liegen in Sphäroidform auf den Biotinten vor (3D-GS-Gruppe)3D-Graphen-Bioink-Biohybrid-Gruppe in Sphäroidformx3
3D-BiotintentropfenEs wird für die REM- und FTIR-Charakterisierungsanalyse hergestellt.x5
3D-Graphen-TropfenEs wird für die REM- und FTIR-Charakterisierungsanalyse hergestellt.x5
3D-Biotinte mit GFP-markierten WJ-MSCs &; 0,1 %Beobachtung der Bewegungen von WJ-MsCs in der Biotinte, die die entsprechende Dosis Graphen enthält.x3

Tabelle 1. Gruppen in der Methode. Alle 2D- und 3D-Gruppen in der Methode sind enthalten.

2. Graphen-Toxizität und 2D-Bildgebung

  1. Aufbereitung von Graphenkonzentrationen und Applikation auf Zellen
    HINWEIS: Rohe Graphen-Nanopartikel wurden kommerziell gekauft (Typ industrielle Graphen-Nanoplatten) und ebenfalls gespendet. Die Abmessungen der Partikel betrugen eine Dicke von 5-8 nm, einen Durchmesser von 5 μm und eine Oberfläche von 120-150m2/g.
    1. Wiegen Sie das Graphen, um eine 1%ige Lösung (mg/ml) zu erhalten. Stellen Sie eine Stammlösung her, indem Sie 10 ml DMEMF-12-Medium mit 10 % FBS zu den gewogenen 100 μg Graphen-Nanopartikeln hinzufügen und diese Lösung als Stammlösung kennzeichnen. Im Autoklaven bei 121 °C unter 1,5 atm Druck für 20 min sterilisieren.
      HINWEIS: Die sterile Graphenmischung wird bis zur Verwendung bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahrt. Es ist möglicherweise nicht für den Langzeitgebrauch geeignet (maximal 1 Monat). In diesen Fällen muss das Gemisch rekonstituiert und sterilisiert werden.
    2. Bereiten Sie eine Mischung aus mittlerem Graphen in verschiedenen Konzentrationen vor, um ungiftige Dosen zu bestimmen. Stellen Sie die anfänglichen Verdünnungen auf 1 %, 0,1 %, 0,01 %, 0,001 % und 0,0001 % Graphen/Medium ein.
    3. Beginnen Sie mit der 1%igen Stammlösung, nehmen Sie nacheinander 1 ml aus jeder Konzentration und überführen Sie es in ein neues Röhrchen. Geben Sie 9 ml DMEMF-12-Medium mit 10 % FBS in jedes Röhrchen, so dass fünf allmählich verdünnte Proben entstehen, und schütteln und wirbeln Sie die Lösungen, um eine gleichmäßige Verteilung zu erhalten. Verwenden Sie nur 10 ml DMEMF-12-Medium mit 10 % FBS als Kontrolle.
      HINWEIS: Die schweren Graphenflocken fallen aus und müssen daher umverteilt werden.
    4. Säen Sie die WJ-MSCs in 6-Well-Platten mit 2 ml frischem Medium mit 10 % FBS bei 5 x 105 Zellen pro Well. 1 Tag bei 37 °C inkubieren. Teilen Sie dann die Platten in Gruppen gleicher und wiederholter Vertiefungen. Mache fünf Wiederholungen für jede Konzentration.
    5. Verwerfen Sie das Medium und ersetzen Sie es dann durch Graphen-Medium-Konzentrationen mit 2 ml pro Well. Verwenden Sie nur das Medium für die Kontrollgruppe. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 24 h.
  2. Bestimmung von nicht-toxischen Konzentrationen von Graphen mit MTT
    1. Medien mit Graphen nach 24 h verwerfen. Waschen Sie jede Vertiefung mit PBS. Fügen Sie frisches DMEMF-12-Medium mit 10 % FBS bei 2 ml pro Well hinzu.
      HINWEIS: Es ist wichtig, sich nach dem Auftragen von Graphenkonzentrationen auf die Zelle mit PBS zu waschen, da Graphen-Nanopartikel, die nicht durch Endozytose in die Zelle aufgenommen werden, aus der Umgebung entfernt werden. Dadurch wird der MTT-Test effizienter.
    2. Verwenden Sie das MTT-Protokoll (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid), um den IC50-Wert zu bestimmen, der eine 50%ige Zellviabilität anzeigt, wie in Kose et al.22 und in den Schritten 2.2.3.-2.2.6 beschrieben.
    3. Wiegen Sie zunächst 5 mg/ml MTT-Salz ab und lösen Sie es in PBS auf. Sterilisieren Sie mit einem 0,45-μm-Filter. Wickeln Sie die MTT-Lösung in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit Aluminiumfolie ein und lagern Sie sie bei 4 °C.
    4. Geben Sie 10 μl MTT in alle Vertiefungen und inkubieren Sie die Platte 4 h lang bei 37 °C. Beobachten Sie die Bildung von Formazankristallen bei 10-facher Vergrößerung unter dem Mikroskop nach der Inkubation.
    5. Um die in den Zellen gebildeten Kristalle aufzulösen, geben Sie 100 μl DMSO in jede Vertiefung und mischen Sie sie durch Pipettieren. Bewahren Sie den Teller 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln auf. Legen Sie die Platte in den ELISA-Plattenleser ein. Stellen Sie aus dem Programm für die Absorptionsmessung eine Wellenlänge von 570 nm ein und lassen Sie die Platte22 ablesen.
      HINWEIS: Während nur Graphenpartikel bei 270 nm23 abgelesen werden, dient der Lesebereich von 570 nm24 hier nur der Viabilität von Zellen.
    6. Führen Sie eine statistische Analyse der erhaltenen Ergebnisse mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Tukey-Test in einem statistischen Analyseprogramm durch.
  3. Stitch-Bildgebung
    1. Um die Wechselwirkung verschiedener Graphenkonzentrationen mit Zellen zu untersuchen, führen Sie einen Zeitraffer der Zellen mit der Methode namens Stitch Imaging durch. Bei dieser Methode wird ein Zeitrafferbild aus Bildproben erstellt, die in regelmäßigen Abständen unter dem Mikroskop aufgenommen werden.
    2. Schalten Sie dazu zuerst den Computer ein. Schalten Sie den Zeitraffer-Inkubator ein und stellen Sie ihn auf 37 °C ein. Legen Sie die MTT-Platte in den Zeitraffer-Inkubatorschlitz.
    3. Öffnen Sie das Stitch-Programm auf dem Computer. Geben Sie die Wells an, die im System gelesen werden sollen. Bringen Sie das Lesegerät zum ersten Brunnen und lokalisieren und fokussieren Sie den Bereich mit 10-facher Vergrößerung im weißen Licht. Starten Sie das Programm.
      HINWEIS: Es ist ein Programm zum Erstellen hochwertiger Fotocollagen mit 4 Zeilen x 5 Spalten. Das Programm kombiniert nacheinander aufgenommene Fotos in HD-Qualität. Wenn Sie die Systemstarttaste drücken, werden die Vertiefungen automatisch gelesen, und es werden 4 Reihen x 5 Spalten mit mehreren Fotos aufgenommen und geheftet.

3. Herstellung von Biohybrid-Hydrogelen in Graphen - Bioink und Differenzierung von WJ-MSCs

  1. Herstellung von Biotinten
    HINWEIS: Die lyophilisierten, kommerziell erhältlichen Alginat-Gelatine-Pulver (3:5) werden als Basis für Biotinten verwendet. Die Graphen-Bioink-Gruppe (3D-G; 3D-GS) und die Graphen-freie Kontroll-Bioink-Gruppe (3D-B; 3D-BS) werden mit der gleichen Methode hergestellt (Tabelle 1).
    1. Verwenden Sie für die Präparation konische 50-ml-Röhrchen. Zuerst werden 4,5 mg Alginat und 1,5 mg Gelatine abgewogen und in ein Zentrifugenröhrchen umgefüllt. DMEMF-12-Medium mit 10 % FBS auf ein Gesamtvolumen von 50 ml in die Mischung geben. Dies ist die Kontrollgruppe (C) ohne Graphen.
    2. Wiederholen Sie das Abwägen von 4,5 mg Alginat und 1,5 mg Gelatine und geben Sie es in ein Zentrifugenröhrchen. Dann werden 50 μl des vorbereiteten 0,1%igen Graphens aus Schritt 2.1.3 entnommen. und geben Sie es in die Tube. DMEMF-12 mit 10 % FBS auf ein Gesamtvolumen von 50 ml geben.
    3. Mischen Sie die Biotinten zuerst durch Pipettieren und dann durch Wirbeln. Im Autoklaven bei 121 °C unter 1,5 atm Druck für 20 min sterilisieren. Alternativ können Sie die Sterilisation durch Mikrowelle bis zum Siedepunkt durchführen.
    4. Nachdem die Mischungen autoklaviert wurden, zentrifugieren Sie bei 280 x g für 2 Minuten bei Raumtemperatur, um gebildete Blasen zu entfernen. Halten Sie die Biotinten bei 37 °C, bis die Zellen vorbereitet sind.
  2. Hinzufügung von WJ-MSCs und 3D-Bioprinting
    1. Waschen Sie die Zellen zum Zählen, wenn eine 80%ige Konfluenz mit ca. 5 ml PBS vorliegt, und fügen Sie 5 ml 0,25%iges Trypsin und 2,21 mM EDTA 4Na hinzu. 5 min bei 37 °C ruhen lassen.
    2. Nach der Entnahme aus dem Inkubator werden 10 ml DMEM-F12-Medium mit 10 % FBS in die Zellen gegeben. Gut suspendieren, das Medium auffangen und in ein Zentrifugenröhrchen umfüllen. Bei 101 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und dann den Überstand verwerfen.
    3. Lassen Sie ca. 250 μl Medium mit dem Pellet. Lösen Sie das Pellet in 1 ml frischem Medium wieder auf. Zu 48 μl Medium werden 2 μl Zellsuspension und 50 μl Trypanblau (0,4 g Trypanblau/100 ml) in ein konisches Röhrchen (1,5 ml) gegeben, um4 zu zählen. Pipettieren Sie es gut.
    4. Geben Sie ca. 10 ml der vorbereiteten gefärbten Zellsuspension in eine Thoma-Zellzählkammer. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Zellen, die in die Quadrate auf beiden Seiten des Lichtmikroskops fallen.
      Berechnen Sie den Vitalitätsprozentsatz (%) = (gezählte lebensfähige Zellen/Gesamtzahl der gezählten Zellen) x 100
      HINWEIS: Die Interaktion zwischen Zelle und Biotinte wird auf zwei Arten untersucht: (1) Sie kann gedruckt werden, indem sie in die Biotinten (3D-B; 3D-G) gegeben wird; (2) Die Zellen werden nach dem Pressen auf die Biotinten gesät und die Zellen bilden ein Sphäroid (3D-BS; 3D-GS).
    5. Für die Zell-Bioink-Interaktion erstellen Sie zunächst die Bioink-Gruppen (Tabelle 1). Gruppe 1 umfasst 3D-B und 3D-G, die mit Biotinte für das Bioprinting gedruckt wurden. Gruppe 2 umfasst 3D-BS- und 3D-GS-Biotinten, auf denen nach dem Bioprinting Sphäroide gebildet wurden.
    6. Zählen Sie die Zellen für Gruppe 1 so, dass sich ungefähr 1 x 107 Zellen in 0,5 ml Medium befinden. Fügen Sie 4,5 ml Biotinte hinzu, um das Gesamtvolumen auf 5 ml zu erhöhen. Übertragen Sie diese mit Hilfe von Spritzen auf die Kartuschen im Sterilschrank. Setzen Sie die Kartuschen in den entsprechenden Extruderabschnitt des Bioprinters ein.
    7. Für die zweite Gruppe entnehmen Sie 5 ml aus jeder der Biotintengruppen und überführen sie mit Hilfe eines Injektors in sterile Kartuschen.
    8. Verwenden Sie den Bioprinter mit zwei koaxialen Druckköpfen und der pneumatisch angetriebenen Extrusionstechnologie. Stellen Sie die X/Y/Z-Auflösung pro Mikroschritt auf 1,25 μm, die Extrusionsbreite auf 400 μm und die Extrusionshöhe auf 200 μm ein. Ein Raster von 20 mm x 20 mm x 5 mm ist eines der am häufigsten verwendeten 3D-Modelle für 3D-Bioprinting-Arbeiten.
    9. Erstellen Sie die 3D-Modelle mit webbasierten Open-Source-CAD-Programmen. Erstellen Sie vor dem Bioprinting einfache 3D-Modelle mit einer der Open-Source-Plattformen (z. B. Infill). Das Modell kann linear (wie das hier verwendete Modell), wabenförmig oder gitterförmig sein. Exportieren und Herunterladen im .stl-Format, nachdem Sie ein Quadrat von 5 mm x 20 mm x 20 mm erstellt haben.
    10. Die Bioprinter-Software verwendet .stl-Dateien und konvertiert sie mithilfe von Slicer-Modulen in das druckbare .gcode-Format. Um eine druckbare Rasterform zu erhalten, deaktivieren Sie die äußere Shell im Slicermodul. Wischen Sie das Gerät vor dem Betrieb mit 70%igem Ethanol ab und sterilisieren Sie es anschließend durch UV-Sterilisation.
    11. Für den Bioprinting-Prozess werden die Biotintengruppen mit Hilfe eines Injektors auf die Kartuschen übertragen. Setzen Sie die Kartuschen in den entsprechenden Extruderabschnitt des Bioprinters ein.
    12. Stellen Sie den durchschnittlichen Druck des 3D-Druckers auf 7,5 psi und die Kartuschen- und Betttemperatur auf 37 °C ein. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 60 % ein und führen Sie einen Standard-3D-Druckprozess durch.
      HINWEIS: Die Planung der vorbereiteten Modelle mit Räumen (wie ein lineares Modell) ermöglicht die Zellkultur in den Räumen nach dem Bioprinting.
    13. Bringen Sie das System während der Schreibphase in die Ausgangsposition. Positionieren Sie die Achsen (X, Y, Z) automatisch, wählen Sie den Extruder aus und stellen Sie ihn ein. Starten Sie den Druckvorgang. Nehmen Sie nach dem Bioprinting-Prozess die Probe und legen Sie sie unter eine Laminar-Flow-Kabine.
    14. Besprühen Sie die Biotinten nach dem Drucken mit 0,1 NCaCl2-Lösung oder geben Sie 1 ml der Lösung mit einer Pipette bei Raumtemperatur hinzu. Warten Sie ca. 10-20 s und waschen Sie die gedruckten Muster 2x mit PBS, dasCa2+ und Mg2+ enthält.
    15. Fügen Sie 2 ml DMEMF-12 mit 10%igem FBS-Medium auf jede der zellhaltigen Biotintengruppen hinzu. Die Platten werden bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Anschließend werden 2 ml Suspensionsmedium mit 1 x 106 Zellen zu jeder Gruppe für die Sphäroidbildung hinzugefügt.
    16. Die Platten werden bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Beobachten Sie nach 24 h Inkubation die Sphäroidbildung unter einem inversen Mikroskop.
  3. Differenzierung von WJ-MSCs zu neuronenähnlichen Zellen
    1. Beobachten und fotografieren Sie alle Chargen von Biotinte nach 24 Stunden Inkubation. Fügen Sie 2 ml neurogenes Differenzierungsmedium pro Vertiefung hinzu (außer für die Kontrollgruppe) und aktualisieren Sie es alle 2 Tage. Befolgen Sie die Studie 7 Tage lang, um die neuronale Differenzierung zu beobachten.

4. Charakterisierung von Graphen-Bioink-Biohybrid-Hydrogelen

HINWEIS: Zeitrafferaufnahmen, Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT/IR) und Rasterelektronenmikroskopie (REM) werden zur Charakterisierung von Graphen-Bioink-Biohybrid-Hydrogel durchgeführt. Die Proben werden aus 3D-B- und 3D-G-Biotintengruppen mit der Drip-Methode für die FT/IR- und REM-Analyse hergestellt.

  1. FT/IR-Analyse
    HINWEIS: FT/IR ist eine chemische Analysemethode, die auf der mathematischen Fourier-Transformation basiert und für die Materialcharakterisierung unerlässlich ist. Verwenden Sie ein FT/IR-Gerät, das auf den Prinzipien des Michelson-Interferometers bei 28 °C basiert, mit einer Halogenlampe, einer wassergekühlten Quecksilberlichtquelle, einem Signalseitenverhältnis von 4 cm−1, gemessen für 1 Minute, bei 2.200 cm−1.
    1. Bereiten Sie das FT/IR-Mikroskop vor und stellen Sie sicher, dass die Optik des Instruments ausgerichtet ist. Kalibrieren Sie das Gerät.
    2. Da sich die Probe in einem Tropfen befindet, nehmen Sie ein Stück 1-2 mm dickes Hydrogel und legen Sie es mit einer Pinzette auf das Probenteil. Konzentrieren Sie sich auf die Probe und heben Sie sie an, bis ein enger Kontakt hergestellt ist. Erfassen Sie das Probenspektrum, indem Sie den Prozess vom System aus starten.
  2. Rasterelektronenmikroskopie (REM) Analyse
    HINWEIS: Die Oberflächenmorphologie, die innere Struktur, die Zellverteilung und die Interaktionen zwischen Tinte und Zelle können durch REM-Analyse in verschiedenen Dimensionen untersucht werden.
    1. Das Hydrogel wird mit der Pipettenspitzen-Tröpfchenmethode in 6-Well-Platten mit 1 ml CaCl-2-Vernetzer getropft (siehe Abbildung 1).
    2. Waschen Sie die Platten 2x mit ca. 1 ml PBS, um die Salzlösung zu befreien. Geben Sie diese Tropfen dann mit Hilfe einer Pinzette in ein Falkenröhrchen, das 5 ml 5%iges Paraformaldehyd enthält.
    3. Machen Sie mit Hilfe eines Skalpells dünne Schnitte aus den Tropfenbiotinten. Kleben Sie die Proben auf der klebrigen Seite auf die Metallplatte. Setzen Sie die Probe in das Beschichtungsgerät ein, wo das Goldpalladium, das durch Ersetzen der Luft durch Argongas in die Plasmaphase übergeht, die Probe bedeckt.
    4. Legen Sie es in das Elektronenmikroskop (REM). Öffnen Sie das Mikroskopprogramm, mit dem das REM verbunden ist. Führen Sie die Skalierung durch und nehmen Sie Bilder von verschiedenen Teilen der Probe auf. Für dieses Protokoll wurden 5 μm-, 10 μm- und 200 μm-Skalen verwendet. Insgesamt wurden 40 Bilder für die 3D-B- und 3D-G-Gruppen aufgenommen.
  3. Zeitraffer-Aufnahmen
    HINWEIS: Bei der Zeitraffer-Bildgebung wurden nicht nur Biotintenproben verwendet, die GFP-Gen-transformierte Zellen enthielten, sondern auch Biotinten mit Sphäroiden wurden für 16 h abgebildet. Zeitrafferaufnahmen werden durchgeführt, um die Auswirkungen von Graphen auf Stammzellen zu untersuchen und Zellinteraktionen innerhalb der Biotinte zu überwachen.
    1. Geben Sie handelsübliche 1 x 107 GFP-markierte MSCs in 5 ml Biotinte und Bioprint wie in Schritt 3.2.11 beschrieben. 1 ml Vernetzer hinzufügen, 20-30 s halten und 2x mit PBS waschen.
    2. Schalten Sie den Zeitraffermonitor ein und öffnen Sie das Programm auf dem Computer. Stellen Sie ca. 16 h im Zeitraffermodus ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein. Drücken Sie die Start-Taste. Videos in Form von 40 s Zeitraffer-Videobeispielen werden vom System aufgezeichnet.
    3. Fokussieren Sie das Mikroskop alle 2 h mit 10-facher Vergrößerung. Visualisieren Sie auch die erstellten Sphäroide, indem Sie die gleichen Schritte ausführen.

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Abbildung 1: 3D-B- und 3D-G-Biotintengruppen, die als Tropfen zur Verwendung in der Charakterisierung hergestellt werden. (A) Biotintenproben (Vorcharakterisierungsbild) auf einer Platte mit einem Vernetzer. (B) 3D-B-Tropfenbild von Biotinte. (C) 3D-G-Biotinten-Tropfenbild. Das zu charakterisierende Biomaterial und die darin enthaltenen Zellen können Prozesse wie Vergoldung, Probenahme usw. leichter durchlaufen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

5. Bestimmung der neurogenen Differenzierung mittels Immunfärbemethode

  1. Sammeln Sie die Sphäroide, ohne die Kugelformen zu unterbrechen, und säen Sie sie in neue Platten ein, um sie mit einer einfacheren Methode neu zu konstruieren, anstatt sie für die Gewebeschnitte in Paraffin einzubetten.
  2. Decken Sie die 48-Well-Platten mit etwa 20 ml vorautoklavierter 0,1%iger Gelatinelösung ab und bewahren Sie sie mindestens 1 Stunde lang in einem Inkubator auf. Pipettieren Sie ca. 500 μl vorbereitete 0,1%ige Gelatine in 48-Well-Platten. Lassen Sie die gallertartigen Platten 10 Minuten im Inkubator.
    Anmerkungen: Dadurch kann die Gelatine leicht aufquellen, die Oberfläche bedecken und eine bessere Umgebung für die gesammelten Sphäroide schaffen.
  3. Sammeln Sie die Sphäroide durch Pipettieren, verteilen Sie die gesammelten Sphäroide aus dem Inkubator in die Vertiefungen der 48-Well-Platte und fügen Sie frisches Medium hinzu. Dann 12-24 Stunden inkubieren.
    HINWEIS: Es ist ziemlich schwierig, die Sphäroide durch Zählen zu verteilen. Sammeln Sie die Sphäroide in einem einzigen Röhrchen und verteilen Sie das Gesamtvolumen gleichmäßig auf die Vertiefungen. Für diese Studie enthielt jede Vertiefung etwa 4-6 Sphäroide.
    HINWEIS: Für 2D-Proben ist das Waschen vor der Färbung ausreichend, und es ist kein Medienwechsel erforderlich.
  4. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen langsam mit PBS, da sich die Sphäroide oben befinden. 2 h in 4%igem Paraformaldehyd fixieren.
  5. Waschen Sie die Proben erneut mit PBS und blockieren Sie sie mit ca. 10 mL 2% BSA und 0,1% TritonX für 30 min. Anschließend mit PBS 3x waschen.
  6. Ausgewählte Primer-Antikörper (N-Cadherin-Kaninchen und β-III-Tubulin-Maus) werden im Verhältnis 1:100 mit einer Antikörper-Verdünnungsreagenzlösung verdünnt. Zu jeder Probe werden 100 μl Antikörperlösung gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert.
  7. Waschen Sie die Proben 3x mit PBS. Inkubation mit Anti-Maus-IgG-FTIC-Kaninchen für β-III-Tubulin und Anti-Maus-IgG-SC2781-Ziegen-Sekundärantikörper für N-Cad, verdünnt auf 1:200 bei Raumtemperatur für 30 min. Führen Sie alle Vorgänge im Dunkeln durch.
    HINWEIS: Unabhängig davon, welcher Stamm als primärer Antikörper verwendet wird (z. B. Maus) bei der Doppelfärbung, sollte ein anderer Stamm (z. B. Ziege oder Kaninchen) für den sekundären Antikörper verwendet werden.
  8. Waschen Sie den Sekundärantikörper mit PBS 3x und tropfen Sie dann die DAPI-Lösung (1:1) in jede der Proben. Warten Sie 15-20 Minuten. Führen Sie eine Immunfluoreszenzbildgebung durch.

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Ergebnisse

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Graphen-Toxizität und 2D-Bildgebung
Die statistische Analyse der erhaltenen MTT-Ergebnisse wurde mit einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Tukey-Test in einer statistischen Analysesoftware durchgeführt, und die erhaltene Grafik ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Graphenanteil im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte nur für die Graphenkonzentration von 0,001 % (**p < 0,01) eine signifikante Abnahme. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den anderen Gru...

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Diskussion

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Die Vorteile von Behandlungen, die mit technischen 3D-Gerüsten gegenüber herkömmlichen 2D-Methoden angewendet werden, werden von Tag zu Tag deutlicher. Stammzellen, die allein in diesen Therapien oder zusammen mit Gerüsten aus verschiedenen Biomaterialien mit geringer Biokompatibilität und biologischer Abbaubarkeit hergestellt werden, sind in der Regel unzureichend für die periphere Nervenregeneration. Die mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees (WJ-MSCs) scheinen eine geeignete Kandidatenzelllinie zu sein, insbeson...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht. Das Projekt wurde in Zusammenarbeit mit HD Bioink, dem Entwickler der 3D-Bioprinting-Technologie, durchgeführt.

Danksagungen

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Das in dieser Studie verwendete Graphen wurde an der Kirklareli University, Fakultät für Maschinenbau, entwickelt. Es wurde von Dr. Karabeyoğlu gespendet. Finanziert wurde der Graphen-Toxizitätstest durch das Projekt "Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks" (Antrags-Nr.: 1139B411802273), das im Rahmen des TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program durchgeführt wurde. Der andere Teil der Studie wurde durch den Forschungsfonds der Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713) unterstützt. Mesenchymale Stammzellen mit GFP, die in der Zeitraffer-Bildgebung verwendet wurden, wurden von Virostem Biotechnology gespendet. Die Autoren danken dem Darıcı LAB und dem YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB Team für die produktiven Diskussionen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare

Zentrifugal		HitachiWird in Zellkulturen und Biomaterialien Schritt
0,1N CaCl2HD Bioinkverwendet für Vernetzer
0,22 &; Mikro; m MembranfilterAι sι moWird für die Sterilisation
0,45 & Mikro verwendet; m SpritzenvorsatzfilterAι sι moWird für die Sterilisation
verwendet 1,5 ml konisches RöhrchenEppendorfaWird für Biotintentropfen
verwendet 15 ml Falcon RöhrchenNestWird in Zellkulturschritten
verwendet 25 cm2 Zellkulturflaschen (Falcon, TPP GewebekulturkolbenNestWird für Zellkulturen
verwendet 3D BioprintingAxolotl Biosystems Bio A2 (Türkei)Bioprinting Schritt
50 mL Falcon TubeNestWird in Zellkultur-Step-6
/24/48/96-Well-Platten verwendet (Falcon, TPP-Mikrotiterplatten)Merck MilliporeWird in Zellkultur-Steps
75 cm2 Zellkulturflaschen verwendet (Falcon, TPP-GewebekulturflaschenNestWird für Zellkulturen
verwendet Anti-Maus-IgG-FTIC-KaninchenSanta Cruz BiotechnologyJ1514Seconder-Antikörper, wird für Farbstoffe verwendet
Anti-Maus IgG-SC2781-ZiegeSanta Cruz BiotechnologieC3109Seconder-Antikörper, verwendet für
Farbstoff-Au-Beschichtungsgerät EM ACE600Leicafür die Vergoldung von Biomaterialschnitt vor der REM-Bildgebung
AutoklavNUVE-OT 90LWird für den Sterilisationsprozess verwendet.
AutoklavNUVE-OT 90LWird für den Sterilisationsprozess verwendet.
Cell Cultre CabineHera Safe KSWird für den Zellkulturprozess
verwendet Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12SigmaRNBJ7249Wird als Zellkulturmedium
verwendet FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEMQuanta FEG450für SEM
Fetal Bovine Serum-FBSCapricornFBS-16AEs wurde durch Zugabe zum Zellkulturmedium verwendet.
Gefrierschrank -80°; CPanasonicMDF-U5386S-PEWir wurden zur Lagerung von Zellen und den daraus resultierenden Exosomen verwendet
Gelatine-Alginat-BiotintenpulverHD BioinkWird für die Herstellung von Biotinte verwendet
Schritt GFP markiert-WJ-MSCsVirostemWird für die Bildgebung der Zell-Biotinte-Wechselwirkung verwendet
Graphen-Nanoplättchen (Graphen-IGP2)Grafen Chemical Industries Co.Wird für die Herstellung von 3D-G-Biotinte
Immunfluoreszenz-Antikörper (N-CAD; β-III Tubulin)Zellsignalisierung und Santa CruzWird für den Farbstoff
JASCO 6600Tetrafür FTIR
MTT Assayverwendet SigmaViabilitätstests
Penicilin/Streptomycin LösungCapricornPB-SEs wurde dem Medium zugesetzt, um eine Kontamination zu verhindern in Zellkultur.
Thoma ObjektträgerIsolabWird zur Zählung der Zelle
verwendet Zeitraffer-BildgebungssystemZeiss Axio.Observer.Z1Bildgebung
Tripsin-EDTAMulticellDer Kolben wurde verwendet, um die Zellen zu entfernen, die die Oberfläche bedecken.
VorteksBiobaseFür die Herstellung von Biotinte
Schritt WJ-MSCsATCCWird für den Zellkulturprozess verwendet
verwendet

Referenzen

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