Summary
Vi konstruerade ett oriktat metabolomiskt arbetsflöde som integrerade XY-Meta och metaX tillsammans. I detta protokoll visade vi hur man använder XY-Meta för att generera ett lockbete spektralbibliotek från open access-spektrareferens och utförde sedan FDR-kontroll och använde metaX för att kvantifiera metaboliterna efter att ha identifierat metabolomicspektra.
Abstract
Oriktade metabolomiktekniker används i stor utsträckning de senaste åren. Den snabbt ökande genomströmningen och antalet prover skapar dock en enorm mängd spektra, vilket ställer utmaningar för kvalitetskontroll av masspektrometrispektra. För att minska de falska positiva resultaten krävs kvalitetskontroll av falsk identifieringsfrekvens (FDR). Nyligen utvecklade vi en programvara för FDR-kontroll av oriktad metabolomidentifiering som är baserad på en Target-Decoy-strategi som heter XY-Meta. Här demonstrerade vi en komplett analyspipeline som integrerar XY-Meta och metaX tillsammans. Detta protokoll visar hur man använder XY-meta för att generera en lockbete-databas från en befintlig referensdatabas och utföra FDR-kontroll med hjälp av Target-Decoy-strategin för storskalig metabolomidentifiering på en open access-datauppsättning. Differentialanalysen och metabolitennoteringen utfördes efter körning av metaX för metaboliter toppar detektion och kvantifiering. För att hjälpa fler forskare utvecklade vi också en användarvänlig molnbaserad analysplattform för dessa analyser, utan behov av bioinformatikkunskaper eller några datorspråk.
Introduction
Metaboliter spelar viktiga roller i biologiska processer. Metaboliter är ofta regulatorer för olika processer som energiöverföring, hormonregler, reglering av neurotransmittorer, cellulär kommunikation och protein post-translationella modifieringar, etc 1,2,3,4. Oriktad metabolomik ger en global bild av många metaboliter 5,6. Med framsteg inom masspektrometri och kromatografiteknik ökar genomströmningen av metabolom MS / MS-spektra snabbt de senaste åren 7,8,9,10,11. För att identifiera metaboliter från dessa enorma datamängder utvecklades olika anteckningsprogram11, såsom MZmine12, MS-FINDER13, CFM-ID14, MetFrag15 och SLAW16. Dessa identifieringar innehåller dock ofta många falska positiva resultat. Anledningarna inkluderar: (1) MS / MS-spektra innehåller slumpmässigt brus, vilket kan vilseleda toppmatchningen. (2) Isomerer och skillnader i fragmenteringsenergier orsakar flera spektrafingeravtryck och ökar därmed referensbibliotekets volym. (3) Kvaliteten på referensbiblioteken varierar. En ordentlig standard för att bygga ett bra referensspektralbibliotek behövs. Därför är en systematisk falsk upptäcktshastighet (FDR) -kontroll för oriktad metabolomik avgörande för funktionell metabolomforskning 7,8,9,17.
Både den empiriska Bayes-metoden och Target-Decoy-strategin tog itu med FDR-kontrollproblemet i allmänhet. visade att Target-Decoy-strategin på lockbetedatabasen genererad från fragmenteringsträdbaserad metod är den bästa metoden för FDR-kontroll9. konstruerade en metod för lockgenerering baserad på oktettregeln i kemi och förbättrade precisionen i FDR-uppskattning17. Spektralbiblioteket för att generera lockbetesdatabas demonstrerades för bättre prestanda18. Här förbättrade vi den spektrala biblioteksbaserade metoden och utvecklade en programvara som heter XY-Meta19 som ytterligare kan förbättra FDR-uppskattningens precision. Den använder det befintliga referensspektralbiblioteket för att generera ett lockbibliotek för FDR-kontrollen under Target-Decoy-schemat. XY-Meta stöder sina egna spektramatchnings- och cosinuslikhetsalgoritmer. Det tillåter konventionell sökning och iterativa söklägen. I steget för FDR-utvärdering stöder den Target-Decoy-sammanfogat läge och separerat läge. För bättre flexibilitet accepterar XY-Meta externa lockbibliotek.
Toppdetektion och kvantifiering av metaboliter är också ett viktigt steg i oriktad metabolomanalys. Toppdetektering är den huvudsakliga metoden för metabolomidentifiering. I allmänhet påverkades noggrannheten för toppdetektering av metaboliter av flera faktorer, såsom brussignaler från masspektrometri, låg förekomst av metaboliter, föroreningar och nedbrytningsprodukter av metaboliter20. När antalet prover av är för stort eller vätskekromatografikolonnen ersattes i experiment med oriktat metabolom kan anmärkningsvärda batcheffekter uppstå, vilket är en stor utmaning för metabolomkvantifiering 21,22,23. För närvarande kan programvara som XCMS24, Workflow4Metabolomic25, iMet-Q26 och metaX19 utföra toppdetektering och kvantifiering av oriktad metabolom, men vi föreslår att pipelinen för metaX är mer komplett och lättare att använda. Här demonstrerar vi processen för identifiering och FDR-kontroll för en offentligt tillgänglig datauppsättning msv000084112 med XY-Meta, och toppdetektering och kvantifiering av metaboliter med metaX. Det här arbetsflödet kräver bara två grupper och varje grupp behöver minst två exempel. MS / MS-spektradata behövs, oavsett masspektrometerplattform, joniseringsläge, laddningsläge och provtyp, och kan stödja provbaserad normalisering och toppbaserad normalisering. Efter detta exempel kan forskare utföra metabolomikidentifiering och kvantifiering på ett lätthanterligt sätt. Att använda den här pipelinen kräver R-programmeringskapacitet. För att hjälpa forskaren utan programmeringskunskap utvecklade vi också en molnanalysplattform för metabolomikanalys. Vi demonstrerade denna molnanalysplattform i kompletterande material 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered metabolomikdatauppsättningar för analys
I den här demonstrationen använder vi metabolomikdatauppsättningar utan QC-exempel. Data för ärende- och kontrollgrupper behövs. För demonstration använder vi en offentlig datauppsättning i GNPS-databas27.
- Gå till webbsidan https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp. Klicka på Bläddra bland datauppsättningar.
- Sök på nyckelordet "msv000084112" i kolumnen Titel . Klicka på datauppsättningens ID-nummer för mer information och ladda ned datauppsättningen med FTP.
- Lägg rådata i mappen /msv000084112.
Den här datauppsättningen har hämtats med C18 RP-UHPLC på Q Exactive-plattformen i positivt läge. Det representerar en kohort med en okarakteriserad sjukdom i metabolismen av urinprovdata, inklusive 33 prover av friska människor, 12 tomma prover, två blandningsprover och 82 prover av patienter28 (kompletterande material 8). För att demonstrera arbetsflödet valde vi slumpmässigt sex prover av friska personer (NH) som kontrollgrupp och sex prover med sjukdomen (NT) som fallgrupp för att utföra arbetsflödet.
2. Konvertering av dataformat
Om datauppsättningen är rådata som genereras direkt från masspektrometern är den vanligtvis i .raw-, .wiff- eller .cdf-format. De bör konverteras till mzXML- och mgf-format. Här använder vi msconvert-verktyget i ProteoWizard29-paketet för att göra formatkonvertering.
- Ladda ner ProteoWizard från https://proteowizard.sourceforge.io/download.html och installera den.
- Konvertera dataformat med msconvert.exe under installationsvägen ProteoWizard.
- Konvertera rådata till mzXML-format och lagra dem i mappen /mzXML:/msconvert.exe /raw/*.raw -o /raw/mzXML/ --filter "peakPicking true [1,2]" --filter "zeroSamples removeExtra" --mzML --zlib --mz64 --filter "msLevel 1-2" --filter "titleMaker
. . . ". - Konvertera raw/mzXML-data till mgf-format och lagra dem i mappen /mgf:/msconvert.exe /msv000084112/*.raw -o /msv000084112/mgf/ --filter "peakPicking true [1,2]" --filter "zeroSamples removeExtra" --mgf --mz64 --filter "msLevel 1-2" --filter "titleMaker
. . . ".
- Konvertera rådata till mzXML-format och lagra dem i mappen /mzXML:/msconvert.exe /raw/*.raw -o /raw/mzXML/ --filter "peakPicking true [1,2]" --filter "zeroSamples removeExtra" --mzML --zlib --mz64 --filter "msLevel 1-2" --filter "titleMaker
3. Förbered referensspektralbiblioteket för metaboliterna
OBS: XY-meta stöder referensspektralbiblioteken endast i mgf-format.
- Gå till webbsidan https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/libraries.jsp. Sök på nyckelordet "NIST" för att hitta objektet. Klicka på Visa för mer information och ladda ned biblioteket.
OBS: GNPS Public Spectral Libraries samlade in många metaboliter bibliotek, ordnade i typ, ursprung, art och samlingslägen. Även om endast en liten del av dessa bibliotek genereras med hjälp av standardmaterial, är de vanligtvis tillräckliga för de flesta grundläggande forskning. - Placera det nedladdade biblioteket GNPS-NIST14-MATCHES.mgf i mappen /database.
4. Identifiering av metaboliter och FDR-kontroll
- Ladda ner XY-meta (Windows-version). Hitta parameterkonfigurationsfilen parameter.default under mappen /XY-Meta-Win/config/. Ändra dess innehåll enligt kompletterande material 1.
OBS: I lösning bildar metaboliter ofta addukter med anjoner eller katjoner, vilket leder till en massförskjutning av moderjoner. Därför är det nödvändigt att ställa in typerna av addukter. Vi tillhandahöll adduktlistor för jonbytarkolonn och omvända analytiska kolumner under positivt laddningsläge och negativt laddningsläge i mappen / adduct. Användare kan också redigera sin egen adduktlista enligt sitt forskningsprojekt. Adduktlistan ska vara i samma format som den angivna listan. - Utför metabolitidentifieringen och FDR-kontrollen med XY-Meta:XY-Meta.exe -S /XY-Meta-Win/config/parameter.default -D /msv000084112/ pos_wt-1_a.mgf -R /database/GNPS-NIST14-MATCHES.mgf.
XY-Meta stöder inte jokertecken i parametrar. Därför bör ett enda kommando användas för att bearbeta varje mgf-fil. För ett stort antal filer rekommenderas en batchfil.
5. Differentiell analys
OBS: metaX är ett R-paket med öppen källkod. Installera den enligt guiden på https://github.com/wenbostar/metaX. 8 GB RAM krävs för denna analys.
- Redigera en sampleList.txt-fil för att ange exemplet och dess motsvarande MS-data. Se kompletterande material 2.
OBS: metaX stöder kvantitativ analys för datamängderna med QC-prover. När du använder QC-exempel ändrar du klassegenskapen till NA för QC-exempel. - Skapa mappen /output för att lagra resultaten av kvantitativ analys. Använd R för att köra skriptet i tilläggsmaterial 3 för att använda metaX för att kvantifiera MOCK- och WT-grupperna.
Innan du kör skriptet i tilläggsmaterial 3 ändrar du sökvägarna i skriptet till de faktiska lokala sökvägarna.
6. Integrering av kvalitativa och kvantitativa resultat
- Kör R-skriptet i kompletterande material 4 för att kommentera topparna i kvalitativ och kvantitativ analys med hjälp av metabolitidentifieringar.
OBS: Innan du kör skriptet i tilläggsmaterial 4, ändra sökvägarna i skriptet till dina faktiska lokala sökvägar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rådata för msv000084112 konverterades av msconvert.exe och genererade mgf-filer (Supplementary Material S6).
XY-Meta-genererad GNPS-NIST14-MATCHES_Decoy.mgf-fil under / databasmapp. Detta är lockbetebiblioteket som genereras från det ursprungliga referensspektralbiblioteket GNPS-NIST14-MATCHES.mgf. Detta lockbibliotek kan återanvändas. När du återanvänder det här lockbetebiblioteket ska användaren ställa in decoy_pattern som 1 i parameter.default-filen och ange decoyinput som den absoluta sökvägen till lockbetebiblioteket. Identifieringsresultaten genererades under mappen /mgf (med suffixet .meta), vilket inkluderar spektramatchningspoäng, FDR, m/z av metaboliterna, retentionstid och namnet på metaboliterna (tilläggsmaterial 7).
Den kvantitativa analysen av metaX fanns i mappen /output. Den allmänna kvantitativa fördelningen av NH och NT är likartade, med låg fluktuation av medelvärdena (figur 1A). Det fanns bara en liten del av de saknade värdena: endast 3,39% av metaboliterna har mer än 30% av de saknade värdena (figur 1B). metaX ökade anmärkningsvärt andelen metaboliter med CV ≤ 0,3 (figur 1C). Rutdiagrammen lagrades i mappen /metaX_box. Elueringsprofilerna lagrades i mappen /metaX_eic. Metabolittopparna registrerades i metaX-funktionen.txt. De kvantitativa värdena för metaboliterna som identifierades i båda grupperna och differentialanalysresultaten lagrades i metaX_peaks.txt (figur 1D). Tillämpning av tröskelvärdet för | LogFC| ≥ 1 och p-värde < 0,05 detekterades 342 metaboliter differentiellt, med 206 uppreglerade och 136 nedreglerade (kompletterande material 9).
Vi kommenterade de metaX-detekterade topparna med hjälp av FDR < 0,01-identifieringar. Om en topp kan kommenteras av flera metaboliter tog vi den med den högsta spektrummatchningspoängen som den sista anteckningen. Med hjälp av dessa kriterier kommenterade vi sex differentiella metabolittoppar (figur 2).
Figur 1. Kvantitativ analys av metaX. A) Fältdiagram över kvantifierade metaboliter för alla prover. (B) Histogram över saknad värdefördelning. C) PCA-diagram över två gruppprover. D) Venndiagram över differentiellt detekterade metaboliter från tre statistiska testmetoder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Retentionstid (RT) och m/z-fördelning av alla kommenterade metaboliter. Röda prickar representerar de signifikanta och differentiellt detekterade metaboliterna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande material 1: Parameterfilen för XY-Meta. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande material 2: Gruppering av informationsblad med prover för metaX. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande material 3: Skriptet för att integrera arbetsflödet för XY-Meta och metaX. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande material 4: Skriptet för att kommentera topparna med hjälp av metabolomidentifieringar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande material 5: Ett komplett arbetsflöde för metabolomanalys med hjälp av molnplattformen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande material 6: En mgf-fil konverterad från msconvert för exempeldata på msv000084112. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande material 7: En identifieringsresultattabell från XY-Meta för exempeldata för msv000084112. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande material 8: Kohortens kliniska informationsblad för msv000084112. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande material 9: Identifieringslista över alla metaboliter och differentialanalysresultat för alla metabolittoppar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FDR-kontrollen av oriktade metaboliter har varit en stor utmaning. Här demonstrerade vi en komplett pipeline av storskalig oriktad metabolomikanalys (kvalitativ och kvantitativ) med FDR-kontroll. Detta minskar effektivt de falska positiva resultaten, som är mycket vanliga vid MS-analys.
Att förbereda ett lämpligt referensspektralbibliotek för din studie är en viktig punkt. En framgångsrik och känslig MS/MS-identifiering kräver inte bara korrekta matchningsalgoritmer utan också korrekta referensspektralbibliotek. Tillämpligheten av offentliga spektralbibliotek är begränsad på grund av följande skäl: (1) många offentliga spektralbibliotek innehåller inte fullständiga metabolitlistor. (2) Spektra i offentliga spektralbibliotek härstammar från olika MS-instrument och/eller olika fragmenteringsförhållanden30,31. Därför föreslår vi att du samlar spektra i samma instrument och samma fragmenteringsförhållanden med hjälp av standardmetaboliter för att konstruera ett "exklusivt" spektralbibliotek. Dessa förhållanden bör också bibehållas under de faktiska mätningarna. Dessutom, när man ändrar parameterfilen, bör toleransen för prekursorjonerna och fragmentjonerna sammanfalla med instrumentets parametrar. Normalt bör intervallet för prekursortolerans vara mellan 10 ppm och 20 ppm, och fragmenttoleransen bör ställas in mellan 0,01 Da och 0,5 Da. För denna datauppsättning är parametrarna för instrumentet okända, men fragmenttoleransen på 0,05 Da är ett konservativt val för att detta arbetsflöde ska fungera normalt.
Användare kan fortfarande få olika felmeddelanden när de kör den här pipelinen. Vanliga misstag inkluderar felaktig inmatningsfilsökväg, saknad parameterfil och filåtkomstkonflikt (t.ex. åtkomst nekad av operativsystemet och samtidig åtkomst till samma fil).
Att notera är detta arbetsflöde för närvarande endast tillämpligt på den riktade och oriktade metabolomiska analysen av små molekyler mindre än 1 000 Da och kan inte användas för att analysera metabolomerna hos makromolekyler såsom glykankedjor eller lipidkedjor. Dessutom är både DIA-data (dataoberoende) och jonmobilitetsdata inte lämpliga för analys med detta arbetsflöde. Det här arbetsflödet stöder inte användning av m/z och retentionstid för metaboliter för att kommentera toppdetekteringsresultat och stöder endast differentiell analys av två grupper av data med mer än två prover.
Under lång tid har identifieringsresultaten för oriktat metabolom som domineras av toppdetekteringsteknik tenderat att innehålla många falska positiva resultat, främst på grund av det stora antalet metabolitelisomerer och olika joniska adduktformer. Att jämföra MS/MS-spektra för metaboliter med referensspektra för kända metaboliter kan lösa metaboliternas struktur för att särskilja isomerer32. En metabolit kan dock inte identifieras om referensspektrumet för en metabolit inte är offentligt eller kommersiellt tillgängligt7. Därför är det en stor utmaning att bygga ett tillförlitligt bibliotek med metabolitreferensspektra. Referensspektra av låg kvalitet och med liknande struktur leder till slumpmässig matchning av experimentella spektra. Därför är FDR-kontroll av identifieringsresultat nödvändig för att säkerställa säkra identifieringar. Användare kan använda denna pipeline för att automatiskt identifiera metabolom med FDR-kontroll, såväl som kvantifiering och differentialanalys, genom att tillhandahålla nödvändiga indata som det protokoll som krävs. Det är bekvämt och ekonomiskt för många forskare, särskilt för nybörjare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Key Research and Development Program (2018YFC0910200/2017YFA0505001) och Guangdong Key R&D Program (2019B020226001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GNPS | open source | n/a | https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp |
| XY-Meta | open source | n/a | https://github.com/DLI-ShenZhen/XY-Meta |
| metaX | open source | n/a | https://github.com/wenbostar/metaX |
| ProteoWizard | Free Download | 3.0.22116.18c918b-x86_64 | https://proteowizard.sourceforge.io/download.html |
| CHI.Client | Free Download | ndp48-x86-x64-allos-enu | http://www.chi-biotech.com/technology.html?ty=ypt |
References
- Misra, B. B., Fahrmann, J. F., Grapov, D. Review of emerging metabolomic tools and resources: 2015-2016. Electrophoresis. 38 (18), 2257-2274 (2017).
- Idle, J. R., Gonzalez, F. J.
- Fiehn, O. Metabolomics — the link between genotypes and phenotypes. Functional Genomics. Town, C. , Springer. Netherlands. Dordrecht. 155-171 (2002).
- Functional Genomics. Town, C. , Springer. Netherlands. Dordrecht. (2002).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D.
- Vinayavekhin, N., Saghatelian, A.
- Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).
- Palmer, A., et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nature Methods. 14 (1), 57-60 (2017).
- Scheubert, K., et al. Significance estimation for large scale metabolomics annotations by spectral matching. Nature Communications. 8 (1), 1494 (2017).
- Schrimpe-Rutledge, A. C., Codreanu, S. G., Sherrod, S. D., McLean, J. A. Untargeted metabolomics strategies-challenges and emerging directions. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (12), 1897-1905 (2016).
- Blaženović, I., Kind, T., Ji, J., Fiehn, O. Software tools and approaches for compound identification of LC-MS/MS data in metabolomics. Metabolites. 8 (2), (2018).
- Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), Oxford, England. 634-636 (2006).
- Tsugawa, H., et al. Hydrogen rearrangement rules: computational MS/MS fragmentation and structure elucidation using MS-FINDER software. Analytical chemistry. 88 (16), 7946-7958 (2016).
- Wang, F., et al. CFM-ID 4.0: More accurate ESI-MS/MS spectral prediction and compound identification. Analytical Chemistry. 93 (34), 11692-11700 (2021).
- Ruttkies, C., Schymanski, E. L., Wolf, S., Hollender, J., Neumann, S. MetFrag relaunched: incorporating strategies beyond in silico fragmentation. Journal of Cheminformatics. 8, 3 (2016).
- Delabriere, A., Warmer, P., Brennsteiner, V., Zamboni, N. SLAW: A scalable and self-optimizing processing workflow for untargeted LC-MS. Analytical chemistry. 93 (45), 15024-15032 (2021).
- Wang, X., et al. Target-decoy-based false discovery rate estimation for large-scale metabolite identification. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2328-2334 (2018).
- Li, D., et al. XY-Meta: a high-efficiency search engine for large-scale metabolome annotation with accurate FDR estimation. Analytical Chemistry. 92 (8), 5701-5707 (2020).
- Wen, B., Mei, Z., Zeng, C., Liu, S. metaX: a flexible and comprehensive software for processing metabolomics data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 183 (2017).
- Aberg, K. M., Torgrip, R. J. O., Kolmert, J., Schuppe-Koistinen, I., Lindberg, J. Feature detection and alignment of hyphenated chromatographic-mass spectrometric data. Extraction of pure ion chromatograms using Kalman tracking. Journal of Chromatography. A. 1192 (1), 139-146 (2008).
- Liu, Q., et al. Addressing the batch effect issue for LC/MS metabolomics data in data preprocessing. Scientific Reports. 10 (1), 13856 (2020).
- Han, W., Li, L. Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics. Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).
- Fei, F., Bowdish, D. M. E., McCarry, B. E. Comprehensive and simultaneous coverage of lipid and polar metabolites for endogenous cellular metabolomics using HILIC-TOF-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (15), 3723-3733 (2014).
- Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- Giacomoni, F., et al. Workflow4Metabolomics: a collaborative research infrastructure for computational metabolomics. Bioinformatics. 31 (9), Oxford, England. 1493-1495 (2015).
- Chang, H. -Y., et al. iMet-Q: A user-friendly tool for label-free metabolomics quantitation using dynamic peak-width determination. PloS One. 11 (1), 0146112 (2016).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Schmid, R., et al. Ion identity molecular networking for mass spectrometry-based metabolomics in the GNPS environment. Nature Communications. 12 (1), 3832 (2021).
- Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), Oxford, England. 2534-2536 (2008).
- Johnson, S. R., Lange, B. M. Open-access metabolomics databases for natural product research: present capabilities and future potential. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 22 (2015).
- Horai, H., et al. MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences. Journal of Mass Spectrometry: JMS. 45 (7), 703-714 (2010).
- Rawlinson, C., et al. Hierarchical clustering of MS/MS spectra from the firefly metabolome identifies new lucibufagin compounds. Scientific Reports. 10 (1), 6043 (2020).
