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Biochemistry

Um fluxo de trabalho integrado de identificação e quantificação no metabolome não-alvo baseado em controle FDR

Published: September 20, 2022 doi: 10.3791/63625
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,2
1Key Laboratory of Functional Protein Research of Guangdong Higher Education Institutes and MOE Key Laboratory of Tumor Molecular Biology, Institute of Life and Health Engineering, College of Life Science and Technology, Jinan University, 2Chi-Biotech Co. Ltd.
* These authors contributed equally

Summary

Construímos um fluxo de trabalho metabolômico não-acompanhado que integrou XY-Meta e metaX juntos. Neste protocolo, exibimos como usar o XY-Meta para gerar uma biblioteca espectral chamariz a partir da referência de espectro de acesso aberto e, em seguida, executamos o controle FDR e usamos o metaX para quantificar os metabólitos depois de identificar o espectro metabolômico.

Abstract

Técnicas de metabolômica não-alvo estão sendo amplamente utilizadas nos últimos anos. No entanto, o rápido aumento do rendimento e o número de amostras criam uma enorme quantidade de espectros, estabelecendo desafios para o controle de qualidade do espectrometria de massa. Para reduzir os falsos positivos, é necessário um controle de qualidade da taxa de descoberta falsa (FDR). Recentemente, desenvolvemos um software para controle FDR de identificação metabolome não direcionada que é baseado em uma estratégia de isca alvo chamada XY-Meta. Aqui, demonstramos um pipeline de análise completo que integra XY-Meta e metaX juntos. Este protocolo mostra como usar o XY-meta para gerar um banco de dados de isca a partir de um banco de dados de referência existente e executar o controle FDR usando a estratégia Target-Decoy para identificação metabolome em larga escala em um conjunto de dados de acesso aberto. A análise diferencial e a anotação dos metabólitos foram realizadas após a execução do metaX para picos metabólitos de detecção e quantitação. Para ajudar mais pesquisadores, também desenvolvemos uma plataforma de análise baseada em nuvem para essas análises, sem a necessidade de habilidades bioinformáticas ou qualquer linguagem de computador.

Introduction

Os metabólitos desempenham papéis importantes nos processos biológicos. Metabólitos são frequentemente reguladores de vários processos como transferência de energia, regulamentos hormonais, regulação de neurotransmissores, comunicações celulares e modificações pós-translacionais de proteínas, etc 1,2,3,4. Metabolômica não-alvo fornece uma visão global de numerosos metabólitos 5,6. Com os avanços nas tecnologias de espectrometria de massa e cromatografia, o rendimento dos espectros metabolome MS/MS está aumentando rapidamente nos últimos anos 7,8,9,10,11. Para identificar metabólitos desses enormes conjuntos de dados, vários softwares de anotação foram desenvolvidos11, como MZmine12, MS-FINDER13, CFM-ID14, MetFrag15 e SLAW16. No entanto, essas identificações muitas vezes contêm muitos falsos positivos. As razões incluem: (1) Os espectros MS/MS contêm ruído aleatório, o que pode enganar a correspondência de pico. (2) Isômeros e diferenças nas energias de fragmentação causam múltiplas impressões digitais de espectro e, assim, aumentam o volume da biblioteca de referência. (3) A qualidade das bibliotecas de referência varia. É necessário um padrão adequado para construir uma boa biblioteca espectral de referência. Portanto, um controle sistemático de falsas taxas de descoberta (FDR) para metabolômica não-alvo é essencial para a pesquisa de metabolome funcional 7,8,9,17.

Tanto a abordagem empírica de Bayes quanto a estratégia target-decoy resolveram o problema de controle FDR em geral. Kerstin Scheubert et al. mostraram que a estratégia target-decoy no banco de dados de isca gerada a partir do método baseado em árvores de fragmentação é o melhor método para o controle FDR9. Xusheng Wang et al. projetaram um método para a geração de isca com base na regra do octeto em química e melhoraram a precisão da estimativa de FDR17. A biblioteca espectral para geração de banco de dados de isca foi demonstrada para melhor desempenho18. Aqui, melhoramos o método baseado em biblioteca espectral e desenvolvemos um software chamado XY-Meta19 que pode melhorar ainda mais a precisão da estimativa do FDR. Ele usa a biblioteca espectral de referência existente para gerar uma biblioteca de isca para o controle FDR sob o esquema Target-Decoy. XY-Meta suporta seus próprios algoritmos de correspondência de espectros e similaridade cossino. Permite modos convencionais de pesquisa e pesquisa iterativa. Na etapa de avaliação do FDR, ele suporta o modo concateado Target-Decoy e o modo separado. Para uma melhor flexibilidade, o XY-Meta aceita bibliotecas de isca externas.

A detecção e quantificação de picos de metabólitos também é um passo importante da análise metabolome não alvo. A detecção de picos é o principal método de identificação metabolome. Em geral, a precisão da detecção de pico de metabólitos foi afetada por múltiplos fatores, como sinais sonoros de espectrometria de massa, baixa abundância de metabólitos, contaminantes e produtos de degradação de metabólitos20. Quando o número de amostras é muito grande ou a coluna de cromatografia líquida foi substituída em experimentos de metabolome não-alvo, podem aparecer efeitos notáveis em lote, o que é um grande desafio para a quantitação metabolome 21,22,23. Atualmente, softwares como XCMS24, Workflow4Metabolomic25, iMet-Q26 e metaX19 podem realizar detecção de pico e quantitação de metabolome não-alvo, mas sugerimos que o pipeline de metaX é mais completo e fácil de usar. Aqui, demonstramos o processo de identificação e controle de FDR para um conjunto de dados disponível publicamente msv000084112 usando XY-Meta, e o pico de detecção e quantificação de metabólitos usando metaX. Este fluxo de trabalho requer apenas dois grupos, e cada grupo precisa de pelo menos duas amostras. Os dados de espectro de MS/MS são necessários, independentemente da plataforma de espectrômetro de massa, modo de ionização, modo de carga e tipo de amostra, e podem suportar a normalização baseada em amostras e a normalização baseada em picos. Seguindo este exemplo, os pesquisadores podem realizar a identificação e quantificação metabolômica de forma fácil de lidar. O uso deste pipeline requer capacidade de programação R. Para ajudar o pesquisador sem qualquer conhecimento de programação, também desenvolvemos uma plataforma de análise em nuvem para análise metabolômica. Demonstramos essa plataforma de análise de nuvem em Material Suplementar 5.

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Protocol

1. Prepare os conjuntos de dados metabolômicos para análise

NOTA: Nesta demonstração, usamos conjuntos de dados metabolômicos sem amostra de QC. São necessários dados para grupos de casos e controle. Para demonstração, usamos um conjunto de dados público no banco de dados GNPS27.

  1. Vá para a página https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp. Clique em Procurar Conjuntos de dados.
  2. Pesquise a palavra-chave "msv000084112" na coluna Título . Clique no número de identificação do conjunto de dados para obter detalhes e baixe o conjunto de dados usando FTP.
  3. Coloque os dados brutos na pasta /msv000084112.
    NOTA: Este conjunto de dados foi adquirido usando C18 RP-UHPLC na plataforma Q Exactive no modo positivo. Representa uma coorte com uma doença não caracterizada do metabolismo de dados de amostras de urina, incluindo 33 amostras de pessoas saudáveis, 12 amostras em branco, duas amostras de mistura e 82 amostras de pacientes28 (Material Suplementar 8). Para demonstrar o fluxo de trabalho, escolhemos aleatoriamente seis amostras de pessoas saudáveis (NH) como grupo controle e seis amostras com a doença (NT) como um grupo de casos para realizar o fluxo de trabalho.

2. Conversão de formato de dados

NOTA: Se o conjunto de dados é o dados bruto gerados diretamente do espectrômetro de massa, geralmente está no formato .raw, .wiff ou .cdf. Eles devem ser convertidos em formatos mzXML e mgf. Aqui, usamos a ferramenta msconvert no pacote ProteoWizard29 para fazer a conversão de formato.

  1. Baixe o ProteoWizard de https://proteowizard.sourceforge.io/download.html e instale-o.
  2. Converta o formato de dados usando msconvert.exe sob o caminho de instalação ProteoWizard.
    1. Converta os dados brutos em formato mzXML e armazene-os em /mzXML folder:/msconvert.exe /raw/*.raw -o /raw/mzXML/ --filter "peakPicking true [1,2]" -filtro "zeroSamples removeExtra " -mzML --zlib --mz64 --filtro "msLevel 1-2" --filtro "titleMaker ... ".
    2. Converta os dados bruto/mzXML em formato mgf e armazene-os em /mgf folder:/msconvert.exe /msv000084112/*.raw -o /msv000084112/mgf/ --filter "peakPicking true [1,2 ]" -Filtro "zeroSamples removeExtra" --mgf --mz64 --filtro "msLevel 1-2" --filtro "titleMaker ... ".

3. Prepare a biblioteca espectral de referência para os metabólitos

NOTA: XY-meta suporta as bibliotecas espectrais de referência apenas no formato mgf.

  1. Vá para a página https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/libraries.jsp. Pesquise a palavra-chave "NIST" para encontrar o item. Clique em Exibir para obter os detalhes e baixe a biblioteca.
    NOTA: As Bibliotecas Espectrais Públicas do GNPS coletaram muitas bibliotecas metabólicas, dispostas em modos de tipo, origem, espécies e coleta. Embora apenas uma pequena fração dessas bibliotecas sejam geradas usando materiais padrão, elas geralmente são suficientes para a pesquisa mais fundamental.
  2. Coloque a biblioteca baixada GNPS-NIST14-MATCHES.mgf na pasta /banco de dados.

4. Identificação de metabólitos e controle de FDR

  1. Baixe o XY-meta (versão do Windows). Encontre o parâmetro de configuração do parâmetro de configuração.padrão na pasta /XY-Meta-Win/config/. Alterar seu conteúdo de acordo com Material Suplementar 1.
    NOTA: Na solução, metabólitos frequentemente formam adutos com ânions ou ânations, o que leva a uma mudança em massa de íons-mãe. Portanto, é necessário definir os tipos de adutos. Fornecemos listas de adutos para coluna de troca de íons e colunas analíticas reversas em modo de carga positiva e modo de carga negativa na pasta /aduct. Os usuários também podem editar sua própria lista de adutos de acordo com seu projeto de pesquisa. A lista de adutos deve estar no mesmo formato da lista fornecida.
  2. Realize a identificação metabólica e o controle FDR usando XY-Meta:XY-Meta.exe -S /XY-Meta-Win/config/parameter.default -D /msv000084112/ pos_wt-1_a.mgf -R /banco de dados/GNPS-NIST14-MATCHES.mgf.
    NOTA: XY-Meta não suporta curingas em parâmetros. Portanto, um único comando deve ser usado para processar cada arquivo mgf. Para um grande número de arquivos, um arquivo em lote é recomendado.

5. Análise diferencial

NOTA: metaX é um pacote R de código aberto. Por favor, instale-o de acordo com o guia em https://github.com/wenbostar/metaX. 8GB de RAM é necessário para esta análise.

  1. Editar um arquivo sampleList.txt para especificar a amostra e seus dados de MS correspondentes. Consulte o Material Complementar 2.
    NOTA: metaX suporta análise quantitativa para os conjuntos de dados com amostras de QC. Ao usar amostras de QC, por favor, modifique a propriedade da classe para na para amostras de QC.
  2. Criar/pasta de saída para armazenar os resultados da análise quantitativa. Use R para executar o script em Material Suplementar 3 para usar metaX para quantificar os grupos MOCK e WT.
    NOTA: Antes de executar o script em Material Suplementar 3, modifique os caminhos no script para os caminhos locais reais.

6. Integração dos resultados qualitativos e quantitativos

  1. Execute o script R em Material Suplementar 4 para anotar os picos em análise qualitativa e quantitativa utilizando identificações metabólicas.
    NOTA: Antes de executar o script em Material Suplementar 4, por favor, modifique os caminhos no script para seus caminhos locais reais.

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Representative Results

Os dados brutos de msv000084112 foram convertidos por msconvert.exe e arquivos MGF (Material Suplementar S6).

XY-Meta gerou arquivo GNPS-NIST14-MATCHES_Decoy.mgf em /pasta de banco de dados. Esta é a biblioteca de isca gerada a partir da biblioteca espectral de referência original GNPS-NIST14-MATCHES.mgf. Esta biblioteca de isca pode ser reutilizada. Ao reutilizar esta biblioteca de isca, o usuário deve definir o decoy_pattern como 1 em arquivo parameter.default e definir o chamariz como o caminho absoluto da biblioteca de isca. Os resultados de identificação foram gerados sob a pasta /mgf (com o sufixo .meta), que inclui escores de correspondência de espectros, FDR, m/z dos metabólitos, tempo de retenção e o nome dos metabólitos (Material Suplementar 7).

A análise quantitativa por metaX foi em /pasta de saída. A distribuição quantitativa geral de NH e NT são semelhantes, com baixa flutuação dos valores médios (Figura 1A). Havia apenas uma pequena fração dos valores faltantes: apenas 3,39% dos metabólitos têm mais de 30% dos valores faltantes (Figura 1B). metaX aumentou notavelmente a proporção dos metabólitos com CV ≤ 0,3 (Figura 1C). Os lotes da caixa foram armazenados em /metaX_box pasta. Os perfis de elução foram armazenados em /metaX_eic pasta. Os picos metabólitos foram registrados em metaX-feature.txt. Os valores quantitativos dos metabólitos identificados em ambos os grupos e os resultados da análise diferencial foram armazenados em metaX_peaks.txt (Figura 1D). Aplicando o limiar de | LogFC| ≥ 1 e valor p < 0,05, foram detectados 342 metabólitos, com 206 para cima regulados e 136 para baixo (Material Suplementar 9).

Anotamos os picos detectados pelo metaX usando as identificações FDR < 0,01. Se um pico pode ser anotado por vários metabólitos, pegamos aquele com a maior pontuação de correspondência de espectro como a anotação final. Utilizando esses critérios, anotamos seis picos diferenciais metabólicos (Figura 2).

Figure 1
Figura 1. Análise quantitativa por metaX. (A) Gráfico de caixa de metabólitos quantificados de todas as amostras. (B) Histograma da distribuição de valor ausente. (C) gráfico pca de duas amostras de grupo. (D) Diagrama venn de metabólitos detectados diferencialmente a partir de três métodos estatísticos de teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Tempo de retenção (RT) e m/z de todos os metabólitos anotados. Os pontos vermelhos representam os metabólitos significativos e diferenciados detectados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Material Suplementar 1: O arquivo parâmetro de XY-Meta. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Material Suplementar 2: Agrupando folha de informações de amostras para metaX. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Material Suplementar 3: O script para integrar o fluxo de trabalho de XY-Meta e metaX. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Material suplementar 4: O script para anotar os picos usando identificações metabolome. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Material Suplementar 5: Um fluxo de trabalho completo para análise metabolome usando a plataforma de nuvem. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Material Suplementar 6: Um arquivo mgf convertido de msconvert para uma amostra de dados de msv000084112. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Material Suplementar 7: Uma tabela de resultado de identificação de XY-Meta para dados amostrais de msv000084112. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Material Suplementar 8: A ficha de informações clínicas de coorte de msv000084112. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Material Suplementar 9: Lista de identificação de todos os metabólitos e resultados de análise diferencial de todos os picos metabólitos. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

O controle fdr de metabólitos não-alvo tem sido um grande desafio. Aqui, demonstramos um pipeline completo de análise metabolômica não-alvo em larga escala (qualitativa e quantitativa) com controle FDR. Isso reduz efetivamente os falsos positivos, que são muito comuns na análise de ESM.

Preparar uma biblioteca espectral de referência apropriada para o seu estudo é um ponto-chave. Uma identificação de MS/MS bem-sucedida e sensível requer não apenas algoritmos adequados de correspondência, mas também bibliotecas espectrais de referência adequadas. A aplicabilidade das bibliotecas espectrais públicas são limitadas devido às seguintes razões: (1) muitas bibliotecas espectrais públicas não incluem listas metabólitos completas. (2) Os espectros nas bibliotecas espectrais públicas originaram-se de diversos instrumentos de ESM e/ou várias condições de fragmentação30,31. Portanto, sugerimos que você colete espectros no mesmo instrumento e as mesmas condições de fragmentação usando metabólitos padrão para construir uma biblioteca espectral "exclusiva". Além disso, essas condições devem ser mantidas durante as medições reais. Além disso, ao modificar o arquivo de parâmetros, a tolerância dos íons precursores e dos íons fragmentários deve coincidir com os parâmetros do instrumento. Normalmente, a faixa de tolerância precursora deve ser entre 10 ppm e 20 ppm, e a tolerância ao fragmento deve ser definida entre 0,01 Da e 0,5 Da. Para este conjunto de dados, os parâmetros do instrumento são desconhecidos, mas a tolerância de fragmento de 0,05 Da é uma escolha conservadora para que este fluxo de trabalho funcione normalmente.

Os usuários ainda podem receber várias mensagens de erro quando executam este pipeline. Erros comuns incluem caminho de arquivo de entrada errônea, arquivo de parâmetro ausente e conflito de acesso a arquivos (por exemplo, acesso negado pelo sistema operacional e acesso simultâneo do mesmo arquivo).

Para notar, este fluxo de trabalho é atualmente aplicável apenas à análise metabolômica direcionada e não direcionada de pequenas moléculas com menos de 1.000 Da, e não pode ser usado para analisar os metabolomas de macromoléculas, como cadeias glican ou cadeias lipídicas. Além disso, tanto os dados de aquisição independente de dados (DIA) quanto os dados de mobilidade de íons não são adequados para análise com este fluxo de trabalho. Este fluxo de trabalho não suporta o uso de m/z e o tempo de retenção de metabólitos para anotar resultados de detecção de pico e apenas suporta análise diferencial de dois grupos de dados com mais de duas amostras.

Por muito tempo, os resultados de identificação de metabolome não-alvo dominado pela tecnologia de detecção de pico tendem a conter muitos falsos positivos, principalmente devido ao grande número de isômeros metabólitos e diferentes formas de aduto iônico. Comparar os espectros ms/ms de metabólitos com os espectros de referência de metabólitos conhecidos pode resolver a estrutura dos metabólitos para distinguir os isômeros32. No entanto, um metabólito não pode ser identificado se o espectro de referência de um metabólito não estiver disponível publicamente ou comercialmente7. Portanto, construir uma biblioteca confiável de espectros de referência metabólica é um grande desafio. Espectros de referência de baixa qualidade e com estrutura semelhante levam à correspondência aleatória de espectros experimentais. Portanto, o controle fdr dos resultados de identificação é necessário para garantir identificações confiantes. Os usuários podem usar este pipeline para identificar automaticamente metabolo com controle FDR, bem como quantitação e análise diferencial, fornecendo os dados de entrada necessários conforme o protocolo necessário. Isso é conveniente e econômico para muitos pesquisadores, especialmente para iniciantes.

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Disclosures

Sem conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho é apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Chaves (2018YFC0910200/2017YFA0505001) e pelo Programa de P&D De Chaves de Guangdong (2019B0226001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GNPS open source n/a https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp
XY-Meta open source n/a https://github.com/DLI-ShenZhen/XY-Meta
metaX open source n/a https://github.com/wenbostar/metaX
ProteoWizard Free Download 3.0.22116.18c918b-x86_64 https://proteowizard.sourceforge.io/download.html
CHI.Client Free Download ndp48-x86-x64-allos-enu http://www.chi-biotech.com/technology.html?ty=ypt

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References

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Bioquímica Edição 187
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Li, D., Liang, J., Zhang, Y., Zhang, G. An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome. J. Vis. Exp. (187), e63625, doi:10.3791/63625 (2022).

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