Summary
Diese Arbeit liefert ein systematisch optimiertes Verfahren zur CRISPR/Cas9-Ribonuklease-basierten Konstruktion homozygoter Heuschreckenmutanten sowie eine detaillierte Methode zur Kryokonservierung und Reanimation der Heuschreckeneier.
Abstract
Die Wanderheuschrecke Locusta migratoria ist nicht nur eine der weltweiten Pestheuschrecken, die dem Menschen enorme wirtschaftliche Verluste zugefügt hat, sondern auch ein wichtiges Forschungsmodell für die Metamorphose von Insekten. Das CRISPR/Cas9-System ist in der Lage, einen bestimmten DNA-Locus genau zu lokalisieren und innerhalb des Zielorts zu spalten, wodurch Doppelstrangbrüche effizient eingeführt werden, um einen Knockout des Zielgens zu induzieren oder neue Genfragmente in den spezifischen Locus zu integrieren. Die CRISPR/Cas9-vermittelte Genom-Editierung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Beantwortung von Fragen der Heuschreckenforschung sowie eine vielversprechende Technologie zur Heuschreckenbekämpfung. Diese Studie liefert ein systematisches Protokoll für CRISPR/Cas9-vermittelten Gen-Knockout mit dem Komplex aus Cas9-Protein und Single Guide RNAs (sgRNAs) in wandernden Heuschrecken. Die Auswahl der Zielstellen und das Design der sgRNA werden detailliert beschrieben, gefolgt von der in vitro Synthese und Verifizierung der sgRNAs. Zu den nachfolgenden Verfahren gehören die Entnahme von Eierfloßen und die Trennung von gegerbten Eiern, um eine erfolgreiche Mikroinjektion mit niedriger Sterblichkeitsrate zu erreichen, die Eikultur, die vorläufige Abschätzung der Mutationsrate, die Heuschreckenzucht sowie der Nachweis, die Konservierung und die Passage der Mutanten, um die Populationsstabilität der editierten Heuschrecken zu gewährleisten. Diese Methode kann als Referenz für CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editing-Anwendungen sowohl bei Wanderheuschrecken als auch bei anderen Insekten verwendet werden.
Introduction
Gen-Editing-Technologien könnten verwendet werden, um Insertionen oder Deletionen in einen bestimmten Genomlocus einzuführen, um das Zielgen absichtlich künstlich zu modifizieren1. In den letzten Jahren hat sich die CRISPR/Cas9-Technologie rasant weiterentwickelt und hat ein wachsendes Anwendungsspektrum in verschiedenen Bereichen der Lebenswissenschaften 2,3,4,5,6. Das CRISPR/Cas9-System wurde bereits 1987 entdeckt 7 und ist in Bakterien und Archaeen weit verbreitet. Weitere Untersuchungen deuteten darauf hin, dass es sich um ein prokaryotisches adaptives Immunsystem handelt, das auf die RNA-gesteuerte Nuklease Cas9 angewiesen ist, um Phagen zu bekämpfen8. Das künstlich modifizierte CRISPR/Cas9-System besteht im Wesentlichen aus zwei Komponenten, einer einzelnen Leit-RNA (sgRNA) und dem Cas9-Protein. Die sgRNA besteht aus einer zur Zielsequenz komplementären CRISPR-RNA (crRNA) und einer relativ konservierten trans-aktivierenden crRNA (tracrRNA). Wenn das CRISPR/Cas9-System aktiviert wird, bildet die sgRNA mit dem Cas9-Protein ein Ribonukleoprotein (RNP) und leitet Cas9 über die Basenpaarung von RNA-DNA-Interaktionen an seinen Zielort. Dann kann die doppelsträngige DNA durch das Cas9-Protein gespalten werden und als Ergebnis entsteht der Doppelstrangbruch (DSB) in der Nähe des Protospacer-Nachbarmotivs (PAM) der Zielstelle 9,10,11,12. Um die durch die DSBs verursachten Schäden zu mindern, würden Zellen umfassende DNA-Schadensantworten aktivieren, um die genomischen Schäden effizient zu erkennen und den Reparaturprozess einzuleiten. Es gibt zwei unterschiedliche Reparaturmechanismen in der Zelle: die nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und die homologiegesteuerte Reparatur (HDR). NHEJ ist der häufigste Reparaturweg, der DNA-Doppelstrangbrüche schnell reparieren kann und Zellapoptose verhindert. Es ist jedoch fehleranfällig, da kleine Fragmente von Insertionen und Deletionen (Indels) in der Nähe der DSBs verbleiben, was in der Regel zu einer Verschiebung des offenen Leserasters führt und somit zu einem Gen-Knock-out führen kann. Im Gegensatz dazu ist eine homologiste Reparatur ein recht seltenes Ereignis. Unter der Voraussetzung, dass es eine Reparaturschablone mit Sequenzen gibt, die homolog zum Kontext der DSB sind, würden Zellen gelegentlich den genomischen Bruch gemäß der nahe gelegenen Schablone reparieren. Das Ergebnis von HDR ist, dass die DSB präzise repariert wird. Insbesondere, wenn es eine zusätzliche Sequenz zwischen den homologen Sequenzen in der Vorlage gibt, würden diese durch HDR in das Genom integriert werden, und auf diese Weise könnten die spezifischen Geninsertionen realisiert werden13.
Mit der Optimierung und Entwicklung der sgRNA-Strukturen und Cas9-Proteinvarianten wurde das CRISPR/Cas9-basierte genetische Editierungssystem auch erfolgreich in der Erforschung von Insekten eingesetzt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella und Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. Nach bestem Wissen der Autoren wurden zwar RNPs, die aus dem Cas9-Protein und in vitro transkribierter sgRNA bestehen, für die Editierung des Heuschreckengenomsverwendet 20,21,22, aber ein systematisches und detailliertes Protokoll für die CRISPR/Cas9-Ribonuklease-vermittelte Konstruktion homozygoter Mutanten der wandernden Heuschrecke fehlt noch.
Die Wanderheuschrecke ist ein wichtiger landwirtschaftlicher Schädling, der weltweit verbreitet ist und eine erhebliche Bedrohung für die Nahrungsmittelproduktion darstellt, da sie besonders für Getreidepflanzen wie Weizen, Mais, Reis und Hirse schädlich ist23. Genfunktionsanalysen, die auf Genom-Editing-Technologien basieren, können neue Angriffspunkte und neue Strategien zur Bekämpfung von Wanderheuschrecken liefern. Diese Studie schlägt eine detaillierte Methode vor, um wandernde Heuschreckengene über das CRISPR/Cas9-System auszuschalten, einschließlich der Auswahl von Zielorten und des Designs von sgRNAs, der In-vitro-Synthese und Verifizierung der sgRNAs, der Mikroinjektion und Kultur von Eizellen, der Abschätzung der Mutationsrate im Embryonalstadium, dem Nachweis von Mutanten sowie der Passage und Konservierung der Mutanten. Dieses Protokoll könnte als basale Referenz für die Manipulation der überwiegenden Mehrheit der Heuschreckengene verwendet werden und kann wertvolle Referenzen für die Genom-Editierung anderer Insekten liefern.
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Protocol
1. Auswahl der Zielstelle und sgRNA-Design
- Sammeln Sie so viele Sequenzinformationen wie möglich für das interessierende Gen durch Literaturrecherche und/oder Suche nach der mRNA oder kodierenden DNA-Sequenz (CDS) des Gens bei NCBI und Heuschreckendatenbank24.
- Vergleichen Sie die Sequenz des interessierenden Gens mit seiner genomischen DNA-Sequenz, um die Exon- und Intron-Regionen zu unterscheiden.
- Wählen Sie eine Kandidatenregion für die Gestaltung der Zielwebsite basierend auf dem Forschungszweck aus. Entwerfen Sie Primerpaare, um das Fragment der Kandidatenregion zu amplifizieren und seine Wildtyp-Sequenz durch Sequenzierungsanalyse des PCR-Produkts zu verifizieren.
HINWEIS: Es gibt verschiedene Strategien für die Auswahl der Kandidatenzielregion. Zum Beispiel wird in den meisten Gen-/Proteinfunktionsforschungen das Exon-Fragment in der Nähe seines Startcodons als Kandidatenregion verwendet, um sicherzustellen, dass die gesamte Protein-/RNA-Funktion nach der Genom-Editierung (d. h. Gen-Knock-out) verloren geht. Wählen Sie für die Funktionsanalyse einer bestimmten Domäne die Kandidatenregion am Anfang (oder an beiden Enden) der Domäne aus. - Nutzen Sie Online-Ressourcen wie das E-CRISP Design25 , um nach potenziellen Zielstandorten in der potenziellen Zielregion zu suchen.
- Wählen Sie "Drosophila melanogaster BDGP6" (oder ein anderes Insekt) in der Dropdown-Liste der Referenzgenome aus und wählen Sie "Eingabe ist FASTA-Sequenz" und fügen Sie anschließend die Sequenz der Zielregion in das Textfeld ein (im FASTA-Format).
- Starten Sie die Anwendung, indem Sie auf "sgRNA-Suche starten" mit "medium" und "single design" klicken, um die möglichen Zielstellen zu erhalten. Wählen Sie 1-3 potenzielle Ziele aus den Ergebnissen basierend auf ihren prognostizierten Werten aus und entwerfen Sie die entsprechenden sgRNAs entsprechend.
HINWEIS: Es gibt viele weitere Online-Plattformen für CRISPR-Design, wie z. B. CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT usw. (siehe Materialtabelle). Einige von ihnen haben die Funktion der Spezifitätsprüfung für die Arten, deren genomische Sequenzdaten in ihren Datenbanken enthalten sind. Die genomische Sequenz der Heuschrecken wurde jedoch auf keiner Online-Website gefunden. Es ist besser, mehr als ein Online-Tool für das CRISPR-Design bei Heuschrecken zu verwenden. Betrachten Sie umfassend die Ergebnisse von verschiedenen Websites und wählen Sie die sgRNA aus den Ergebnissen nach dem Prinzip der höchsten Spezifität, der höchsten Effizienz und der geringsten Mismatch-Rate aus (Abbildung 1A,B).
2. Synthese und Verifizierung der sgRNA in vitro
- Synthetisieren Sie die sgRNA mit sgRNA-Synthesekits gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers (Materialtabelle). Dieses Verfahren umfasst in der Regel drei Schritte: DNA-Template-Amplifikation, In-vitro-Transkription und sgRNA-Aufreinigung21. Verdünnen Sie die synthetisierte sgRNA mit nukleasefreiem Wasser auf eine Speicherkonzentration von 300 ng/μL für die weitere Verwendung.
- Amplifizieren und reinigen Sie das Zielgenfragment, um es als Substrat für den In-vitro-Spaltungsassay des CRISPR/Cas9-Systems zu verwenden. Führen Sie diese Schritte gemäß den Anweisungen des Herstellers aus.
- Verdünnen Sie das gekaufte Cas9-Protein mit nukleasefreiem Wasser auf 300 ng/μl. Inkubieren Sie 1 μl sgRNA (300 ng/μl) und 1 μl Cas9-Protein (300 ng/μl) mit 200 ng gereinigtem Zielfragment im Spaltpuffer bei 37 °C für 1 h (10 μl Gesamtvolumen; siehe Tabelle 1). Abschätzung der Effizienz der sgRNA-induzierten Cas9-Spaltung durch Agarose-Gelelektrophorese (Abbildung 1C). Wählen Sie die sgRNAs mit hoher Aktivität für die folgende Mikroinjektion aus.
HINWEIS: Die Ergebnisse der Agarose-Gelelektrophorese können mit Bildverarbeitungssoftware in Graustufenbilder umgewandelt werden, und die Spalteffizienz wird anhand der Graustufen der Banden spekulierter Größen geschätzt.
3. Mikroinjektion und Kultivierung der Eizellen
- Bereiten Sie die Injektionsnadeln vor, indem Sie Glaskapillaren mit einem Mikropipettenabzieher ziehen (Materialtabelle). Stellen Sie die Parameter wie folgt ein: Heat auf 588, Pull auf 90, Velocity auf 60 und Time auf 40. Schleifen Sie die Spitze der Injektionsnadel mit einem Mikroschleifer (Materialtabelle).
HINWEIS: Ideale Nadelspitzen sind offen und scharfkantig (Abbildung 2A). Es wird dringend empfohlen, zusätzliche Nadeln für die Experimente vorzubereiten, da die Nadeln bei Injektionen manchmal blockiert oder versehentlich gebrochen werden. - Mischen Sie 1 μl Cas9-Protein (300 ng/μl) mit 1 μl der verifizierten sgRNA (300 ng/μl) zusammen, um die RNPs für die Injektion zu erhalten. Fügen Sie 8 μl RNase-freies steriles Wasser hinzu, um das endgültige Volumen der Mischung auf 10 μl zu erhöhen. Mischen Sie die Lösung gründlich und bewahren Sie sie auf Eis auf.
HINWEIS: Die endgültigen Konzentrationen des Cas9-Proteins und der sgRNAs können entsprechend den Editierergebnissen optimiert werden. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen der vorbereiteten RNP-Lösung und es wird empfohlen, sie sofort zu verwenden. - Ziehen Sie die männlichen und weiblichen adulten Heuschrecken zusammen bei 30 °C mit einer Photoperiode von 16 (hell):8 (dunkel) auf und versorgen Sie sie mit ausreichend frischen Weizensämlingen als Nahrung. Beobachten Sie diese Heuschrecken täglich und stellen Sie einen Eiablagetopf (einen Blumentopf oder Becher aus Plastik, der mit nassem, sterilem Sand gefüllt ist) in den Aufzuchtkäfig zur Eiablage, sobald sich die Heuschrecken gepaart haben.
HINWEIS: Normalerweise reichen 100 Paare erwachsener Heuschrecken, die in einem Aufzuchtkäfig (40 cm x 40 cm x 40 cm) aufgezogen werden, aus, um Eier zu erzeugen, um ein einzelnes Gen auszuschalten. Züchten Sie zusätzliche Heuschreckenpaare, wenn mehr Eier benötigt werden. - Sammeln Sie die frisch gelegten Eierschoten aus dem Eiablagetopf und warten Sie ca. 30 Minuten, bis die Eier gegerbt sind. Isolieren Sie die Eier vorsichtig mit einer feinen Bürste in Wasser und waschen Sie sie dreimal mit sterilem Wasser. Bewahren Sie die Eier in einer Petrischale auf und fügen Sie steriles Wasser hinzu, um sie feucht zu halten.
HINWEIS: Die Gerbung der neu gelegten Eier kann die Mutanteneffizienz erheblich verbessern21. - Füllen Sie eine Injektionsnadel mit der vorbereiteten RNP-Lösung und laden Sie sie in den Mikromanipulator (Materialtabelle).
- Stellen Sie die Mikroinjektionsparameter wie folgt ein: 300 hPa des Einspritzdrucks (pi), 0,5 s der Einspritzzeit (ti) und 25 hPa des Ausgleichsdrucks (pc).
- Drücken Sie das Pedal, um das Volumen der injizierten Lösung zu bewerten. Stellen Sie den Einspritzdruck und die Einspritzzeit so ein, dass das Einspritzvolumen etwa 50-100 nL beträgt.
Anmerkungen: Lassen Sie die Restluft in der Nadel ab, um die Injektionslösung so kontinuierlich und kontrollierbar wie möglich zu machen. Die Verbindung zwischen der Nadel und dem Mikromanipulator muss dicht sein.
- Ordnen Sie die sterilen Eizellen regelmäßig auf dem Injektionskissen an (Abbildung 2B, C) und legen Sie das Pad auf den Objekttisch des Mikroskops (Abbildung 3A). Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops ein, bis die Eier zu sehen sind. Stellen Sie die Mikroinjektionsnadel unter dem Mikroskop ein, bis die Injektionsspitze zu sehen ist, und positionieren Sie sie in der Nähe der zu injizierenden Eizelle.
- Beginnen Sie die Injektion in einer geeigneten Höhe und einem Winkel von 30-45 Grad. Führen Sie die Spitze vorsichtig in der Nähe der Mikropylen des Eies in das Ei ein (Abbildung 3B) und drücken Sie das Pedal, um die Injektion durchzuführen. Ziehen Sie die Nadel schnell zurück und bewegen Sie das Injektionskissen für die Injektion der nächsten Eizelle.
HINWEIS: Eine leichte Ausdehnung der Eizelle während der Mikroinjektion sollte beobachtet werden. Eine geringe zytoplasmatische Leckage an der Lochblende ist akzeptabel. Ersetzen Sie die Injektionsnadel durch eine neue oder passen Sie den Injektionswinkel an, wenn der Flüssigkeitsausfluss zu groß ist. - Übertragen Sie die injizierten Eier in eine Kulturschale (eine Petrischale mit einem Stück feuchtem Filterpapier) und legen Sie sie in einen Inkubator bei 30 °C.
ANMERKUNG: Es dauert etwa 13-14 Tage, bis aus diesen injizierten Eiern Nymphen schlüpfen (unter der Voraussetzung, dass die Mutation des Zielgens die Entwicklung der Embryonen nicht beeinträchtigt) (Abbildung 3C). Injizieren Sie mindestens 100 Eier, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Schlupf- und Eklosionsmenge vorhanden ist, um ein bestimmtes Gen auszuschalten.
4. Schätzung der Mutationsrate und das Screening von Mutanten
- Überprüfen Sie die Entwicklung der injizierten Eizellen jeden Tag nach der Injektion. Übertragen Sie die injizierten Eizellen in den ersten 5 Tagen alle 24 Stunden in eine neue Kulturschale.
- Am 6. Tag (oder später) nach der Injektion 10 Eizellen nach dem Zufallsprinzip in ein Röhrchen geben und die Eizellen mit zwei Stahlkugeln bei 60 Hz 6 Minuten lang mit einem Mahlwerk ausreichend zerkleinern (siehe Materialtabelle). Resuspendieren Sie den Schmutz mit 1 ml PBS. 5 μl des Gemisches in 45 μl 50 mM NaOH überführen und 5 min bei 95 °C lysieren. Geben Sie 5 μL 1 M Tris-HCl (pH=8,0) in das Lysesystem, um die alkalische Lysereaktion zu beenden.
HINWEIS: Eizellen können an jedem Tag nach dem letzten Transfer für die alkalische Lyse entnommen werden, und je nach Entwicklungssituation können mehrere Eizellen als eine Probe verwendet werden (z. B. können fünf 6 Tage alte Embryonen als eine Probe und zwei 10 Tage alte Embryonen als eine Probe verwendet werden). Manchmal ist es nicht möglich, die genomische DNA von Eiern mit der alkalischen Lysemethode zu gewinnen. Kommerzielle genomische DNA-Extraktionskits können als alternative Methode zur Isolierung der genomischen DNA aus den Eiern verwendet werden. - Nehmen Sie 1 μl des Lyseprodukts als PCR-Template, um das Zielgenfragment zu amplifizieren (Tabelle 2 und Tabelle 3) und senden Sie die PCR-Produkte zur Sequenzierung. Vergleichen Sie die Sequenzierungsergebnisse mit der Wildtyp-Sequenz, um vorläufig zu beurteilen, ob das CRISPR/Cas9-System das Zielgen in vivo gespalten hat (Abbildung 4A). Lassen Sie den Rest der Eizellen für die spätere Entwicklung bereiten, vorausgesetzt, dass Indels im Embryonalstadium nachgewiesen werden.
HINWEIS: Auf diese Weise kann die Mutationsrate im Embryonalstadium vorläufig abgeschätzt werden. Wenn in diesem Schritt keine Indels gefunden werden, stellen Sie einige neue sgRNAs für das Zielgen her und wiederholen Sie das Knock-out-Protokoll aus Schritt 2.1. - Setzen Sie die geschlüpften Nymphen in einen Aufzuchtkäfig um und kultivieren Sie sie wie in Schritt 3.3 beschrieben. Wenn sich die Nymphen bis zum fünften Stadium entwickelt haben, trennen Sie sie mit Plastikkulturbechern (1 Nymphe/Becher).
HINWEIS: Normalerweise dauert es etwa 25-35 Tage, bis sich die Nymphen zu ihrem fünften Stadium entwickelt haben, und der offensichtlichste Phänotyp ist, dass sich die Flügelknospen bis zum vierten oder fünften Bauchsegment erstrecken. Darüber hinaus wird empfohlen, die Phänotypen toter Nymphen aufzuzeichnen, um die Beziehung zwischen dem Zielgen und den Phänotypen in der weiteren Forschung vorherzusagen. - Schneiden Sie mit einer Präparierschere ca. 2 mm Länge der Fühler ab und lysieren Sie sie mit der alkalischen Lysemethode (Schritt 4.2). Analysieren Sie die Zielgenfragmentsequenz dieser Nymphen wie oben beschrieben (Schritt 4.3), um dieG0-Mutanten zu identifizieren (Abbildung 4B).
HINWEIS: Der Antennenschnitt für die Lyse kann etwas länger sein und das Schleifen oder Zerkleinern der Antennen ist für die Lyse hilfreich, obwohl die Antennen direkt verdaut werden können. Individuen mit mehreren Peaks in der Nähe des Zielortes im Sequenzierungsergebnis werden als positive Mutanten identifiziert und können sich anschließend entwickeln und paaren.
5. Etablierung und Weitergabe von Mutantenlinien
- Kreuzung mitG0-Mutanten und Wildtyp-Heuschrecken (Abbildung 4B). Sammeln Sie die Oozysten und inkubieren Sie diese Oozysten separat bei 30 °C. Verwenden Sie 3-6 entwickelte Eizellen in jeder Oozyste, um Mutationen zu erkennen, wie in den Schritten 4.2 und 4.3 beschrieben. Bewahren Sie mutationspositive Oozysten für die spätere Entwicklung auf und geben Sie die mutationsnegativen Oozysten auf.
HINWEIS: Die Schätzung der Mutationsrate im Embryonalstadium kann das Screening vonG1-Mutanten erheblich beschleunigen. In der Regel können 3-6 entwickelte Eizellen wie oben beschrieben als eine Probe für die PCR-vermittelte Genotypisierung gemischt werden. - Ziehen Sie die G1 Nymphen wie in Schritt 4.4 beschrieben auf. Schneiden Sie etwa 2 mm Länge der Antennen ab, um eine PCR-basierte Genotypisierung durchzuführen, wie in Schritt 4.5 zum Nachweis von G1-Heterozygoten beschrieben. Führen Sie die TA-Klonierung gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) durch, um ihre Mutationen zu identifizieren. Führen Sie eine Kreuzung mit G1-Heterozygoten mit den gleichen Mutationen durch, umG2-Nymphen zu erhalten.
HINWEIS: Die Sanger-Sequenzierung der PCR-Produkte kann nur Informationen liefern, um die Heterozygoten herauszufinden, aber nicht genügend Informationen, um die genauen Mutationen zu identifizieren. Daher ist eine TA-Klonierung mit den PCR-Produkten erforderlich, um die Mutationen eindeutig zu identifizieren und kann die Etablierung stabiler Mutantenlinien fördern. - Ziehen Sie die G2 Nymphen bis zu ihrem fünften Stadium auf. Verwenden Sie die in Schritt 5.2 beschriebene PCR-basierte Genotypisierung, um die Homozygoten und/oder Heterozygoten zu identifizieren, die für weitere Forschung und eine stabile Passage geeignet sind (Abbildung 4B).
HINWEIS: Achten Sie darauf, eine Vermischung von Homozygoten und Heterozygoten zu vermeiden. Es wird empfohlen, in jeder Generation eine PCR-basierte Genotypisierung durchzuführen, um die Homozygotie und/oder Heterozygotie jeder Population zu bestätigen. Die Anzahl der Heuschrecken, die für diese Kontrolle verwendet werden, hängt von der Populationsgröße ab. Darüber hinaus kann die Population der Heuschrecken durch die In-Cross-Strategie erweitert werden.
6. Kryokonservierung und Wiederbelebung von Eizellen
- Waschen Sie die zu konservierenden Eier mit sterilem Wasser und inkubieren Sie sie wie oben beschrieben (Schritt 3.8) in einer Kulturschale für 5-6 Tage. Sammeln Sie diese Eier in der Kulturschale und bedecken Sie sie mit Filterpapierfragmenten. Wickeln Sie die gesamte Kulturschale mit einer Paraffinfolie ein.
- Bewahren Sie das Gericht 2 Tage lang bei 25 °C auf, gefolgt von weiteren 2 Tagen bei einer relativ niedrigeren Temperatur (13-16 °C). Dann die Schüssel in einen 6 °C kalten Kühlschrank stellen. Fügen Sie alle 2 Wochen Wasser hinzu, um eine feuchte Umgebung für die Eier zu schaffen (Abbildung 5A).
ANMERKUNG: Es wird spekuliert, dass sich die Embryonen im Katatrepsis-Stadium befinden, nachdem sie 5-6 Tage lang bei 30 °C entwickelt wurden26. Die Gradientenkühlung ist hilfreich für die Kryokonservierung von Eizellen (Tabelle 5). - Um die kryokonservierten Eier wiederzubeleben, nehmen Sie die Petrischale aus dem Kühlschrank und bewahren Sie sie 2 Tage lang bei 25 °C auf. Legen Sie diese Eier in einen 30 °C heißen Inkubator, bis die Nymphen schlüpfen (Abbildung 5B).
HINWEIS: Es ist notwendig, die kryokonservierten Eier bei 25 °C zu lagern, bevor sie in einen 30 °C-Inkubator überführt werden. Die Embryonen können mindestens fünf Monate lang kryokonserviert werden, obwohl die Schlupfrate und die Eklosionsrate aufgrund der Kryokonservierung abnehmen können (Tabelle 5).
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Representative Results
Dieses Protokoll enthält die detaillierten Schritte zur Erzeugung homozygoter Mutanten der wandernden Heuschrecken mit dem RNP, das aus Cas9-Protein und in vitro synthetisierter sgRNA besteht. Im Folgenden sind einige repräsentative Ergebnisse des CRISPR/Cas9-vermittelten Zielgen-Knockouts in Heuschrecken aufgeführt, einschließlich der Zielauswahl, der sgRNA-Synthese und -Verifizierung (Abbildung 1A), der Eizellentnahme und -injektion, des Mutantenscreenings und der Weiterbildung, der Kryokonservierung und der Wiederbelebung der homozygoten Eier.
In dieser Studie wird der Zielort für das CRISPR/Cas9-System anhand der Ergebnisse von drei Online-Programmen (E-CRISP, CRISPOR und ZiFit) ausgewählt und im ersten Exon lokalisiert (Abbildung 1B). Nach dem Cas9-Spaltungsassay in vitro (Tabelle 1) konnte der CRISPR/Cas9-RNP das PCR-Fragment (mit der Zielstelle) mit einer Spaltrate von etwa 55 % verdauen (Abbildung 1C). Anschließend wurde dieses RNP in 120 befruchtete Eizellen in ihrem Einzelzellstadium mit dem Standard-Mikroinjektionssystem mikroinjiziert (Abbildung 2 und Abbildung 3). Die Sequenzierungsergebnisse für die Schätzung der Mutationsrate im Embryonalstadium deuten auf eine effiziente Genomeditierung am Zielort hin (Abbildung 4A). Darüber hinaus ergab diese Studie eine Schlupfrate von 52,73 % der Nymphen und 66,7 % derG0-Erwachsenen waren Mosaikmutanten (Tabelle 4).
Weiterhin wurdendie G0-Chimären mit Wildtyp-Heuschrecken gekreuzt, um heterozygote G1-Individuen zu erhalten, und dieG1-Heterozygoten mit den gleichen Mutationen (gescreent durch TA-Klonierung) wurden eingekreuzt, um dieG2-Tiere zu erzeugen. Für den Nachweis von Mutanten wurde eine PCR-basierte Phänotypisierung verwendet, und die erhaltenen Homozygoten wurden gekreuzt, um stabile Mutantenlinien zu etablieren (Abbildung 4B).
Währenddessen wurden die überschüssigen homozygoten Eizellen kryokonserviert, um die Verwertungsrate der Homozygoten zu verbessern. Obwohl die Schlupfrate der kryokonservierten Eier mit der Verlängerung der Kryokonservierungszeit verringert wurde (Tabelle 5), waren die Abhilfemaßnahmen wie das Auftragen von Filterpapierfragmenten zum Feuchthalten der Eier und die Gewinnung dieser konservierten Eier mit einem Gradienten steigender Temperatur für die Wiederbelebung hilfreich (Abbildung 5 und Tabelle 5). Schließlich gelang es, die homozygote Population der Mutanten für die spätere Forschung zu erhalten.
Abbildung 1: Design des Targets und In-vitro-Verifikation der sgRNA. (A) Das Flussdiagramm für die Auswahl des Targets, die sgRNA-Synthese und die Verifizierung der Bioaktivität in vitro (einschließlich, aber nicht beschränkt auf Heuschrecken). (B) Schematische Darstellung der Genstruktur und des Zielortes. Die Exons dieses Zielgens sind als blaue Domänen dargestellt und die Zielstelle wurde stromabwärts des Startcodons in Exon 1 ausgewählt. Die Zielsequenz wird rot hervorgehoben. (C) Das Ergebnis der Agarose-Gelelektrophorese des In-vitro-Cas9-Spaltassays. Ein DNA-Fragment mit der Zielsequenz (ca. 400 bp lang) wurde amplifiziert und als Substrat für den Cas9-Verdau verwendet. Die erwarteten kleinen Banden (hier etwa 100 bp und 300 bp; markiert mit roten Dreiecken) deuteten darauf hin, dass die synthetisierte sgRNA eine effektive Cas9-Spaltung induzieren könnte. Die Spaltrate lag laut Graustufenanalyse bei ca. 55%. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Nadelvorbereitung und Mikroinjektionskissen für Heuschreckeneier. (A) Spitze einer präparierten Nadel für die Mikroinjektion von Heuschreckeneiern. Maßstabsleiste: 1 mm. (B) Bild eines Mikroinjektionskissens, auf dem Eier (mit einem roten Dreieck gekennzeichnet) angeordnet sind. Der Maßstabsbalken stellt 1 cm dar. (C) Die Größe des Mikroinjektionskissens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Mikroinjektion von Eizellen . (A) Ein repräsentatives Mikroinjektionssystem, das mit roten Kästchen gekennzeichnet ist, die ein Mikroskop (Mitte) und einen Mikromanipulator (rechts) anzeigen, der mit einem Mikroinjektor (links) verbunden ist. Der Computer dient zur Datenspeicherung und zur Hilfsbeobachtung. (B) Injektion des Heuschreckeneies. Die Injektionsstelle ist mit einem roten Dreieck markiert. (C) Eine geschlüpfte Nymphe unter dem Mikroskop. Die Maßstabsbalken stellen 1 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Die Sequenzierungsergebnisse der G0-Tiere und die Passagenstrategie der Mutantenlinien . (A) Die typische Sequenzierung ergibt dasG0-Screening. Mehrere Peaks in der Nähe des Zielortes (markiert mit einem roten Rechteck in der Wildtyp-Sequenz) zeigten an, dass das getestete Ei/die Heuschrecke erfolgreich durch das CRISPR/Cas9-System editiert wurde (wie in G 0-1 und G0-2 gezeigt), während das Individuum ohne Änderung des Sequenzierungsergebnisses als nicht editiert und aufgegeben galt (z. B. G0-3). (B) Die Passagenstrategie der Mutantenlinien. DieG0-Tiere wurden zunächst durch PCR-vermittelte Genotypisierung gescreent und diejenigen mit mehreren Spitzenwerten in ihren Sequenzierungsergebnissen wurden mit Wildtyp-Heuschrecken gekreuzt, umdie G1-Tiere zu erzeugen. PCR-vermittelte Genotypisierung und TA-Klonierung wurden verwendet, um die G1-Heterozygoten zu identifizieren. Dann wurden Heterozygoten mit den gleichen Mutationen eingekreuzt, um dieG2-Tiere (Homozygoten und Heterozygoten) für weitere Forschung und Weitergabe zu erzeugen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Kryokonservierung und Wiederbelebung von Eizellen. (A) Das Verfahren der Kryokonservierung: Isolieren Sie die Eier aus den Eikapseln und bebrüten Sie sie nach dem Waschen mit sterilem Wasser 5-6 Tage lang bei 30 °C. Sammeln Sie dann die entwickelten Eier in der Petrischale zusammen und bedecken Sie sie mit kleinen Resten feuchten Filterpapiers. Wickeln Sie die gesamte Petrischale mit einer Paraffinfolie ein und halten Sie sie 2 Tage lang bei 25 °C, gefolgt von weiteren 2 Tagen bei einer relativ niedrigeren Temperatur (z. B. 13-16 °C). Zum Schluss kühlen Sie es bei 6 °C. (B) Das Verfahren der Wiederbelebung: Nehmen Sie die Petrischalen mit kryokonservierten Eiern aus dem Kühlschrank und bewahren Sie sie nach dem Entfernen der Filterpapierreste 2 Tage lang bei 25 °C auf. Anschließend können die Eier für die spätere Entwicklung bei 30 °C kultiviert werden, bis die Nymphen schlüpfen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Reagenz | Volumen (μL) |
| Cas9-Protein (300 ng/μl) | 1 |
| sgRNA (300 ng/μl) | 1 |
| PCR-Produkt (200 ng/μl) | 1 |
| 10×NEBuffer r3.1 | 1 |
| Nukleasefreies Wasser | 6 |
Tabelle 1: In-vitro-Verdauungssystem . 200 ng gereinigtes Zielfragment (PCR-Produkt) wurden mit dem CRISPR/Cas9-System gemischt (300 ng von jeder Komponente), um die Bioaktivität der synthetisierten sgRNAs zu testen. Es wurde ein handelsüblicher Puffer verwendet und nukleasefreies Wasser hinzugefügt, um das Gesamtvolumen auf 10 μl zu erhöhen.
| Reagenz | Volumen (μL) |
| 2xEs Taq MasterMix | 12.5 |
| Vorwärts-Primer | 0.5 |
| Umgekehrte Grundierung | 0.5 |
| Template (Lyseprodukt) | 1 |
| Nukleasefreies Wasser | 10.5 |
Tabelle 2: PCR-System zur Amplifikation von Zielgenfragmenten. Um das genomische Fragment des Zielgens zu amplifizieren, wurde eine handelsübliche Taq-Mischung verwendet und Primer gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzugefügt. 1 μl des Lyseprodukts wurde als Matrize verwendet und nukleasefreies Wasser wurde verwendet, um das Gesamtvolumen auf 25 μl zu erhöhen.
| Temperatur (°C) | Zeit | Zyklen |
| 95 | 5 Minuten | 1 |
| 95 | 30 s | 35 |
| 55 | 30 s | |
| 72 | 40 s | |
| 72 | 10 Minuten | 1 |
Tabelle 3: PCR-Programm zur Amplifikation von Zielgenen. Das PCR-Programm zur Amplifikation der Zielgene war: 95 °C für 5 min; 35 Zyklen à 95 °C für 30 s, 55 °C für 30 s, 72 °C für 40 s; 72 °C für 10 min.
| Artikel | Daten |
| Anzahl der injizierten Eizellen | 120 |
| Getestete Embryonen | 10 |
| Anzahl der geschlüpften Nymphen | 58 |
| Schlupfrate | 52.73% |
| Anzahl G0 Erwachsene | 12 |
| Anzahl der G0 Mutanten | 8 |
| Mutationseffizienz bei G0 Erwachsenen | 66.67% |
Tabelle 4: Zusammenfassung der Bearbeitungseffizienz. 120 Eizellen wurden injiziert, um das Zielgen auszuschalten, und 10 Eizellen wurden für Tests während des Embryonalstadiums entnommen. Aus den restlichen Embryonen schlüpften 58 Nymphen (die Schlupfrate betrug 52,73%). Schließlich entwickelten sich 12 G0 Heuschrecken bis zum adulten Stadium und 8 von ihnen wurden erfolgreich am Zielort editiert. Die Mutationsrate beiG0-Erwachsenen betrug 66,67%.
| Kontrollgruppe | Gruppe 1 | Gruppe 2 | Gruppe 3 | Gruppe 4 | |
| Anzahl der Eier | 120 | 120 | 120 | 120 | 120 |
| Temperaturbehandlung für die Lagerung | 30 °C | 30°C (5-6 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C |
| Lagerzeit | 14 Tage | 14 Tage | 1 Monat | 3 Monate | 5 Monate |
| Temperaturbehandlung zur Reanimation | 30 °C | 6°C→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C |
| Anzahl der geschlüpften Heuschrecken | 108 | 0 | 96 | 86 | 78 |
| Schlupfrate | 90.00% | 0 | 80.00% | 71.67% | 65.00% |
| Anzahl der erwachsenen Heuschrecken | 81 | 0 | 60 | 46 | 31 |
| Eklusionsrate | 75.00% | 0 | 62.50% | 53.49% | 39.74% |
Tabelle 5: Zusammenfassung der Kryokonservierung und Wiederbelebung von Eizellen. 600 Eizellen wurden für Kryokonservierungs- und Wiederbelebungsstudien in fünf Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe (Kontrolle) von 120 Eiern wurde immer bei 30 °C bebrütet und 14 Tage gelagert. Die zweite Gruppe (Gruppe 1) von 120 Eiern wurde nach Inkubation bei 30 °C für 5-6 Tage in einen Kühlschrank gestellt und 14 Tage bei 6 °C gelagert. Anschließend wurden diese Eizellen zur Wiederbelebung auf 30 °C gebracht. Die anderen Gruppen (Gruppe 2, Gruppe 3 und Gruppe 4, jede Gruppe enthielt 120 Eier) erfuhr eine Gradientenkühlungs- und Erholungstemperaturbehandlung, wie im Protokoll beschrieben (Schritte 6.1-6.3) mit einer anderen Lagerzeit (1 Monat für Gruppe 2, 3 Monate für Gruppe 3 und 5 Monate für Gruppe 4). Zuletzt schlüpften 108 Nymphen aus der Kontrollgruppe (mit einer Schlupfrate von 90%) und 81 von ihnen entwickelten sich bis zum Erwachsenenstadium (75% der Eklosionsrate). In der zweiten Gruppe (Gruppe 1) schlüpften keine Heuschrecken. Die Schlupfrate und die Eklosionsrate der anderen Gruppen waren im Vergleich zur Kontrollgruppe niedriger und nahmen mit der Lagerzeit ab. 96 Nymphen schlüpften in Gruppe 2 und 60 von ihnen entwickelten sich bis zum Erwachsenenstadium. 86 Nymphen schlüpften in Gruppe 3 und 46 von ihnen entwickelten sich bis zum Erwachsenenstadium. In Gruppe 4 schlüpften 78 Nymphen und 31 von ihnen entwickelten sich bis zum Erwachsenenstadium.
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Discussion
Heuschrecken gehören seit der Zivilisation der Menschheit zu den verheerendsten Schädlingen in der Landwirtschaft23. Die CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editing-Technologie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die biologischen Mechanismen von Heuschrecken besser zu verstehen und eine vielversprechende Schädlingsbekämpfungsstrategie zu entwickeln. Daher ist es von großem Nutzen, eine effiziente und einfach anzuwendende Methode zur CRISPR/Cas9-vermittelten Konstruktion homozygoter Heuschreckenmutanten zu entwickeln. Obwohl einige großartige Arbeiten berichtet wurden, die einen grundlegenden Arbeitsablauf für die Genom-Editierung bei Heuschrecken 18,20,21,22 lieferten, fehlt noch eine systematische Optimierung des gesamten Verfahrens. Im Allgemeinen kann die homozygote Heuschreckenmutante, die durch embryonale Injektion des CRISPR/Cas9-Systems erzeugt wird, in drei Hauptschritte unterteilt werden: a) sgRNA-Design, -Synthese und -Screening in vitro, b) Eizellentnahme, -vorbereitung und -injektion; und c) Mutanten-Screening und homozygote Erhaltung. Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf und die Schritte der Auswahl der Zielstelle, des In-vitro-sgRNA-Screenings, der Mikroinjektion der Eizellen sowie des Nachweises von Mutanten sind besonders kritisch für die effektive Erzeugung homozygoter mutierter Heuschrecken mit dem CRISPR/Cas9-System.
Zunächst wurden die Zielstelle, die Form der entsprechenden sgRNA und die Konzentration der sgRNA als kritische Faktoren für die Effizienz der Genom-Editierung bei Insekten vorgeschlagen18,27,28. Um dieses Problem zu lösen, wird empfohlen, zunächst die Genstruktur zu analysieren und mehr als eine Zielstelle auf Exon 1 oder in der Nähe des Startcodons mit Hilfe der Online-Ressourcen zu entwerfen. Anschließend synthetisieren Sie sgRNA in vitro und mischen sie mit Cas9-Protein in verschiedenen Konzentrationen, um die Schneideeffizienz von RNP zu optimieren. Dieses Verfahren wird dazu beitragen, eine sgRNA mit hoher Bioaktivität zu identifizieren und die Zusammensetzung des RNP-Komplexes für das Kandidaten-Zielgen zu optimieren.
Zweitens sind die Entnahme möglichst vieler frischer Eier in einer begrenzten Zeit und die Verbesserung der Schlupfrate sowie der Mutationsrate ebenfalls große Herausforderungen für die Genom-Editierung. Die geselligen erwachsenen Heuschrecken, die im Zustand von 16 (hell):8 (dunkel) Photoperiode aufgezogen werden, werden verwendet, um in kurzer Zeit zwischen 9:00 und 11:00 Uhr genügend Eier zu sammeln. Es ist wichtig, mit einem Pinsel oder einer Pinzette vorsichtig Druck nach unten zwischen den Eiern auszuüben, um die Eier vorsichtig von der Schote zu isolieren. Mit genügend Übung können mehrere Benutzer einzelne Eier zuverlässig von der Schote trennen. Nachdem jede Eizelle isoliert und mit sterilem Wasser gewaschen wurde, werden die Eizellen auf den dafür vorgesehenen Injektionskissen (Abbildung 2B, C) ausgerichtet, um die Eizellen während der Mikroinjektion zu stabilisieren. Die Eizelle wird mit dem optimierten RNP in der Nähe der Mikropylen injiziert. Um die mechanischen Schäden zu begrenzen und die Verschmutzung der Eier zu minimieren, werden frische Eier etwa 30 Minuten lang in den Schoten verbleiben, um sicherzustellen, dass die Eierschalengerbung aufgrund ihrer kondensierten Struktur und ihrer hohen Verteidigungsfähigkeit bei Invasion nach ausreichender Bräunung ideal für die Mikroinjektion21 geeignet ist29,30. In der Zwischenzeit deutete ein veröffentlichter Bericht darauf hin, dass die synzytiale Teilung31 der Heuschreckeneier irgendwann zwischen 0 und 4 Stunden nach der Ablage stattfindet. Mit dem aktuellen Standard-Mikroinjektionsprotokoll kann die Injektion von etwa 100 Eizellen innerhalb von 40 Minuten durchgeführt werden. Insgesamt kann das Verfahren der Gerbung und Mikroinjektion von 100 befruchteten Eizellen innerhalb von 2 Stunden abgeschlossen werden. Somit bleiben mindestens 2 h für die CRISRP/Cas9-vermittelte Spaltung und die Reparatur von Zielgenen, um eine effiziente Mutation in den injizierten Eiern und zukünftigen adulten Heuschrecken zu erreichen.
Schließlich sind effektive Strategien für die Passage und die Identifizierung von Mutanten wichtig, um Homozygoten in den meisten mutierten Tieren zu erzeugen. In Heuschrecken ist die hier vorgeschlagene Kreuzungsstrategie für Gene, die nach der Editierung nicht tödlich sind, dass G0-Mutanten mit Breittyp-Heuschrecken gekreuzt werden und weitere In-Kreuzungen mit denG1-Heterozygoten mit den gleichen Mutationen durchgeführt werden können, um homozygoteMutanten in der folgenden Generation zu erzeugen. Um die Mutation in jeder Heuschrecke während des Mutantenvererbungsprozesses zu verifizieren, wird empfohlen, die alkalische Lysemethode zu verwenden, um ein kurzes Segment der Antennen als Vorlage für die PCR-basierte Genotypisierung zu verdauen. Verwenden Sie schließlich die erhaltenen homozygoten adulten Tiere für weitere Kreuzungen, um die Population zu erweitern. Begrenzt durch die Populationsgröße und die Unterschiede im Entwicklungsstadium zwischen homozygoten Heuschrecken werden die überschüssigen Eier für die Kryokonservierung bei 6 °C und die Wiederbelebung durch Gradiententemperaturanstieg empfohlen (Abbildung 5), die auf dem Prinzip der Tieftemperatur-Diapause und der Hochtemperatur-Diapausenfreisetzung von wandernden Heuschreckeneiern beruht32,33.
Kurz gesagt, das CRISPR/Cas9-System hat sich als zuverlässiges Werkzeug erwiesen, um die Untersuchung der funktionellen Genomik von Wanderheuschrecken zu erleichtern. Dieses detaillierte Protokoll kann als Referenz für CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editing-Anwendungen sowohl bei Wanderheuschrecken als auch bei anderen Insekten verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32070502, 31601697, 32072419 und der China Postdoctoral Science Foundation (2020M672205) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B7030S | The buffer of in vitro Cas9 cleavage assays |
| 2xEs Taq MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0690 | For gene amplification |
| 2xPfu MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0686 | For gene amplification |
| CHOPCHOP | Online website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| CRISPOR | Online website for designing sgRNAs, http://crispor.org. | ||
| CRISPRdirect | Online website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/. | ||
| Electrophoresis power supply | LIUYI BIOLOGY | DYY-6D | Separation of nucleic acid molecules of different sizes |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 30125177 | For sample collection, etc. |
| Fine brushes | Annigoni | 1235 | For cleaning and isolating eggs. Purchased online. |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | For making the microinjection needles |
| Gel Extraction Kit | Cwbio | CW2302 | DNA recovery and purification |
| Gel Imaging Analysis System | OLYMPUS | Gel Doc XR | Observe the electrophoresis results |
| GeneTouch Plus | Bioer | B-48DA | For gene amplification |
| Glass electrode capillary | Gairdner | GD-102 | For making injection needles with a micropipette Puller |
| Incubator | MEMMERT | INplus55 | For migratory locust embryo culture |
| Metal bath | TIANGEN | AJ-800 | For heating the sample |
| Micro autoinjector | Eppendorf | 5253000068 | Microinjection of embryos early in development |
| Micro centrifuge | Allsheng | MTV-1 | Used for mixing reagents |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | To ground the tip of injection needle |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | For loading solutions into the injection needles. |
| Micromanipulation system | Eppendorf | TransferMan 4r | An altinative manipulation system for microinjection |
| Microscope | cnoptec | SZ780 | For microinjection |
| Motor-drive Manipulator | NARISHIGE | MM-94 | For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure |
| Multi-Sample Tissue Grinder | jingxin | Tissuelyser-64 | Grind and homogenize the eggs |
| ovipisition pot | ChangShengYuanYi | CS-11 | Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online. |
| Parafilm | ParafilmM | PM996 | For wrapping the petri dishes. |
| pEASY-T3 Cloning Kit | TransGen Biotech | CT301-01 | For TA cloning |
| Petri dish | NEST | 752001 | For culture and preservation of the eggs. |
| Pipettor | Eppendorf | Research plus | For sample loading |
| plastic culture cup | For rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online. | ||
| Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Primer Premier | PREMIER Biosoft | Primer Premier 5.00 | For primer design |
| SnapGene | Insightful Science | SnapGene®4.2.4 | For analyzing sequences |
| Steel balls | HuaXinGangQiu | HXGQ60 | For sample grinding.Purchased online. |
| Tips | bioleaf | D781349 | For sample loading |
| Trans DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | Used to determine gene size |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo | A36496 | Cas9 protein |
| UniversalGen DNA Kit | Cwbio | CWY004 | For genomic DNA extraction |
| VANNAS Scissors | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | For cutting off the antennae |
| Wheat | To generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers. | ||
| ZiFiT | Online website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx. |
References
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